TY  - THES
A1  - Iosip, Anda-Larisa
T1  - Molecular Mechanosensing Mechanisms of the Carnivorous Plant \(Dionaea\) \(muscipula\)
T1  - Molekulare Mechanismen der Mechanoperzeption in der fleischfressenden Pflanze \(Dionaea\) \(muscipula\)
N2  - Plants are able to sense mechanical forces in order to defend themselves against predators,
for instance by synthesizing repellent compounds. Very few plants evolved extremely sensitive
tactile abilities that allow them to perceive, interpret and respond by rapid movement in the
milliseconds range. One such rarity is the charismatic Venus flytrap (Dionaea muscipula) - a
carnivorous plant which relies on its spectacular active trapping strategy to catch its prey. The
snapping traps are equipped with touch-specialised trigger hairs, that upon bending elicit an
action potential (AP). This electrical signal originates within the trigger hairs’ mechanosensory
cells and further propagates throughout the whole trap, alerting the plant of potential prey.
Two APs triggered within thirty seconds will set off the trap and more than five APs will
initiate the green stomach formation for prey decomposition and nutrient uptake. Neither
the molecular components of the plant’s AP nor the Venus flytrap’s fast closure mechanism
have been fully elucidated yet. Therefore, the general objective of this study is to expound
on the molecular basis of touch perception: from AP initiation to trap closure and finally to
stomach formation.

The typical electrical signal in plants lasts for minutes and its shape is determined by the
intensity of the mechanical force applied. In contrast, the Venus flytrap’s one-second AP is of
all-or-nothing type, similar in shape to the animal AP. In order to gain more insight into the
molecular components that give rise to the Venus flytrap’s emblematic AP, the transcriptomic
landscape of its unique mechanotransducer - the trigger hair – was compared to the rest
of the non-specialised tissues and organs. Additionally, the transcriptome of the electrically
excitable fully-developed adult trap was compared to non-excitable juvenile traps that are
unable to produce sharp APs. Together, the two strategies helped with the identification of
electrogenic channels and pumps for each step of the AP as follows: (1) the most specific to
the trigger hair was the mechanosensitive channel DmMSL10, making up the best candidate for
the initial AP depolarization phase, (2) the K+ outward rectifier DmSKOR could be responsible
for repolarisation, (3) further, the proton pump DmAHA4, might kick in during repolarisation
and go on with hyperpolarisation and (4) the hyperpolarization- and acid-activated K+ inward
rectifier KDM1 might contribute to the re-establishment of electrochemical gradient and
the resting potential. Responsible for the AP-associated Ca2+ wave and electrical signal
propagation, the glutamate-like receptor DmGLR3.6 was also enriched in the trigger hairs.
Together, these findings suggest that the reuse of genes involved in electrical signalling in
ordinary plants can give rise to the Venus flytrap’s trademark AP.

The Venus flytrap has been cultivated ever since its discovery, generating more than one
hundred cultivars over the years. Among them, indistinguishable from a normal Venus flytrap
at first sight, the ’ERROR’ cultivar exhibits a peculiar behaviour: it is unable to snap its traps
upon two APs. Nevertheless, it is still able to elicit normal APs. To get a better understanding
of the key molecular mechanisms and pathways that are essential for a successful trap closure,
the ’ERROR’ mutant was compared to the functional wild type.
Timelapse photography led to the observation that the ’ERROR’ mutants were able to leisurely
half close their traps when repeated mechanostimulation was applied (10 minutes after 20
APs, 0.03 Hz). As a result of touch or wounding in non-carnivorous plants, jasmonic acid
(JA) is synthesized, alerting the plants of potential predators. Curiously, the JA levels were reduced upon mechanostimulation and completely impaired upon wounding in the ’ERROR’
mutant. In search of genes accountable for the ’ERROR’ mutant’s defects, the transcriptomes
of the two phenotypes were compared before and after mechanostimulation (1h after 10
APs, 0.01 Hz). The overall dampened response of the mutant compared to the wild type,
was reflected at transcriptomic level as well. Only about 50% of wild type’s upregulated
genes after touch stimulation were differentially expressed in ’ERROR’ and they manifested
only half of the wild type’s expression amplitude. Among unresponsive functional categories
of genes in ’ERROR’ phenotype, there were: cell wall integrity surveilling system, auxin
biosynthesis and stress-related transcription factors from the ethylene-responsive AP2/ERF and
C2H2-ZF families. Deregulated Ca2+-decoding as well as redox-related elements together with
JA-pathway components might also contribute to the malfunctioning of the ’ERROR’ mutant. As
the mutant does not undergo full stomach formation after mechanical treatment, these missing
processes represent key milestones that might mediate growth-defence trade-offs under JA
signalling. This confirms the idea that carnivory has evolved by recycling the already available
molecular machineries of the ubiquitous plant immune system.

To better understand the mutant’s defect in the trap snapping mechanism, the ground states
(unstimulated traps) of the two phenotypes were compared. In this case, many cell wall-related
genes (e.g. expansins) were downregulated in the ’ERROR’ mutant. For the first time, these
data point to the importance of a special cell wall architecture of the trap, that might confer
the mechanical properties needed for a functional buckling system - which amplifies the speed
of the trap closure.

This study provides candidate channels for each of the AP phases that give rise to and shape
the sharp Venus flytrap-specific AP. It further underlines the possible contribution of the cell
wall architecture to the metastable ready-to-snap configuration of the trap before stimulation
- which might be crucial for the buckling-dependent snapping. And finally, it highlights
molecular milestones linked to defence responses that ensure trap morphing into a green
stomach after mechanostimulation. Altogether, these processes prove to be interdependent
and essential for a successful carnivorous lifestyle.
N2  - Pflanzen sind in der Lage, mechanische Einflüsse zu spüren, um sich gegen Fressfeinde zu
verteidigen, indem sie zum Beispiel abweisende Verbindungen synthetisieren. Nur sehr wenige
Pflanzen haben extrem sensible taktile Fähigkeiten entwickelt, die es ihnen ermöglichen,
schnelle Bewegungen im Millisekundenbereich wahrzunehmen, zu interpretieren und darauf
zu reagieren. Eine solche Rarität ist die charismatische Venusfliegenfalle (Dionaea muscipula)
- eine fleischfressende Pflanze, die sich auf ihre spektakuläre aktive Fallenstrategie verlässt,
um ihre Beute zu fangen. Die Schnappfallen sind mit berührungssensitiven Auslösehaaren
ausgestattet, die beim Biegen ein Aktionspotenzial (AP) auslösen. Dieses elektrische
Signal entsteht in den mechanosensorischen Zellen der Auslösehaare und breitet sich in
der gesamten Falle aus, wodurch die Pflanze auf potenzielle Beute aufmerksam gemacht
wird. Zwei APs, die innerhalb von dreißig Sekunden ausgelöst werden, lösen die Falle aus,
und mehr als fünf APs leiten die Bildung des grünen Magens ein, der die Beute zersetzt
und die Nährstoffe aufnimmt. Weder die molekularen Komponenten des AP der Pflanze
noch der Schnellverschlussmechanismus der Venusfliegenfalle sind bisher vollständig geklärt.
Daher besteht das allgemeine Ziel dieser Studie darin, die molekularen Grundlagen der
Berührungswahrnehmung zu erforschen: von der Initiierung des AP bis zum Schließen der
Falle und schließlich zur Magenbildung.

Das typische elektrische Signal in Pflanzen dauert Minuten und seine Form wird durch
die Intensität der angewandten mechanischen Kraft bestimmt. Im Gegensatz dazu ist das
einsekündige AP der Venusfliegenfalle vom Alles-oder-Nichts-Typ und ähnelt in seiner Form
dem tierischen AP. Um mehr Einblick in die molekularen Komponenten zu erhalten, die
das emblematische AP der Venusfliegenfalle hervorbringen, wurde das Transkriptom ihres
einzigartigen Mechanosensors - des Triggerhaars - mit den übrigen nicht spezialisierten
Geweben und Organen verglichen. Darüber hinaus wurde das Transkriptom der elektrisch
erregbaren, voll entwickelten adulten Falle mit nicht erregbaren juvenilen Fallen verglichen,
die keine scharfen APs erzeugen können. Beide Strategien zusammen halfen bei der
Identifizierung von elektrogenen Kanälen und Pumpen für jeden Schritt des AP: (1) Am
spezifischsten für die Triggerhaare war der mechanosensitive Kanal DmMSL10, der der beste
Kandidat für die anfängliche AP-Depolarisationsphase war, (2) der K+-Auswärtsgleichrichter
DmSKOR könnte für die Repolarisation verantwortlich sein, (3) ferner, die H+-Pumpe DmAHA4,
könnte während der Repolarisation einsetzen und mit der Hyperpolarisation fortfahren und
(4) der durch Hyperpolarisation und Säure aktivierte K+-Einwärtsgleichrichter KDM1 könnte
zur Wiederherstellung des elektrochemischen Gradienten und des Ruhepotentials beitragen.
Der möglicherweise für die AP-assoziierte Ca2+-Welle und die elektrische Signalausbreitung
verantwortliche Glutamatrezeptor DmGLR3.6 war ebenfalls in den Triggerhaaren angereichert.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Wiederverwendung von
Genen, die an der elektrischen Signalübertragung in gewöhnlichen Pflanzen beteiligt sind, zu
dem für die Venusfliegenfalle typischen AP führen kann.

Die Venusfliegenfalle wird seit ihrer Entdeckung kultiviert und hat im Laufe der Jahre mehr
als hundert Kultivare hervorgebracht. Die Sorte "ERROR", die auf den ersten Blick nicht von
einer normalen Venusfliegenfalle zu unterscheiden ist, weist ein besonderes Verhalten auf:
Sie ist nicht in der Lage, ihre Fallen nach dem Auslösen von 2 APs zu schließen. Dennoch ist sie in der Lage, normale APs auszulösen. Um ein besseres Verständnis der molekularen
Schlüsselmechanismen und -wege zu erhalten, die für ein erfolgreiches Schließen der Fallen
notwendig sind, wurde die "ERROR"-Mutante mit dem funktionalen Wildtyp verglichen.

Zeitrafferaufnahmen führten zu der Beobachtung, dass die ’ERROR’-Mutanten in der Lage
waren, ihre Fallen bei wiederholter mechanischer Stimulation (10 Minuten nach 20 APs,
0,03 Hz) sehr langsam etwa zur Hälfte zu schließen. Bei nicht karnivoren Pflanzen
wird infolge von Berührungen oder Verletzungen Jasmonsäure (JA) synthetisiert, die die
Pflanzen vor potenziellen Fressfeinden warnt. Merkwürdigerweise waren die JA-Spiegel
bei mechanischer Stimulation reduziert und bei Verwundung in der "ERROR"-Mutante im
Gegensatz zum WT überhaupt nicht erhöht. Auf der Suche nach Genen, die für die
Defekte der "ERROR"-Mutante verantwortlich sind, wurden die Transkriptome der beiden
Phänotypen vor und nach der Mechanostimulation (1 Stunde nach 10 APs, 0,01 Hz) verglichen.
Die insgesamt gedämpfte Reaktion der Mutante im Vergleich zum Wildtyp spiegelte sich
auch auf transkriptomischer Ebene wider. Nur etwa 50 % der nach Berührungsstimulation
hochregulierten Gene des Wildtyps wurden in "ERROR" unterschiedlich exprimiert, und sie
wiesen nur die Hälfte der Expressionsamplitude des Wildtyps auf. Zu den nicht reagierenden
funktionellen Genkategorien gehörten: das System zur Überwachung der Zellwandintegrität,
die Auxin-Biosynthese und stressbezogene Transkriptionsfaktoren aus den auf Ethylen
reagierenden AP2/ERF- und C2H2-ZF-Familien. Deregulierte Ca2+-decodierende sowie
redoxbezogene Elemente könnten zusammen mit Komponenten des JA-Signalwegs ebenfalls
zur Fehlfunktion der "ERROR"-Mutante beitragen. Da die Mutante nach mechanischer
Behandlung keine vollständige Magenbildung durchläuft, stellen diese fehlenden Prozesse
wichtige Meilensteine dar, die bei der JA-Signalübertragung einen Kompromiss zwischen
Wachstum und Verteidigung vermitteln könnten. Dies bestätigt die Idee, dass sich Karnivorie
durch die Wiederverwertung bereits vorhandener Signalwege und -komponenten entwickelt
hat.

