TY  - THES
A1  - Käppler, Ulrich
T1  - Synthese und Testung nichtpeptidischer Cystein-Protease-Inhibitoren - Etacrynsäure als Leitstruktur
T1  - Synthesis and evaluation of non-peptidic cysteine protease inhibitors - etacrynic acid as lead compound
N2  - Cystein-Proteasen sind in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischen Prozesse involviert. Auch bei humanpathogenen Parasiten sind sie weit verbreitet und für das Überleben der Erreger essentiell. Substanzen, die diese Proteasen hemmen, könnten daher bei vielen Indikationen als neue Arzneistoffe eingesetzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden nichtpeptidische Cystein-Proteaseinhibitoren synthetisiert, die als elektrophile Gruppe ein a,b-ungesättigtes Keton enthalten, und den Cysteinrest im aktiven Zentrum der Proteasen in einer Michael-Reaktion addieren. Als Leitstruktur diente das Diuretikum Etacrynsäure, dessen Struktur an verschiedenen Positionen modifiziert wurde. Der Hauptsyntheseweg kann wie folgt beschrieben werden: Die Acylseitenkette gewünschter Kettenlänge wurde durch Friedel-Crafts-Acylierung in entsprechend substituierte Anisole eingeführt. Diese wurden in einer unmittelbar anschließenden Reaktion zu acylierten Phenolen gespalten, die in einem Folgeschritt mit Bromessigsäureethylester zu acylierten Phenoxyessigsäureethylestern verethert wurden. In diese wurde in a-Position zum Keton eine Doppelbindung eingeführt. Über eine Mannich-Reaktion mit N,N,N’,N’-Tetramethyldiaminomethan/Acetanhydrid oder Urotropin/Acetanhydrid erhält man so die acylierten Phenoxyessigsäureethylester mit a,b-ungesättigter Ketonstruktur. Zur Darstellung der entsprechenden ungesättigten Säuren aus den acylierten Phenoxyessigsäureethylestern bedient man sich einer basenkatalysierten Aldokondensation mit Formaldehyd, unter deren Bedingungen der Ethylester zur Säure gespalten wird. Kupplung von Etacrynsäure mit Aminen unter Aktivierung mit DCC/N-Hydroxysuccinimid führte zu den Etacrynsäureamiden. Methylierung der acylierten Phenole und anschließende Mannich-Reaktion dient der Darstellung der acylierten Anisole mit a,b-ungesättigter Ketonstruktur. Auf diesem Syntheseweg wurden 28 Derivate mit Michael-System synthetisiert. Diese wurden an den Cystein-Proteasen Papain, Cathepsin B (CB), Falcipain (FP) und Rhodesain (RD) getestet. Gegen Serin-Proteasen wurde keine Hemmung festgestellt. Die meisten Inhibitoren zeigten bei CB, FP und RD eine nicht-zeitabhängige Kinetik der Enzyminaktivierung. Nur bei Papain wurde eine zeitabhängige Kinetik beobachtet. Die Substanzen wurden zwar als irreversible Inhibitoren konzipiert, Dialyseversuche beweisen jedoch eine reversible Hemmung. Da eine Vergleichssubstanz ohne aktivierte Doppelbindung unwirksam ist, kann von einer kovalenten Reaktion mit den Cystein-Proteasen ausgegangen werden. Bestimmt wurden die Dissoziationskonstanten Ki der Enzym-Inhibitor-Komplexe EI als Maß für die Affinitäten der Inhibitoren zum Enzym und, soforn möglich, auch die Alkylierungsgeschwindigkeitskonstanten ki der Reaktion zu modifiziertem Enzym E-I. Eine allgemeine Selektivität für einzelne Enzyme konnte nicht gefunden werden. Die besten Inhibitoren (Ki = 3.2 - 57.5 µM) waren die Etacrynsäureamide. Die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass wie erwartet das a,b-ungesättigte System essentiell für die Wirksamkeit an Cystein-Proteasen ist, ebenso ein aromatischer Ring. Eine längere Seitenkette an der Doppelbindung, die mindestens einen Ethylrest trägt, sowie zwei benachbarte Halogenatome am aromatischen Ring erwiesen sich als wirkungssteigernd. Ester und Amide zeigten generell bessere Hemmeigenschaften als die freien Säuren. Methoxy-Gruppen am Aromaten hatten keinen Wirkungsverlust zur Folge, senken aber die Löslichkeit in wässrigem Medium. Viel versprechend ist auch der [5-Chlor-2-(2-methylenbutyryl)-phenoxy]-essigsäureethylester, der das a,b-ungesättigte Doppelbindungs-System in ortho-Position zum phenolischen Sauerstoffatom trägt. Innerhalb der Amide sind kurze, voluminöse Reste wie der tertButylrest von Vorteil, eine gewisse Selektivität wird mit langkettigen Amiden wie dem n-Hexylamid für FP gegenüber CB und RD erreicht. Die Verbindungen