TY  - THES
A1  - Ali, Walid Wahid
T1  - Screening of plant suspension cultures for antimicrobial activities and characterization of antimicrobial proteins from 	 Arabidopsis thaliana
T1  - -
N2  - Die zunehmende Resistenz humanpathogener Mikroorganismen gegen bekannte Antibiotika bedingt die Notwendigkeit, nach neuen Quellen für die Produktion antimikrobieller Stoffe zu suchen. Als eine solche Quelle gelten besonders Pflanzen, da viele antimikrobielle Stoffe bei der Abwehr gegen invasierende Mikroorganismen bilden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit besteht in der Charakterisierung von pflanzlichen Zellkulturen im Hinblick auf ihre Fähigkeit, anitimkrobielle Aktivität gegen humanpathogene Mikroorganismen zu entwickeln. Dabei sollen aktive Proteine aufgereinigt und die kodierenden Gene isoliert werden. Dazu wurden zehn verschiede pflanzliche Suspensionskulturen in Anwesenheit von neun Elicitoren auf ihre antimikrobielle Aktivität gegen fünf humanpathogene Mikroorganismen getestet. Dabei erwiesen sich die heterotrophen Kulturen im Vergleich zu den autotrophen als aktiver. Die höchste antimikrobielle Aktivität wurde bei der intrazellulären Fraktion der mixotrophen Kultur von Arabidopsis thaliana nach Elicitierung mit Salicylsäure nachgewiesen. Da in einem Präzipitat mit Ammoniumsulfat Aktivität gegen Candida maltosa nachgewiesen wurde, konnte angenommen werden, dass es sich bei der aktiven Komponente um ein Protein handelt. Durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation wurde eine partielle Aufreinigung dieser aktiven Komponente erreicht. Die proteinoide Natur wurde durch Bioautographie bestätigt und das Molekulargewicht auf ca. 26kDa geschätzt. Mittels Gelfiltration und Massenspektrometrie wurde das Protein aufgereinigt. Die Mikrosequenzierung ergab ein Protein mit bisher unbekannter Funktion, das eine pflanzliche Stressdomäne (PLAT) enthält. Das Protein wurde daraufhin als AtPDP1 (Arabidopsis thaliana Plat-Domain Protein 1) bezeichnet. Das Gen und ein zweites mit hochgradiger Homologie (AtPDP2) wurden in E. coli kloniert. Der Digital Northern zeigt an, das beide Gene durch verschiedene Pathogene induziert werden, sowie von Chemikalien, die pflanzliche Abwehr hervorrufen und weiterhin von Phytohormonen. Der Versuch, AtPDP1 unter die Kontrolle eines Promors einer Proteinase zu stellen, der Induzierbarkeit durch Elicitoren vermittelt, blieb erfolglos. Weiterhin wurden 13 Thaumatingene aus Arabidopsis thaliana in E. coli kloniert, da ihre antimikrobielle Aktivität bekannt ist, und ihre Expression durch verschiedene Stimuli induziert wird. Von diesen Genen zeigt der Digital Northern bei allen Stimuli eine maximale Expression für At1g75800, während At1g75050 minimal induziert ist. Diese Gene stehen für zukünftige Studien zur Verfügung.
N2  - The continuously increase in resistance of human pathogenic microorganisms to the known antibiotics leads to the necessity for searching new sources for production of new active antimicrobial compounds from different natural sources especially plants, since many plants have been found to be able to produce antimicrobial compounds as a defense phenomenon against invading microorganisms. The aim of this work is to screen cultures for production of antimicrobial activity against representative of human pathogenic microorganisms and selection the most active cell culture producing antimicrobial protein(s) which are active against these pathogenic microorganisms and also isolation ,purification of the active protein(s) and cloning of its/their genes. Ten different plant suspension cultures have been screened in presence of nine elicitors for their antimicrobial activity against five selected human pathogenic microorganisms, and it has been found that the heterotrophic cultures are more active against the tester isolates than the autotrophic ones. The intracellular fraction of the mixotrophic Arabidopsis thaliana culture elicited with salicylic acid showed the highest antimicrobial activity against the tester isolates. The presence of proteinous antimicrobial activity has been elucidated by testing the activity of ammonium sulphate precipitate against Candida maltosa. High speed centrifugation technique has been used for partial purification of the active protein. The proteinous nature of the isolated compound has been confirmed by using bioautography technique and its molecular weight could be estimated to be around 26KDa. The active protein has been purified using gel filtration, and using mass spectrometry technique, for microsequencing of the active protein, it has been found that the function of the protein is unknown and we have termed it as AtPDP1 according to Arabidopsis thaliana Plat-Domain Protein1, since it contains a plant stress domain termed PLAT domain. It has been found that a second protein from the same plant with high homology level to AtPDP1 with the same domain, we termed it as AtPDP2. Genes for AtPDP1 and AtPDP2 have been cloned in E. coli using PGEM-T easy vector. The expression of both genes have been tested using Digital Northern program, and it has been observed that both genes are induced by different pathogens, chemicals known to induce defense in plant cells and also different hormones. We tried to clone the gene for AtPDP1 in PBI121 binary vector under the control of an elicitor inducible promoter of a proteinase inhibitor gene, to test its function in plant by overexpression, but we did not succeeded. Also the work aims to cloning the different known thaumatin genes from Arabidopsis thaliana for future work which represented by testing their expression under different stimuli, since most thaumatins have antimicrobial activity and some of them are active against Candida spp..Thirteen genes of known thaumatins from Arabidopsis thaliana have been cloned in PGEM-Teasy vector in DH5-alpha cells. coli cells. The expression of the thirteen genes has been done using Digital Northern program and it has been found that different genes show different expressions under different stimuli and the expression of At1g75800 gene was the maximum under all stimuli. The minimum expression of genes was for At1g75050. The rest of thaumatin genes showed moderate expressions under different stimuli.
KW  - -
KW  - Plant antimicrobial proteins
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - PLAT-Domain
KW  - Thaumatins
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24358
ER  - 
TY  - THES
A1  - Anwar, Ammarah
T1  - Natural variation of gene regulatory networks in \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
T1  - Natürliche Variation genregulatorischer Netzwerke in \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
N2  - Understanding the causal relationship between genotype and phenotype is a major objective in biology. The main interest is in understanding trait architecture and identifying loci contributing to the respective traits. Genome-wide association mapping (GWAS) is one tool to elucidate these relationships and has been successfully used in many different species. However, most studies concentrate on marginal marker effects and ignore epistatic and gene-environment interactions. These interactions are problematic to account for, but are likely to make major contributions to many phenotypes that are not regulated by independent genetic effects, but by more sophisticated gene-regulatory networks. Further complication arises from the fact that these networks vary in different natural accessions. However, understanding the differences of gene regulatory networks and gene-gene interactions is crucial to conceive trait architecture and predict phenotypes.