Um den Defekt der Mutante im Fallenschnappmechanismus besser zu verstehen, wurden die
Grundzustände (unstimulierte Fallen) der beiden Phänotypen verglichen. In diesem Fall waren
viele zellwandbezogene Gene (z. B. Expansine) in der "ERROR"-Mutante herunterreguliert.
Diese Daten weisen zum ersten Mal auf die Bedeutung einer speziellen Zellwandarchitektur
der Falle hin, die möglicherweise die mechanischen Eigenschaften für ein Umklappen der
Fallenhälften verleiht, was wiederum die Geschwindigkeit des Fallenschlusses erhöht.

Diese Studie liefert Kandidatenkanäle für jede der AP-Phasen, die das scharfe
Venusfliegenfallen-spezifische AP hervorbringen und formen. Sie unterstreicht außerdem den
möglichen Beitrag der Zellwandarchitektur zur metastabilen, schnappbereiten Konfiguration
der Falle vor der Stimulation - die für das durch das Umklappen der Fallenhälften bedingte
Zuschnappen der Falle entscheidend sein könnte. Und schließlich werden molekulare
Meilensteine hervorgehoben, die mit Abwehrreaktionen verbunden sind und dafür sorgen,
dass sich die Falle nach mechanischer Stimulation in einen grünen Magen verwandelt.
Insgesamt erweisen sich diese Prozesse als voneinander abhängig und wesentlich für eine
erfolgreiche fleischfressende Lebens-weise.
KW  - carnivorous plants
KW  - action potential
KW  - trap closure
KW  - jasmonic acid
KW  - mechanosensation
KW  - touch
KW  - molecular pathways
KW  - wounding
KW  - defence mechanisms
KW  - transcriptomics
KW  - Venusfliegenfalle
KW  - Dionaea muscipula
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287649
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kumar, Manish
T1  - Structural and compositional effects on tree-water relation
T1  - Strukturelle und Zusammenseztungseffekte auf die Beziehung zwischen Baum und Wasser
N2  - Forests are essential sources of tangible and intangible benefits, but global climate change associated with recurrent extreme drought episodes severely affects forest productivity due to extensive tree die-back. On that, it appeals to an urgency for large-scale reforestation efforts to mitigate the impact of climate change worldwide; however, there is a lack of understanding of drought-effect on sapling growth and survival mechanisms. It is also challenging to anticipate how long trees can survive and when they succumb to drought. Hence, to ensure success of reforestation programs and sustainable forest productivity, it is essential to identify drought-resistant saplings. For that, profound knowledge of hydraulic characteristics is needed. To achieve this, the study was split into two phases which seek to address (1) how the hydraulic and anatomical traits influence the sapling’s growth rate under drought stress. (2) how plant water potential regulation and physiological traits are linked to species’ water use strategies and their drought tolerance.
The dissertation is assembled of two study campaigns carried out on saplings at the Chair of Botany II, University of Würzburg, Germany. The first study involved three ecologically important temperate broadleaved tree species — saplings of 18-month (Acer pseudoplatanus, Betula pendula, and Sorbus aucuparia) — grown from seeds in contrasting conditions (inside a greenhouse and outside), with the latter being subjected to severe natural heat waves. In the second study, two additional temperate species (Fagus sylvatica and Tilia cordata) were added. The drying-out event was conducted using a randomised blocked design by monitoring plant water status in a climate-controlled chamber and a greenhouse.
In campaign I, I present the result based on analysed data of 82 plants of temperate deciduous species and address the juvenile growth rate trade-off with xylem safety-efficiency. Our results indicate biomass production varies considerably due to the contrasted growing environment. High hydraulic efficiency is necessary for increased biomass production, while safety-efficiency traits are decoupled and species-specific. Furthermore, productivity was linked considerably to xylem safety without revealing a well-defined pattern among species. Moreover, plasticity in traits differed between stressed and non-stressed plants. For example, safety-related characteristics were more static than efficiency-related traits, which had higher intra-specific variation. Moreover, we recorded anatomical and leaf traits adjustments in response to a stress condition, but consistency among species is lacking.
In campaign II, I combined different ways to estimate the degree of isohydry based on water potential regulation and connected the iso-anisohydric spectrum (i.e., hydroscape area, HSA) to hydraulic traits to elucidate actual plant performance during drought. We analysed plant water potential regulation (Ψpd and Ψmd) and stomatal conductance of 28-29 month saplings of five species. I used a linear mixed modelling approach that allowed to control individual variations to describe the water potential regulation and tested different conceptual definitions of isohydricity. The combined methods allowed us to estimate species' relative degree of isohydry. Further, we examined the traits coordination, including hydraulic safety margin, HSM; embolism resistance, P88; turgor loss, Ψtlp; stomata closure, Ps90; capacitance, C; cuticular conductance, gmin, to determine time to hydraulic failure (Thf). Thf is the cumulative effect of time to stomata closure (Tsc) and time after stomatal closure to catastrophic hydraulic failure (Tcrit).
Our results show the species' HSA matches their stomatal stringency, which confirms the relationship between stomatal response and leaf water potential decline. Species that close stomata at lower water potential notably had a larger HSA. Isohydric behaviour was mostly associated with leaf hydraulic traits and poorly to xylem safety traits. Species' degree of isohydry was also unrelated to the species' time to death during drying-out experiments. This supports the notion that isohydry behaviours are linked to water use rather than drought survival strategies. Further, consistent with our assumptions, more isohydric species had larger internal water storage and lost their leaf turgor at less negative water potentials. Counter to our expectations, neither embolism resistance nor the associated hydraulic safety margins were related to metrics of isohydry. Instead, our results indicate traits associated with plant drought response to cluster along two largely independent axes of variation (i.e., stomatal stringency and xylem safety). Furthermore, on the temporal progression of plant drought responses, stomatal closure is critical in coordinating various traits to determine species' hydraulic strategies. Desiccation avoidance strategy was linked to Tsc and coordinated traits response of Ps90, Ψtlp, and HSA, whereas desiccation tolerance was related to Tcrit and traits such as lower P88 value, high HSM, and lower gmin. Notably, the shoot capacitance (C) is crucial in Thf and exhibits dichotomous behaviour linked to both Tsc and Tcrit. 
In conclusion, knowledge of growth rate trade-offs with xylem safety-efficiency combined with traits linked to species’ hydraulic strategies along the isohydry could substantially enhance our ability to identify drought-resistant saplings to ensure the success of reforestation programs and predicting sensitivity to drought for achieving sustainable forest ecosystems.
N2  - Wälder sind wichtige Quellen materieller und immaterieller Vorteile, aber der globale Klimawandel, der mit wiederkehrenden extremen Dürreperioden einhergeht, beeinträchtigt die Produktivität der Wälder aufgrund des starken Absterbens von Bäumen erheblich. Deshalb werden dringend groß angelegte Aufforstungsmaßnahmen gefordert, um die Auswirkungen des Klimawandels weltweit abzumildern. Allerdings fehlt es an Kenntnissen über die Auswirkungen von Dürre auf das Wachstum und die Überlebensmechanismen von Jungbäumen. Es ist auch schwierig, vorherzusehen, wie lange Bäume überleben können und wann sie der Trockenheit erliegen. Um den Erfolg von Wiederaufforstungsprogrammen und die nachhaltige Produktivität der Wälder zu gewährleisten, ist es daher unerlässlich, trockenheitsresistente Setzlinge zu identifizieren. Dazu ist eine profunde Kenntnis der hydraulischen Eigenschaften erforderlich. Um dies zu erreichen, wurde die Studie in zwei Phasen aufgeteilt, in denen untersucht werden soll, (1) wie die hydraulischen und anatomischen Merkmale die Wachstumsrate der Setzlinge unter Trockenstress beeinflussen. (2) wie die Regulierung des pflanzlichen Wasserpotenzials und die physiologischen Merkmale mit den Wassernutzungsstrategien der Arten und ihrer Trockentoleranz zusammenhängen. 
Die Dissertation setzt sich aus zwei Studienkampagnen zusammen, die am Lehrstuhl für Botanik II der Universität Würzburg an Setzlingen durchgeführt wurden. In der ersten Studie wurden drei ökologisch wichtige Laubbaumarten der gemäßigten Zonen - 18-monatige Setzlinge (Acer pseudoplatanus, Betula pendula und Sorbus aucuparia) - aus Samen unter unterschiedlichen Bedingungen (in einem Gewächshaus und im Freien) aufgezogen, wobei letztere schweren natürlichen Hitzewellen ausgesetzt waren. In der zweiten Studie wurden zwei weitere gemäßigte Arten (Fagus sylvatica und Tilia cordata) hinzugefügt. Der Austrocknungsversuch wurde in einem randomisierten Blockdesign durchgeführt, bei dem der Wasserhaushalt der Pflanzen in einer klimatisierten Kammer und einem Gewächshaus überwacht wurde.
In Kampagne I präsentiere ich die Ergebnisse, die auf den analysierten Daten von 82 Pflanzen gemäßigter Laubbaumarten basieren, und gehe auf den Kompromiss zwischen der Wachstumsrate von Jungpflanzen und der Sicherheitseffizienz des Xylems ein. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Biomasseproduktion aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen stark variiert. Eine hohe hydraulische Effizienz ist für eine erhöhte Biomasseproduktion notwendig, während die Sicherheitseffizienz entkoppelt und artspezifisch ist. Darüber hinaus war die Produktivität in erheblichem Maße mit der Xylemsicherheit verknüpft, ohne dass sich ein klar definiertes Muster zwischen den Arten ergab. Darüber hinaus war die Plastizität der Merkmale zwischen gestressten und nicht gestressten Pflanzen unterschiedlich. So waren beispielsweise sicherheitsbezogene Merkmale statischer als effizienzbezogene Merkmale, die eine stärkere intra-spezifische Variation aufwiesen. Darüber hinaus haben wir Anpassungen der anatomischen Merkmale und der Blatteigenschaften als Reaktion auf eine Stressbedingung festgestellt, aber es fehlt die Konsistenz zwischen den Arten.
In Kampagne II kombinierte ich verschiedene Methoden zur Schätzung des Isohydrierungsgrads auf der Grundlage der Wasserpotenzialregulierung und verknüpfte das iso-anisohydrische Spektrum (d. h. die Hydroscape-Fläche, HSA) mit hydraulischen Merkmalen, um die tatsächliche Leistung der Pflanzen bei Trockenheit zu ermitteln. Wir analysierten die Regulierung des pflanzlichen Wasserpotenzials (Ψpd und Ψmd) und die stomatäre Leitfähigkeit von 28-29 Monate alten Setzlingen von fünf Arten. Ich verwendete einen linearen gemischten Modellierungsansatz, der die Kontrolle individueller Variationen zur Beschreibung der Wasserpotenzialregulierung ermöglichte, und testete verschiedene konzeptionelle Definitionen der Isohydrizität. Die kombinierten Methoden ermöglichten es uns, den relativen Grad der Isohydrizität der Arten zu schätzen. Darüber hinaus untersuchten wir die Koordination der Merkmale, einschließlich der hydraulischen Sicherheitsspanne (HSM), des Embolieresistenz (P88), des Turgorverlustes (Ψtlp), des Spaltöffnungsgrades (Ps90), der Kapazität (C) und des kutikulären Leitwertes (gmin), um die Zeit bis zum hydraulischen Versagen (Thf) zu bestimmen. Thf ist der kumulative Effekt der Zeit bis zum Schließen der Spaltöffnungen (Tsc) und der Zeit nach dem Schließen der Spaltöffnungen bis zum katastrophalen hydraulischen Versagen (Tcrit).
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die HSA der Arten mit ihrer Spaltöffnungsintensität übereinstimmt, was die Beziehung zwischen der Spaltöffnungsreaktion und dem Rückgang des Wasserpotenzials der Blätter bestätigt. Arten, die ihre Spaltöffnungen bei einem niedrigeren Wasserpotenzial schließen, hatten einen deutlich größeren HSA. Das isohydrische Verhalten stand hauptsächlich mit den hydraulischen Eigenschaften der Blätter in Verbindung und kaum mit den Sicherheitsmerkmalen des Xylems. Der Grad der Isohydrierung der Arten stand auch in keinem Zusammenhang mit der Zeit bis zum Absterben der Arten während der Austrocknungsversuche. Dies unterstützt die Annahme, dass das Isohydrie-Verhalten eher mit der Wassernutzung als mit Überlebensstrategien bei Trockenheit zusammenhängt. Darüber hinaus wiesen isohydrische Arten, wie von uns angenommen, einen größeren internen Wasserspeicher auf und verloren ihren Blattturgor bei weniger negativen Wasserpotentialen. Entgegen unseren Erwartungen standen weder die Embolieresistenz noch die damit verbundenen hydraulischen Sicherheitsspannen in Zusammenhang mit Isohydratisierungsmerkmalen. Stattdessen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass sich die Merkmale, die mit der Reaktion der Pflanzen auf Trockenheit in Verbindung stehen, entlang zweier weitgehend unabhängiger Variationsachsen (d. h. stomatäre Strenge und Xylem-Sicherheit) gruppieren. Was den zeitlichen Verlauf der pflanzlichen Reaktionen auf Trockenheit betrifft, so ist der Stomataverschluss für die Koordinierung der verschiedenen Merkmale entscheidend, um die hydraulischen Strategien der Arten zu bestimmen. Die Strategie zur Vermeidung von Austrocknung war mit Tsc und koordinierten Merkmalen wie Ps90, Ψtlp und HSA verbunden, während die Austrocknungstoleranz mit Tcrit und Merkmalen wie einem niedrigeren P88-Wert, einem hohen HSM und einem niedrigeren gmin zusammenhing. Insbesondere die Sprosskapazität (C) ist für Thf entscheidend und zeigt ein dichotomes Verhalten, das sowohl mit Tsc als auch mit Tcrit zusammenhängt. 
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Wissen um die Wechselwirkungen zwischen der Wachstumsrate und der Sicherheitseffizienz des Xylems in Verbindung mit Merkmalen, die mit den hydraulischen Strategien der Arten entlang der Isohydrie zusammenhängen, unsere Fähigkeit, trockenheitsresistente Setzlinge zu identifizieren, erheblich verbessern könnte, um den Erfolg von Aufforstungsprogrammen zu gewährleisten und die Empfindlichkeit gegenüber Trockenheit vorherzusagen, um nachhaltige Waldökosysteme zu erreichen.
KW  - Wachstumsrate
KW  - hydraulic efficiency
KW  - phenotypic plasticity
KW  - growth rate
KW  - safety-efficiency trade-off
KW  - vulnerability curve
KW  - stomatal closure
KW  - desiccation time
KW  - hydroscape
KW  - cuticular conductance
KW  - shoot capacitance
KW  - Baum
KW  - Wasser
KW  - hydraulische Effizienz
KW  - Verwundbarkeitskurve
KW  - Stomatenverschluss
KW  - Hydroscape-Gebiet
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326245
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kreisz, Philipp
T1  - Group S1 bZIP transcription factors regulate sink tissue development by controlling carbon and nitrogen resource allocation in \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
T1  - Gruppe S1 bZIP Transkriptionsfaktoren regulieren die Entwicklung von sink-Geweben durch Kontrolle der Verteilung von Kohlen- und Stickstoff Ressourcen in \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
N2  - The evolutionary success of higher plants is largely attributed to their tremendous developmental 
plasticity, which allows them to cope with adverse conditions. However, because these adaptations 
require investments of resources, they must be tightly regulated to avoid unfavourable trade-offs.
Most of the resources required are macronutrients based on carbon and nitrogen. Limitations in the 
availability of these nutrients have major effects on gene expression, metabolism, and overall plant 
morphology. These changes are largely mediated by the highly conserved master kinase SNF1-RELATED 
PROTEIN KINASE1 (SnRK1), which represses growth and induces catabolic processes. Downstream of 
SnRK1, a hub of heterodimerising group C and S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) transcription factors has 
been identified. These bZIPs act as regulators of nutrient homeostasis and are highly expressed in 
strong sink tissues, such as flowers or the meristems that initiate lateral growth of both shoots and 
roots. However, their potential involvement in controlling developmental responses through their 
impact on resource allocation and usage has been largely neglected so far. Therefore, the objective of 
this work was to elucidate the impact of particularly S1 bZIPs on gene expression, metabolism, and 
plant development.
Due to the high homology and suspected partial redundancy of S1 bZIPs, higher order loss-of-function
mutants were generated using CRISPR-Cas9. The triple mutant bzip2/11/44 showed a variety of robust 
morphological changes but maintained an overall growth comparable to wildtype plants. In detail 
however, seedlings exhibited a strong reduction in primary root length. In addition, floral transition 
was delayed, and siliques and seeds were smaller, indicating a reduced supply of resources to the shoot 
and root apices. However, lateral root density and axillary shoot branching were increased, suggesting
an increased ratio of lateral to apical growth in the mutant. The full group S1 knockout 
bzip1/2/11/44/53 showed similar phenotypes, albeit far more pronounced and accompanied by 
growth retardation. Metabolomic approaches revealed that these architectural changes were
accompanied by reduced sugar levels in distal sink tissues such as flowers and roots. Sugar levels were 
also diminished in leaf apoplasts, indicating that long distance transport of sugars by apoplastic phloem 
loading was impaired in the mutants. In contrast, an increased sugar supply to the proximal axillary 
buds and elevated starch levels in the leaves were measured. In addition, free amino acid levels were 
increased in bzip2/11/44 and bzip1/2/11/44/53, especially for the important transport forms 
asparagine and glutamine. The increased C and N availability in the proximal tissues could be the cause 
of the increased axillary branching in the mutants.
To identify bZIP target genes that might cause the observed shifts in metabolic status, RNAseq
experiments were performed. Strikingly, clade III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) 
8
genes were abundant among the differentially expressed genes. As SWEETs are crucial for sugar export 
to the apoplast and long-distance transport through the phloem, their reduced expression is likely to 
be the cause of the observed changes in sugar allocation. Similarly, the reduced expression of 
GLUTAMINE AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), which exhibits glutaminase activity, could be an 
explanation for the abundance of glutamine in the mutants. Additional experiments (ATAC-seq, DAP� seq, PTA, q-RT-PCR) supported the direct induction of SWEETs and GAT1_2.1 by S1 bZIPs. To confirm 
the involvement of these target genes in the observed S1 bZIP mutant phenotypes, loss-of-function 
mutants were obtained, which showed moderately increased axillary branching. At the same time, the 
induced overexpression of bZIP11 in axillary meristems had the opposite effect. 
Collectively, a model is proposed for the function of S1 bZIPs in regulating sink tissue development. For 
efficient long-distance sugar transport, bZIPs may be required to induce the expression of clade III 
SWEETs. Thus, reduced SWEET expression in the S1 bZIP mutants would lead to a decrease in apoplastic 
sugar loading and a reduced supply to distal sinks such as shoot or root apices. The reduction in long� distance transport could lead to sugar accumulation in the leaves, which would then increasingly be
transported via symplastic routes towards proximal sinks such as axillary branches and lateral roots or
sequestered as starch. The reduced GAT1_2.1 levels lead to an abundance of glutamine, a major 
nitrogen transport form. The combined effect on C and N allocation results in increased nutrient 
availability in proximal tissues, promoting the formation of lateral plant organs. Alongside emerging 
evidence highlighting the power of bZIPs to steer nutrient allocation in other species, a novel but
evolutionary conserved role for S1 bZIPs as regulators of developmental plasticity is proposed, while
the generation of valuable data sets and novel genetic resources will help to gain a deeper 
understanding of the molecular mechanisms involved
N2  - Der evolutionäre Erfolg höherer Pflanzen wird weitgehend auf ihre enorme Entwicklungsplastizität 
zurückgeführt, die es ihnen ermöglicht, widrigen Bedingungen zu trotzen. Da diese Anpassungen 
jedoch einen immensen Ressourceneinsatz erfordern, müssen sie streng reguliert werden, um 
unvorteilhafte Reaktionen zu vermeiden. Den Großteil der benötigten Ressourcen machen 
Makronährstoffe auf der Basis von Kohlenstoff und Stickstoff aus. Eine eingeschränkte Verfügbarkeit 
dieser Nährstoffe hat erhebliche Auswirkungen auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die 
Morphologie der Pflanzen. Diese Veränderungen werden größtenteils durch die hochkonservierte 
Kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) vermittelt, die das Wachstum unterdrückt und 
katabole Prozesse einleitet. Downstream von SnRK1 wurde ein Netzwerk von heterodimerisierenden 
Transkriptionsfaktoren der Gruppe C und S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) identifiziert. Diese bZIPs 
wirken als Regulatoren der Nährstoffhomöostase und werden vor allem in starken sink-Geweben wie 
Blüten oder den Meristemen, die das Seitenwachstum von Sprossen und Wurzeln ermöglichen, 
exprimiert. Ihre potenzielle Beteiligung an der Steuerung von Entwicklungsreaktionen durch ihren 
Einfluss auf die Ressourcenzuteilung und -nutzung wurde bisher jedoch weitgehend vernachlässigt. 
Ziel dieser Arbeit war es daher, die Auswirkungen insbesondere von S1 bZIPs auf die Genexpression, 
den Stoffwechsel und die Pflanzenentwicklung zu erforschen.
Aufgrund der hohen Homologie und der vermuteten teilweisen Redundanz der S1 bZIPs wurden 
mithilfe von CRISPR-Cas9 loss-of-function Mutanten höherer Ordnung erzeugt. Die Dreifachmutante 
bzip2/11/44 zeigte eine Vielzahl robuster morphologischer Veränderungen, behielt aber insgesamt ein 
mit Wildtyp-Pflanzen vergleichbares Wachstum bei. Im Detail jedoch wiesen die Keimlinge eine starke 
Verringerung der Primärwurzellänge auf. Darüber hinaus verzögerte sich der Blühzeitpunkt, und die 
Schoten und Samen waren kleiner, was auf eine geringere Versorgung der Spross- und Wurzelspitzen 
mit Ressourcen hinweist. Die Dichte der Seitenwurzeln und die axilläre Verzweigung des Sprosses 
waren jedoch erhöht, was auf ein erhöhtes Verhältnis von lateralem zu apikalem Wachstum in der 
Mutante hindeutet. Die Knockout-Mutante bzip1/2/11/44/53 zeigte ähnliche Phänotypen, wenn auch 
weitaus ausgeprägter und begleitet von Wachstumsverzögerungen. Metabolische Untersuchungen 
ergaben, dass diese Veränderungen in der Architektur mit reduzierten Zuckerspiegeln in distalen sink� Geweben wie Blüten und Wurzeln einhergingen. Die Zuckerspiegel waren auch in den Apoplasten der 
Blätter vermindert, was darauf hindeutet, dass der Ferntransport von Zucker durch apoplastische 
Phloembeladung in den Mutanten beeinträchtigt war. Im Gegensatz dazu wurden eine erhöhte 
Zuckerzufuhr zu den proximalen Achselknospen und erhöhte Stärkekonzentrationen in den Blättern 
gemessen. Zusätzlich war die Konzentration freier Aminosäuren in bzip2/11/44 und bzip1/2/11/44/53
10
erhöht, insbesondere für die wichtigen Transportformen Asparagin und Glutamin. Die erhöhte C- und 
N-Verfügbarkeit in den proximalen Geweben könnte die Ursache für die verstärkte axilläre 
Verzweigung in den Mutanten sein.
Um bZIP-Zielgene zu identifizieren, die die beobachteten Verschiebungen im Stoffwechselstatus 
verursachen könnten, wurden RNAseq-Experimente durchgeführt. Auffallend ist, dass die Gene der 
Gruppe III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) unter den unterschiedlich exprimierten 
Genen sehr häufig vorkamen. Da SWEETs für den Zuckerexport in den Apoplasten und den 
Langstreckentransport durch das Phloem von entscheidender Bedeutung sind, ist ihre verringerte 
Expression wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Veränderungen in der Zuckerallokation. 
Ebenso könnte die verringerte Expression von GLUTAMIN AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), die 
Glutaminase-Aktivität aufweist, eine Erklärung für die Häufigkeit von Glutamin in den Mutanten sein. 
Zusätzliche Experimente (ATAC-seq, DAP-seq, PTA, q-RT-PCR) bestätigten die direkte Induktion von 
SWEETs und GAT1_2.1 durch S1 bZIPs. Um die Beteiligung dieser Zielgene an den in den S1 bZIP� Mutanten beobachteten Phänotypen zu bestätigen, wurden loss-of-function-Mutanten untersucht, 
die eine mäßig erhöhte axilläre Verzweigung aufwiesen. Gleichzeitig hatte die induzierte 
Überexpression von bZIP11 in axillären Meristemen den gegenteiligen Effekt. 
Auf Basis dieser Ergebnisse wird ein Modell für die Funktion von S1 bZIPs bei der Regulierung der 
Entwicklung von sink-Geweben vorgeschlagen. Für einen effizienten Zuckertransport über große 
Entfernungen könnten bZIPs erforderlich sein, um die Expression von SWEETs der Gruppe III zu 
induzieren. Eine verringerte SWEET-Expression in den S1 bZIP-Mutanten würde zu einem Rückgang der 
apoplastischen Zuckerbeladung und einer verringerten Versorgung von distalen sink-Geweben wie den 
Spross- oder Wurzelspitzen führen. Die Verringerung des Ferntransports könnte zu einer Anhäufung 
von Zucker in den Blättern führen, der dann verstärkt über symplastische Wege zu proximalen sink� Geweben wie den axillären Meristem und Seitenwurzeln transportiert oder als Stärke gespeichert
wird. Die verringerte GAT1_2.1 Expression führt zu einem Überfluss an Glutamin, einer wichtigen 
Stickstofftransportform. Die kombinierte Wirkung auf die C- und N-Allokation führt zu einer erhöhten 
Nährstoffverfügbarkeit in den proximalen Geweben und fördert die Bildung von seitlichen 
Pflanzenorganen. Neben neuen Erkenntnissen, die die Wirksamkeit von bZIPs bei der Steuerung der 
Nährstoffallokation in anderen Arten unterstreichen, wird eine neuartige, jedoch evolutionär 
konservierte Rolle für S1 bZIPs als Regulatoren der Entwicklungsplastizität vorgeschlagen, während die 
Generierung wertvoller Datensätze und neuer genetischer Ressourcen dazu beitragen wird, ein 
tieferes Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen zu gewinnen.
KW  - Molekularbiologie
KW  - Sugar allocation
KW  - Nitrogen allocation
KW  - Basic leucine zipper
KW  - Developmental plasticity
KW  - CRISPR Cas9
KW  - Ackerschmalwand
KW  - CRISPR/Cas-Methode
KW  - Arabidopsis thaliana
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321925
ER  - 
TY  - THES
A1  - Huang, Shouguang
T1  - Role of ABA-induced Ca\(^{2+}\) signals, and the Ca\(^{2+}\)-controlled protein kinase CIPK23, in regulation of stomatal movements
T1  - Rolle von ABA-abhängigen Ca\(^{2+}\) Signalen, und der Ca\(^{2+}\)-gesteuerten Proteinkinase CIPK23, bei der Regulation der Spaltöffnungsbewegungen
N2  - Stomata are pores in the leaf surface, formed by pairs of guard cells. The guard cells modulate the aperture of stomata, to balance uptake of CO2 and loss of water vapor to the atmosphere. During drought, the phytohormone abscisic acid (ABA) provokes stomatal closure, via a signaling chain with both Ca2+-dependent and Ca2+-independent branches. Both branches are likely to activate SLAC1-type (Slow Anion Channel Associated 1) anion channels that are essential for initiating the closure of stomata. However, the importance of the Ca2+-dependent signaling branch is still debated, as the core ABA signaling pathway only possesses Ca2+-independent components. Therefore, the aim of this thesis was to address the role of the Ca2+-dependent branch in the ABA signaling pathway of guard cells.
In the first part of the thesis, the relation between ABA-induced Ca2+ signals and stomatal closure was studied, with guard cells that express the genetically encoded Ca2+-indicator R-GECO1-mTurquoise. Ejection of ABA into the guard cell wall rapidly induced stomatal closure, however, only in ¾ of the guard cells ABA evoked a cytosolic Ca2+ signal. A small subset of stomata (¼ of the experiments) closed without Ca2+ signals, showing that the Ca2+ signals are not essential for ABA-induced stomatal closure. However, stomata in which ABA evoked Ca2+ signals closed faster as those in which no Ca2+ signals were detected. Apparently, ABA-induced Ca2+ signals enhance the velocity of stomatal closure. In addition to ABA, hyperpolarizing voltage pulses could also trigger Ca2+ signals in wild type guard cells, which in turn activated S-type anion channels. However, these voltage pulses failed to elicit S-type anion currents in the slac1/slah3 guard cells, suggesting that SLAC1 and SLAH3 contribute to Ca2+-activated conductance. Taken together, our data indicate that ABA-induced Ca2+ signals enhance the activity of S-type anion channels, which accelerates stomatal closure.
The second part of the thesis deals with the signaling pathway downstream of the Ca2+ signals. Two types of Ca2+-dependent protein kinase modules (CPKs and CBL/CIPKs) have been implicated in guard cells. We focused on the protein kinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23), which is activated by the Ca2+-dependent protein CBL1 or 9 (Calcineurin B-Like protein 1 or 9) via interacting with the NAF domain of CIPK23. The CBL1/9-CIPK23 complex has been shown to affect stomatal movements, but the underlying molecular mechanisms remain largely unknown. We addressed this topic by using an estrogen-induced expression system, which specifically enhances the expression of wild type CIPK23, a phosphomimic CIPK23T190D and a kinase dead CIPK23K60N in guard cells. Our data show that guard cells expressing CIPK23T190D promoted stomatal opening, while CIPK23K60N enhanced ABA-induced stomatal closure, suggesting that CIPK23 is a negative regulator of stomatal closure. Electrophysiological measurements revealed that the inward K+ channel currents were similar in guard cells that expressed CIPK23, CIPK23T190D or CIPK23K60N, indicating that CIPK23-mediated inward K+ channel AKT1 does not contribute to stomatal movements. Expression of CIPK23K60N, or loss of CIPK23 in guard cells enhanced S-type anion activity, while the active CIPK23T190D inhibited the activity of these anion channels. These results are in line with the detected changes in stomatal movements and thus indicate that CIPK23 regulates stomatal movements by inhibiting S-type anion channels. CIPK23 thus serves as a brake to control anion channel activity. Overall, our findings demonstrate that CIPK23-mediated stomatal movements do not depend on CIPK23-AKT1 module, instead, it is achieved by regulating S-type anion channels SLAC1 and SLAH3.
