TY - THES A1 - Schwarz, Gisela Maria T1 - Regulation von c-MYC durch CIP2A im kolorektalen Karzinom T1 - Regulation of c-MYC by CIP2A in colorectal cancer N2 - Das kolorektale Karzinom ist eines der häufigsten beim Menschen vorkommenden Karzinome [2]. Diesem liegen unterschiedliche Mutationen zugrunde, die in knapp 100% der kolorektalen Karzinome zu einer Überexpression von MYC führen, welches als Transkriptionsfaktor maßgeblich den Zellzyklus, Proliferation und Vaskularisierung beeinflusst [10,16]. Damit stellt MYC ein potenzielles Therapieziel in der Behandlung des Kolorektalen Karzinoms dar. Zusätzlich konnte in den letzten Jahren ein Onkoprotein namens CIP2A identifiziert werden, welches nach Depletion mit einem Verlust von MYC Protein einhergeht [69]. Zusätzlich ist CIP2A ein unabhängiger prognostischer Faktor im Kolorektalen Karzinom [70]. Diese Arbeit konnte zeigen, dass CIP2A-depletierte Zellen einen deutlichen Wachstumsnachteil gegenüber unbehandelten Zellen zeigen. Dieser Unterschied kann nicht durch eine gesteigerte Apoptose, sondern vielmehr durch einen verlängerten Zellzyklus erklärt werden. Weiterhin konnte eine neue Zelllinie mit DOX-induzierbarer shCIP2A hergestellt werden, die für weitere Experimente genutzt werden kann. Entgegen der Wirkweise im Zervixkarzinom [69], konnte im kolorektalen Karzinom kein Einfluss auf die Stabilität von MYC Protein durch CIP2A nachgewiesen werden. Auch konnte der Verlust von MYC nach CIP2A Knockdown nicht durch gleichzeitige Inhibierung des Abbaus, durch Okadasäure, MG132 oder in den FBWX7-defizienten Zellen, verhindert werden. Stattdessen resultiert die Herunterregulation von CIP2A in einem leichten Rückgang der MYC-mRNA Menge und einem deutlichen Verlust an MYC-Protein. In Zellen mit verschiedenen Konstrukten der MYC Transkripte kann dieser Verlust an MYC Protein auf eine translationelle Regulation in der 5’UTR zurückgeführt werden, was eine bisher nicht beschriebene Wirkweise von CIP2A darstellt. Da CIP2A in normalen Zellen praktisch nicht exprimiert ist [78], könnte dies ein mögliches Ziel in der Tumortherapie darstellen. Dieses gilt es in weiteren Experimenten noch genauer zu untersuchen. N2 - Colorectal Cancer is one of the most common type of cancer in human beings [2]. These are based on different mutations, which, in nearly 100%, lead to overexpression of MYC. As an transcription factor, MYC influences cell cyclus, proliferation and vascularization [10,16]. So MYC appears to be a good target in the therapy of colorectal cancer. Additionally a oncoprotein called CIP2A could be identified in the last years, which depletion leads also to a loss of MYC protein [69]. CIP2A was also found to be a independent prognostic factor in colorectal cancer [70]. In this work it could be demonstrated, that CIP2A-depleted cells show disadvantage in cell growth compared to the untreated cells. This difference could not be explained through an increased cell death, but an extended cell cycle. Additionally, a new cell line with DOX-inducible shRNA against CIP2A was established, which can be used for further experiments. Contrary to the mode of action which was found in cells of cervix carcinoma [69] we could not see an influence of CIP2A on the stability of MYC. Furthermore, the loss of MYC protein after knockdown of CIP2A could not be prevented by simultaneous inhibition of MYC degradation by okadaic acid, MG132 or in FBWX7-deficient cells. Instead knockdown of CIP2A lead to little decrease of MYC-mRNA and a clear loss of MYC protein. In cells with different constructs of MYC mRNA the loss of MYC protein can be attributed to a regulation in the 5’UTR. Because CIP2A is rarely expressed in normal tissue [78] it seems to be a possible target in the treatment of colorectal cancer. This should be further evaluated in future experiments. KW - Myc KW - Translation KW - CIP2A KW - PP2A Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-276181 ER - TY - THES A1 - Schäffler, Katrin M. T1 - Regulation der eukaryotischen Translation durch RNA-bindende Faktoren: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des La-verwandten Proteins 4B (LARP4B) T1 - Regulation of the eukaryotic translation by RNA-binding factors: structural and functional characterization of the La-related protein 4B (LARP4B) N2 - In Zellen liegen RNAs in Form von Ribonukleoprotein-Komplexen (RNP) vor, wobei das Zusammenwirken von RNA und Proteinen die Funktionen der einzelnen RNPs definiert. RNA-bindenden Proteinen kommt demnach eine zentrale Bedeutung beim Verständnis des RNA-Metabolismus zu. Zu dieser Proteingruppe zählen auch die La-verwandten Proteine (engl. La-related proteins, LARPs), welche eine evolutionär konservierte Familie von Faktoren bilden und durch eine putative