The basic subject of this study – using data from the Arabidopsis 1001 Genomes Project – is the analysis of pre-mature stop codons. These have been incurred in nearly one-third of the ~ 30k genes. A gene-gene interaction network of the co-occurrence of stop codons has been built and the over and under representation of different pairs has been statistically analyzed. To further classify the significant over and under- represented gene-gene interactions in terms of molecular function of the encoded proteins, gene ontology terms (GO-SLIM) have been applied. Furthermore, co- expression analysis specifies gene clusters that co-occur over different genetic and phenotypic backgrounds. To link these patterns to evolutionary constrains, spatial location of the respective alleles have been analyzed as well. The latter shows clear patterns for certain gene pairs that indicate differential selection.
N2  - Das Verständnis des kausalen Zusammenhangs zwischen Genotyp und Phänotyp ist ein wichtiges Ziel in der Biologie. Das Hauptinteresse liegt darin, die Merkmalsarchitektur zu verstehen und Loci zu identifizieren, die zu den jeweiligen Merkmalen beitragen. Genome-wide association mapping (GWAS) ist ein Werkzeug, um diese Zusammenhänge aufzuklären und wurde erfolgreich in vielen verschiedenen Arten eingesetzt. Die meisten Studien konzentrieren sich jedoch auf marginale Markereffekte und ignorieren epistatische und Gen-Umwelt-Interaktionen. Diese Wechselwirkungen sind problematisch zu erklären, werden aber wahrscheinlich einen wichtigen Beitrag zu vielen Phänotypen leisten, die nicht durch unabhängige genetische Effekte, sondern durch ausgefeiltere genregulatorische Netzwerke reguliert werden. Eine weitere Komplikation ergibt sich aus der Tatsache, dass sich diese Netzwerke in verschiedenen natürlichen Akzessionen unterscheiden. Das Verständnis der Unterschiede zwischen genregulatorischen Netzwerken und Gen-Gen- Interaktionen ist jedoch entscheidend, um die Merkmalsarchitektur zu konzipieren und Phänotypen vorherzusagen.
Das grundlegende Thema dieser Studie – unter Verwendung von Daten aus dem Arabidopsis 1001 Genomes Project – ist die Analyse von vorzeitigen Stop-Codons. Diese sind in fast einem Drittel der ~ 30k-Gene aufgetreten. Ein Gen-Gen- Interaktionsnetzwerk des gleichzeitigen Auftretens von Stop-Codons wurde aufgebaut und die Über- und Unterrepräsentation verschiedener Paare wurde statistisch analysiert. Um die signifikante über- und unterrepräsentierte Gen-Gen-Interaktion in Bezug auf den biologischen Prozess der kodierten Proteine weiter zu klassifizieren, wurden genonkologische Begriffe (GO-SLIM) verwendet. Darüber hinaus spezifiziert die Koexpressionsanalyse Gencluster, die über verschiedene genetische und phänotypische Hintergründe hinweg gleichzeitig auftreten. Um diese Muster mit evolutionären Einschränkungen in Verbindung zu bringen, wurde auch die räumliche Lage der jeweiligen Allele analysiert. Letzteres zeigt klare Muster für bestimmte Genepaare, die auf eine differentielle Selektion hinweisen.
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Co-occurrence matrix
KW  - co-expression coefficient
KW  - gene expression networks
KW  - non-sense mutations
KW  - phenotype
KW  - local adaptation
KW  - variations in genome
KW  - Ackerschmalwand
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-291549
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dindas, Julian
T1  - Cytosolic Ca\(^2\)\(^+\), a master regulator of vacuolar ion conductance and fast auxin signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
T1  - Zytosolisches Ca\(^2\)\(^+\), ein zentraler Regulator der vakuolären Ionenleitfähigkeit und der schnellen Auxin-Signaltransduktion in \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
N2  - Das Phytohormon Auxin erfüllt wichtige Funktionen bei der Initiierung von pflanzlichen Geweben und Organen, wie auch in der Steuerung des Wurzelwachstums im Zusammenspiel mit äußeren Reizen wie Schwerkraft, Wasser- und Nähstoffverfügbarkeit. Diese Funktionen basieren dabei vor allem auf der Auxin-abhängigen Regulation von Zellteilung und -streckung. Wichtig für letzteres ist dabei die Kontrolle des Zellturgors durch die Vakuole. Als Speicher für Nährstoffe, Metabolite und Toxine sind Vakuolen von essentieller Bedeutung. Vakuolär gespeicherte Metabolite und Ionen werden sowohl über aktive Transportprozesse, als auch passiv durch Ionenkanäle, über die vakuoläre Membran mit dem Zytoplasma ausgetauscht. In ihrer Funktion als second messenger sind Kalziumionen wichtige Regulatoren, aber auch Gegenstand vakuolärer Transportprozesse. Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration wirken nicht nur lokal, sie werden auch mit einer Signalweiterleitung über längere Distanzen in Verbindung gebracht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden elektrophysiologische Methoden mit bildgebenden Methoden kombiniert um Einblicke in das Zusammenspiel zwischen zytosolischen Kalziumsignalen, vakuolärer Transportprozesse und der Auxin-Physiologie im intakten pflanzlichen Organismus zu gewinnen. 
Kalziumsignale sind an der Regulierung vakuolärer Ionenkanäle und Transporter beteiligt. Um dies im intakten Organismus zu untersuchen wurden im Modellsystem junger Wurzelhaare von Arabidopsis thaliana Messungen mit intrazellulären Mikroelektroden durchgeführt. Mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik konnte bestätigt werden, dass die vakuoläre Membran der limitierende elektrische Wiederstand während intravakuolärer Messungen ist und so gemessene Ionenströme in der Tat nur die Ströme über die vakuoläre Membran repräsentieren. Die bereits bekannte zeitabhängige Abnahme der vakuolären Leitfähigkeit in Einstichexperimenten konnte weiterhin mit einer einstichbedingten, transienten Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration korreliert werden. Durch intravakuoläre Spannungsklemmexperimente in Wurzelhaarzellen von Kalziumreporterpflanzen konnte dieser Zusammenhang zwischen vakuolärer Leitfähigkeit und der zytosolischen Kalziumkonzentration bestätigt werden. 