In sum, the data presented in this thesis give new insights into the Ca2+-dependent branch of ABA signaling, which may help to put forward new strategies to breed plants with enhanced drought stress tolerance, and in turn boost agricultural productivity in the future.
N2  - Stomata sind Poren in der Blattoberfläche, die von einem Paar von Schließzellen gebildet werden. Die Schließzellen kontrollieren den Öffnungsweite der stomatären Pore, um die Aufnahme von CO2 und den Verlust von Wasserdampf in die Atmosphäre auszubalancieren. Während Trockenperioden bewirkt das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) einen Stomaschluss über eine Signalkaskade, welche über Ca2+-abhängige und Ca2+-unabhängige Pfade verfügt. Beide Pfade aktivieren wahrscheinlich Anionenkanäle aus der SLAC1 Familie (Slow Anion Channel Associated 1), welche essentiell sind um den Stomaschluss einzuleiten. Allerdings wird über die Wichtigkeit des Ca2+-abhängigen Pfades noch immer diskutiert, da der ABA-Hauptsignalweg ausschließlich Ca2+-unabhängige Komponenten beinhaltet. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Thesis, die Rolle des Ca2+-abhängigen Pfades im ABA-Signalweg aufzulösen.
Im ersten Teil der Thesis wurde mit Schließzellen, die den genetisch kodierten Ca2+-Sensor R-GECO1-mTurquoise exprimierten, der Zusammenhang zwischen ABA-induzierten Ca2+ Signalen und dem Stomaschluss untersucht. Die Injektion von ABA in die Zellwand von Schließzellen bewirkte einen schnellen Stomaschluss, jedoch wurde nur bei drei Vierteln der Zellen auch ein zytosolisches Ca2+ Signal erzeugt. Ein kleiner Teil der Stomata (in einem Viertel der Experimente) schloss sich ohne Ca2+ Signal, was zeigt, dass die Ca2+ Signale nicht essentiell für den ABA-induzierten Stomaschluss sind. Es schlossen sich jedoch Stomata schneller, in deren Schließzellen ABA-induzierte Ca2+ Signale detektiert wurden. ABA-induzierte Ca2+-Signale verbesserten also offenbar die Geschwindigkeit des Stomaschlusses. Neben ABA konnten Ca2+ Signale in wildtypischen Schließzellen auch durch hyperpolarisierende Spannungspulse erzeugt werden, welche daraufhin S-Typ Anionenkanäle aktivierten. Diese Spannungspulse konnten jedoch in slac1/slah3 Schließzellen keine S-typischen Anionenströme hervorrufen, was darauf hindeutet, dass SLAC1 und SLAH3 zur Ca2+-aktivierten Leitfähigkeit beitragen. Zusammengefasst deuten unsere Daten darauf hin, dass ABA-induzierte Ca2+ Signale die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen verbessern und somit den Stomaschluss beschleunigen.
Der zweite Teil der Thesis befasst sich mit dem Signalweg, der den Ca2+-Signalen nachgeschaltet ist. Es wurden zwei Typen Ca2+-abhängiger Proteinkinase-Module (CPKs und CBL/CIPKs) in Schließzellen nachgewiesen. Wir haben uns auf die Proteinkinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23) konzentriert, welche von den Ca2+-abhängigen Proteinen CBL1 und CBL9 (Calcineurin B-Like Protein 1 oder 9) über Interaktion mit der NAF Domäne des CIPK23 aktiviert wird. Es konnte bereits gezeigt werden, dass der CBL1/CIPK23 Komplex die stomatäre Bewegung beinflusst, jedoch sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bisher weitgehend unbekannt geblieben. Wir haben dieses Thema mit einem Östrogen-induzierten Expressionssystem untersucht, welches spezifisch in Schließzellen die Expression von wildtypischem CIPK23 erhöhte. Hinzu kamen Experimente mit einer phosphomimetischen CIPK23T190D und einer CIPK23K60N mit disfunktionaler Kinasedomäne. Unsere Daten zeigen, dass CIPK23T190D exprimierende Schließzellen eine verbesserte Stomaöffnung aufwiesen, während CIPK23K60N den ABA-induzierten Stomaschluss förderte, was auf eine negativ regulierende Rolle von CIPK23 beim Stomaschluss hindeutet. Elektrophysiologische Messungen zeigten, dass die einwärtsgerichteten K+-Ströme in CIPK23-, CIPK23T190D- oder CIPK23K60N-exprimierenden Schließzellen vergleichbar waren, was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von AKT1 durch CIPK23 nicht zur stomatären Bewegung beiträgt. Allerdings führte die Expression von CIPK23K60N, wie auch der Verlust von CIPK23, in Schließzellen zu einer erhöhten S-typischen Anionenkanalaktivität, während eine CIPK23T190D-Expression diese Anionenkanalaktivität inhibierte. Diese Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen zu den gezeigten Veränderungen der stomatären Bewegung überein und deuten daher auf eine regulierende Rolle von CIPK23 für die stomatäre Bewegung durch die Inhibierung von S-Typ Anionenkanälen hin. Insgesamt beweisen unsere Befunde, dass die CIPK23-vermittelte stomatäre Bewegung nicht durch eine Interaktion von CIP23 mit AKT1, sondern durch die Regulierung der S-Typ Anionenkanäle SLAC1 und SLAH3 vermittelt wird.
Zusammengefasst ergeben die in dieser Thesis präsentierten Daten neue Einblicke in den Ca2+-abhängigen Pfad des ABA-Signalwegs. Dies könnte in Zukunft helfen neue Strategien zur Zucht von Pflanzen mit verbesserter Trockenstresstoleranz zu entwickeln und somit die agrarwirtschaftliche Produktivität zu erhöhen.
KW  - Stomata
KW  - guard cells
KW  - ABA
KW  - OST1
KW  - SLAC1
KW  - anion channels
KW  - Ca2+ signal
KW  - CIPK23
KW  - AKT1
KW  - K+ channels
KW  - drought stress
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204737
ER  - 
TY  - THES
A1  - Li, Kunkun
T1  - Dissecting the interconnection of Ca\(^{2+}\) and pH signaling in plants with a novel biosensor for dual imaging
T1  - Untersuchung der Verknüpfung von Ca\(^{2+}\) und pH-Signalen in Pflanzen mit einem neuartigen Biosensor für duale Bildgebung
N2  - Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology.
N2  - Kalziumionen (Ca2+) und Protonen (H+) werden beide als Botenstoffe angesehen, die am Pflanzenwachstum und an Mechanismen zur Stressbewältigung beteiligt sind. In der Pflanzenphysiologie sind H+-Signale jedoch im Vergleich zu Ca2+-Signalen weniger gut untersucht. Die Frage, ob zwischen diesen beiden Botenstoffen Zusammenhänge bestehen, muss noch geklärt werden, da geeignete bildgebende Verfahren zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Ca2+ und H+ Signalen sowie eine genaue bioinformatische Analyse noch entwickelt werden müssen. Um dieses Problem zu überwinden und die Rolle und möglichen Zusammenhang von Ca2+ und H+ Signalen in Pflanzen zu entschlüsseln, wurde ein neuer Biosensor namens CapHensor entwickelt und optimiert, um intrazelluläre Ca2+- und H+-Veränderungen gleichzeitig und ratiometrisch zu untersuchen. Der CapHensor bestand aus einem optimierten grün fluoreszierenden pH-Sensor (PRpHluorin) und einem etablierten rot fluoreszierenden Ca2+-Sensor (R-GECO1), die über eine P2A-Sequenz in einem Konstrukt kombiniert wurden. Eine sogenannte P2A-„self-cleavage site“ zwischen den beiden Sensoren ermöglichte die Expression gleicher Mengen, aber räumlich getrennter Sensoren, was eine artefaktfreie und ratiometrische Darstellung von zellulärem Ca2+ und pH nebeneinander ermöglichte. Die Funktion des CapHensors wurde in Pollenschläuchen verifiziert, da diese einen ständigen Ca2+- und pH-Gradienten aufweisen. Wir stellten fest, dass die Qualität der Bildaufnahmen und das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Bildgebung in lebenden Zellen verbessert wurden, wenn zwei R-GECO1-Proteine innerhalb des CapHensor-Konstrukts translational fusioniert wurden. Um eine ausschließliche zytosolische Lokalisierung zu gewährleisten und gemischte Signale aus verschiedenen Kompartimenten zu vermeiden, wurden sogenannte „Nuclear Export Sequence“ (NES) und die „Nuclear Localization Sequence“ (NLS) verwendet, um PRpHluorin und R-GECO1 in unterschiedlichen Kompartimente zu lokalisieren. Nach der Optimierung und Überprüfung seiner Funktionsweise wurde CapHensor erfolgreich in verschiedenen Zelltypen exprimiert, um die Rolle von Ca2+- und H+-Signalen bei der Kontrolle des polaren Wachstums von Pollenschläuchen, die Stomabewegung oder Abwehrmechanismen der Blätter zu untersuchen. Die in der Vergangenheit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl der Ca2+-Gradient als auch der pH-Gradient in Pollenschläuchen eine Rolle beim polaren Wachstum spielen, wobei dem Ca2+-Gradient zum Teil die Hauptrolle zugesprochen wird. Die Rolle und die zeitlicheVI Beziehung zwischen dem Wachstumsprozess und den Veränderungen von Ca2+ und pH sind jedoch noch nicht abschließend geklärt. Mit Hilfe von CapHensor fand ich heraus, dass eine zytosolische Ansäuerung an der Spitze die Wachstumsgeschwindigkeit in N. tabacumPollenschläuchen fördern und eine Alkalisierung die Wachstumsgeschwindigkeit unterdrücken kann, was darauf hindeutet, dass die zytosolische H+-Konzentration ([H+]cyt) trotz der damit einhergehenden Veränderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]cyt) eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Pollenschläuchen spielt. Außerdem korrelierte das Wachstum viel besser mit dem [H+]cyt-Verlauf an der Spitze als mit dem Verlauf des [Ca2+]cytSignals. Überraschenderweise hinkten jedoch sowohl die [Ca2+]cyt- als auch die [H+]cytOszillationen an der Spitze den Wachstumsoszillationen um etwa 33 s bzw. 18 s hinterher, so dass die Rolle von [Ca2+]cyt an der Spitze für das Wachstum des Pollenschlauchs neu bewertet werden muss. Die CapHensor-Bildgebung an lebenden Zellen in Kombination mit Elektrophysiologie ergab, dass die oszillierende Membrandepolarisation besser mit den [H+]cyt-Oszillationen an der Spitze korrelierte als mit den [Ca2+]cyt-Oszillationen, was darauf hindeutet, dass [H+]cyt auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des elektrogenen Membrantransports spielt. Mit Hilfe des CapHensors und dem gleichzeitigen Auslesen der Zellbewegungen konnte eine präzise zeitliche und räumliche Auflösung der Ereignisse erzielt werden, was auf eine herausragende Rolle von [H+]cyt beim Wachstum der Pollenschlauchspitze hinweist. Für den Einsatz des CapHensors in Blattzellen musste ein spezielles CapHensor-Konstrukt entwickelt werden, das zusätzliche NES-Lokalisierungssequenzen enthielt, um eine Überlappung der Fluoreszenzsignale aus dem Zellkern und dem Zytosol zu vermeiden. Nachdem dies erreicht war, wurde die Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen in Schließzellen, einem gut beschriebenen Einzelzellsystem, untersucht. Veränderungen des zytosolischen pH-Werts wurden bei der Bewegung von Stomata in früheren Studien beschrieben, aber die physiologische Rolle dieser Veränderungen und die Interaktion mit sich verändernden Ca2+-Signalen waren noch unerforscht. Der Einsatz von CapHensor zusammen mit der von mir entwickelten Technik zur parallelen Erfassung der Stomatabewegung hat unser Verständnis der Rolle von Ca2+ und H+ bei der Stomatabewegung erheblich verbessert. Das Phytohormon ABA und der bakterielle Elicitor Flagellin (flg22) sind typische abiotische bzw. biotische Stressfaktoren, die das Schließen der Stomata auslösen. Welche Art von Ca2+- und H+-Signalen in den Schließzellen durch ABA und flg22 ausgelöst werden und in welchem zeitlichen Zusammenhang sie stehen und welche Rolle sieVII für die Bewegung der Stomata spielen, war bisher unbekannt. Bei der durch ABA und flg22 ausgelösten Schließung der Stomata wurde ein Anstieg von [Ca2+]cyt beobachtet, aber die Dynamik von [H+]cyt unterschied sich grundlegend und zeigte eine andere Dynamik. ABA löste eine ausgeprägte zytosolische Alkalisierung aus, die der [Ca2+]cyt-Antwort um 57 s deutlich vorausging, während die Spaltöffnungen erst ca. 205 s danach anfingen zu schliessen. Bei Flg22 ging das Schließen der Spaltöffnungen nur mit einer leichten zytosolischen Alkalisierung einher, aber die Ca2+-Reaktion war im Vergleich zur ABA-Reaktion viel ausgeprägter. Woher die zytosolische Alkalisierung stammt, war unklar, aber in der Vergangenheit wurde spekuliert, dass die Vakuole dazu beiträgt. In dieser Arbeit wurden vakuoläre pH-Änderungen mit Hilfe des Farbstoffs BCECF über die Zeit verfolgt, wobei die Konzentrationsverschiebung in der Vakuole im Grunde genommen genau den umgekehrten Verlauf aufwies als im Zytosol beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Dynamik des vakuolären pH-Wertes stark an die Änderungen des zytosolischen pHWertes gekoppelt ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bei der Signalgebung für das Schließen der Stomata eine wichtige Rolle spielen. Als ich jedoch definierte H2O2-Mengen auf die Zellen applizierte, führten nur unphysiologosch hohe H2O2-Konzentrationen (> 200 µM), die zu einem Verlust der Membranintegrität führten, zum Schließen der Stomata. Unerwarteterweise führten physiologische Konzentrationen von ROS zu einer Ansäuerung des Zytosols, die mit der Öffnung der Stomata, aber nicht mit der Schließung der Stomata in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von [H+]cyt bei der Steuerung der stomatären Bewegung im Detail zu untersuchen, wurden extrazelluläre und intrazelluläre pH-Änderungen in N. tabacumSchließzellen hervorgerufen um deren Verhalten bei pH-Änderungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine zytosolische Ansäuerung die Öffnung der Stomata stimuliert, während eine zytosolische Alkalisierung die Schließung der Stomata auslöst, begleitet von einem Anstieg von [Ca2+]cyt. Dies beweist, dass die pH-Regulierung ein wichtiger Aspekt der stomatären Bewegung darstellt und auf die Ca2+-Dynamik einwirkt. Bemerkenswert war, dass die zytosolische Alkalisierung und nicht der Ca2+-Anstieg eine entscheidende Rolle bei der Schließung der Stomata zu spielen schien, da eine stärkere zytosolische Alkalisierung trotz eines ähnlichen [Ca2+]cyt - Anstiegs eine stärkere Schließung der Stomata hervorrief. Erhöhungen von [Ca2+]cyt, die in der Vergangenheit als frühes Stomataschließungssignal diskutiert wurden, konnten in meinen Experimenten den Stomataschluß nicht allein auslösen, selbst wenn extrem starke Ca2+-Signale ausgelöst wurden. Was die Interaktion zwischen den beiden Botenstoffen anbelangt, so warenVIII [Ca2+]cyt und [H+]cyt meist negativ miteinander korreliert, was sich von den Pollenschläuchen unterschied, die eine positive Korrelation zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt aufwiesen. Ca2+- Erhöhungen waren immer mit einer Alkalisierung des Zytosols verbunden, und diese Beziehung konnte durch die Anwesenheit von Vanadat, ein H+-Pumpen Blocker blockiert werden, was darauf hindeutet, dass die H+-ATPasen der Plasmamembran zu der negativen Korrelation von [Ca2+]cyt und [H+]cyt beitragen. Im Vergleich zu den CapHensor-Reaktionen bei Schließzellen wurden zytosolische und Zellkern-lokalisierende Versionen von CapHensor in Mesophyllzellen von N. benthamiana, einem von uns untersuchten multizellulären System, exprimiert. Die Reaktionen der Mesophyllzellen auf die gleichen Stimuli wie bei den Schließzellen zeigten, dass ABA und H2O2 keine Veränderungen von [Ca2+]cyt und [H+]cyt hervorrufen, während flg22 einen Anstieg von [Ca2+]cyt und [H+]cyt bewirkt, der sich von der Reaktion in Schließzellen unterscheidet. Damit konnte ich eindeutig nachweisen, dass Schließ- und Mesophyllzellen in Bezug auf [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Änderungen sehr unterschiedlich auf dieselben Stimuli reagieren, ein Konzept, das zwar schon früher vorgeschlagen, aber noch nie so detailliert für Pflanzen nachgewiesen wurde. Ein Phänomen, das seit langem in Schließzellen beobachtet wird, dessen Funktion oder Ursache aber noch nicht verstanden ist, sind regelmäßige Ca2+-Oszillationen, die spontan auftreten. Interessanterweise wurden zwei Populationen von oszillierenden Schließzellen anhand ihrer [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Phasenbeziehung identifiziert. Bei etwa der Hälfte der oszillierenden Zellen gingen die [H+]cyt-Oszillationen den [Ca2+]cyt-Oszillationen voraus, während in der anderen Hälfte der Schließzellenpopulation [Ca2+]cyt das vorangehende Signal war. Auffallend ist, dass die natürlichen [H+]cyt-Oszillationen durch ABA gedämpft wurden, nicht aber durch flg22. Dieser Effekt lässt sich gut durch die Dämpfung der vakuolären H+-Oszillationen in Gegenwart von ABA erklären, aber nicht durch flg22, das ich mit BCECF sichtbar gemacht habe. Es zeigte sich, dass sowohl der vakuoläre pH-Wert zu spontanen [H+]cyt-Oszillationen beiträgt als auch, dass ABA, nicht aber flg22, den Zusammenhang der natürlichen [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale blockieren kann. Um die Rolle der [Ca2+]cyt-Oszillationen bei der Bewegung der Stomata zu untersuchen, wurden Lösungen mit hohen und niedrigen KCl-Konzentrationen verwendet, um [Ca2+]cyt-Oszillationen auszulösen. Das Auslösen von Ca2+-Oszillationen nach dieser Methode wurde in Studien vor zwei Jahrzehnten etabliert, und die Ergebniss daraus haben zu dem Dogma geführt, dass der Anstieg von [Ca2+]cyt das entscheidende Signal für die Schließung von Stomata ist. Ich habe jedoch herausgefunden, dass die Bewegung der Stomata mit dieser Methode hauptsächlich auf osmotischeIX Effekte und nicht auf die Auswirkungen der [Ca2+]cyt-Erhöhungen zurückzuführen waren. Glücklicherweise fand ich mit dieser Methode heraus, dass es eine starke Korrelation zwischen dem zytosolischen pH-Wert und dem Kaliumtransport über die Plasmamembran und die Vakuole gibt. Die H+-ATPasen der Plasmamembran und die H+-gekoppelten K+-Transporter wurden als Ursache für die pH-Änderungen identifiziert, beides sehr wichtige Aspekte in der Stomaphysiologie, die zuvor nicht experimentell sichtbar gemacht werden konnten. Der Transport von Natriumionen (Na+) ist für die Regulierung der Stomata und der Adaption von Blättern bei Salzstress wichtig, da Salz von der Wurzel zum Spross transportiert werden kann. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Ca2+-abhängigen Na+-Transportmechanismen in den Wurzeln ist überhaupt nicht bekannt, wie Blätter Salzstress verarbeiten. Ich habe Salz auf Protoplasten von Blättern, Mesophyllzellen und Schießzellen appliziert und „Live-Cell-Imaging“ mit Aufzeichnungen der Membranspannung kombiniert, um den Transport und die Signalreizweiterleitung bei Salzstress in Blättern zu verstehen. Sowohl in Mesophyll- als auch in Schließzellen löste NaCl keine Ca2+-Signale aus, wie sie für Wurzeln beschrieben wurden, sondern führte beim Auswaschen von Salz zu [Ca2+]cyt-Transienten. Eine Membrandepolarisation und eine ausgeprägte Alkalisierung wurden jedoch sehr zuverlässig durch NaCl ausgelöst, was vermutlich als Signal für die Entgiftung von hohen Salzkonzentrationen dienen könnte. Im Einklang damit konnte ich zeigen, dass der vakuoläre Kationen/H+-Antiporter NHX1 eine Rolle beim Natriumtransport, der zytosolischen pH-Homöostase und der Kontrolle des Membranpotenzials spielt. Die Überexpression von AtNHX1 ermöglichte es, [H+]cyt-Veränderungen zu vermindern und führte zu einer geringeren Depolarisationsreaktion unter NaCl-Stress. Meine Ergebnisse zeigen somit, dass Blattzellen im Gegensatz zu Wurzeln keine Ca2+-abhängigen Signalkaskaden nutzen, um mit Salzstress umzugehen, und ich konnte zeigen, dass Na+ und K+ die [H+]cyt- und Membranspannungs-Reaktionen auslöst und der Cl--Transport nur einen geringen Einfluss hat. Zusammenfassend habe ich festgestellt, dass pH-Signale eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Wachstums von Pollenschläuchen spielen, sowie bei der Bewegung der Stomata und der Entgiftung der Blätter durch Salz beteiligt sind. Meine Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass pH-Änderungen ein wichtigeres Signal für die Steuerung verschiedener Prozesse in Pflanzen sein könnten als bisher angenommen. Durch den Einsatz des CapHensors in Kombination mit elektrophysiologischen und bioinformatischen Methoden konnte ich feststellen, dass in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zusammenhänge zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt bestehenX und dass unterschiedliche [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale durch verschiedene Stimuli und Umweltreize ausgelöst werden. Der CapHensor wird in Zukunft sehr nützlich sein, um die koordinierte Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen bei der Steuerung der Pflanzenphysiologie weiter zu untersuchen.
KW  - Calcium
KW  - pH
KW  - live-cell imaging
KW  - pollen tubes
KW  - guard cells
KW  - mesophyll cells
KW  - Pflanzen
KW  - Biosensor
KW  - Bilderzeugung
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249736
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schliermann [geb. Stratmann], Anna Theresa
T1  - The Role of FGF Receptor 2 in GDF5 mediated Signal Transduction
T1  - Die Rolle des FGF Rezeptors 2 in GDF5-vermittelter Signaltransduktion
N2  - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are involved in various aspects of cell-cell communication in complex life forms. They act as morphogens, help differentiate different cell types from different progenitor cells in development, and are involved in many instances of intercellular communication, from forming a body axis to healing bone fractures, from sugar metabolism to angiogenesis. If the same protein or protein family carries out many functions, there is a demand to regulate and fine-tune their biological activities, and BMPs are highly regulated to generate cell- and context-dependent outcomes.
Not all such instances can be explained yet. Growth/differentiation factor (GDF)5 (or BMP14) synergizes with BMP2 on chondrogenic ATDC5 cells, but antagonizes BMP2 on myoblastic C2C12 cells. Known regulators of BMP2/GDF5 signal transduction failed to explain this context-dependent difference, so a microarray was performed to identify new, cell-specific regulatory components. One identified candidate, the fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, was analyzed as a potential new co-receptor to BMP ligands such as GDF5: It was shown that FGFR2 directly binds BMP2, GDF5, and other BMP ligands in vitro, and FGFR2 was able to positively influence BMP2/GDF5-mediated signaling outcome in cell-based assays. This effect was independent of FGFR2s kinase activity, and independent of the downstream mediators SMAD1/5/8, p42/p44, Akt, and p38. The elevated colocalization of BMP receptor type IA and FGFR2 in the presence of BMP2 or GDF5 suggests a signaling complex containing both receptors, akin to other known co-receptors of BMP ligands such as repulsive guidance molecules. 
This unexpected direct interaction between FGF receptor and BMP ligands potentially opens a new category of BMP signal transduction regulation, as FGFR2 is the second receptor tyrosine kinase to be identified as BMP co-receptor, and more may follow. The integration of cell surface interactions between members of the FGF and BMP family especially may widen the knowledge of such cellular communication mechanisms which involve both growth factor families, including morphogen gradients and osteogenesis, and may in consequence help to improve treatment options in osteochodnral diseases.
N2  - Bone morphogenetic proteins (BMPs) sind oft an interzellulärer Kommunikation beteiligt. Sie sind Morphogene, spielen eine Rolle in der Differenzierung von zahlreichen Zelltypen aus verschiedenen Vorgängerzellen während der Entwicklung, und sind an vielen weiteren Beispielen der Zell-Zell-Kommunikation beteiligt: von der Formation einer Körperachse bis hin zur Heilung von Knochenbrüchen, vom Zuckermetabolismus bis zur Angiogenese. Wann immer dasselbe Protein oder dieselbe Proteinfamilie so viele Funktionen erfüllt, bedarf es der Regulation und Feinabstimmung ihrer diversen biologischen Aktivitäten, und BMPs sind zu dem Erzielen zell- und kontextspezifischer Effekte in ihrer Wirkung entsprechend stark reguliert. 
Nicht in allen Fällen sind die Mechanismen solcher Regulation bisher bekannt. Growth/differentiation factor (GDF)5 (oder BMP14) agiert mit BMP2 auf den chondrogenen ATDC5 Zellen synergistisch, aber antagonisiert BMP2 auf den myoblastischen C2C12 Zellen. Diese kontextabhängige Diskrepanz konnte mithilfe der bekannten Regulatoren von BMP2/GDF5-mediierten Signalen nicht erklärt werden. Daher wurde ein Microarray durchgeführt, um neue, zellspezifische regulatorische Proteine zu identifizieren. Einer der identifizierten Kandidaten, fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, wurde auf eine potentielle Funktion als neuer Korezeptor für BMP Liganden wie GDF5 analysiert: Es konnte gezeigt werden, dass FGFR2 BMP2, GDF5 und andere BMP Liganden in vitro direkt binden und die biologische Aktivität von BMP2 und GDF5 in Zellkultursystemen positiv beeinflussen konnte. Diese Beobachtungen waren unabhängig von der Kinaseaktivität des FGFR2, und unabhängig von den intrazellulären Mediatoren SMAD1/5/8, p42/p44, Akt und p38. Die erhöhte Kolokalisation von FGFR2 mit dem BMP Rezeptor IA in der Präsenz von BMP2 oder GDF5 weist darauf hin, dass der entsprechende Signalkomplex möglicherweise beide Rezeptoren gleichzeitig enthält; ähnlich, wie das für andere bekannte Korezeptoren von BMP Liganden wie etwa den repulsive guidance molecules der Fall ist. 
Die unerwartete direkte Interaktion von einem FGF Rezeptor mit BMP-Liganden ist möglicherweise nur ein Beispiel für einen generelleren Mechanismus. Tatsächlich ist FGFR2 bereits die zweite Rezeptortyrosinkinase, die als BMP-Korezeptor identifiziert wurde, und es ist möglich, dass es noch mehr gibt. Speziell im Bezug auf die FGF-BMP Interaktion bergen die hier dargestellten Ergebnisse Potential zu neuen Erkenntnissen. Die Proteinfamilien dieser beiden Wachstumsfaktoren sind häufiger an demselben zellulären Mechanismen beteiligt; etwa an der Entstehung von Morphogengradienten in der Entwicklung oder an der Osteogenese. Die Interaktion der FGF und BMP Proteinfamilien auf der Zelloberfläche könnte eine wertvolle Ergänzung zu der Untersuchung ihres Zusammenspiels im Zellinneren sein, und könnte in diesem Zusammenhang sogar langfristig die Behandlungsmöglichkeiten von osteochondralen Erkrankungen erweitern.
KW  - Molekularbiologie
KW  - FGF signaling
KW  - BMP signaling
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192889
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Değirmenci, Laura
A1  - Rogé Ferreira, Fabio Luiz
A1  - Vukosavljevic, Adrian
A1  - Heindl, Cornelia
A1  - Keller, Alexander
A1  - Geiger, Dietmar
A1  - Scheiner, Ricarda
T1  - Sugar perception in honeybees
JF  - Frontiers in Physiology
N2  - Honeybees (Apis mellifera) need their fine sense of taste to evaluate nectar and pollen sources. Gustatory receptors (Grs) translate taste signals into electrical responses. In vivo experiments have demonstrated collective responses of the whole Gr-set. We here disentangle the contributions of all three honeybee sugar receptors (AmGr1-3), combining CRISPR/Cas9 mediated genetic knock-out, electrophysiology and behaviour. We show an expanded sugar spectrum of the AmGr1 receptor. Mutants lacking AmGr1 have a reduced response to sucrose and glucose but not to fructose. AmGr2 solely acts as co-receptor of AmGr1 but not of AmGr3, as we show by electrophysiology and using bimolecular fluorescence complementation. Our results show for the first time that AmGr2 is indeed a functional receptor on its own. Intriguingly, AmGr2 mutants still display a wildtype-like sugar taste. AmGr3 is a specific fructose receptor and is not modulated by a co-receptor. Eliminating AmGr3 while preserving AmGr1 and AmGr2 abolishes the perception of fructose but not of sucrose. Our comprehensive study on the functions of AmGr1, AmGr2 and AmGr3 in honeybees is the first to combine investigations on sugar perception at the receptor level and simultaneously in vivo. We show that honeybees rely on two gustatory receptors to sense all relevant sugars.
KW  - AmGr1
KW  - AmGr2
KW  - AmGr3
KW  - sugar responsiveness
KW  - proboscis extension response (PER)
KW  - gustatory receptors (Grs)
KW  - honeybee taste perception
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302284
SN  - 1664-042X
VL  - 13
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lambour, Benjamin
T1  - Regulation of sphingolipid long-chain bases during cell death reactions and abiotic stress in \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
T1  - Regulation von Sphingobasen während der Zelltodreaktion und abiotischem Stress in \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
N2  - Sphingobasen (LCBs) sind die Bausteine der Biosynthese von Sphingolipiden. Sie werden als
Strukturelemente der pflanzlichen Zellmembran definiert und spielen eine wichtige Rolle für das
Schicksal der Zellen. Komplexe Ceramide machen einen wesentlichen Teil der gesamten
Sphingolipide aus, die einen großen Teil der eukaryotischen Membranen bilden. Gleichzeitig sind
LCBs bekannte Signalmoleküle für zelluläre Prozesse in Eukaryonten und sind an
Signalübertragungswegen in Pflanzen beteiligt. Es hat sich gezeigt, dass hohe LCB-Konzentrationen
mit der Induktion des programmierten Zelltods sowie mit dem durch Pathogene ausgelösten Zelltod
in Verbindung stehen. Mehrere Studien haben die regulierende Funktion der Sphingobasen beim
programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen bestätigt: (i) Spontaner PCD und veränderte
Zelltodreaktionen, die durch mutierte verwandte Gene des Sphingobasen-Stoffwechsels verursacht
werden. (ii) Zelltodbedingungen erhöhen den Gehalt an LCBs. (iii) PCD aufgrund eines gestörten
Sphingolipid-Stoffwechsels, der durch von nekrotrophen Krankheitserregern produzierte Toxine wie
Fumonisin B1 (FB1) hervorgerufen wird. Um den Zelltod zu verhindern und die Zelltodreaktion zu
kontrollieren, kann daher die Regulierung des Gehalts an freien LCBs entscheidend sein.

