TY - JOUR A1 - Gerlach, Manfred A1 - Maetzler, Walter A1 - Broich, Karl A1 - Hampel, Harald A1 - Rems, Lucas A1 - Reum, Torsten A1 - Riederer, Peter A1 - Stäffler, Albrecht A1 - Streffer, Johannes A1 - Berg, Daniela T1 - Biomarker candidates of neurodegeneration in Parkinson's disease for the evaluation of disease-modifying therapeutics JF - Journal of Neural Transmission N2 - Reliable biomarkers that can be used for early diagnosis and tracking disease progression are the cornerstone of the development of disease-modifying treatments for Parkinson’s disease (PD). The German Society of Experimental and Clinical Neurotherapeutics (GESENT) has convened a Working Group to review the current status of proposed biomarkers of neurodegeneration according to the following criteria and to develop a consensus statement on biomarker candidates for evaluation of disease-modifying therapeutics in PD. The criteria proposed are that the biomarker should be linked to fundamental features of PD neuropathology and mechanisms underlying neurodegeneration in PD, should be correlated to disease progression assessed by clinical rating scales, should monitor the actual disease status, should be pre-clinically validated, and confirmed by at least two independent studies conducted by qualified investigators with the results published in peer-reviewed journals. To date, available data have not yet revealed one reliable biomarker to detect early neurodegeneration in PD and to detect and monitor effects of drug candidates on the disease process, but some promising biomarker candidates, such as antibodies against neuromelanin, pathological forms of α-synuclein, DJ-1, and patterns of gene expression, metabolomic and protein profiling exist. Almost all of the biomarker candidates were not investigated in relation to effects of treatment, validated in experimental models of PD and confirmed in independent studies. KW - disease progression KW - biomarkers KW - neuroprotection KW - disease-modifying therapies KW - Parkinson’s disease KW - surrogate endpoints KW - drug development Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125375 VL - 119 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Ramachandran, Sarada Devi T1 - Development Of Three-Dimensional Liver Models For Drug Development And Therapeutical Applications T1 - Entwicklung eines dreidimensionalen Lebermodels für Wirkstoffentwicklung und therapeutische Anwendungen N2 - Primary human liver cells such as hepatocytes when isolated and cultured in 2D monolayers, de-differentiate and lose their phenotypic characteristics. In order to maintain the typical polygonal shape of the hepatocytes and their polarization with respect to the neighbouring cells and extra cellular matrix (ECM), it is essential to culture the cells in a three-dimensional (3D) environment. There are numerous culturing techniques available to retain the 3D organization including culturing hepatocytes between two layers of collagen and/or MatrigelTM (Moghe et al. 1997) or in 3D scaffolds (Burkard et al. 2012). In this thesis, three different 3D hepatic models were investigated. 1. To reflect the in vivo situation, the hepatocytes were cultured in 3D synthetic scaffolds called Mimetix®. These were generated using an electrospinning technique using biodegradable polymers. The scaffolds were modified to increase the pore size to achieve an optimal cell function and penetration into the scaffolds, which is needed for good cell-cell contact and to retain long-term phenotypic functions. Different fibre diameters, and scaffold thicknesses were analyzed using upcyte® hepatocytes. The performance of upcyte® hepatocytes in 3D scaffolds was determined by measuring metabolic functions such as cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) and MTS metabolism. 2. Apart from maintaining the hepatocytes in 3D orientation, co-culturing the hepatocytes with other non-parenchymal cell types, such as liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and mesenchymal stem cells (MSCs), better reflects the complexity of the liver. Three different upcyte® cell types namely, hepatocytes, LSECs and MSCs, were used to generated 3D liver organoids. The liver organoids were generated and cultured in static and dynamic conditions. Dynamic conditions using Quasi-vivo® chambers were used to reflect the in vivo blood flow. After culturing the cells for 10 days, the structural orientation of cells within the organoids was analyzed. Functional integrity was investigated by measuring CYP3A4 activities. The organoids were further characterized using in situ hybridization for the expression of functional genes, albumin and enzymes regulating glutamine and glucose levels. 