TY - THES A1 - Mahmood, Zafar T1 - Effect of cytokine inhibition on peripheral memory B cells in patients with Rheumatoid arthtritis T1 - Auswirkung der Zytokinhemmung auf periphere Gedächtnis B-Zellen in Patienten mit rheumatoider Arthritis N2 - Objective: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, systemic, inflammatory autoimmune disease. Enhanced B cell activity has been proposed in the pathogenesis of RA along with different pro-inflammatory cytokines such as interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α), critically involved in chronic inflammation. Biological agents targeting these cytokines IL-6 and TNF-α have considerably advanced treatment of autoimmunity. Enhanced B cell activity, particularly memory B cells gained particularly interest in evaluating response during therapies from biologics. Human peripheral memory B cells can be distinguished by the phenotypic expression of CD27 and IgD defining three major B cell subpopulations: CD27+IgD+ pre-switch, CD27+IgD- post-switch and CD27-IgD- double negative (DN) memory B cells. Therefore, we analyzed different memory populations during cytokine inhibition by using tocilizumab (anti-IL-6R, TCZ) and adalimumab (anti-TNF-α, ADA), with focus on DN B cells Suspended. DN B cells lacking the conventional memory marker CD27, but due to their mutational Ig repertoire (IgR) considered in the memory compartment. However, only scare data are available for this DN subpopulation in RA. Methods: Phenotype analysis of activation markers (CD95 and ki-67) of B cell and their subsets were compared in RA patients (median age ~56 years) and in HD. DN memory B cells were phenotypically analyzed from RA patients during IL-6R or TNF-α inhibition at baseline week 12, week 24 and 1 year. Single B cell PCR approach was used to study Ig- receptors VH genes and isotype specific genes. Nonparametric Wilcoxon matched pair test and Mann-Whitney U test was used for statistical analysis by using GraphPadPrism 5. Univariate logistic regression was used to calculate odd ratios and correlation using Pearson r using SPSS statistics 22. Results: Surface and intracellular staining of B cells showed a significantly higher percentage of CD95 and ki-67 expressions in RA, which was highest in post-switch memory B cells followed by pre-switch and DN memory B cells. During cytokines (IL-6R & TNF-α) inhibition, both CD95 and ki-67 expression were significantly reduced at week 12 and 24 along with reduction in their clinical parameters like DAS28, CRP, ESR. Furthermore, the phenotypic analysis in 107 RA patients and 49 healthy donors (HD) showed a significantly expanded population of DN B cells in RA which contain a heterogeneous mixture of IgA, IgG and IgM expressing cells with a clear dominance of IgG+ cells. Pre-therapy analysis of rearranged IgR sequences from patients (n=9) revealed that DN B cells carry rearranged heavy chain gene sequences with a diversified mutational pattern consistent with memory B cells. In contrast to tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) inhibition, a significant reduction in mutational frequency of BCR gene rearrangements at week 12, 24 and 1 year (p < 0.0001) was observed by in vivo IL-6R inhibition. These changes were observed for all BCR isotypes IgG, IgA and IgM at week 12, 24 and 1 year (p < 0.0001). IgA-RF, IgA serum level and IgA+ DN B cells decreased significantly (p < 0.05) at week 12 and week 24 during TCZ. Patients with a good European league against rheumatism (EULAR) response to TCZ had less DN B cells at baseline as compared to moderate responders (p = 0.006). Univariate logistic regression analysis revealed that the frequency of DN B cells at baseline is inversely correlated to a subsequent good EULAR response (p = 0.024) with an odds ratio of 1.48 (95% confidence interval as 1.05-2.06). Conclusion: Both anti-TNF-α and anti-IL-6R could reduce higher B cell activity and improve disease activity tremendously in RA patients. The heterogeneous DN B cell compartment is expanded in RA and dominated by IgG isotype. TCZ can modulate the mutational status of DN Ig isotype receptors over 1 year. Interestingly, the frequency of DN B cells in RA may serve as a baseline predictor of subsequent EULAR response to TCZ. N2 - Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, systemische, und