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stellten das Verständnis der Sphingobasen und
Sphingolipidspiegel während der PCD in Frage. Wir lieferten eine detaillierte Analyse der
Sphingolipidspiegel, die Zusammenhänge zwischen bestimmten Sphingolipidarten und dem Zelltod
aufzeigte. Darüber hinaus ermöglichte uns die Untersuchung der Sphingolipid-Biosynthese ein
Verständnis des Fluxes nach Akkumulation hoher LCB-Konzentrationen. Weitere Analysen von
Abbauprodukten oder Sphingolipid-Mutantenlinien wären jedoch erforderlich, um vollständig zu
verstehen, wie die Pflanze mit hohen Mengen an Sphingobasen umgeht.
N2  - Sphingolipid long-chain bases (LCBs) are the building blocks of the biosynthesis of sphingolipids. They
are defined as structural elements of the plant cell membrane and play an important role
determining the fate of the cells. Complex ceramides represent a substantial fraction of total
sphingolipids which form a major part of eukaryotic membranes. At the same time, LCBs are well
known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes and are involved in signal transduction
pathways in plants. High levels of LCBS have been shown to be associated with the induction of
programmed cell death as well as pathogen-derived toxin-induced cell death. Indeed, several studies
confirmed the regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD):
(i) Spontaneous PCD and altered cell death reaction caused by mutated related genes of sphingobase
metabolism. (ii) Cell death conditions increases levels of LCBs. (iii) PCD due to interfered sphingolipid
metabolism provoked by toxins produced from necrotrophic pathogens, such as Fumonisin B1 (FB1).
Therefore, to prevent cell death and control cell death reaction, the regulation of levels of free LCBs
can be crucial.