Die Vakuole ist jedoch nicht nur ein Empfänger zytosolischer Kalziumsignale. Da die Vakuole den größten intrazellulären Kalziumspeicher darstellt, wird seit Langem diskutiert, ob sie auch an der Erzeugung solcher Signale beteiligt ist. Dies konnte in intakten Wurzelhaarzellen bestätigt werden. Änderungen des vakuolären Membranpotentials wirkten sich auf die zytosolische Kalziumkonzentration in diesen Zellen aus. Während depolarisierende Potentiale zu einer Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration führten, bewirkte eine Hyperpolarisierung der vakuolären Membran das Gegenteil. Thermodynamische Überlegungen zum passiven und aktiven Kalziumtransport über die vakuoläre Membran legten dabei den Schluss nahe, dass die hierin beschriebenen Ergebnisse das Verhalten von vakuolären H+/Ca2+ Austauschern wiederspiegeln, deren Aktivität durch die protonenmotorische Kraft bestimmt wird. 
Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich weiterhin heraus, dass zytosolisches Kalzium ebenso ein zentraler Regulator eines schnellen Auxin-induzierten Signalweges ist, über den der polare Transport des Hormons reguliert wird. 
Im gleichen Modellsystem junger Wurzelhaare konnte gezeigt werden, dass die externe Applikation von Auxin eine sehr schnelle, Auxinkonzentrations- und pH-abhängige Depolarisation des Plasmamembranpotentials zur Folge hat. Synchron zur Depolarisation des Plasmamembranpotentials wurden im Zytosol transiente Kalziumsignale registriert. Diese wurden durch einen von Auxin aktivierten Einstrom von Kalziumionen durch den Ionenkanal CNGC14 hervorgerufen. Experimente an Verlustmutanten als auch pharmakologische Experimente zeigten, dass zur Auxin-induzierten Aktivierung des Kalziumkanals die Auxin-Perzeption durch die F-box Proteine der TIR1/AFB Familie erforderlich ist. Durch Untersuchungen der Auxin-abhängigen Depolarisation wie auch des Auxin-induzierten Einstroms von Protonen in epidermale Wurzelzellen von Verlustmutanten konnte gezeigt werden, dass die sekundär aktive Aufnahme von Auxin durch das hochaffine Transportprotein AUX1 für die schnelle Depolarisation verantwortlich ist. Nicht nur die zytosolischen Kalziumsignale korrelierten mit der CNGC14 Funktion, sondern ebenso die AUX1-vermittelte Depolarisation von Wurzelhaaren. Eine unveränderte Expression von AUX1 in der cngc14 Verlustmutante legte dabei den Schluss nahe, dass die Aktivität von AUX1 posttranslational reguliert werden muss. Diese Hypothese erfuhr Unterstützung durch Experimente, in denen die Behandlung mit dem Kalziumkanalblocker Lanthan zu einer Inaktivierung von AUX1 im Wildtyp führte. 
Die zytosolische Beladung einzelner epidermaler Wurzelzellen mit Auxin hatte die Ausbreitung lateraler und acropetaler Kalziumwellen zur Folge. Diese korrelierten mit einer Verschiebung des Auxin-Gradienten an der Wurzelspitze und unterstützten somit eine hypothetische Kalziumabhängige Regulation des polaren Auxin Transports. Ein Model für einen schnellen, Auxin induzierten und kalziumabhängigen Signalweg wird präsentiert und dessen Bedeutung für das gravitrope Wurzelwachstum diskutiert. Da die AUX1-vermittelte Depolarisation in Abhängigkeit von der externen Phosphatkonzentration variierte, wird die Bedeutung dieses schnellen Signalwegs ebenso für die Anpassung des Wurzelhaarwachstums an eine nicht ausreichende Verfügbarkeit von Phosphat diskutiert.
N2  - The phytohormone auxin performs important functions in the initiation of plant tissues and organs, as well as in the control of root growth in conjunction with external stimuli such as gravity, water and nutrient availability. These functions are based primarily on the auxin-dependent regulation of cell division and elongation. Important for the latter is the control of the cell turgor by the vacuole. As storage for nutrients, metabolites and toxins, vacuoles are of vital importance. Vacuolar stored metabolites and ions are exchanged across the vacuolar membrane with the cytoplasm via active transport processes as well as passively through ion channels. In their function as second messenger, calcium ions are important regulators but also subject to vacuolar transport processes. Changes in the cytosolic calcium concentration not only act locally, but are also associated with signal transduction over longer distances. In this work, electrophysiological methods were combined with imaging techniques to gain insights into the interaction between cytosolic calcium signals, vacuolar transport processes and auxin physiology in the intact plant organism.
Calcium signals are involved in the regulation of vacuolar ion channels and transporters. In order to investigate this in the intact organism, intracellular microelectrode measurements were performed in the model system of bulging Arabidopsis thaliana root hairs. By means of the two-electrode voltage-clamp technique, it could be confirmed that the vacuolar membrane is the limiting electrical resistance during intravacuolar measurements and thus measured ion currents actually represent only the currents across the vacuolar membrane. The already known time-dependent decrease of vacuolar conductivity during intravacuolar experiments could be further correlated with an impalement-related, transient increase of the cytosolic calcium concentration. Intravacuolar voltage-clamp experiments in root hair cells of calcium reporter plants confirmed this relationship between vacuolar conductivity and the cytosolic calcium concentration.
However, the vacuole is not just a recipient of cytosolic calcium signals. Since the vacuole represents the largest intracellular calcium reservoir, it has long been argued that it is also involved in the generation of such signals. This could be confirmed in intact root hair cells. Changes in the vacuolar membrane potential affected the cytosolic calcium concentration in these cells. While depolarizing potentials led to an increase of the cytosolic calcium concentration, hyperpolarization of the vacuolar membrane caused the opposite. Thermodynamic considerations of passive and active calcium transport across the vacuolar membrane suggested that the results described herein reflect the behaviour of vacuolar H+/Ca2+ exchangers whose activity is determined by the proton motive force.
In addition, cytosolic calcium has been shown to be a key regulator of a rapid auxin-induced signaling pathway that regulates polar transport of the hormone.
In the same model system of bulging root hairs it could be shown that the external application of auxin results in a very fast, auxin concentration- and pH-dependent depolarization of the plasma membrane potential. Synchronous with the depolarization of the plasma membrane potential, transient calcium signals were recorded in the cytosol. These were caused by an auxin-activated influx of calcium ions through the ion channel CNGC14. Experiments on loss-of-function mutants as well as pharmacological experiments showed that the auxin-induced activation of the calcium channel requires auxin-perception by the F-box proteins of the TIR1/AFB family.