wurden auf die Wachstumshemmung von grampositiven und gramnegativen Problemkeimen, sowie auf die Hemmung der Biofilmbildung grampositiver Erreger getestet. Bei gramnegativen Keimen wurde das Wachstum nicht gehemmt. Bei den grampositiven Keimen Staphylococcus aureus und S. epidermidis wirkten ebenfalls der Etacrynsäureethylester und das Hexylamid, Benzylamid, Anilid der Etacrynsäure am besten (MHK = 5 - 20 µM). Die genannten Verbindungen zeigten auch die stärkste Hemmwirkung auf die Biofilmbildung (100 % bei 20 - 40 µM bis zu 95 % bei 2.5 - 5 µM an S. aureus). Aufgrund positiver Screeningergebnisse in einem enzymatischen HPLC-Assays an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) wurden Docking-Experimente mit Etacrynsäure-tertbutylamid an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) durchgeführt. Die Ergebnisse führten zur Synthese einer modifizierten Verbindung, die eine geringe Verbesserung der Enzyminhibition im fluorimetrischen Assay zeigte.
N2  - Cysteine proteases are involved in a variety of physiological and pathophysiological processes. They are wide-spread in pathogenic parasites as well and are essential for the survival of the pathogens. Compounds which inhibit these proteases could serve as new pharmaceuticals for many therapeutic indications. In the present work non-peptidic cysteine protease inhibitors, which contain an a,b-unsaturated ketone as electrophilic group and which are able to add the cysteine residue of the proteases’ active site in a Michael-type reaction, were synthesized. The diuretic etacrynic acid was used as lead compound, its structure was modified in several positions. The main synthetic pathway is as follows: the acyl side chain of the desired length was introduced in correspondingly substituted anisoles via a Friedel-Crafts acylation. The yielded acylated anisols were cleaved to the acylated phenols in a consecutive reaction. They were transferred to the acylated phenoxy acetic acid esters in a following step with bromo acetic acid ethyl ester. A double bond was introduced into the acylated phenoxy acetic acid esters in a-position of the ketone. The acylated phenoxy acetic acid ethyl esters with an a,b-unsaturated ketone moiety are yielded via a Mannich reaction with N,N,N’,N’-tetramethyl-diaminomethane/acetic acid anhydride or urotropine/acetic acid anhydride. To synthesize the corresponding unsaturated acids out of the acylated phenoxy acetic acid esters a base-catalyzed aldol condensation with formaldehyde in aqueous ethanol is used. Under these conditions the ethyl ester is cleaved to give the free acid. Coupling of etacrynic acid with amines by activation with DCC/N-hydroxy succinic imide led to the etacrynic acid amides. Methylation of the acylated phenols and consecutive Mannich reaction, as described above, leads to the acylated anisols with a,b-unsaturated ketone moiety. Following this synthetic pathway 28 derivatives with a Michael system were synthesized. These compounds were tested in the cysteine proteases papain, cathepsin B (CB), falcipain (FP) and rhodesain (RD). No inhibition of serine proteases was detected. Most of the inhibitors showed non-time-dependent kinetics for enzyme inactivation of CB, FP and RD. Only with papain time-dependent kinetics are observed. Although the compounds were planned as irreversible inhibitors, dialysis assays proved a reversible inhibiton. Since a comparative compound without a double bond is inactive, a covalent reaction with the cystein proteases can be assumed. Dissociation constants Ki of the enzyme-inhibitor-complexes EI were determined as a measurement of the affinities of the inhibitors towards the enzymes, as well as the alkylation velocity constants ki of the reaction yielding the modified enzyme E-I. The latter could be determined only in cases of a time-dependent inhibition. A general selectivity for single enzymes could not be found. The etacrynic acid amides were the best inhibitors (Ki = 3.2 - 57.5 µM). The analysis of the structure-activity relationship showed, as expected, the a,b-unsaturated system being essential for activity in cysteine proteases. The same fact is true for the aromatic ring. A longer