The results of the present study challenged the comprehension of sphingobases and sphingolipid
levels during PCD. We provided detailed analysis of sphingolipids levels that revealed correlations of
certain sphingolipid species with cell death. Moreover, the investigation of sphingolipid biosynthesis
allowed us to understand the flux after the accumulation of high LCB levels. However, further
analysis of degradation products or sphingolipid mutant lines, would be required to fully understand
how high levels of sphingobases are being treated by the plant.
KW  - PCD
KW  - Sphingolipids
KW  - LCB
KW  - Ackerschmalwand
KW  - programmed cell death
KW  - arabidopsis thaliana
KW  - abiotic stress
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325916
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jaślan, Justyna Joanna
T1  - R-type currents in \(Arabidopsis\) guard cells: properties and molecular nature
T1  - R-type Ströme in \(Arabidopsis\) Schließzellen: Eigenschaften und molekularer Hintergrund
N2  - In contrast to the well described molecular basis for S-type anion currents, the genes underlying R-type anion currents were unknown until 2010. Meyer S. and colleagues (2010) showed that, localized in the guard cell plasma membrane, AtALMT12 is an R-type anion channel involved in stomatal closure. However, knocking out AtALMT12 did not fully shut down R-type currents; the almt12 loss-of-function mutant has residual R-type-like currents indicating that ALMT12 is not the only gene encoding Arabidopsis thaliana R-type channels (Meyer S. et al., 2010). This PhD thesis is focussed on understanding the properties, regulation and molecular nature of the R-type channels in Arabidopsis thaliana plants. To fulfil these aims, the patch clamp technique was used to characterize electrical features of R-type currents in various conditions such as the presence/absence of ATP, variation in cytosolic calcium concentration or the presence of cytosolic chloride. Electrophysiological study revealed many similarities between the features of Arabidopsis thaliana R-type currents (Col0) and residual R-type currents (the almt12 loss-of-function mutant). Strong voltage dependency, channel activity in the same voltage range, position of maximal recorded current and blockage by cytosolic ATP all pointed to a shared phylogenetic origin of the channels underlying these R-type currents. Expression patterns of the ALMT family members for Col0 and the almt12 mutant revealed ALMT13 and AMT14 as potential candidates of the R-type channels. Electrical characterization of Col0, almt12 and the two double loss-of-function mutants (almt12/almt13 and almt12/almt14) strongly suggest that ALMT13 mediates the calcium-dependent R-type current component that is directly regulated by cytosolic calcium. Additionally, similarly to ALMT12, ALMT14 could participate as a calcium-independent R-type anion channel. Differences in response to the cytosolic calcium concentration between ALMT12, ALMT13 and ALMT14 suggest their possible involvement in different signalling pathways leading to stomatal closure. Moreover, a study performed for the two Arabidopsis thaliana ecotypes Col0 and WS showed drastically increased ALMT13 expression for WS, which is related to R-type current properties. The WS ecotype has calcium-dependent R-type current behaviour, while it is calcium-independent in Col0. Furthermore, this plant line showed lower peak current densities compared to Col0 and almt mutants. These facts strongly suggest interaction between ALMT12 and ALMT13, with ALMT13 as a repressor of the ALMT12. Acquired patch clamp data revealed sulphate-dependent increases in ALMT13 current. This could be caused by changes in absolute open probability and/or permeability for sulphate and possibly chloride and links ALMT13 with sulphate-mediated stomatal closure under drought stress. It was then confirmed that ATP affects R-type currents. In contrast to Vicia faba, ATP was identified as a negative regulator of the Arabidopsis thaliana R-type anion channels. The effect of ATP is ambiguous but there is a high probability that it is a result of direct block and phosphorylation. However, the phosphorylation site and place of ATP binding needs further investigation.
The story of the ALMT family, as examined in this thesis, sheds light on the complexity of the stomatal closure process.
N2  - Im Gegensatz zu den gut beschriebenen S-Typ Anionenströmen, die durch Kanäle der SLAC1 Familie vermittelt werden, waren die Gene, die für R-Typ Anionenkanäle kodieren bis 2010 unbekannt (Negi J. et al., 2008,  Vahisalu T. et al., 2008). In diesem Jahr identifizierten Meyer
S. und Kollegen AtALMT12 als R-Typ Anionenkanal, der in der Plasmamembran von Schließzellen lokalisiert und am Stomaschluss beteiligt ist. In almt12 Verlustmutanten sind jedoch restliche R-Typ Ströme messbar, die darauf hinweisen, dass ALMT12 nicht das einzige Gen ist, das in Arabidopsis thaliana für R-Typ Anionenkanäle kodiert (Meyer S. et al., 2010). Diese Dissertation konzentriert sich auf die Analyse der Eigenschaften, der Regulation und der molekularen Natur der R-Typ Kanäle in Arabidopsis thaliana Pflanzen. Dafür wurde die Patch Clamp Technik angewandt, um den Einfluss verschiedener Faktoren wie z.B. das Fehlen/Vorhandensein von ATP, Unterschiede in der zytosolischen Kalziumkonzentration oder das Vorhandensein von zytosolischem Chlorid auf die elektrische Eigenschaften der R-Typ Ströme der verschiedene Kanäle zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Untersuchungen zeigten viele Ähnlichkeiten zwischen den Eigenschaften von R-Typ Ströme in Wildtyp Pflanzen (Col0) und den noch vorhandenen Strömen in der Verlustmutante almt12. Beide sind stark spannungsabhängig, zeigen Kanalaktivität im gleichen Spannungsbereich und werden durch zytosolisches ATP inhibiert, was auf einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung der R-Typ Anionenkanäle hinweist. Die Expressionsanalyse der Gene der ALMT-Familie zeigte, dass ALMT13 und ALMT14 weitere potenzielle Kandidaten für Anionenkanäle des R-Typs sind. Die elektrophysiologische Charakterisierung von Col0, almt12 und den beiden zweifachen Verlustmutanten almt12/almt13 und almt12/almt14 ermöglichte es, die durch ALMT13 vermittelten Ströme als kalziumabhängige Komponente der R-Typ Ströme zu spezifizieren. Dabei wird ALMT13 direkt durch zytosolisches Kalzium reguliert. ALMT14 vermittelt dagegen kalziumunabhängige Ströme, ähnlich wie ALMT12. Unterschiede in der Reaktion auf die zytosolische Kalziumkonzentration zwischen ALMT12, ALMT13 und ALMT14 deuten auf eine mögliche Beteiligung an verschiedenen Signalwegen hin, die zum Stomaschluss führen. Darüber hinaus wurde eine Studie für zwei Arabidopsis thaliana Ökotypen durchgeführt. Pflanzen des Ökotyps WS zeigten eine erhöhte Expression von ALMT13 im Vergleich zu Col0 Pflanzen, während die Expression von ALMT12 in beiden vergleichbar ist. Diese Unterschiede
 