Investigations of auxin-dependent depolarization as well as the auxin-induced influx of protons into epidermal root cells of loss-of-function mutants showed that the secondary active uptake of auxin by the high-affinity transport protein AUX1 is responsible for the rapid depolarization
Not only the cytosolic calcium signals correlated with CNGC14 function, but also the AUX1-mediated depolarization of root hairs. An unchanged expression of AUX1 in the cngc14 loss-of-function mutant suggested that the activity of AUX1 must be post-translationally regulated. This hypothesis was supported by experiments in which treatment with the calcium channel blocker lanthanum led to inactivation of AUX1 in the wild type.
The cytosolic loading of individual epidermal root cells with auxin resulted in the spread of lateral and acropetal calcium waves. These correlated with a shift of the auxin gradient at the root apex and thus supported a hypothetical calcium-dependent regulation of polar auxin transport. A model for a rapid, auxin-induced and calcium-dependent signaling pathway is presented and its importance for gravitropic root growth is discussed. Since AUX1-mediated depolarization varied with external phosphate concentration, the importance of this rapid signaling pathway is also discussed for the adaptation of root hair growth to an inadequate availability of phosphate.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Auxine
KW  - Vakuole
KW  - Calcium
KW  - Elektrophysiologie
KW  - Pflanzenhormone
KW  - Hormontransport
KW  - Ionenleitfähigkeit
KW  - Signaltransduktion
KW  - Arabidopsis thaliana
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158638
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Dindas, Julian
A1  - Dreyer, Ingo
A1  - Huang, Shouguang
A1  - Hedrich, Rainer
A1  - Roelfsema, M. Rob G.
T1  - A voltage-dependent Ca\(^{2+}\) homeostat operates in the plant vacuolar membrane
JF  - New Phytologist
N2  - Cytosolic calcium signals are evoked by a large variety of biotic and abiotic stimuli and play an important role in cellular and long distance signalling in plants. While the function of the plasma membrane in cytosolic Ca\(^{2+}\) signalling has been intensively studied, the role of the vacuolar membrane remains elusive.
A newly developed vacuolar voltage clamp technique was used in combination with live-cell imaging, to study the role of the vacuolar membrane in Ca\(^{2+}\) and pH homeostasis of bulging root hair cells of Arabidopsis.
Depolarisation of the vacuolar membrane caused a rapid increase in the Ca\(^{2+}\) concentration and alkalised the cytosol, while hyperpolarisation led to the opposite responses.
The relationship between the vacuolar membrane potential, the cytosolic pH and Ca2+ concentration suggests that a vacuolar H\(^{+}\)/Ca\(^{2+}\) exchange mechanism plays a central role in cytosolic Ca2+ homeostasis. Mathematical modelling further suggests that the voltage-dependent vacuolar Ca\(^{2+}\) homeostat could contribute to calcium signalling when coupled to a recently discovered K\(^{+}\) channel-dependent module for electrical excitability of the vacuolar membrane.
KW  - voltage clamp
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - calcium signalling
KW  - computational cell biology
KW  - cpYFP cytosolic pH reporter
KW  - R-GECO1 cytosolic Ca\(^{2+}\) reporter
KW  - TPC1 channel
KW  - vacuolar membrane
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259627
VL  - 230
IS  - 4
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Fröschel, Christian
T1  - In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen
JF  - Plant Methods
N2  - Background
While leaves are far more accessible for analysing plant defences, roots are hidden in the soil, leading to difficulties in studying soil-borne interactions. Inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, but it remains demanding to obtain a methodological overview. To address this challenge, this study uses the model root pathogen Verticillium longisporum on Arabidopsis thaliana host plants and provides recommendations for selecting appropriate infection systems to investigate how plants cope with root pathogens.

Results
A novel root infection system is introduced, while two existing ones are precisely described and optimized. Step-by-step protocols are presented and accompanied by pathogenicity tests, transcriptional analyses of indole-glucosinolate marker genes and independent confirmations using reporter constructs. Advantages and disadvantages of each infection system are assessed. Overall, the results validate the importance of indole-glucosinolates as secondary metabolites that limit the Verticillium propagation in its host plant.

Conclusion
Detailed assistances on studying host defence strategies and responses against V. longisporum is provided. Furthermore, other soil-borne microorganisms (e.g., V. dahliae) or model plants, such as economically important oilseed rape and tomato, can be introduced in the infection systems described. Hence, these proven manuals can support finding a root infection system for your specific research questions to further decipher root-microbe interactions.
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Brassica napus
KW  - indole-glucosinolates
KW  - plant defence
KW  - root infection systems
KW  - root pathogens
KW  - soil-borne microorganisms
KW  - Solanum lycopersicum
KW  - Verticillium dahliae
KW  - Verticillium longisporum
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-260807
VL  - 17
ER  - 
TY  - THES
A1  - Horn, Hannes
T1  - Analysis and interpretation of (meta-)genomic data from host-associated microorganisms
T1  - Analyse und Interpretation von (meta-)genomischen Daten aus Wirt-assoziierten Mikroorganismen
N2  - Host–microbe interactions are the key to understand why and how microbes inhabit specific environments. With the scientific fields of microbial genomics and metagenomics, evolving on an unprecedented scale, one is able to gain insights in these interactions on a molecular and ecological level. The goal of this PhD thesis was to make (meta–)genomic data accessible, integrate it in a comparative manner and to gain comprehensive taxonomic and functional insights into bacterial strains and communities derived from two different environments: the phyllosphere of Arabidopsis thaliana and the mesohyl interior of marine sponges.

This thesis focused first on the de novo assembly of bacterial genomes. A 5–step protocol was developed, each step including a quality control. The examination of different assembly software in a comparative way identified SPAdes as most suitable. The protocol enables the user to chose the best tailored assembly. Contamination issues were solved by an initial filtering of the data and methods normally used for the binning of metagenomic datasets. This step is missed in many published assembly pipelines. The described protocol offers assemblies of high quality ready for downstream analysis.

Subsequently, assemblies generated with the developed protocol were annotated and explored
in terms of their function. In a first study, the genome of a phyllosphere bacterium, Williamsia sp. ARP1, was analyzed, offering many adaptions to the leaf habitat: it can deal with temperature shifts, react to oxygen species, produces mycosporins as protection against UV–light, and is able to uptake photosynthates. Further, its taxonomic position within the Actinomycetales was infered from 16S rRNA and comparative genomics showing the close relation between the genera Williamsia and Gordonia.