side chain next to the double bond, which contains at least an ethyl moiety, as well as two vicinal halogen atoms at the aromatic ring proved to enhance the activtity of the inhibitors. Generally, esters and amides showed better inhibition properties than the free acids. Methoxy groups at the aromatic ring did not result in a loss of inhibition but in a reduced solubility in aqueous media. Compound [5-Chloro-2-(2-methylenebutyryl)-phenoxy]-acetic acid ethyl ester, which carries the a,b-unsaturated double bond system in ortho position to the phenolic oxygen atom, is also promising. Within the amides short voluminous moieties such as the tertbutyl moiety are advantageous. A distinct selectivity for FP against CB and RD can be achieved with long-chain amides such as the n-hexyl amide. The compounds were examined for growth inhibition of gram-positive and gram-negative pathogens as well as for inhibition of biofilm formation of gram-positive pathogens. The growth of gram-negative germs was not inhibited. The gram-positive germs Staphylococcus aureus and S. epidermidis were inactivated best by etacrynic acid ethyl ester and by the n-hexyl amide, the benzyl amide and the anilide of etacrynic acid (MHK = 5 - 20 µM). The mentioned compounds also showed the highest inhibition rate for biofilm formation (100 % at 20 - 40 µM to 95 % at 2.5 - 5 µM in S. aureus). Due to positive screening results in a enzymatic HPLC-assay of human SARS coronavirus main protease (SARS-CoV Mpro) docking experiments were conducted on etacrynic acid tertbutyl amide. The results led to the synthesis of a modified compound which showed weak improvement of enzyme inhibition in a fluorimetric assay.
KW  - Cysteinproteasen
KW  - Proteaseinhibitor
KW  - Etacrynsäure
KW  - Etacrynsäure
KW  - nichtpeptidische Inhibitoren
KW  - Cystein-Protease
KW  - etacrynic acid
KW  - non-peptidic inhibitors
KW  - cysteine protease
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12122
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heist, Katrin
T1  - Die Bedeutung der Proteasehemmer-Plasmakonzentration für das Lipodystrophiesyndrom bei Patienten mit HIV-Infektion unter HAART
T1  - Lipodystrophy Syndrome and Plasmaconcentrations of Protease-Inhibitors during HAART in HIV-Infected Patients
N2  - Durch die Entwicklung neuer antiretroviral wirksamer Therapieschemata konnte in den letzten Jahren die Letalität HIV-Positiver deutlich gesenkt werden. Zur Gruppe der Hochaktiven Antiretroviralen Therapie (HAART) gehören die Proteaseinhibitoren (PI) mit den Substanzen Ritonavir (RTV), Saquinavir (SQV), Indinavir (IDV) und Nelfinavir (NVF) sowie den neueren Substanzen Amprenavir und Lopinavir, die in Kombination mit Substanzen der Nukleosidischen- (NRTI) und Nicht-Nukleosidalen-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) eingenommen werden. Nach Einführung einer solchen HAART trat ein bisher ätiologisch unbekannter Symtpomenkomplex auf, den man vor allem mit den Proteaseinhibitoren in Verbindung brachte. Dazu gehört die Ausbildung einer Fettverteilungsstörung mit Fettatrophie im Gesicht, an den Extremitäten, am Gesäß und Fettakkumulation im Brust-, Bauch- und Nackenbereich. Diese äußerlichen Fettumverteilungen können mit metabolischen Veränderungen im Sinne einer Hypertriglyzeridämie oder Hypercholesterinämie, einer Insulinresistenz und seltener einer diabetische Stoffwechsellage einhergehen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung einer HAART für die Entstehung des HIV-assoziierten Lipodystrophiesyndroms untersucht. Von besonderem Interesse waren dabei die Plasmakonzentrationen der verschiedenen Proteaseinhibitoren. Die Triglyzerid-, Cholesterin- und Glukosewerte im Blut von 79 HIV-Infizierten, deren Laborparameter sowohl vor als auch nach PI-Therapiebeginn bekannt waren, erhöhten sich unter PI-Medikation signifikant. Ebenso fand sich ein signifikanter Anstieg der Anzahl von Personen mit Hypertriglyzeridämie und Hypercholesterinämie nach PI-Medikation. Eine Hyperglykämie wurde im gesamten Kollektiv von 91 Patienten bei nur einem diagnostiziert. Die Plasmakonzentrationen der PI-Substanzen Ritonavir und Saquinavir korrelierten bei 91 Patienten positiv