TY - THES A1 - Mönch, Romana T1 - The Growth Factor PDGF and its Signaling Pathways in Colorectal Cancer T1 - Der Wachstumsfaktor PDGF und seine Signalwege im Kolorektalkarzinom N2 - A successful therapy for colorectal cancer (CRC), one of the most common malignancies worldwide, requires the greatest possible research effort. Of critical importance is an understanding of the relevant intracellular networks of signaling cascades, their activation, and the resulting cellular changes that are a prerequisite for a more successful CRC therapy. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and the appropriate VEGF receptors represent molecular targets that have already been successfully implemented in the clinic (i.e. using monoclonal antibodies, tyrosine kinase inhibitors). However, for platelet derived growth factor (PDGF) and the relevant PDGF receptors, there are currently no clinically approved molecular therapeutics available. However, there are preliminary data to show that PDGF and its associated signaling pathways play an important role in CRC progression. In particular, the PI3K/Akt/mTOR pathway is emerging as an important intracellular partner of PDGF with which to control proliferation, migration, and angiogenesis in tumor cells. Therefore it was the objective of this work to investigate the multifactorial influence of PDGF on proliferation and metabolism, depending on CRC mutation status. The intention was to identify new therapeutic targets for future cancer therapy through analyses of PDGF-induced intracellular changes. For this purpose two human colorectal cancer cell lines were analyzed at gene and/or protein level for components of the PI3K/Akt/mTOR and MAPK signaling pathway, c-Myc, p53, and HIF1α (hypoxia-inducible-factor 1α). Changes in proliferation and metabolism, either during stimulation with PDGF and/or PI3K/Akt/mTOR inhibition, were also investigated. Experiments conducted at protein level during PDGF stimulation and/or PI3K/Akt/mTOR inhibition revealed changes in signaling pathways and crosstalk. The influence of the tumor suppressors (retinoblastoma, Rb), oncogenes (c-Myc, p53mut), and HIF1α during stimulation with PDGF, and their interactions in the tumor cell with respect to proliferation and glycolysis warrant further examination in terms of clinical treatment options. Investigations at the gene level of ex vivo samples (UICC I-IV) complete the study with regards to the clinical relevance of PDGF. PDGF stimulation increases tumor cell proliferation in HT29 cells via the PI3K/Akt/mTOR pathway rather than the MAPK pathway. However, if the PI3K/Akt/mTOR pathway is pharmacologically blocked, PDGF stimulation is mediated by inhibitory crosstalk through the MAPK pathway. Further analyses revealed that specific Akt inhibition impedes tumor cell growth, while PI3K inhibition had little effect on proliferation. Inhibitory crosstalk was found to be responsible for these different effects. Careful intervention strategies are therefore required if future therapies intend to make use of these specific signaling pathways. One aim of future research should be to gain a better understanding of the crosstalk between these signaling pathways. In this fashion, “over-inhibition” of the signal pathways, which would result in additional clinical side effects for patients, could be prevented. In late stage UICC, more mutation events occur, with tumorigenicity promoted by an increased mutation rate. Given that PDGF is increasingly expressed in the late UICC stages, our data would indicate that PDGF's effects are amplified with increasing malignancy. The activating effect of PDGF on the PI3K/Akt/mTOR pathway and subsequent changes in the activity of p53mut, Rb, c-Myc, and HIF1α, lead to an unfavorable prognosis for colon cancer patients. PDGF acts on colon cancer cells in an Akt-activating, glycolysis-dependent manner. PDGF increases glycolysis and the ability of CRC cells to adjust their energy metabolism. These activities should be taken as possible starting points with which to design therapeutic interventions for CRC therapy. PDGF, as another representative of the growth factor family, seems to play a similar role to VEGF in CRC. The data from this study underline the importance of the PDGF - PI3K/Akt/mTOR pathway-axis and its potential as a possible target in colorectal cancer. Thus PDGF represents an attractive therapeutic target, besides the VEGF/EGFR-based therapies already used in CRC. N2 - Die erfolgreiche Therapie von Darmkrebs, eine der häufigsten malignen Erkrankungen weltweit, erfordert den größtmöglichen Forschungsaufwand. Von entscheidender Bedeutung ist das Verständnis der maßgeblichen intrazellulären Vernetzungen der Signalkaskaden, deren Aktivierung und die daraus resultierenden zellulären Veränderungen als Vorrausetzung einer erfolgreicheren Darmkrebstherapie. Der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und die entsprechenden VEGF Rezeptoren stellen molekulare Ziele dar, die im Kolorektalkarzinom bereits erfolgreich in die Klinik implementiert wurden (wie zum Beispiel monoklonale Antikörper oder Tyrosinkinaseinhibitoren). Für den Wachstumsfaktor Platelet Derived Growth Factor (PDGF) und den entsprechenden PDGF Rezeptoren stehen jedoch noch keine klinisch zugelassenen molekularen Therapeutika zu Verfügung. Allerdings zeigen erste Daten, dass PDGF und seine zugehörigen Signalwege auch eine wichtige Rolle in der Tumorprogression spielen. Insbesondere der PI3K/Akt/mTOR Signalweg kristallisiert sich als wichtiger intrazellulärer Partner von PDGF heraus, um die Proliferation, Migration und Angiogenese in Tumorzellen zu steuern. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, den multifaktoriellen Einfluss von PDGF auf die Proliferation und den Metabolismus, abhängig vom Mutationsstatus, im CRC näher zu untersuchen. Neue therapeutische Angriffsziele für eine zukünftige Tumortherapie sollen durch Analyse der PDGF-bedingten intrazellulären Veränderungen gefunden werden. Hierfür wurden zwei humane Kolorektalkarzinom Zelllinien auf Gen- und/oder Proteinebene auf Komponenten des PI3K/Akt/mTOR- und des MAPK-Signalwegs, auf c-Myc, p53 und HIF1α (Hypoxia-inducible-factor 1α) analysiert. Ferner wurden Änderungen der Proliferation und des Metabolismus jeweils unter Stimulation mit PDGF bzw. PI3K/Akt/mTOR Inhibition untersucht. Durchgeführte Proteinuntersuchungen unter PDGF Stimulation bzw. PI3K/Akt/mTOR Inhibition offenbarten Veränderungen in den Signalwegen und des Crosstalks. Auch die Beeinflussung der Tumor Suppressoren (Retinoblastoma, Rb), Onkogenen (c-Myc, p53mut) und HIF1α unter PDGF Stimulation und deren Zusammenspiel in der Tumorzelle hinsichtlich Proliferation und Glykolyse rechtfertigen im Hinblick auf klinische Therapiemöglichkeiten weitere Untersuchungen. Die Genuntersuchung von ex vivo Gewebeproben (UICC I-IV) komplettieren die Untersuchung unter Beachtung der klinischen Relevanz von PDGF. Die PDGF Stimulation steigert die Tumorzellproliferation in den HT29 Kolonkarzinom Zellen über den PI3K/Akt/mTOR Signalweg anstatt über den MAPK Signalweg. Allerdings wird die Stimulation mit PDGF durch den inhibitorischen Crosstalk über den MAPK Signalweg vermittelt, sollte der PI3K/Akt/mTOR Signalweg durch pharmakologische Inhibition blockiert sein. Die weitergehende Analyse hat gezeigt, dass eine spezifische Akt Inhibition das Tumorzellwachstum hemmt, während eine PI3K Inhibition kaum Einfluss auf die Proliferation besitzt. Der inhibitorische Crosstalk ist für diese unterschiedlichen Effekte verantwortlich. Sorgfältige Interventionsstrategien sind daher erforderlich, wenn man diese spezifischen Signalwege zukünftig therapeutisch ausnutzen möchte. Daher sollte ein besseres Verständnis der Crosstalks zwischen diesen Signalwegen Ziel zukünftiger Forschung sein. Auf diese Weise könnte auch eine „Über-Inhibition“ der Signalwege verhindert werden, die zusätzliche klinische Nebenwirkungen für die Patienten zur Folge hätte. In den späten UICC Stadien treten vermehrt Mutationen auf, die die Kanzerogenität mit steigender Mutationsrate fördert. Angesichts der Tatsache, dass PDGF in den späten UICC Stadien verstärkt exprimiert wird, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Effekte von PDGF die erhöhte Malignität verstärken. Der aktivierende Effekt von PDGF auf den PI3K/Akt/mTOR Signalweg und nachfolgende Aktivitätsänderungen von p53mut, Rb, c-Myc und HIF1α führen zu einem ungünstigen Verlauf bei Patienten mit Kolorektalkarzinom. PDGF wirkt auf Darmkrebszellen in einer Akt- aktivierenden, Glykolyse-abhängigen Art und Weise. PDGF steigert die Glykolyse und die Fähigkeit der kolorektalen Karzinomzellen, ihren Energiemetabolismus unter PDGF Stimulation anzupassen. Diese Aktivitäten sollten als mögliche therapeutisch nutzbare Ausgangspunkte verwendet werden, um Therapieansätze für das kolorektale Karzinom zu entwerfen. PDGF, als weiterer Vertreter aus der Familie der Wachstumsfaktoren, scheint eine vergleichbare Rolle wie VEGF im kolorektalen Karzinom zu spielen. Die Daten dieser Studie unterstreichen die Wichtigkeit der PDGF - PI3K/Akt/mTOR Signalwegsachse und deren Potential für ein mögliches Angriffsziel im kolorektalen Karzinom. PDGF stellt somit ein interessantes therapeutisches Ziel neben der bereits genutzten VEGF/EGFR – basierten Therapie im kolorektalen Karzinom dar. KW - PDGF KW - PI3K/Akt/mTor pathway KW - Proliferation KW - metabolism KW - PDGFR KW - Dickdarmkrebs KW - Signaltransduktion KW - Platelet-derived Growth Factor Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139100 ER - TY - THES A1 - Flemming, Johannes T1 - Der Einfluss von Erythropoetin auf die neuronale Differenzierung von murinen, induzierten pan neuralen Progenitorzellen T1 - The impact of erythropoietin on the neural differentiation from murin, induced pan neural progenitor cells N2 - Die