In a second study, six sponge–derived actinomycete genomes were investigated for secondary metabolism. By use of state–of–the–art software, these strains exhibited numerous gene clusters, mostly linked to polykethide synthases, non–ribosomal peptide synthesis, terpenes, fatty acids and saccharides. Subsequent predictions on these clusters offered a great variety of possible produced compounds with antibiotic, antifungal or anti–cancer activity. These analysis highlight the potential for the synthesis of natural products and the use of genomic data as screening toolkit.

In a last study, three sponge–derived and one seawater metagenomes were functionally compared. Different signatures regarding the microbial composition and GC–distribution were observed between the two environments. With a focus on bacerial defense systems, the data indicates a pronounced repertoire of sponge associated bacteria for bacterial defense systems, in particular, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, restriction modification system, DNA phosphorothioation and phage growth limitation. In addition, characterizing genes for secondary metabolite cluster differed between sponge and seawater microbiomes. Moreover, a variety of Type I polyketide synthases were only found within the sponge microbiomes. With that, metagenomics are shown to be a useful tool for the screening of secondary metabolite genes. Furthermore, enriched defense systems are highlighted as feature of sponge-associated microbes and marks them as a selective trait.
N2  - Mikroben–Wirt Interaktionen sind der Schlüssel, um zu verstehen “Wie?” und “Warum?” Mikroben in bestimmten Umgebungen vorkommen. Mithilfe von Genomik und Metagenomik lassen sich Einblicke auf dem molekularen sowie ökolgischen Level gewinnen. Ziel dieser Arbeit war es, diese Daten zugänglich zu machen und zu vergleichen, um Erkenntnisse auf taxonomischer und funktionaler Ebene in bakterielle Isolate und bakterielle Konsortien zu erhalten. Dabei wurden Daten aus zwei verschiedenen Umgebungen erhoben: der Phyllosphäre von Arabidopsis thaliana und aus der Mesohyl–Matrix mariner Schwämme.

Das Ziel war zunächst, bakterieller Genome denovo zu assemblieren. Dazu wurde ein Protokoll, bestehend aus 5 Schritten, entwickelt. Durch Verwendung verschiedener Soft- ware zum Assemblieren konnte SPAdes als am besten geeignet für die gegebenen Daten herausgearbeitet werden. Durch anfängliches Filtern der Daten konnte erste Kontamina- tion entfernt werden. Durch das Anwenden weiterer Methoden, welche ursprünglich für metagenomische Datensätze entwickelt wurden, konnten weitere Kontaminationen erkannt und von den “echten” Daten getrennt werden. Ein Schritt, welcher in den meisten pub- lizierten Assembly–Pipelines fehlt. Das Protokoll ermöglicht das Erstellen hochqualitativer Assemblies, welche zur weiteren Analyse nicht weiter aufbereitet werden müssen.
Nachfolgend wurden die generierten Assemblies annotiert. Das Genom von William- sia sp. ARP1 wurde untersucht und durch dessen Interpretation konnten viele Anpassungen an die Existenz in der Phyllosphäre gezeigt werden: Anpassung an Termperaturveränderun- gen, Produktion von Mycosporinen als Schutz vor UV–Strahlung und die Möglichkeit, von der Pflanze durch Photosynthese hergestellte Substanzen aufzunehmen. Seine taxonomische Position wurde aufgrund von 16S rRNA sowie vergleichende Genomik bestimmt. Dadurch konnte eine nahe Verwandtschaft zwischen den Gattungen Williamsia und Gordonia gezeigt werden.

In einer weiteren Studie wurden sechs Actinomyceten–Genome, isoliert aus Schwämmen, hinsichtlich ihres Sekundärmetabolismus untersucht. Mihilfe moderner Software konnten in zahlreiche Gen–Cluster identifiziert werden. Zumeist zeigten diese eine Zugehörigkeit zu Polyketidsynthasen, Nichtribosomalen Peptidsynthasen, Terpenen, Fettsäuren oder Sac- chariden. Durch eine tiefere Analyse konnten die Cluster mit chemischen Verbindungen assoziiert werden, welche antibakterielle oder fungizide Eigenschaften besitzen.

In der letzten Untersuchung wurden Metagenome von drei Schwämmen sowie Meerwasser auf funktioneller Ebene verglichen. Beobachtet wurden Unterschiede in deren mikrobiellen Konsortien und GC–Gehalt. Schwamm–assoziierte Bakterien zeigten ein ausgeprägtes Inventar an Verteidigungsmechanismen gegenüber deren Vertretern aus dem Meerwasser. Dies beinhaltete vor allem: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, das Restriktions-Modifikationssystem, DNA Phosphorothioation, oder Gene, welche das Wachstum von Phagen hemmen können. Gene für Sekundärmetabolite waren zwischen Schwamm– und Meerwasser–Metagenomen unterschiedlich stark ausgeprägt. So konnten Typ I Polyketidsynthasen ausschließlich in den Schwamm–Metagenomen gefunden werden. Dies zeigt, dass metagenomische Daten ebenso wie genomische Daten zur Untersuchung des Sekundärmetabolismus genutzt werden können. Des Weiteren zeigt die Anhäufung an Verteidigungsmechanismen eine Anpassung von Schwamm–assoziierten Mikroben an ihre Umgebung und ist ein Hinweis auf deren mögliche selektive Eigenschaft.
KW  - Bakterien
KW  - Meeresschwämme
KW  - Metagenom
KW  - Phyllosphäre
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Metagenomics
KW  - Genomics
KW  - Phyllosphere
KW  - Sponges
KW  - Bacteria
KW  - Deep sequencing
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Bioinformatics
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152035
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Huang, Shouguang
A1  - Ding, Meiqi
A1  - Roelfsema, M. Rob G.
A1  - Dreyer, Ingo
A1  - Scherzer, Sönke
A1  - Al-Rasheid, Khaled A. S
A1  - Gao, Shiqiang
A1  - Nagel, Georg
A1  - Hedrich, Rainer
A1  - Konrad, Kai R.
T1  - Optogenetic control of the guard cell membrane potential and stomatal movement by the light-gated anion channel GtACR1
JF  - Science Advances
N2  - Guard cells control the aperture of plant stomata, which are crucial for global fluxes of CO\(_2\) and water. In turn, guard cell anion channels are seen as key players for stomatal closure, but is activation of these channels sufficient to limit plant water loss? To answer this open question, we used an optogenetic approach based on the light-gated anion channelrhodopsin 1 (GtACR1). In tobacco guard cells that express GtACR1, blue- and green-light pulses elicit Cl\(^-\) and NO\(_3\)\(^-\) currents of -1 to -2 nA. The anion currents depolarize the plasma membrane by 60 to 80 mV, which causes opening of voltage-gated K+ channels and the extrusion of K+. As a result, continuous stimulation with green light leads to loss of guard cell turgor and closure of stomata at conditions that provoke stomatal opening in wild type. GtACR1 optogenetics thus provides unequivocal evidence that opening of anion channels is sufficient to close stomata.