entzündliche Autoimmunerkrankung. Es wird angenommen, dass neben verschiedenen inflammatorischen Zytokinen wie beispielsweise Interleukin-6 (IL-6) und Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α) auch eine verstärkte Aktivität von B-Zellen in chronischen Entzündungsprozessen involviert ist. Biologische Agenzien, die gezielt gegen die Zytokine IL-6 und TNF-α gerichtet sind, haben die Behandlungsmöglichkeiten der Autoimmunerkrankungen wesentlich vorangetrieben. Derzeit rückt eine verstärkte B-Zell Aktivität, insbesondere die von Gedächtnis B-Zellen, bei der Evaluierung von Reaktionen auf biologische Therapien in den Focus des Interesses. Humane periphere Gedächtnis B-Zellen können anhand der Expression von CD27 und IgD phänotypisch charakterisiert werden und lassen sich dadurch in drei Subpopulationen einteilen: CD27+IgD+ prä-switch, CD27+IgD- post-switch und CD27-IgD- doppelt negative (DN) Gedächtnis B-Zellen. Wir untersuchten die verschiedenen Gedächtnis B-Zell-Populationen während der Zytokininhibierung mittels Tocilizumab (anti-IL-6R, TCZ) und Adalimumab (anti-TNF-α, ADA), wobei der Focus auf DN B-Zellen lag. DN B-Zellen fehlt der konventionelle Gedächtniszellen-Marker CD27, sie werden aber aufgrund ihres mutierten Ig-Repertoires (IgR) den Gedächtniszellen zugeordnet. Für diese DN B-Zell Subpopulation gibt es allerdings bislang nur wenige Daten im Zusammenhang mit RA. Die B-Zell Subpopulationen von RA Patienten (durchschnittliches Alter ~56 Jahre) und gesunden Spendern (englisch: healthy donors, HD) gleichen Alters als Kontrolle, wurden hinsichtlich der Aktivierungsmarker, CD95 und ki-67, phänotypisch analysiert und verglichen. DN Gedächtnis B-Zellen von RA Patienten wurden phänotypisch zu Beginn der IL-6R oder TNF-α Inhibition, nach 12 und 24 Wochen sowie 1 Jahr nach Behandlungsbeginn bestimmt. Es wurden Einzel-PCR Analysen von B-Zellen durchgeführt, um die VH Gene der Ig-Rezeptoren und spezifische Gene zu typisieren. Für die statistischen Auswertungen wurde in GraphPad Prism 5 der‚nonparametric Wilcoxon matched pair test‘ und der‚ Mann-Whitney U test‘ verwendet. Die eindimensionale logistische Regression wurde angewandt, um Odd-Ratio und Korrelationen mittels Pearson r in SPSS Statistik 22 zu berechnen. Die phänotypische Analyse der Oberflächen und intrazellulären Färbungen der B-Zellen ergab einen signifikant erhöhten Prozentsatz der CD95 und ki-67-Expression in RA-Patienten, wobei die Expression am höchsten in post-switch Gedächtnis B-Zellen, gefolgt von prä-switch und DN Gedächtnis B-Zellen, war. Während der Zytokin-Inhibierung (IL-6R & TNF-α) war sowohl die CD95 als auch ki-67-Expression zum Zeitpunkt Woche 12 und Woche 24 signifikant reduziert, einhergehend mit der Verringerung klinischer Parameter wie DAS28, CRP und ESR. Weiterhin zeigte die phänotypische Analyse von 86 RA-Patienten und 49 HD eine deutlich expandierte DN B-Zell Population in RA-Patienten. Diese setzte sich aus einer heterogenen Mischung von IgA, IgG und IgM exprimierenden Zellen zusammen, wobei IgG+ B-Zellen deutlich dominierten. Die Analyse von neu-gruppierten IgR Sequenzen von B-Zellen aus RA Patienten (n=9) vor Therapiebeginn zeigte, dass DN B-Zellen umgruppierte Gensequenzen der schweren Ketten mit diversen Mutationsmustern tragen, wie es bei Gedächtnis B-Zellen der Fall ist. Im Gegensatz zur TNF-α-Hemmung ist bei der in vivo IL-6R-Inhibierung eine signifikante Reduktion der Mutationsrate innerhalb der umgruppierten der Gene der B-Zell Rezeptoren (BCR) nach 12 und 24 Wochen sowie nach 1 Jahr (p<0,0001) zu beobachten. Diese Änderungen waren bei allen BCR Isotypen IgG, IgA und IgM bei Woche 12, 24 und 1 Jahr (p<0.0001) zu sehen. IgA-RF, IgA-Serum Spiegel sowie IgA+ DN B Zellen nahmen 12 und 24 Wochen nach Beginn der Behandlung mit TCZ signifikant ab (p<0,05). Patienten mit einer guten klinischen Besserung (EULAR Antwort) auf TCZ hatten weniger DN B-Zellen vor Therapiebeginn im Blut als Patienten, die eine moderate Reaktion zeigten. Univariate logistische Regressionsanalysen zeigten, dass die Frequenz von DN B-Zellen vor Therapiebeginn invers mit einer sich anschließenden guten EULAR Antwort korreliert. Die Odds Ratio war 1,48 (95% Konfidenz Intervall wie 1,05-2,06). Im Ergebnis hat die Studie Phänotypen von aktivierten Gedächtnis