3. An ex vivo bioreactor employing a decellularized organic scaffold called a “Biological Vascularized Scaffold” (BioVaSc) was established. Jejunum of the small intestine from pigs was chemically decellularized by retaining the vascular system. The vascular tree of the BioVaSc was repopulated with upcyte® microvascular endothelial cells (mvECs). The lumen of the BioVaSc was then used to culture the liver organoids generated using upcyte® hepatocytes, LSECs and MSCs. The structural organisation of the cells within the organoids was visualized using cell-specific immunohistochemical stainings. The performance of liver organoids in the BioVaSc was determined according to metabolic functions (CYP3A4 activities). This thesis also addresses how in vitro models can be optimized and then applied to drug development and therapy. A comprehensive evaluation was conducted to investigate the application of second-generation upcyte® hepatocytes from 4 donors for inhibition and induction assays, using a selection of reference inhibitors and inducers, under optimized culture conditions. CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 were reproducibly inhibited in a concentration-dependent manner and the calculated IC50 values for each compound correctly classified them as potent inhibitors. Upcyte® hepatocytes were responsive to prototypical CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 inducers, confirming that they have functional AhR, CAR and PXR mediated CYP regulation. A panel of 11 inducers classified as potent, moderate or non-inducers of CYP3A4 and CYP2B6 were tested. Three different predictive models for CYP3A4 induction, namely the Relative Induction Score (RIS), AUCu/F2 and Cmax,u/Ind50 were analyzed. In addition, PXR (rifampicin) and CAR-selective (carbamazepine and phenytoin) inducers of CYP3A4 and CYP2B6 induction, respectively, were also demonstrated. Haemophilia A occurs due to lack of functional Factor VIII (FVIII) protein in the blood. Different types of cells from hepatic and extrahepatic origin produce FVIII. Supernatants harvested from primary LSECs were evaluated for the presence of secreted functional FVIII. In order to increase the FVIII production, different upcyte® endothelial cells such as blood outgrowth endothelial cells (BOECs), LSECs and mvECs were transduced with lentiviral particles carrying a FVIII transgene. Also, to reflect a more native situation, primary mvECs were selected and modified by transducing them with FVIII lentivirus and investigated as a potential method for generating this coagulation factor. N2 - Primäre humane Leberzellen wie beispielsweise Hepatozyten de-differenzieren und verlieren ihre phänotypischen Eigenschaften, wenn man sie isoliert und in 2D Monoschicht kultiviert. Um die typische, polygonale Form der Hepatozyten und ihre Polarisation gegenüber den benachbarten Zellen und der extrazellulären Matrix (EZM) zu erhalten, ist es essentiell die Zellen in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung zu kultivieren. Es sind zahlreiche Techniken verfügbar, um die 3D-Organisation zu erhalten wie beispielsweise die Kultur von Hepatozyten zwischen zwei Schichten von Kollagen und/oder MatrigelTM (Moghe et al. 1997) oder in einem 3D Gerüst (Burkard et al. 2012). In dieser Arbeit wurden 3 verschiedene, hepatische 3D Modelle untersucht. 1. Um die in vivo Situation widerzuspiegeln, wurden die Hepatozyten in einer synthetischen 3D Matrix namens Mimetix® kultiviert. Diese wurde aus biologisch abbaubaren Polymeren elektrogesponnen. Die Matrix wurde modifiziert indem die Poren vergrößert wurden, um eine optimale Besiedlung des Zellgerüsts und dadurch eine gesteigerte Zellfunktionalität zu erreichen. Dies wird sowohl für die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten wie auch für den Erhalt der phänotypischen Funktionen über einen längeren Zeitraum hin benötigt. Unterschiedliche Faserdurchmesser und Matrixschichtdicken wurden mittels upcyte® Hepatozyten analysiert. Die Leistungsfähigkeit der upcyte® Hepatozyten wurde durch die Messung metabolischer Funktionen bestimmt, wie beispielsweise Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) und MTS Metabolismus. 2. Abgesehen vom Erhalt der 3D Orientierung der Hepatozyten, hilft eine Ko-Kultur der Hepatozyten mit anderen nicht-parenchymalen Zelltypen wie beispielsweise leber-sinusoidalen Endothelzellen (LSECs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) die Komplexität der Leber darzustellen. Drei unterschiedliche upcyte® Zelltypen, das heißt Hepatozyten, LSECs und MSCs wurden eingesetzt, um 3D Leberorganoide zu generieren. Die Leberorganoide wurden in statischen Zellkulturbedingungen generiert und dynamischen Bedingungen kultiviert. Durch den Quasi-vivo Bioreaktor als dynamisches Zellkultursystem wurde der Blutstrom in vivo widergespiegelt. Nach einer Kulturdauer von 10 Tagen wurde die strukturelle Organisation der Zellen innerhalb der Organoide analysiert. Die Funktionalität wurde durch Messungen der CYP3A4 Enzymaktivitäten untersucht. Darüber hinaus wurden die Organoide mittels in situ Hybridisierung auf die Expression von funktionalen Genen, Albumin sowie Glutamin- und Glukose-regulierende Enzyme hin analysiert. 