KW  - abscisic-acid activation
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - H+-atpase
KW  - signal transduction
KW  - potassium channel
KW  - intact plants
KW  - K+ channels
KW  - R-type
KW  - CO2
KW  - SLAC1
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-260925
VL  - 7
IS  - 28
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Jakobson, Liina
A1  - Vaahtera, Lauri
A1  - Tõldsepp, Kadri
A1  - Nuhkat, Maris
A1  - Wang, Cun
A1  - Wang, Yuh-Shuh
A1  - Hõrak, Hanna
A1  - Valk, Ervin
A1  - Pechter, Priit
A1  - Sindarovska, Yana
A1  - Tang, Jing
A1  - Xiao, Chuanlei
A1  - Xu, Yang
A1  - Talas, Ulvi Gerst
A1  - García-Sosa, Alfonso T.
A1  - Kangasjärvi, Saijaliisa
A1  - Maran, Uko
A1  - Remm, Maido
A1  - Roelfsema, M. Rob G.
A1  - Hu, Honghong
A1  - Kangasjärvi, Jaakko
A1  - Loog, Mart
A1  - Schroeder, Julian I.
A1  - Kollist, Hannes
A1  - Brosché, Mikael
T1  - Natural Variation in Arabidopsis Cvi-0 Accession Reveals an Important Role of MPK12 in Guard Cell CO\(_{2}\) Signaling
JF  - PLoS Biology
N2  - Plant gas exchange is regulated by guard cells that form stomatal pores. Stomatal adjustments are crucial for plant survival; they regulate uptake of CO\(_{2}\) for photosynthesis, loss of water, and entrance of air pollutants such as ozone. We mapped ozone hypersensitivity, more open stomata, and stomatal CO\(_{2}\)-insensitivity phenotypes of the Arabidopsis thaliana accession Cvi-0 to a single amino acid substitution in MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN (MAP) KINASE 12 (MPK12). In parallel, we showed that stomatal CO\(_{2}\)-insensitivity phenotypes of a mutant cis (CO\(_{2}\)-insensitive) were caused by a deletion of MPK12. Lack of MPK12 impaired bicarbonate-induced activation of S-type anion channels. We demonstrated that MPK12 interacted with the protein kinase HIGH LEAF TEMPERATURE 1 (HT1)—a central node in guard cell CO\(_{2}\) signaling—and that MPK12 functions as an inhibitor of HT1. These data provide a new function for plant MPKs as protein kinase inhibitors and suggest a mechanism through which guard cell CO\(_{2}\) signaling controls plant water management.
KW  - MPK12
KW  - CO\(_{2}\) signaling
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Cvi-0
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166657
VL  - 14
IS  - 12
ER  - 
TY  - THES
A1  - Klinkenberg, Jörn
T1  - Physiological Role of Fatty Acid Desaturation in Agrobacterium-induced Arabidopsis Crown Galls
T1  - Physiologische Rolle der Fettsäure-Desaturierung in der durch Agrobacterium ausgelösten Wurzelhalsgalle von Arabidopsis
N2  - Crown gall development is accompanied by hypoxia, drought and oxidative stress. These abiotic stress factors are known to have an impact on fatty acid (FA) desaturation. Thus, an alteration in the lipid profile of plant tumors was expected. A comprehensive lipid analysis of Arabidopsis thaliana crown galls induced by Agrobacterium tumefaciens showed an increase in the degree of FA desaturation. The poly unsaturated fatty acid (PUFA) linolenic acid (18:3) of endoplasmic reticulum (ER) derived phospholipids was especially affected. The increased levels of desaturated FAs were reflected by a strong induction of two genes encoding desaturases, FAD3 and SAD6. In contrast to FAD3, which encodes the ER membrane bound fatty acid desaturase enzyme that synthesizes 18:3 PUFAs in the ER, the function of SAD6 is unknown. The ability of SAD6 to complement the extreme dwarf growth phenotype of the ssi2-2 mutant allele suggests that SAD6 is a functional stearoyl-acyl-carrier-protein delta-9 desaturase (SAD) which catalyzes the first step in FA desaturation and forms stearic acid (18:1). Overexpression of the SAD6 gene in Arabidopsis (SAD6-OE) to a similar degree as in tumors resulted in a light-dependent chlorosis phenotype and caused a similar shift in the lipid profile towards unsaturated phospholipids. Posttranscriptional down-regulation of SAD6 overexpression by RNA reverted the chlorosis phenotype and the changes in the lipid profile, showing that SAD6 overexpression forms the unsaturated FA profile and the phenotype in SAD6-OE. The subcellular localization of the SAD6 protein in chloroplasts, which is obligatory for SAD function was demonstrated. SSI2, which encodes the major contributor to the 18:1 FA levels in Arabidopsis is down-regulated in crown galls pointing to a replacement of SSI2 function by SAD6 in the tumor. SAD6 transcripts were almost undetectable in Arabidopsis under normal growth condition, whereas under hypoxia the gene was strongly activated. In the tumor hypoxia most likely caused the very high transcription of SAD6. Hypoxia is known to limit FA desaturation and it is associated with an elevated reactive oxygen species (ROS) production which is detrimental for unsaturated FAs. Thus, up-regulation of SAD6 in the crown gall, most likely serves as an adaptive mechanism to activate desaturation under low oxygen concentrations and to maintain the levels of unsaturated FA under oxidative stress. The ER localized FAD3 most likely is responsible for the rise in 18:3 of the phospholipid class to cope with drought stress in crown galls. This hypothesis was supported by the loss of function mutant, fad3-2, which developed significantly smaller tumors as the wild type under low relative humidity.Taken together, this study suggests that the induction of SAD6 and FAD3 shapes the tumor lipid profile by increasing the levels of unsaturated FAs. Unsaturated fatty acids prepare the crown gall to cope with ongoing hypoxia, drought and oxidative stress during growth and development.