B-Zellen und deren Untergruppen in Patienten mit aktiver RA nachgewiesen. Die höhere Expression des Oberflächenmarker CD95 und des intrazellulären Marker ki-67 spiegelt die Krankheitsaktivität wieder und korreliert mit dieser positiv. Signifikant höhere Populationen von CD27-IgD- DN B-Zellen in der RA stehen jedoch unabhängig von der Krankheitsaktivität in Bezug zum Ansprechen auf die Therapie. Diese erhöhten DN B-Zellen sind eine Mischung aus somatisch mutierten Isotyp IgG, IgA und IgM exprimierenden Zellen, wobei IgG Isotypen dominieren. Die TCZ Therapie bewirkt insbesondere eine Abnahme der Frequenzen von IgA+ DN Gedächtnis B-Zellen, zusammen mit einer Abnahme des Serum-IgA und RF-IgA-Spiegels. Auf molekularer Ebene ist zu sehen, dass mutierte DN B Zellen geringere Mutationen aufweisen als prä-switch und post-switch B-Zellen. Interessanterweise sind IgA+ DN B-Zellen am meisten unter allen 3 Isotypen mutiert. Die TCZ Therapie reduziert die Mutationsrate, auch innerhalb der RGYW Hotspots, in allen DN B-Zell Isotypen über einen Zeitraum von einem Jahr. Eine geringe Anzahl von DN Gedächtnis B-Zellen vor Therapiebeginn mit TCZ (anti-IL-6R) war mit einer verbesserten klinischen Antwort korreliert. Auf Grundlage dieser aktuellen Ergebnisse erscheinen DN Gedächtnis B-Zellen als möglicher Biomarker Kandidaten zu sein, um eine Reaktion auf eine TCZ Therapie anzuzeigen. KW - Arthrosis deformans KW - Rheumatoid arthritis KW - Memory B cells KW - IL-6 Inhibition KW - Double Negative B cells KW - Interleukin 6 KW - B-Lymphozyt KW - Immunology Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117334 ER - TY - THES A1 - Muhammad, Khalid T1 - Longterm impact of anti-CD20 mediated transient B cell depletion on memory B cells in patients with rheumatoid arthritis T1 - Langzeitveränderung der Gedächtnis B-Zellen nach Anti-CD20 vermittelter B-Zelldepletion in Patienten mit rheumatoider Arthritis N2 - B-Lymphozyten leisten unterschiedliche Beiträge zur Pathophysiologie der Rheumatoiden Arthritis. Sie produzieren Autoantikörper, präsentieren Autoantigene und schütten verschiedene Zytokine, die am proinflammatorischen Prozess beteiligt sind, aus. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden in den letzten Jahren Therapien entwickelt, die gezielt B-Lymphozyten ansteuern um direkt oder indirekt in den autoimmunen Krankheitsverlauf einzugreifen. Die zeitlich begrenzte B-Zell-Depletion mit Rituximab (anti CD20-Antikörper) hat dabei in den letzten Jahren einen hohen Stellenwert erlangt und wird im klinischen Alltag insbesondere bei der Behandlung von Patienten mit rheumatoider Arthritis angewandt. Rituximab induziert im peripheren Blut bemerkenswerte Veränderungen in der Homöostase der B-Zell-Subpopulationen. Nach Therapie mit dem anti-CD20 Antikörper Rituximab beginnt die Repletionsphase mit der peripheren Aussaat von transitionalen unreifen B-Zellen. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer Normalisierung des naiven B-Zell-Pools. Das B-Zell Gedächtnis und in besonderem Maße die IgD+CD27+ Gedächtniszellen erholen sich nach Therapie nur langsam. In einer prospektiven klinischen Studie hat unsere Arbeitsgruppe gezeigt, dass die Gesamtzahl der Gedächtniszellen gut mit der Dauer der klinischen Antwort auf Rituximab korreliert. Es ist wenig über die speziellen molekularen Veränderungen innerhalb der Gedächtnis B-Zellen nach Rituximab Therapie bekannt. Um die Veränderungen im peripheren Blut zu verstehen untersuchten wir die somatische Mutationsfrequenz und das Muster der Ig-VH3 Gen Rearrangements, indem wir prä- und posttherapeutisch bei 18 Patienten einzelne B-Zellen isolierten und den individuellen B-Zellrezeptor durch eine Einzelzell RT-PCR amplifizierten und sequenzierten. Wir verglichen das Mutationsmuster nach erfolgreicher B-Zelldepletion in den neu rezirkulierenden Gedächtnis B-Zellen mit dem Mutationsmuster von vier Gesunden Blutspendern und sechs nicht-RA Patienten, die eine Hochdosis Chemotherapie mit anschließender autologer oder allogener Stammzelltransplantation erhalten hatten. Zunächst haben wir die Zusammensetzung der Gedächtniszellen im peripheren Blut analysiert. Der Phänotyp der peripheren prä-switch (IgD+CD27+) und post-switch (IgD-CD27+) Gedächtniszellen zeigte keine quantitativen Unterschiede in RA-Patienten im Vergleich zu