3. Es wurde ein ex vivo Bioreaktor etabliert, dessen Grundlage ein dezellularisiertes Zellgerüst namens ‚Biological Vascularized Scaffold‘ (BioVaSc) bildet. Hierfür wurde das Jejunum vom Dünndarm des Hausschweins chemisch dezellularisiert, wobei gleichzeitig das vaskuläre System erhalten wurde. Dieses Gefäßsystem wurde dann mit upcyte® humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMECs) besiedelt. Das Lumen der BioVaSc wurde anschließend benutzt, um darin die Leberorganoide, die aus den upcyte® Hepatozyten, LSECs und MSCs generiert wurden, zu kultivieren. Die strukturelle Organisation der Zellen innerhalb der Organoide wurde mittels zell-spezifischer, immunhistochemischer Färbungen visualisiert. Die Funktionalität der Leberorganoide in der BioVaSc wurde anhand von metabolischer Aktivität (CYP3A4 Enzymaktivität) bestimmt. Diese Arbeit beschäftigt sich auch mit der Fragestellung, wie in vitro Modelle optimiert werden können, um sie schlussendlich für die Wirkstoffentwicklung aber auch zelltherapeutische Anwendungen einsetzen zu können. Eine umfassende Untersuchung wurde durchgeführt, um zu untersuchen inwiefern 4 Donoren der zweiten upcyte® Hepatozyten Generation für Inhibitions- und Induktionsstudien geeignet sind. Hierfür wurde eine Auswahl an Referenzinhibitoren und – induktoren unter optimierten Kulturbedingungen eingesetzt. CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP3A4 konnten durch den Einsatz von Inhibitoren reproduzierbar, konzentrationsabhängig inhibiert werden und die berechneten IC50-Werte klassifizierte jede Substanz korrekt als potenten Inhibitor. Upcyte® Hepatozyten reagierten auf proto-typische CYP1A2-, CYP2B6-, CYP2C9- und CYP3A4-Induktoren, wodurch eine funktionale AhR-, CAR- und PXR-vermittelte Regulation der jeweiligen CYP Enzymaktivität bestätigt werden konnte. Eine Sammlung von 11 Induktoren, die für CYP2B6 sowie CYP3A4 als potent, moderat potent und nicht potent klassifiziert sind wurden analysiert. Drei unterschiedliche Vorhersage-Modelle für die Induktion von CYP3A4 wurden analysiert, der (I) ‚Relative Induction Score (RIS), (II) AUCu/F2 und (III) Cmax,u. Darüber hinaus wurden PXR-selektive (Rifampicin) und CAR-selektive (Carbamazepin und Phenytoin) Induktoren für eine CYP3A4- und CYP2B6-Induktion gezeigt. Hämophilie A tritt aufgrund eines Mangels an funktionalem Faktor VIII protein (FVIII) im Blut auf. Verschiedene Zelltypen hepatischen und extra-hepatischen Ursprungs produzieren FVIII. Zellkulturüberstände von primären LSECs wurden abgenommen und hinsichtlich des Vorhandenseins von sekretiertem FVIII untersucht. Um die FVIII-Produktion zu steigern, wurden unterschiedliche upcyte® Endothelzellen, wie beispielsweise ‚blood outgrowth endothelial cells‘ (BOECs), LSECs und HDMECs, mit lentiviralen Partikeln, die ein FVIII Transgen tragen transduziert. Um eine nativere Situation widerzuspiegeln, wurden primäre HDMECs ausgewählt, um sie mittels Transduktion von FVIII lentiviralen Partikeln zu modifizieren, zu selektionieren und im Anschluss hinsichtlich ihres Potentials zur Bildung des Koagulationsfaktors FVIII zu untersuchen. KW - 3-D liver model KW - drug development KW - Therapeutical application KW - Leberepithelzelle KW - Dimension 3 KW - Zellkultur Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113155 ER - TY - THES A1 - Luckner, Sylvia T1 - Towards the development of high affinity InhA and KasA inhibitors with activity against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis T1 - Entwicklung von hoch-affinen InhA und KasA Inhibitoren gegen resistente Stämme von Mycobacterium tuberculosis N2 - Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis and responsible for more than eight million new infections and about two million deaths each year. Novel chemotherapeutics are urgently needed to treat the emerging threat of multi drug resistant and extensively drug resistant strains. Cell wall biosynthesis is a widely used target for chemotherapeutic intervention in bacterial infections. In mycobacteria, the cell wall is comprised of mycolic acids, very long chain fatty acids that provide protection and allow the bacteria to persist in the human macrophage. The type II fatty acid biosynthesis pathway in Mycobacterium tuberculosis synthesizes fatty acids with a length of up to 56 carbon atoms that are the precursors of the critical mycobacterial cell wall components mycolic acids. KasA, the mycobacterial ß-ketoacyl synthase and InhA, the mycobacterial enoyl reductase, are essential enzymes in the fatty acid biosynthesis pathway and validated drug