wirken sich auf die R-Typ Ströme aus, die nur in WS-Pflanzen kalziumabhängig sind und eine geringere Amplitude haben. Diese Fakten deuten stark auf eine Interaktion zwischen ALMT12 und ALMT13 hin, bei der ALMT13 als Repressor von ALMT12 wirkt. Die Auswertung der Patch-Clamp-Daten zeigte außerdem eine sulfatabhängige Zunahme der durch ALMT13 vermittelten R-Typ Ströme. Diese wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Offenwahrscheinlichkeit und/oder der Permeabilität für Sulfat und möglicherweise für Chlorid verursacht, und die darauf hinweist, dass ALMT13 für frühe Antworten im sulfatvermittelten Stomaschluss bei Trockenstress eine Rolle spielt. Außerdem wurde gezeigt, dass ATP die R-Typ Ströme beeinflusst. In Arabidopsis thaliana Pflanzen wirkt ATP als negativer Regulator der Anionenkanäle vom R-Typ, nicht jedoch in Vicia faba (Hedrich R. et al., 1990). Der Mechanismus, über den ATP wirkt ist nicht eindeutig geklärt, aber es wird davon ausgegangen, dass es sich um eine direkte Inhibierung und Phosphorylierung handelt. Die Phosphorylierungsstelle und der Ort der ATP-Bindung bedürfen jedoch weiterer Untersuchungen.
Die Geschichte der ALMT-Familie, wie sie in dieser Arbeit untersucht wird, wirft ein Licht auf die Komplexität des stomatalen Verschlussprozesses.
KW  - R-type currents
KW  - ALMT
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188836
N1  - Parts of this thesis have been published in Jaślan, J., Marten, I., Jakobson, L., Arjus, T., Deeken, R., Sarmiento, C., De Angeli, A., Brosché, M., Kollist, H. and Hedrich, R. (2023), ALMT-independent guard cell R-type anion currents. New Phytol. https://doi.org/10.1111/nph.19124.
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fei, Lin
T1  - Optogenetic regulation of osmolarity and water flux
T1  - Optogenetische Regulation der Osmolarität und des Wasserflusses
N2  - Optogenetics is a powerful technique that utilizes light to precisely regulate physiological activities of neurons and other cell types. Specifically, light-sensitive ion channels, pumps or enzymes are expressed in cells to enable their regulation by illumination, thus allowing for precise control of biochemical signaling pathways. The first part of my study involved the construction, optimization, and characterization of two optogenetic tools, KCR1 and NCR1. Elena Govorunova et al. discovered a lightgated potassium channel, KCR1, in the protozoan Hyphochytrium catenoides. Traditional potassium ion channels are classified as either ligand-gated or voltage-gated and possess conserved pore-forming domains and K+ -selective filters. However, KCR1 is unique in that it does not contain the signature sequence of previously known K+ channels and is a channelrhodopsin. We synthesized the KCR1 plasmid according to the published sequence and expressed it in Xenopus oocytes. Due to the original KCR1 current being too small, I optimized it into KCR1 2.0 to improve its performance by fusing LR (signal peptide LucyRho, enhances expression) at the N-terminal and T (trafficking signal peptide) and E (ER export signal peptide) at the C-terminal. Additionally, I investigated the light sensitivity, action spectrum, and kinetics of KCR1 2.0 in Xenopus oocytes. The potassium permeability of KCR1 2.0, PK/Pna  24, makes KCR1 2.0 a powerful hyperpolarizing tool that can be used to inhibit neuronal firing in animals. Inspired by KCR1, we used the KCR1 sequence as a template for gene sequence alignment with the sequences in H. catenoides. We found that NCR1 and KCR1 have similar gene sequences. NCR1 was characterized by us as a light-gated sodium channel. This NCR1 was also characterized and published by Govorunova et al. very recently, with the name HcCCR. Due to the original NCR1 current being too small, I optimized it into NCR1 2.0 to improve its performance by fusing LR at the N-terminal and T and E at the C-terminal, which significantly improved the expression level and greatly increased the current amplitude of NCR1. Full-length NCR1 2.0 contains 432 amino acids. To test whether the number of amino acids changes the characteristics of NCR1 2.0, we designed NCR1 2.0 (330), NCR1 2.0 (283), and NCR1 2.0 (273) by retaining the number of amino acids at 330, 280, and 273 in NCR1 2.0, respectively. As the number of amino acids decreased, the current in NCR1 2.0 increased. I also investigated the light sensitivity, action spectrum, and kinetics of NCR1 2.0 (273) in the Xenopus Abstract 2 oocytes. We performed four point mutations at amino acid positions 133 and 116 of NCR1 2.0 and analyzed the reversal potentials of the mutants. The mutations were as follows: NCR1 2.0 (273 D116H), NCR1 2.0 (273 D116E), NCR1 2.0 (283 V133H), and NCR1 2.0 (283 D116Q). The second part of this study focuses on light-induced water transport using optogenetic tools. We explored the use of optogenetic tools to regulate water flow by changing the osmolarity in oocytes. Water flux through AQP1 is driven by the osmotic gradient that results from concentration differences of small molecules or ions. Therefore, we seek to regulate ion concentrations, using optogenetic tools to regulate the flux of water noninvasively. To achieve this, I applied the light-gated cation channels XXM 2.0 and NCR1 2.0 to regulate the concentration of Na+ , while K + channel KCR1 2.0 was used to regulate K + concentration. As Na+ flows into the Xenopus oocytes, the membrane potential of the oocytes becomes positive, and Clcan influx through the light-gated anion channel GtACR1. By combining these optogenetic tools to regulate NaCl or KCl concentrations, I can change the osmolarity inside the oocytes, thus regulating the flux of water. I co-expressed AQP1 with optogenetic tools in the oocytes to accelerate water flux. Overall, I designed three combinations (1: AQP1, XXM 2.0 and GtACR1. 2: AQP1, NCR1 2.0 and GtACR1. 3: AQP1, KCR1 2.0 and GtACR1) to regulate the flow of water in oocytes. The shrinking or swelling of the oocytes can only be achieved when AQP1, light-gated cation channels (XXM 2.0/NCR1 2.0/KCR1 2.0), and light-gated anion channels (GtACR1) are expressed together. The illumination after expression of either or both alone does not result in changes in oocyte morphology. In sum, I demonstrated a novel strategy to manipulate water movement into and out of Xenopus oocytes, non-invasively through illumination. These findings provide a new avenue to interfere with water homeostasis as a means to study related biological phenomena across cell types and organisms.
N2  - Die Optogenetik ist eine leistungsstarke Technik, die Licht zur präzisen Regulierung der physiologischen Aktivitäten von Neuronen und anderen Zelltypen einsetzt. Konkret werden Licht-empfindliche Ionenkanäle, Pumpen oder Enzyme in Zellen exprimiert, um ihre Regulierung durch Belichtung zu ermöglichen und so eine präzise Kontrolle biochemischer Signalwege zu ermöglichen.