Forschung mit induzierten pluripotenten Stammzellen (ipS) wurde in den letzten Jahren ein wichtiger Bestandteil der Stammzellforschung. Bisher sind nur wenige Möglichkeiten bekannt, wie man die unspezifische Proliferation der aus ipS differenzierten pan neuralen Progenitorzellen kontrollieren kann. Um dies weiter zu untersuchen, wurden murine induzierte Stammzellen, die mit den 4 Faktoren Oct4, Klf4, Sox2 und c-Myc reprogrammiert wurden, untersucht. In diversen Forschungsreihen konnte zudem gezeigt werden, dass Erythropoetin (EPO) einen Einfluss auf das Zellüberleben, die Proliferation und die Differenzierung neuronaler Zellen hat. Ob dieser Einfluss auch bei induzierten pan neuralen pluripotenten Progenitorzellen zu beobachten ist, wird in dieser Arbeit untersucht. Anhand eines Zellviabilitätsversuchs (MTT-Assay) wurde untersucht, ob die Stoffwechselaktivität durch EPO (0,1U/ml, 1 U/ml und 10 U/ml) im Vergleich zur Kontrollgruppe gesteigert werden kann. Dabei zeigte sich eine deutliche Zunahme nach 24 Stunden bei 1 und 10 U/ml EPO. Der Einfluss von EPO auf die Proliferation der Zellen wurde an Neurosphären unter Einsatz verschiedener EPO-Konzentrationen (0,1U/ml, 1U/ml und 10U/ml) sowie ohne EPO (Kontrollgruppe) untersucht. Dabei zeigte sich eine Reduzierung der Sphärenanzahl mit einem Durchmesser von >100µm bei zunehmender EPO-Konzentration. Im Gegensatz hierzu stieg die Anzahl der Sphären mit einem Durchmesser von 50-100µm. Die neuronale Differenzierung wurde durch den Zellfortsatz-Versuch mit Tuj1 positiven Zellfortsätzen in einer Monolayer-Kultur beobachtet. Dabei zeigte sich unter EPO eine Zunahme der Zellen mit einem Fortsatz. Ebenso wurde eine Durchflusszytometrie zum Nachweis der Proliferationshemmung durch EPO durchgeführt. Dazu wurden die Zellen mit CFSE markiert und mit einer EPO- oder Kontrolllösung versetzt. Dabei zeigte sich bei zunehmender EPO-Konzentration eine deutliche Zunahme der CFSE-Konzentration nach 48 und 72 Stunden. Der Nachweis, dass die Zellen auf EPO reagieren, wurde durch einen Western Blot erbracht. Dieser zeigte, dass die verwendeten 4F induzierte pan neurale Progenitorzellen (4F ipNP-Zellen) einen funktionellen EPO-Rezeptor besitzen, dessen Expression durch EPO deutlich gesteigert werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass EPO die Proliferation der Zellen vermindert, gleichzeitig aber auch die Zellviabilität und die Zelldifferenzierung erhöht. Diese Ergebnisse sind jedoch von vielen Faktoren abhängig, sodass noch einiges auf diesem Gebiet zu erforschen bleibt. N2 - In the last years induced stem cells have become an important part of the stem cell research. Until now there are just few possibilities known of how to control the unspecific proliferation of differentiated pan neural progenitor cells. For further research induced murine stem cells which have been reprogramed with the 4 factors oct4, klf4, sox2 and c-myc were used. Other research showed that Erythropoetin (EPO) has an impact on cell survival, proliferation and differentiation of neuronal cells. This thesis analyzes if EPO also shows these effects on induced pan neural progenitor cells. The cell viability has been analyzed via an MTT-assay. The results showed an increase of activity of the cell metabolism after 24 hours with 1 and 10U/ml EPO compared to a placebo group. The impact of EPO on the proliferation of cells has been analyzed on neurosphere cultures. Therefore groups of neurophere cultures treated with different EPO concentrations (0,1U/ml, 1U/ml and 10U/ml) were compared to a placebo group. The results showed a reduction of neurospheres with a diameter from >100µm when the EPO concentration was increased. On the contrary the number of neurospheres with a diameter from 50-100µm increased. The neuronal differentiation has been analyzed with a Tuj1 positive cell process assay in a monolayer culture. The number of cells with one process increased in the EPO group compared to the placebo group. Additionally a FACS was used to proof the proliferation inhibition of EPO. Therefore the cells were marked with CFSE and added to a placebo or EPO (1U/ml and 3U/ml) solution. A significant rise of CFSE concentration with an increasing EPO concentration after 48 and 72 hours could be shown. A western blot further showed the impact of EPO on the cells: It was shown that the used 4 factor induced pan neural progenitor cells (4F ipnp-cells) possess a functional EPO receptor whose expression can be raised through EPO. It was shown that EPO reduces the proliferation, but increases the cell viability and cell proliferation. These results are dependent on many factors. Therefore more research is needed. KW - induzierte Stammzellen KW - induced stem cells KW - Erythropoetin KW - neuronale Differenzierung KW - Proliferation KW - erythropoietin KW - neuonal differentiation KW - proliferation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151268 ER -