N2  - Die Physiologie der durch Agrobacterium tumefaciens hervorgerufenen Wurzelhalsgallen ist geprägt von Sauerstoffmangel, Trocken- und oxidativen Stress. Diese Stressfaktoren beeinflussen die Umwandlung gesättigter zu ungesättigten Fettsäuren (Desaturierung). Somit sind Änderungen im Lipidmuster des durch Agrobacterium tumefaciens ausgelösten Pflanzentumors wahrscheinlich. Eine umfassende Analyse des Wurzelhalsgallenlipidmusters ergab, dass der Anteil an ungesättigten Fettsäuren erhöht war. Am auffälligsten war vor allem die Erhöhung der mehrfach ungesättigten Fettsäure Linolensäure (18:3) in den mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) assoziierten Phospholipiden. Dieser Anstieg ging einher mit der stark erhöhten transkriptionellen Aktivität des FAD3-Gens, das eine membrangebundene Fettsäure-Desaturase kodiert, die Linolensäure (18:3) im ER synthetisiert. Darüber hinaus war ein weiteres funktionell unbekanntes Desaturase-Gen, SAD6, stark aktiviert. Das SAD6 Protein war in Chloroplasten lokalisiert und in der Lage den extremen Zwergwuchs-Phänotyp der ssi2-2 Mutante zum Wildtyp zu komplementieren. Damit wurde nahegelegt, dass SAD6, wie SSI2, eine funktionelle „delta-9 Stearoyl-Acyl-Carrier-Protein-Desaturase“ (SAD) ist. Die Überexpression des SAD6-Gens in Arabidopsis (SAD6-OE), vergleichbar der in Wurzelhalsgallen, führte zu einem Anstieg ungesättigter Phospholipide und einem lichtabhängigen chlorotischen Phänotyp. Eine posttranskriptionelle Reduzierung der SAD6 Überexpression durch RNAi revertierte den Chlorosephänotyp und die Veränderungen im Lipidprofil zum Phänotyp des Wildtyps. Da SSI2, welches das SAD-Enzym für die Ölsäure (18:1)-Produktion in Arabidopsis kodiert, in Wurzelhalsgallen stark herunterreguliert ist, übernimmt hier sehr wahrscheinlich SAD6 die Funktion von SSI2. Insbesondere deshalb, weil der im Tumor vorherrschende Sauerstoffmangel zu einer starken Aktivierung des SAD6-Gens führt. Die Produktion ungesättigter Fettsäuren wird unter hypoxischen Bedingungen limitiert, weshalb eine erhöhte Expression von SAD6 die reduzierte Synthese ungesättigter Fettsäuren kompensieren könnte. Hypoxie und vor allem die posthypoxische Phase führen zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die ungesättigte Fettsäuren peroxidieren, so dass das Hypoxie-sensitive SAD6-Gen darüber hinaus das Niveau ungesättigter Fettsäuren unter oxidativem Stress zu erhalten scheint. Die ER lokalisierte Desaturase FAD3 ist ursächlich für die spezifische Erhöhung von Linolensäure (18:3) in den ER assoziierten Phospholipiden und führt somit zu einer Anpassung an den Trockenstress im Tumor. Dies wird dadurch unterstützt, dass an fad3-2 Mutanten unter erhöhtem Trockenstress deutlich kleinere Tumore wachsen. Diese Studie hat gezeigt, dass die Induktion von SAD6 und FAD3 in der Wurzelhalsgalle mit einer erhöhten Produktion ungesättigter Fettsäuren einhergeht und somit die Entwicklung und das Wachstum von Wurzelhalsgallen unter Sauerstoffmangel, oxidativem Stress und Wasserverlust ermöglicht wird.
KW  - Agrobacterium tumefaciens
KW  - Wurzelhalsgalle
KW  - Lipidstoffwechsel
KW  - Ungesättigte Fettsäuren
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Hypoxie
KW  - Agrobacterium tumefaciens
KW  - Crown Gall
KW  - Lipid Metabolism
KW  - unsaturated Fatty Acids
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Hypoxia
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75262
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lu, Jinping
T1  - The vacuolar TPC1 channel and its luminal calcium sensing site in the luminal pore entrance
T1  - Der vakuoläre TPC1-Kanal und seine luminale Kalzium-Sensorstelle im luminalen Porenbereich
N2  - The slowly activating vacuolar SV/TPC1 channel is ubiquitously expressed in plants and provides a large cation conductance in the vacuolar membrane. Thereby, monovalent (K+, Na+) and in principle also divalent cations, such as Ca2+, can pass through the channel. The SV/TPC1 channel is activated upon membrane depolarization and cytosolic Ca2+ but inhibited by luminal calcium. With respect to the latter, two luminal Ca2+ binding sites (site 1 Asp240/Asp454/Glu528, site 2 Glu239/Asp240/Glu457) were identified to coordinate luminal Ca2+. In this work, the characteristics of the SV/TPC1 channels in terms of regulation and function were further elucidated, focusing on the TPC1s of Arabidopsis thaliana and Vicia faba. For electrophysiological analysis of the role of distinct pore residues for channel gating and luminal Ca2+ sensing, TPC1 channel variants were generated by site-directed mutagenesis and transiently expressed as eGFP/eYFP-fusion constructs in Arabidopsis thaliana mesophyll protoplasts of the TPC1 loss-of-function mutant attpc1-2. 
1. As visualized by confocal fluorescence laser-scanning microscopy, all AtTPC1 (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) and VfTPC1 channel variants (WT, N458E/A607E/ N608D) were correctly targeted to the vacuole membrane.
2. Patch-clamp studies revealed that removal of one of the negative charges at position Glu605 or Asp606 was already sufficient to promote voltage-dependent channel activation with higher voltage sensitivity. The combined neutralization of these residues (E605A/D606N), however, was required to additionally reduce the luminal Ca2+ sensitivity of the AtTPC1 channel, leading to hyperactive AtTPC1 channels. Thus, the residues Glu605/Asp606 are functionally coupled with the voltage sensor of AtTPC1 channel, thereby modulating channel gating, and form a novel luminal Ca2+ sensing site 3 in AtTPC1 at the luminal entrance of the ion transport pathway. 
3. Interestingly, this novel luminal Ca2+ sensing site 3 (Glu605/Asp606) and Glu457 from the luminal Ca2+ sensing site 2 of the luminal Ca2+-sensitive AtTPC1 channel were neutralized by either asparagine or alanine in the TPC1 channel from Vicia faba and many other Fabaceae. Moreover, the VfTPC1 was validated to be a hyperactive TPC1 channel with higher tolerance to luminal Ca2+ loads which was in contrast to the AtTPC1 channel features. As a result, VfTPC1 but not AtTPC1 conferred the hyperexcitability of vacuoles. When AtTPC1 was mutated for the three VfTPC1-homologous polymorphic site residues, the AtTPC1 triple mutant (E457N/E605A/D606N) gained VfTPC1-like characteristics. However, when VfTPC1 was mutated for the three AtTPC1-homologous polymorphic site residues, the VfTPC1 triple mutant (N458E/A607E/N608D) still sustained VfTPC1-WT-like features. These findings indicate that the hyperactivity of VfTPC1 is achieved in part by the loss of negatively charged amino acids at positions that - as part of the luminal Ca2+ sensing sites 2 and 3 – are homologous to AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 and are likely stabilized by other unknown residues or domains. 
