TY  - THES
A1  - Beer, Meike Vanessa
T1  - Correlation of ligand density with cell behavior on bioactive hydrogel layers
T1  - Korrelation der Ligandendichte mit Zellverhalten auf bioaktivierten Hydrogelschichten
N2  - Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Quantifizierung von Zelladhäsion vermittelnden Liganden in und auf dünnen Hydrogelschichten, die zur Oberflächenmodifizierung auf Biomaterialien aufgebracht wurden. Das bereits etablierte und gut charakterisierte inerte NCO-sP(EO-stat-PO) Hydrogelsystem, das eine einfache und reproduzierbare Bioaktivierung mit Peptiden erlaubt, wurde als Basis für diese Arbeit verwendet. Diese Hydrogele können auf zwei Weisen funktionalisiert werden. Liganden können entweder mit der Prepolymerlösung vor der Beschichtung gemischt (Einmischmethode) oder frische Hydrogelschichten mit einer Ligandenlösung inkubiert werden (Inkubationsmethode). Der erste Teil dieser in drei Hauptteile unterteilten Arbeit, beschäftigte sich mit der Konzentrationsbestimmung der Liganden in der gesamten Tiefe der Hydrogelschicht, während sich der zweite Teil auf die oberflächensensitive Quantifizierung von Zelladhäsion vermittelnden Molekülen an der biologischen Grenzfläche konzentrierte. Die Ergebnisse wurden mit Zelladhäsionskinetiken verglichen. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der biochemischen als auch strukturellen Nachahmung der komplexen Extrazellulärmatrix (ECM). Das ECM Protein Fibronektin (FN) wurde über Zucker-Lektin Anbindung präsentiert und Zellverhalten auf diesen biomimetischen Oberflächen untersucht. Ebenfalls wurde Zellverhalten in einer dreidimensionalen Faserumgebung mit identischer Oberflächenchemie wie in den beiden ersten Teilen dieser Arbeit untersucht und mit der Peptidkonzentration korreliert. Insgesamt, war die Hauptfragestellung in dieser Arbeit ‘Wie viel?’, d.h. einerseits die Ermittlung der maximalen, als auch der für Zelladhäsion optimalen Ligandendichte. Im ersten praktischen Teil der vorliegenden Arbeit (Klassische Quantifizierung) wurden Liganden in der gesamten Hydrogelschicht, als auch speziell in oberen Bereichen der Schichten quantifiziert. Die Untersuchung der Hydrogelschichten in Wellplatten und auf Glas funktionalisiert mit GRGDS und 125I-YRGDS erfolgte in Kapitel 3 mittels Radioaktivmessung. Wurden Hydrogelschichten mittels Inkubationsmethode funktionalisiert, konnte eine Sättigung mit Liganden bei etwa 600 µg/mL ermittelt werden. Mittels Einmischmethode funktionalisierte Hydrogele erreichten keine maximale Ligandenkonzentration in den Schichten, mit dem Verhältnis 2/1 als maximales verwendetes Verhältnis. Höhere Liganden zu Prepolymer Verhältnisse als 2/1 wurden jedoch nicht verwendet, um eine ausreichende Vernetzung der Hydrogele nicht zu gefährden. Zur Detektion mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) und Flugzeit-Sekundärionen-Massen-spektrometrie (TOF-SIMS) (Kapitel 4) wurden eine fluorierte Aminosäure und ein iodiertes Peptid mit den Prepolymeren in molaren Verhältnissen von 1/2, 1/1 und 2/1 gemischt. Beide Methoden ermittelten eine maximale Ligandenkonzentration bei Verhältnissen von 1/1. Zusätzliche Liganden (2/1) führten zu keiner vermehrten Anbindung. Wesentlich im Zusammenhang mit der Ligandenquantifizierung auf