Gesunden. Bei der direkten Analyse des B-Zell Immunglobulin Rezeptors fanden sich jedoch zwischen klassengeswitchten und ungeswitchten Gedächtnis B-Zellen signifikante Unterschiede in der Anzahl der Mutationen in der variablen Region der Ig Rezeptors. Die Population der IgD+CD27+ Gedächtniszellen beinhaltete sowohl nicht mutierte, wenig mutierte und stark mutierte (Median= 9 Mutationen pro Sequenz) rearrangierte Ig- Rezeptoren, wohingegen die IgD-CD27+ Gedächtniszellen einen durchgehend hoch mutierten (Median = 18 Mutationen pro Sequenz) Rezeptor aufwiesen. Der Unterschied zwischen beiden Gruppen war signifikant (Mutationsfrequenzen 3.83±0.19% vs. 7.1±0.53%; P=0.0001). Grundlegende Veränderungen wurden bei den rezirkulierenden ungeswitchten Gedächtniszellen (IgD+CD27+) nach vorübergehender B-Zell Depletion mit Rituximab festgestellt. Diese Zellen wurden bis 6 Jahre nach Rituximab beobachtet und zeigten eine stark verzögerte Zunahme an Mutationen im Ig-Rezeptor. Ein Jahr nach einmaliger Gabe von Rituximab waren 84% der einzelnen zirkulierenden IgD+/CD27+ B-Zellen unmutiert. Zu diesem Zeitpunkt fanden sich keine stark mutierten Ig-VH3 Gen Rearrangements (P=0.0001). Mit zunehmendem Abstand zur B-Zell depletierenden Therapie konnten in der Repopulationsphase zunehmende Zahlen an Mutationen in den B-Zell Ig Rezeptoren festgestellt werden. Beispielsweise waren während des 2. Jahres der Regeneration (P=0.0001) 7.8%, sowie nach 4 Jahren nur 14% der Ig Rezeptoren mutiert. Sogar 6 Jahre nach Behandlung, waren VH Mutationen in IgD+ Gedächtniszellen noch deutlich vermindert. Selbst nach dieser Zeit fanden sich in der prä-switch Gedächtnispopulation nur 27% hochmutierte Sequenzen während vor der passageren B-Zelldepletion 52% ein hohe Zahl an Mutationen trugen (P=0.0001). Die posttherapeutische Analyse der CDR3 Länge der regenerierten IgD+ Gedächtniszellen ergab eine erhöhte CDR3 Länge, die signifikant mit der Anzahl der nicht mutierten VH Genrearrangements während der Repletionsphase korreliert. Interessanterweise regenerierten Patienten nach Hochdosis Chemotherapie und allogener Stammzelltransplantation ihre IgD+ Gedächtniszellen mit einer deutlich höheren Anzahl an Mutationen. Ein Jahr nach Transplantation zeigten die Ig Rezeptoren schon 22% hoch mutierte und 42% unmutierte VH Rearrangements. Das zeigt, dass eine gegen CD20 gerichtete Behandlung nicht nur eine Verzögerung der Produktion der ungeswitchten Gedächtniszellen zur Folge hat, sondern darüber hinaus einen signifikanten Effekt auf die Mutationsrate im präswitch Gedächtnis B-Zellpool besitzt. Im Gegensatz zum Mutationsmuster der IgD+ Gedächtniszellen regenerierten die klassengeswitchten Gedächtniszellen nach anti-CD20 Depletion im peripheren Blut mit quantitativ normalen Mutationen im Ig Rezeptor. Interessanterweise fand sich allerdings eine Änderung der exprimierten Isotypen mit deutlicher Dominanz IgA exprimierender B Zellen. Weitere Analysen der klassengeswitchten Gedächtnis B-Zellen zeigen außerdem eine Therapie induzierte qualitative Veränderung dieses B-Zellpools. So waren posttherapeutisch die Mutationen in bestimmten T-Zell abhängigen Mutationshotspots, dem RGYW/WRCY Motiv, signifikant vermehrt (Mutationstargeting vor Therapie 27% vs. 43% nach Rituximab, P=0.0003). Dies weist darauf hin, dass die Mechanismen der Affinitätsreifung im klassengeswitchten B-Zellgedächtnis vor und nach B-Zelldepletion unterschiedlich funktionieren. Der Mutationsmechanismus selbst ist allerdings in diesen Zellen quantitativ nicht eingeschränkt. Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit zum erstem mal, dass es nach einer passageren B-Zelldepletion mit anti-CD20 Antikörpern zu einer über Jahre hinweg nachweisbaren ausgeprägten Verzögerung in der Aquisition von somatischen Mutationen in rearrangierten VH Genen der IgD+ Gedächtniszellen kommt. Demgegenüber erholt sich das klassengeswitchte B-Zellgedächtnis mit uneingeschränkter Zahl von Mutationen im Ig Rezeptor. Diese Resultate zeigen, dass anti-CD20 gerichtete Therapien in besonderem Maße IgD+ Gedächtniszellen beeinflussen. Der Selektionsdruck durch Antigene und/oder die Selektion der Ig Rezeptoren erscheint unter diesen Bedingungen speziell bei IgD-Gedächtnis B-Zellen reduziert. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass prä-switch Gedächtnis B-Zellen im Vergleich zu post-switch Gedächtnis B-Zellen andere Bedingungen für die Aktivierung der Mutationsmaschinerie benötigen. Die Resultate eröffnen neue Wege für das Verständnis der Pathophysiologie der B-Zell Gedächtnisentwicklung und können helfen neue zielgerichtete Therapien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu konzipieren. N2 - Diverse roles of B cells in the pathophysiology of rheumatoid arthritis are now well established. B cells contribute to autoimmunity by producing autoantibodies, processing autoantigen and the production of different cytokines which are involved in the inflammatory cascade. Therefore approaches to target B lymphocytes directly or indirectly are developed for clinical practice to treat autoimmune diseases including rheumatoid arthritis. Transient B cell depletion by rituximab (anti-CD20 antibody) has gained prime importance in recent years. Meanwhile anti-CD20 mediated transient B cell depletion therapy is now used with clinical efficiency in the treatment of patients with rheumatoid arthritis. Rituximab induces noteworthy changes in the homeostasis of peripheral B cell subpopulations during the repletion phase with emerging immature B cells in peripheral blood followed by normalization of the naïve B cell pool and a longterm delay in memory B cell subsets in patients with rheumatoid arthritis. Particularly IgD+CD27+ memory B cells repopulate very slowly during B cell regeneration. In a prospective clinical study, our laboratory has shown that the overall number of memory B cells correlates well to the duration of clinical response to rituximab. Little is known about the particular molecular changes in the memory B cell repertoire after rituximab therapy. To better understand peripheral memory B cell subsets, we explored in detail the somatic mutational frequency and pattern of Ig-VH3 gene rearrangements by using a single B cell sorting technique followed by nested PCR before and up to 6 years after rituximab therapy in 18 RA patients. We compared rituximab inflicted dynamics of mutational acquisition to memory B cell repopulation in 4 healthy donors and 6 non RA patients undergoing high dose chemotherapy followed by autologous or allogeneic stem cell transplantation (SCT). Firstly we analyzed the peripheral composition of memory B cell subsets. The phenotypic analysis of peripheral pre-switch (IgD+CD27+) and post-switch (IgD-CD27+) memory B cells did not reveal any quantitative differences in RA patients prior to B cell depletion therapy compared to healthy donors. However extending those studies in directly analysing the B cell immunoglobulin receptor from individual B cells of RA patients and healthy controls brought interesting results. Pre-switched and post-switched memory B cells showed a highly significant difference in the amount of mutations/sequence. The population of IgD+CD27+ memory B cells is comprised of non-mutated, low and highly mutated (median= 9 mutations/ sequence) rearranged Ig receptors whereas the IgD-CD27+ memory B cell compartment shows quite uniformly highly mutated (median 18 mutations/ sequence) sequences indicating a significant difference between these two groups (mutational frequencies 3.83±0.19% vs. 7.1±0.53%; P=0.0001). Profound changes were noted in the re-emerging pre-switch memory B cells (IgD+/ CD27+) after transient B cell depletion with rituximab. These cells showed over a time period of 6 years after treatment with rituximab significantly delayed acquisition of mutations in Ig receptors on the single B cell level. One year after a single course of rituximab 84% of single repopulating IgD+/CD27+ B cells were unmutated and no highly mutated Ig-VH gene rearrangements were found(P=0.0001). Over time increasing numbers of mutations could be detected i-e 7.8% during 2nd year of regeneration (P=0.0001), 14% after 4 years (n=2). Nevertheless even 6 years after rituximab, VH mutations in IgD+ memory B cells were still reduced with 27% highly mutated sequences compared to 52% pre therapy(P=0.0001). Post-therapy analysis of CDR3 length of regenerated IgD+ memory B cells revealed increased CDR3 length which also correlates well with elevated number of non-mutated VH gene rearrangements observed during repletion phase. In comparison patients undergoing high dose chemotherapy