Der erste Teil meiner Studie umfasste die Konstruktion, Optimierung und Charakterisierung von zwei optogenetischen Werkzeugen, KCR1 und NCR1. Elena Govorunova und Mitarbeiter entdeckten einen lichtgesteuerten Kaliumkanal, KCR1, in dem Protozoen Hyphochytrium catenoides. Herkömmliche Kalium-Ionenkanäle werden entweder als ligandengesteuert oder spannungsgesteuert klassifiziert und verfügen über konservierte porenbildende Domänen und K+-selektive Filter. KCR1 ist jedoch insofern einzigartig, als er nicht die Signatursequenz der bisher bekannten K+-Kanäle enthält und ein Kanalrhodopsin ist. Wir synthetisierten das KCR1-Plasmid entsprechend der veröffentlichten Sequenz und exprimierten es in Xenopus-Oozyten. Da der ursprüngliche KCR1-Strom zu klein war, optimierte ich ihn zu KCR1 2.0, um seine Leistung zu verbessern, indem LR (Signalpeptid LucyRho, verbessert die Expression) am N-Terminus und T (Trafficking-Signalpeptid) und E (ER-Export-Signalpeptid) am C-Terminus fusioniert wurden. Außerdem untersuchte ich die Lichtempfindlichkeit, das Wirkungs-Spektrum und die Kinetik von KCR1 2.0 in Xenopus-Oozyten. Die Kaliumpermeabilität von KCR1 2.0, PK/PNa  24, macht KCR1 2.0 zu einem leistungsfähigen hyperpolarisierenden Werkzeug, das zur Hemmung von Nervenzellen in Tieren eingesetzt werden kann.