Biomaterialien ist, diese an der Oberfläche, die für Zellen zugänglich ist, durchzuführen. Im zweiten Teil dieser Arbeit (Oberflächensensitive Quantifizierung) kamen daher Methoden zum Einsatz, die Liganden ausschließlich auf der Oberfläche quantifizierten. Zur Detektion mit Oberflächenplasmon-resonanz (SPR) und akustischer Oberflächenwellentechnologie (SAW) in Kapitel 5 musste die Standardbeschichtung der Hydrogele von Glas und Silikon auf Cystamin funktionalisierte Goldoberflächen übertragen werden. Mittels Ellipsometrie und Rasterkraftmikroskopie (AFM) konnte nur eine dünne und inhomogene Hydrogelbeschichtung nachgewiesen werden. Dennoch zeigten SPR und SAW die Unterbindung von Serum und Streptavidin (SA) Adsorption auf nicht funktionalisierten Schichten, jedoch eine spezifische und konzentrationsabhängige SA Bindung auf Hydrogelschichten, die mit Biocytin und GRGDSK-biotin funktionalisiert wurden. Die Ligandenquantifizierung mittels Enzymgekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA) und Enzymgekoppelten Lektinadsorptionstest (ELLA) (Kapitel 6) wurde auf Hydrogelschichten in Wellplatten und auf Glas angewendet, die mit verschiedenen Liganden mittels Inkubation und Einmischung funktionalisiert wurden. Das Modellmolekül Biocytin, das biotinylierte Peptid GRGDSK-biotin, das ECM Protein Fibronektin (FN), als auch die Modellzucker N-Acetyl-glukosamin (GlcNAc) und N-Acetyllaktosamin (LacNAc) konnten spezifisch in verschiedenen Konzentrationen nachgewiesen werden. Beispielhaft seien hier Schichten auf Glas genannt, die mittels Einmischmethode mit GRGDSK-biotin funktionalisiert wurden, da diese zum Vergleich in Kapitel 8 herangezogen wurden. Auf diesen Oberflächen wurde eine maximale Peptidkonzentration auf der Oberfläche bei einem Peptid zu Prepolymer Verhältnis von 1/5 ermittelt. Neben diesen verschiedenen Quantifzierungsmethoden ist die in vitro Analyse mit Zellen nicht zu vernachlässigen (Kapitel 7). Hierzu wurden Hydrogele auf Glas aufgebracht und mit GRGDS mittels Einmischmethode funktionalisiert. Durch Zählen adhärenter primärer humaner dermaler Fibroblasten (HDF) auf Mikroskopbildern wurde eine maximale Zelladhäsion bei dem Peptid zu Prepolymer Verhältnis von 1/5 festgestellt. Hingegen wurde ein Verhältnis von 1/2 für optimale Zelladhäsion ermittelt, wenn Zellen zur Quantifizierung von den Hydrogelen abgelöst und im CASY® Zellzähler quantifiziert wurden. Zusätzlich wurde die Zellvitalität durch Messung intrazellulärer Enzymaktivitäten gemessen, jedoch konnte kein Zusammenhang zwischen Zellvitalität und GRGDS Konzentration hergestellt werden. Adhärente HDFs waren in allen Fällen vital, unabhängig von der Ligandenkonzentration auf der Oberfläche. Auch die Mausfibroblasten Zelllinie NIH L929 wurde auf Hydrogelen mit verschiedenen GRGDS zu Prepolymer Verhältnissen durch Zählen adhärenter Zellen auf Mikroskopbildern untersucht. Diese im Verhältnis zu HDFs wesentlich kleineren Mauszellen benötigten höhere GRGDS Konzentrationen (2/1) für maximale Zelladhäsion. Nach der Ligandenquantifizierung in Kapitel 3 bis 7, wurden diese Ergebnisse in Kapitel 8 miteinander verglichen. Hierzu wurden Messungen auf Hydrogelschichten verwendet, die mittels Einmischmethode funktionalisiert wurden. Während die Quantifizierung mittels