followed by allogeneic stem cell transplantation repopulated IgD+ memory cells earlier with higher numbers of mutations in IgD+ memory B cells. One year after transplantation Ig receptors showed already 22% highly mutated and 42 % unmutated VH rearrangements. These findings indicated that anti-CD20 mediated B cell depletion seems not only to delay the production of pre-switch memory B cells but also significantly affects the acquisition of mutations in the IgD+ memory B cell pool. In contrary to the mutational pattern of IgD+ memory B cells after rituximab class switched memory B cells repopulate in the periphery with quantitatively normal mutations in their Ig receptors. Although the numeric replenishment of these recirculating class-switched memory B cells was also reduced after rituximab, we found no delay in quantitative acquisition of mutations also an increased proportion of IgA expressing B cells in this memory B cell subset was detected. Our data showed that post-therapy mutational targeting in RGYW/WRCY motifs were significantly increased as compared with that of pre-treatment (27% before rituximab vs. 43% after therapy, P=0.0003) indicating that affinity maturation may operate differently in class-switched memory B cells before and after B cell depletion. These results indicate a normal development process with an unimpaired mechanism of mutational acquisition in class-switched memory B cells. These data argue for different requirements to undergo somatic hypermutations in IgD+ memory B cells in comparison to class switched memory B cells. To conclude, our work has demonstrated for the first time a delayed acquisition of somatic hypermutations at single Ig receptor VH gene rearrangements of IgD+ memory B cells in comparison to class-switched memory B cells. These results demonstrate that IgD+ memory B cells are particularly susceptible to anti-CD20 treatment in patients with rheumatoid arthritis. In addition antigenic pressure and/or selection are substantially reduced by rituximab therapy which is basically not seen in the class-switched memory compartment. These data are in line with the hypothesis that IgD+ memory B cells have distinct requirements for activating their mutational machinery compared to class-switched memory B cells which recover normal mutations during regeneration phase. The results have implications in understanding the pathophysiology of memory B cell in rheumatoid arthritis and may be helpful in designing new targeted therapies. KW - Rheumatoider arthritis KW - rheumatoide Arthritis KW - B-Zellen KW - Rheumatoid arthritis KW - memory B cells Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36319 ER - TY - THES A1 - Palanichamy, Arumugam T1 - Influence of transient B cell depletion on recirculating B cells and plasma cells in rheumatoid arthritis T1 - Einfluss von passagerer B-Zelldepletion auf rezirkuliriende B-Zellen und Plasmazellen bei Rheumatoider Arthritis N2 - Die zentrale Rolle der B-Zellen in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen hat in den letzten Jahren zu unterschiedlichen therapeutischen Ansätzen geführt, B-Zellen direkt oder indirekt zu targetieren. Ein Beispiel hierfür stellt der monoklonale anti-CD20 Antikörper Rituximab dar. Derzeit ist wenig über das Regenerationsverhalten von B-Zellen nach Therapie mit Rituximab bekannt. Daher untersuchten wir die frühe Regnerationsphase und die Veränderungen des B-Zellrepertoirs. Am Beispiel der VH4 Familie der Immunglobulin schweren Ketten analysierten wir die Modulation des Immunglobulinrezeptor Repertoires durch die passagere B-Zelldepletion. Insgesamt wurden bei 5 Patienten 3 Zeitpunkte analysiert: vor Therapie, in der frühen Regenerationsphase (ERP- early regeneration period, mit einem B-Zellanteil > 1% im peripheren Blut) und in der späten Regenerationsphase (LRP- late regeneration period, 2-3 Monate nach der frühen Regenerationsphase). Bei 3 Patienten (A-C) wurden die Ig-VH4 Gene aus genomischer DNA amplifiziert und zu o.g. Zeitpunkten analysiert. Bei weiteren 2 Patienten (D und E) erfolgte die Analyse der Ig Gene in einzelnen B-Zellen mittels Einzelzellsortierung und Einzelzell RT-PCR. Die B-Zellregeneration nach Therapie mit Rituximab zeigte ein charakteristisches Regenerationsmuster mit einer Dominanz von unreifen CD10+ B-Zellen