mit den Cholesterinwerten. Die Triglyzeride und Glukosewerte korrelierten positiv mit der Höhe der Plasmakonzentrationen von Saquinavir. Darüber hinaus zeigte sich ein Zusammenhang zwischen den Plasmakonzentrationen der PI-Substanzen Ritonavir und Saquinavir und dem Auftreten von Hypertriglyzeridämien sowie Hypercholesterinämien. Patienten mit derartigen Fettstoffwechselstörungen hatten signifikant höhere RTV- und SQV- Plasmakonzentrationen als Patienten mit Lipidwerten im Normbereich. Ritonavir und Saquinavir sind beides PI-Substanzen, die bisher vornehmlich mit Veränderungen im Fettstoffwechsel in Verbindung gebracht wurden. Nach den vorliegenden Ergebnissen könnten deren Plasmakonzentrationen Einfluss auf die Entstehung von Hyperlipidämien haben. Bei 21 der 91 Patienten (23%) wurde eine Fettverteilungsstörung unterschiedlichen Ausmaßes diagnostiziert, davon bei 13 eine milde, bei 6 eine moderate und bei 2 Patienten eine schwere Form. Bei 3 der 21 Patienten trat eine isolierte Fettatrophie ohne Anzeichen einer Fettakkumulation auf, die restlichen 18 Patienten zeigten eine Kombination aus beiden Komponenten. Ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Fettverteilungsstörungen und den einzelnen PI- Plasmakonzentrationen konnte in dieser Untersuchung nicht gefunden werden. Es zeigte sich jedoch ein Zusammenhang zwischen der Einnahme der NRTI-Substanzen Stavudin (D4T) und Didanosin (DDI) und den Fettverteilungsstörungen. Patienten mit einer solchen Körperfettumverteilung wurden signifikant länger mit diesen beiden Medikamenten behandelt als Patienten, bei denen keine Fettverteilungsstörung auftrat. Die NRTI sind Substanzen, die vermutlich aufgrund ihrer Mitochondrialen Toxizität für das Auftreten von Fettatrophien verantwortlich sind. Den stärksten Einfluss scheint dabei bisherigen Studien zufolge die Substanz Stavudin zu haben. Die Dauer einer Therapie mit Stavudin korrelierte in der vorliegenden Untersuchung ebenfalls signifikant mit dem Auftreten von Hypertriglyzeridämien. Aufgrund der längeren Überlebenszeit und des ausgeprägten kardiovaskulären Risikoprofils wird der Arteriosklerose eine zunehmende Bedeutung bei der Behandlung HIV-Infizierter zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit hatten insgesamt 4 der 91 Patienten eine kardiovaskuläre Komplikation: Bei einem Patienten trat ein apoplektischer Insult auf und 3 Patienten erlitten einen Herzinfarkt. Als kardiovaskuläre Risikofaktoren fanden sich bei 2 der Patienten mit Herzinfarkt erhöhte mittlere Cholesterin- und Triglyzeridwerte, ein Nikotinabusus sowie eine famliliäre Disposition für kardiovaskuläre Erkrankungen. Die Inzidenz von Herzinfarkten lag in der vorliegenden Untersuchung mit 3,3% innerhalb von 4 Jahren bzw. 0,8% pro Jahr weit über der derzeitigen Inzidenz von Herzinfarkten in der Bundesrepublik Deutschland (0,3% pro Jahr).
N2  - Therapy with protease inhibitors (PI) is often associated with lipodystrophy syndrome, characterized by a peripheral fat loss or central fat accumulation and metabolic abnormalities (hypertriglyceridaemia, hypercholesterolaemia and glucose metabolism abnormalities). We evaluated PI-drug-levels, measured by a HPLC-method, serum lipids and serum glucose in 91 patients during HAART. 45 patients had normal median lipid levels: cholesterol (CHOL) 184±27 mg/dl, triglycerides (TRIG) 116±32 mg/dl. In 46 patients elevated cholesterol levels (254±29 mg/dl) and/ or elevated triglycerides (322±145 mg/dl) were found. We found a significant posititve correlation between PI-plasma levels of Ritonavir (RTV) and Saquinavir ( SQV) and the degree of hypercholesterolaemia. The SQV-plasma level correlated with the degree of hypertriglyceridaemia. Only one of the 91 patients had an elevated glucose level (112 mg/dl). 21 of the 91 patients showed clinical signs of lipodystrophy. No correlation between the PI-plasma levels and the degree of clinical signs of lipodystrophy was found.
KW  - Proteaseinhibitor
KW  - Proteaseinhibitor-Plasmakonzentration
KW  - Lipodystrophiesyndrom
KW  - HAART
KW  - protease-inhibitors
KW  - drug-levels
KW  - lipodystrophy syndrome
KW  - HAART
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9916
ER  -