Inspiriert von KCR1 verwendeten wir die KCR1-Sequenz als Vorlage für den Gen-Sequenzabgleich mit Sequenzen in H. catenoides. Wir fanden heraus, dass NCR1 und KCR1 ähnliche Gensequenzen haben. NCR1 wurde von uns als lichtgesteuerter Natriumkanal charakterisiert. NCR1 wurde ebenfalls von Govorunova et al. charakterisiert und vor kurzem unter dem Namen HcCCR veröffentlicht. Da der ursprüngliche NCR1-Strom zu gering war, optimierte ich ihn zu NCR1 2.0, um seine Leistung zu verbessern, indem ich LR am N-Terminus und T und E am C-Terminus fusionierte, was das Expressionsniveau erheblich verbesserte und die Stromamplitude von NCR1 stark erhöhte. NCR1 2.0 in voller Länge enthält 432 Aminosäuren. Um zu testen, ob die Anzahl der Aminosäuren die Eigenschaften von NCR1 2.0 verändert, haben wir NCR1 2.0 (330), NCR1 2.0 (283) und NCR1 2.0 (273) entwickelt, indem wir die Anzahl der Aminosäuren auf 330, 280 bzw. 273 in NCR1 2.0 verkürzt haben. Mit abnehmender Anzahl der Aminosäuren nahm der Strom in NCR1 2.0 zu. Ich untersuchte auch die Licht-Empfindlichkeit, das Wirkungsspektrum und die Kinetik von NCR1 2.0 (273) in Xenopus-Oozyten. Wir führten vier Punktmutationen an den Aminosäurepositionen 133 und 116 von NCR1 2.0 durch und analysierten die Umkehrpotentiale der Mutanten. Die Mutationen waren wie folgt: NCR1 2.0 (273 D116H), NCR1 2.0 (273 D116E), NCR1 2.0 (283 V133H), und NCR1 2.0 (283 D116Q).

Der zweite Teil dieser Studie konzentriert sich auf den lichtinduzierten Wassertransport mit Hilfe optogenetischer Methoden. Wir untersuchten den Einsatz optogenetischer Werkzeuge zur Regulierung des Wasserflusses durch Veränderung der Osmolarität in Oozyten. Der Wasserfluss durch AQP1 wird durch den osmotischen Gradienten angetrieben, der durch Konzentrationsunterschiede kleiner Moleküle oder Ionen entsteht. Daher versuchen wir, die Ionenkonzentration mit optogenetischen Mitteln zu regulieren, um den Wasserfluss nicht-invasiv zu steuern. Zu diesem Zweck verwendete ich die lichtgesteuerten Kationenkanäle XXM 2.0 und NCR1 2.0 zur Regulierung der Na+-Konzentration, während der K+-Kanal KCR1 2.0 zur Regulierung der K+-Konzentration eingesetzt wurde. Wenn Na+ in die Xenopus-Oozyten fließt, wird das Membranpotential der Oozyten positiv, und Cl- kann durch den lichtgesteuerten Anionenkanal GtACR1 einströmen. Durch die Kombination dieser optogenetischen Werkzeuge zur Regulierung der NaCl- oder KCl-Konzentration kann ich die Osmolarität innerhalb der Oozyten verändern und so den Wasserfluss regulieren. Ich habe AQP1 zusammen mit optogenetischen Werkzeugen in den Oozyten exprimiert, um den Wasserfluss zu beschleunigen. Insgesamt habe ich drei Kombinationen entwickelt (1: AQP1, XXM 2.0 und GtACR1. 2: AQP1, NCR1 2.0 und GtACR1. 3: AQP1, KCR1 2.0 und GtACR1) zur Regulierung des Wasserflusses in den Eizellen. Das Schrumpfen oder Anschwellen der Oozyten kann nur erreicht werden, wenn AQP1, lichtgesteuerte Kationenkanäle (XXM 2.0/NCR1 2.0/KCR1 2.0) und lichtgesteuerte Anionenkanäle (GtACR1) gemeinsam exprimiert werden. Die Belichtung nach Expression von einem oder beiden allein führt nicht zu Veränderungen der Morphologie der Oozyten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ich eine neuartige Strategie zur nicht-invasiven Beeinflussung der Wasserbewegung in und aus Xenopus-Oozyten durch Licht demonstriert habe. Diese Ergebnisse eröffnen einen neuen Weg zur Beeinflussung der Wasserhomöostase als Mittel zur Untersuchung verwandter biologischer Phänomene in verschiedenen Zelltypen und Organismen.
KW  - aquaporins
KW  - Osmolarität
KW  - optogenetic
KW  - sodium
KW  - potassium
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323092
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