und CD38hi Plasmazellen während der frühen Phase der B-Zellrekonstitution. Im weiteren Verlauf kam es zu einer Abnahme dieser Zellen und einem Anstieg von naiven B-Zellen. Auf der molekularen Ebene zeigte sich vor und nach B-Zelldepletion eine unterschiedliche Nutzung der Ig-VH4 Gene. Mini Gene wie VH4-34 und VH4-39, die in Verbindung mit Autoimmunität stehen, waren vor Einleitung der Therapie überexprimiert. Durch die Behandlung mit Rituximab kam es zu einer Veränderung des Repertoires der regenerierenden B-Zellen mit einer reduzierten Benutzung der VH4-39 Gene im B-Zellpool. Tief greifende Veränderungen fanden sich im regenerierenden Repertoire, mit einem relativen Anstieg von stark mutierten (>=9 Mutationen / Ig Sequenz) B-Zellen.. Die Immunphänotypisierung zeigte, dass diese hochmutierten B-Zellen den Ig-klassengeswitchten Gedächtnis B-Zellkompartiment, insbesondere den Plasmazellen zughörig sind. Um diese Hypothese zu untermauern, erfolgte bei 2 Patienten eine Einzelzellsortierung dieser Plasmazellen während der frühen Regenerationsphase, welche einen vergleichbaren Mutationsstatus zeigte. Da Plasmazellen kein CD20 Molekül exprimieren, werden sie durch eine Therapie mit Rituximab nicht direkt eliminiert. Allerdings zirkulieren sie nicht im peripheren Blut während der Phase der B-Zelldepletion. Während der frühen Regenerationsphase (ERP) lassen sie sich in der Peripherie erneut nachweisen. Es wurde deshalb untersucht ob auch Plasmazellen durch die Therapie moduliert werden, obwohl sie nicht direkt durch Rituximab targetiert werden. In diesem Zusammenhang erfolgte eine detaillierte Analyse des Mutationsmusters der Plasmazellen vor Therapie und während der frühen Regenerationsphase. Die Analyse der Mutationshäufigkeit in RGYW/WRCY Hotspot Motive (R=purine, Y=pyrimidine, W=A/T) erlaubt Abschätzung in wieweit die somatische Hypermutation der B-Zellen durch T-Zell abhängige Differenzierung erfolgte. Die Plasmazellen vor Therapie zeigten einem verminderten Targeting der RGYW/WRCY Motive. Im Gegensatz hierzu zeigte sich in den rezirkulierenden Plasmazellen während der frühen Regenerationsphase ein zunehmendes Targeting der RGYW/WRCY Motive. Dies spricht für einen Repertoire Shift zu mehr T-Zellabhängigen B-Zell Mutation. Ein Zusatand, wie er bei Gesunden beobachtet wird. Um die Hypothese der Rituximab-induzierten Plasmazell Modulation zu stützen wurde die R/S- Ratio (replacement to silent mutations ratio) der hypervariablen Regionen (CDRs) der Plasmazell Ig Sequenzen bestimmt. In unserer Studie war die mittlere R/S Ratio der CDRs der Plasmazellen vor Therapie entsprechend relativ niedrig (1.87). Interessanterweise kam es in der frühen und späten Regenerationsphase zu einer signifikant erhöhten R/S Ration in den rezirkulierenden Plasmazellen mit Werten von 2.67 bzw. 3.60. Die verminderte R/S Ratio in den CDRs der Plasmazellen kann als Entwicklung des Ig-Repertoires durch positive Antigenselektion interpretiert werden und weist damit eine Therapie induzierte Veränderung auf, die dem entspricht wie man sie bei Gesunden findet. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass die passagere B-Zelldepletion mit Rituximab zu einer Modulation des Plasmalzellkompartimentes führt, welches nicht direkt durch die Therapie targetiert wird. Die Modulation der Plasmazellen bei der RA kann eventuell auch als möglicher Biomarker entwickelt werden, um ein Ansprechen auf die Therapie vorherzusagen. Dies muss im Weiteren untersucht werden, um tiefer greifende Einblicke in Prozesse zu erlangen, die durch zukünftige Therapien beeinflussbar werden. N2 - B cells play diverse roles in the immunopathogensis of autoimmune diseases several approaches targeting B cell directly or indirectly are in clinical practice in the treatment of autoimmunity. In this regard, temporal B cell depletion by rituximab (anti CD20 antibody) is being appreciated and gaining more importance in recent years. To date, little is known about the regeneration profile of B cells following B cell depletion. We wanted to investigate the early replenishing B cells and examine the dynamic changes in the repertoire. we studied the immunoglobulin receptor (IgR) modulation of Ig-VH4 genes as representative of the heavy chain family. Five patients were included in the study and therapy induced alterations