4.The luminal polymorphic pore residues (Glu605/Asp606 in AtTPC1) apparently do not contribute to the unitary conductance of TPC1. Under symmetrical K+ conditions, a single channel conductance of about 80 pS was determined for AtTPC1 wild type and the AtTPC1 double mutant E605A/D606A. This is in line with the three-fold higher unitary conductance of VfTPC1 (232 pS), which harbors neutral luminal pore residues at the homologous sites to AtTPC1. 
In conclusion, by studying TPC1 channel from Arabidopsis thaliana and Vicia faba, the present thesis provides evidence that the natural TPC1 channel variants exhibit differences in voltage gating, luminal Ca2+ sensitivity and luminal Ca2+ binding sites.
N2  - Der langsam aktivierende vakuoläre SV/TPC1-Kanal wird in Pflanzen ubiquitär exprimiert und besitzt eine große Kationenleitfähigkeit in der Vakuolen¬membran. Dabei können einwertige (K+, Na+) und im Prinzip auch zweiwertige Kationen, wie Ca2+, den Kanal passieren. Der SV/TPC1-Kanal wird bei Membrandepolarisation und zytosolischem Ca2+ aktiviert, aber durch luminales Calcium gehemmt. In Bezug auf letzteres wurden zwei luminale Ca2+-Bindungsstellen (Seite I Asp240/Asp454/Glu528, Seite II Glu239/Asp240/Glu457) zwecks Koordination von luminalem Ca2+ identifiziert. In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften der SV/TPC1-Kanäle in Bezug auf Regulierung und Funktion weiter aufgeklärt, wobei der Schwerpunkt auf den TPC1-Proteinen von Arabidopsis thaliana und Vicia faba lag. Zur elektrophysiologischen Analyse der Rolle verschiedener Porenaminosäuren für das Kanal-Gating und die luminale Ca2+-Erkennung wurden TPC1-Kanalvarianten durch gezielte Mutagenese erzeugt und transient als eGFP/eYFP-Fusionskonstrukte in Mesophyll-Protoplasten der TPC1-Verlust¬mutante attpc1-2 von Arabidopsis thaliana exprimiert.
1. Mittels konfokaler Fluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskopie wurde anhand der eGFP- bzw. eYFP-Fluoreszenzsignale nachgewiesen, dass alle AtTPC1- (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) und VfTPC1-Kanalvarianten (WT, N458E/A607E/ N608D) korrekt in die Vakuolenmembran eingebaut wurden.
2. Patch-Clamp-Studien zeigten, dass die Entfernung einer der negativen Ladungen an den Positionen Glu605 oder Asp606 bereits ausreichte, um die spannungsabhängige Kanalaktivierung mit höherer Spannungsempfindlichkeit zu fördern. Die kombinierte Neutralisierung dieser Reste (E605A/D606N) war jedoch erforderlich, um die luminale Ca2+-Empfindlichkeit des AtTPC1-Kanals zusätzlich zu reduzieren, was zu hyperaktiven AtTPC1-Kanälen führte. Die Aminosäurereste Glu605/Asp606 sind also funktionell mit dem Spannungssensor des AtTPC1-Kanals gekoppelt und modulieren dadurch das Kanaltor. Sie bilden eine neuartige luminale Ca2+-Sensorstelle 3 in AtTPC1 am luminalen Eingang des Ionentransportweges. 
3. Interessanterweise waren diese Aminosäurereste Glu605/Asp606 der neuartigen luminalen Ca2+-Sensorstelle 3 und Glu457 von der luminalen Ca2+-Sensorstelle 2 des luminalen Ca2+-empfindlichen AtTPC1-Kanals im TPC1-Kanal von Vicia faba und vielen anderen Fabaceae entweder durch Asparagin oder Alanin neutralisiert. Darüber hinaus wurde der VfTPC1 als hyperaktiver TPC1-Kanal mit höherer Toleranz gegenüber luminalen Ca2+-Belastungen validiert, was im Gegensatz zu den Eigenschaften des AtTPC1-Kanals stand. Infolgedessen ist VfTPC1, nicht aber AtTPC1, für die hohe Erregbarkeit der Vakuolen verantwortlich. Wenn AtTPC1 für die drei VfTPC1-homologen polymorphen Stellen mutiert wurde, erhielt die AtTPC1-Dreifachmutante (E457N/E605A/D606N) VfTPC1-ähnliche Eigenschaften. Wenn VfTPC1 jedoch für die drei AtTPC1-homologen polymorphen Stellen mutiert wurde, behielt die VfTPC1-Dreifachmutante (N458E/A607E/N608D) weiterhin VfTPC1-WT-ähnliche Merkmale. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hyperaktivität von VfTPC1 zum Teil durch den Verlust von negativ geladenen Aminosäuren an Positionen erreicht wird, die - als Teil der luminalen Ca2+-Sensorstellen 2 und 3 - homolog zu AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 sind und wahrscheinlich durch andere unbekannte Reste oder Domänen stabilisiert werden. 
4. Die luminalen polymorphen Porenreste (Glu605/Asp606 in AtTPC1) beeinflussen offenbar nicht die Einzelkanaleitfähigkeit von TPC1. Unter symmetrischen K+-Bedingungen wurde für den AtTPC1-Wildtyp und die AtTPC1-Doppelmutante E605A/D606A eine Einzelkanalleitfähigkeit von etwa 80 pS ermittelt. Dies steht im Einklang mit der dreifach höheren Einzelkanalleitfähigkeit von VfTPC1 (232 pS), der an den homologen Stellen zu AtTPC1 neutrale luminale Porenreste aufweist.
Durch die Untersuchung von TPC1-Kanälen aus Arabidopsis thaliana und Vicia faba konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass diese natürlichen TPC1-Kanalvarianten Unterschiede im Spannungs-Gating, der luminalen Ca2+-Empfindlichkeit und den luminalen Ca2+-Bindungsstellen aufweisen.
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Vicia faba
KW  - vacuole
KW  - SV/TPC1
KW  - luminal Ca2+ sensing sites
KW  - luminale Ca2+-Sensorstellen
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251353
ER  -