RNA-bindende Domäne, dem La Modul, charakterisiert sind. Bereits für zwei Vertreter dieser Proteinklasse (LARP3 und LARP7) konnte eine über das La Modul vermittelte spezifische Interaktion mit uridylreichen RNA-Sequenzen gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Vertreter der LARP-Familie, das sogenannte LARP4B, sowohl biochemisch als auch strukturell zu untersuchen und es somit einem zellulären Prozess zuzuordnen. Zellbiologische Studien zeigten zunächst, dass LARP4B unter normalen Wachstumsbedingungen eine homogene zytoplasmatische Verteilung aufweist. Unter Stressbedingungen akkumuliert LARP4B hingegen in diskreten subzellulären Domänen, den sogenannten Stress Granules (SGs). Obwohl SGs bislang noch wenig funktionell untersucht sind, wird davon ausgegangen, dass sie der reversiblen Speicherung von mRNA-gebundenen Translationsfaktoren dienen. Durch affinitätschromatographische Strategien ließen sich spezifische Interaktionspartner von LARP4B identifizieren. Als direkte Bindungspartner wurden das zytoplasmatische Poly (A) bindende Protein 1 (PABPC1) und der Rezeptor für aktivierte C Kinase 1 (RACK1) gefunden. Darüber hinaus zeigten Sedimentationsanalysen, dass LARP4B nahezu quantitativ mit Ribosomen und Polyribosomen assoziiert vorliegt. Diese Studie identifizierte daher LARP4B als ein Protein, das mit Schlüsselfaktoren der eukaryotischen Translation wechselwirkt. In Übereinstimmung mit diesen Befunden reduziert ein RNAi-induzierter Mangel des Proteins die Translationsrate drastisch, während die Überexpression von LARP4B in vivo zu einer Stimulation der Proteinbiosynthese führt. Da dieser stimulatorische Einfluss bei einer Vielzahl unterschiedlicher mRNA-Spezies detektiert werden konnte, kann LARP4B als genereller, positiver Translationsfaktor angesehen werden. Interessanterweise wurden in Studien, die zeitgleich für das verwandte LARP1 durchgeführt wurden, vergleichbare zelluläre Interaktionen wie für LARP4B beschrieben. Um zu klären, ob beide LARPs Orthologe darstellen und funktionelle Redundanz zeigen, wurde in der vorgelegten Arbeit ein Vergleich von LARP4B mit LARP1 durchgeführt. Unabhängige in vivo Studien und Sedimentationsanalysen zeigten deutlich, dass beide Proteine im mRNA-Metabolismus agieren, jedoch in diesem unterschiedliche Phasen der eukaryotischen Proteinbiosynthese beeinflussen. N2 - The cooperation of RNA with different classes of proteins in so called ribonucleoprotein complexes (RNPs) is essential for the function of these RNPs. Therefore, RNA-binding proteins play a crucial role to understand the complex mechanisms of RNA-metabolism. One family of such proteins comprise the La-related proteins (LARPs). These evolutionary conserved factors are characterized by a putative RNA-binding domain, named the La module. For two of these factors (LARP3 and LARP7) a specific interaction with RNA containing uridine-rich sequence elements mediated via their La module could be described. The present work describes the biochemical and structural characterization of LARP4B, a thus far uncharacterized member of the LARP family. Immunofluorescence analyses identified LARP4B as a cytosolic protein that accumulates upon arsenite treatment in cellular stress granules (SGs). While still not sufficiently determined, these domains are believed to serve as storage pools for stalled, mRNA-bound translation initiation complexes formed upon polyribosome disassembly. Biochemical experiments further uncovered an interaction of LARP4B with the Poly(A) binding protein cytosolic 1 (PABPC1) and the receptor for activated C Kinase 1 (RACK1). Moreover, under physiological conditions, LARP4B co-sediments almost quantitatively with polysomes in cellular extracts, suggesting a role in translation. In agreement with this notion, knockdown of LARP4B by RNA-interference impaired translation of cellular mRNAs whereas over-expression stimulated protein synthesis. As this stimulatory effect could be detected for a wide range of different mRNA-species, LARP4B hence represents a general stimulator of translation. Interestingly, parallel studies uncovered comparable cellular interactions for another LARP family member (LARP1). To test whether LARP4B and LARP1 represent orthologs possessing redundant function, these two factors have been compared in this work using several independent in vivo and in vitro studies. These data clearly showed that both proteins positively influence RNA-metabolism but influence different phases of protein biosynthesis. KW - Translation KW - Eukaryoten KW - Ribonucleoproteine KW - Regulation KW - LARP4B KW - La Protein KW - PABPC1 KW - RACK1 KW - translation KW - LARP4B KW - La protein KW - PABPC1 KW - RACK1 Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69809 ER -