were assessed. Three time points namely before therapy, early regeneration phase (ERP- the early time point during regeneration where just above 1% B cells were found in the peripheral lymphocyte pool) and later regeneration phase (LRP- which commenced 2-3 months following ERP) were chosen. In three patients (A-C), Ig-VH4 genes were amplified from total genomic DNA during the above-mentioned all time points and in another two patients (D and E), Ig genes during ERP were studied by single cell amplification technique. Firstly, B cell regeneration followed the characteristic regeneration pattern as reported by several groups, with a predominant circulation of CD38hi expressing plasma cells and immature B cells in the ERP. During LRP, the proportion of these cells reduced relatively and the levels of naïve B cells rose gradually. On a molecular level, Ig-VH4 variable gene usage prior and post B cell depletion was determined and it was noticed that a diverse set of Ig-VH4 genes were employed in the repertoire before and after therapy. Mini gene segments such as VH4-34 and VH-4-39, which were reported to be connected with autoimmunity, were over expressed in the B cell repertoire before therapy. Profound changes were noticed in the early reemerging repertoire with a relatively increased population of intensely mutated B cells. These B cells acquired >=9 mutations in the Ig genes. Immunophenotyping with specific surface markers revealed that these highly mutated B cells evolve from the isotype-switched memory compartment especially the plasma cells. To support the hypothesis that the highly mutated B cells observed during ERP were plasma cells we carried out single cell amplification of individual plasma cells in another two patients during ERP and compared the mutational load, which remained similar. Actually plasma cells do not express CD20 on their surface and are not eliminated by rituximab therapy. However they were not observed in the peripheral blood following B cell depletion. The earliest time point when plasma cells are found again in peripheral circulation is the early recovery period (ERP). Therefore, it was intriguing to ascertain if the plasma cells were also modulated by rituximab therapy although they were not directly targeted by the therapy. We investigated if there is a therapy mediated mutational modulation of the plasma cells though these are not directly targeted by the therapy. We examined the confinement of mutations to the pre-defined RGYW/WRCY hotspot motifs (R=purine, Y=pyrimidine, W=A/T) in the plasma cells, which provides information on the involvement of T cells in B cell somatic hypermutation (SHM). Plasma cells before rituximab manifested the characteristics of active disease, which was revealed by restricted mutational targeting to the RGYW/WRCY motifs. The reemerging plasma cells during ERP had an increased targeting of the RGYW/WRCY motifs which indicated for a more pronounced T cell mediated B cell mutations which is the scenario observed in the healthy subjects. To further support the hypothesis of rituximab-mediated plasma cell modulation, we delineated the replacement to silent mutations ratio (R/S) in the hypervariable regions (CDRs) of the plasma cell Ig sequences. Within our study, the mean R/S ratio in the plasma cell CDRs of the patient group was relatively low (1.87) before rituximab treatment and interestingly this ratio increased significantly in the recirculating plasma cells to values of 2.67 and 3.60 in ERP and LRP status respectively. The increase in R/S ratios in reemerging plasma cells can be interpreted as a shaping of the Ig-repertoire by positive antigen selection as seen in healthy individuals. To conclude, our study demonstrates temporal B cell depletion by rituximab therapy seems to modulate also the plasma cell compartment, which is not directly targeted by the therapy. Modulation of plasma cells in RA could be also used as a potential biomarker in studying the effective response in RA treatment. This needs to be further explored to gain deeper insights into the underlying processes, which may be influenced by future therapies. KW - B-zellen KW - Rituximab KW - Gelenkrheumatismus KW - B cells KW - Rituximab KW - Rheumatoid arthritis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25132 ER -