targets. In this work, KasA was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and co-crystallized in complex with the natural thiolactone antibiotic thiolactomycin (TLM). High-resolution crystal structures of KasA and the C171Q KasA variant, which mimics the acyl enzyme intermediate of the enzyme, were solved in absence and presence of bound TLM. The crystal structures reveal how the inhibitor is coordinated by the enzyme and thus specifically pinpoint towards possible modifications to increase the affinity of the compound and develop potent new drugs against tuberculosis. Comparisons between the TLM bound crystal structures explain the preferential binding of TLM to the acylated form of KasA. Furthermore, long polyethylene glycol molecules are bound to KasA that mimic a fatty acid substrate of approximately 40 carbon atoms length. These structures thus provide the first insights into the molecular mechanism of substrate recognition and reveal how a wax-like substance can be accommodated in a cytosolic environment. InhA was purified and co-crystallized in complex with the slow, tight binding inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70). Two crystal structures of the ternary InhA-NAD+-PT70 were solved and reveal how the inhibitor is bound to the substrate binding pocket. Both structures display an ordered substrate binding loop and corroborate the hypothesis that slow onset inhibition is coupled to loop ordering. Upon loop ordering, the active site entrance is more restricted and the inhibitor is kept inside more tightly. These studies provide additional information on the mechanistic imperatives for slow onset inhibition of enoyl ACP reductases. N2 - Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose ist für mehr als acht Millionen Neu-Infektionen und ungefähr zwei Millionen Todesfälle jedes Jahr verantwortlich. Besonders die Entwicklung von multiresistenten und extrem resistenten Stämmen macht die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dringend erforderlich. Die Zellwandbiosynthese ist ein validiertes Ziel für die Chemotherapie bei bakteriellen Infektionen. Bei Mycobakterien besteht die Zellwand zum Großteil aus Mykolsäuren, sehr langkettigen Fettsäuren, die den Bakterien Schutz bieten und ihnen ermöglichen, in Makrophagen zu überleben. Mycobakterien synthetisieren in der Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) Fettsäuren bis zu einer Länge von 56 Kohlenstoffatomen, die Bestandteile der Mykolsäuren sind. KasA, die mycobakterielle ß-ketoacyl Synthase und InhA, die mycobakterielle enoyl Reductase, sind essentielle Enzyme der FAS-II und geeignete Ziele für die Entwicklung neuer Antibiotika. In dieser Arbeit wurde KasA in Mycobacterium smegmatis exprimiert und aufgereinigt. Das Protein wurde im Komplex mit dem natürlich vorkommenden Thiolacton-Antibiotikum Thiolactomycin (TLM) co-kristallisiert. Kristallstrukturen von KasA und der C171Q KasA Variante, die das acylierte Enzym-Intermediat darstellt, wurden als apo-Strukturen und im Komplex mit gebundenem TLM aufgeklärt. Die Kristallstrukturen zeigen, wie der Inhibitor an das Enzym gebunden ist und deuten darauf hin, wie das TLM Molekül verändert werden könnte, um seine Affinität für das Protein zu erhöhen und damit ein wirksames Medikament gegen Tuberkulose zu entwickeln. Vergleiche zwischen den TLM gebundenen Kristallstrukturen erklären, warum TLM bevorzugt an die acylierte Form des Enzyms bindet. Des Weiteren sind lange Polyethylenglykol-Moleküle an KasA gebunden, die ein Fettsäuresubstrat einer Länge von etwa 40 Kohlenstoff-Atomen nachahmen. Die Strukturen geben damit zum ersten Mal einen Einblick in den molekularen Mechanismus der Substrat-Erkennung und zeigen, wie eine wachsartige Substanz in einem cytosolischen Umfeld aufgenommen werden kann. InhA wurde aufgereinigt und im Komplex mit dem „slow binding“ Inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70) co-kristallisiert. Zwei Kristallstrukturen des ternären InhA-NAD+-PT70 Komplexes wurden gelöst und zeigen wie der Inhibitor in der Substratbindetasche gebunden ist. Beide Strukturen, weisen geordnete Substrat-Binde-Loops auf, die den Eingang zur „Active Site“ schließen und damit den gebundenen Inhibitor in der Tasche festhalten. Die Strukturen bestätigen damit die Hypothese, dass „Slow Binding Inhibition“ mit der Ordnung des Loops zusammenhängt. Diese Studien können als Basis für die Entwicklung weiterer „Slow Binding“ Inhibitoren verwendet werden. KW - Tuberkelbakterium KW - Multidrug-Resistenz KW - Arzneimitteldesign KW - Fettsäure-Synthase KW - Zellwand KW - Kristallstruktur KW - tuberculosis KW - multi-drug-resistance KW - drug development KW - fatty acid synthesis KW - cell wall KW - crystal structure KW - structure based drug design Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43621 ER -