Radioaktivmessung in der gesamten Tiefe der Hydrogelschichten keine maximale Ligandenkonzentration ermitteln konnte, war in den oberen Bereichen der Schicht ein Maximum an Liganden bei 1/1 festzustellen (XPS, TOF-SIMS). SPR und SAW wurden zum Vergleich nicht herangezogen, da die Beschichtung auf Gold erst optimiert werden muss. Oberflächensensitive Quantifizierung mittels ELISA und Zelladhäsion, die lediglich die sterisch zugänglichen Liganden auf einer Oberfläche nachweisen, ergaben übereinstimmend eine optimale Ligandenkonzentration für SA Bindung und Zelladhäsion bei einem Peptid zu Prepolymer Verhältnis von 1/5. Dies unterstreicht, wie wichtig der Vergleich der Methoden, als auch die Verwendung von oberflächensensitiven Methoden ist. Der dritten Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der biochemischen und strukturellen Nachahmung der komplexen extrazellulären Umgebung (Advanced ECM engineering), ein wichtiger Aspekt in der Biomaterialforschung, da zum größten Teil zwei-dimensionale Biomaterialien zum Einsatz kommen, die direkt mit Liganden kovalent funktionalisiert werden. Die ECM ist jedoch um ein Vielfaches komplexer und die bestmögliche Nachahmung ist Voraussetzung für eine bessere Akzeptanz durch Zellen und Gewebe. In Kapitel 9 wurde eine Möglichkeit aufgezeigt, das ECM Protein FN nicht-kovalent über Zucker-Lektinbindungen zu immobilisieren. Ein Schichtaufbau von Hydrogel, dem darauf durch Mikrokontakt-druckverfahren (MCP) kovalent gebundenen Zucker Poly-N-Acetyllaktosamin (polyLacNAc) und den darauf nicht-kovalent gebundenen Galektin His6CGL2 und FN, konnte mit Fluoreszenzfärbung elegant nachgewiesen werden. Optimale Konzentrationen für den Schichtaufbau wurden mittels ELLA/ELISA auf Hydrogelschichten ermittelt, die durch Inkubation mit dem Zucker funktionalisiert wurden. Nur der komplette Schichtaufbau konnte zufriedenstellende HDF Adhäsion vermitteln und im Vergleich zu Zellkulturpolystyrol (TCPS) Oberflächen konnten HDFs auf dem biomimetischen Schichtaufbau schneller adhärieren und spreiten. Zudem wurde die Umorganisierung von auf Glas adsorbiertem FN, auf NCO-sP(EO-stat-PO) kovalent gebundenem FN und biomimetisch über polyLAcNAc-His6CGL2 gebundenem FN durch HDFs verglichen. Nur auf den biomimetischen Oberflächen schien eine Umorganisation durch die Zellen möglich, wie sie auch in der ECM zu finden ist. Diese biomimetische und flexible Präsentation eines Proteins erwies sich als vielversprechende Möglichkeit eine biomimetischere Oberfläche für Zellen zu schaffen, die eine optimale Biokompatibilität ermöglichen könnte. Auch die strukturelle Nachahmung der ECM ist eine vielversprechende Strategie zum Nachbau der ECM. In Kapitel 10 wurde ein Einschrittverfahren zur Herstellung synthetischer, bioaktiver und degradierbarer Faserkonstrukte durch Elektrospinnen zur Nachahmung der ECM präsentiert. In diesem System wurden durch Zugabe von NCO-sP(EO-stat-PO) als reaktives Additiv zu Poly(D,L-laktid-co-Glycolid) (PLGA) Fasern hergestellt, die mit einer ultradünnen, inerten Hydrogelschicht versehen waren. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Verwendung von NCO-sP(EO-stat-PO) als Additiv die Adsorption von Rinderserumalbumin (BSA) im Vergleich zu PLGA um 99,2% reduziert, die Adhäsion von HDFs verhindert und die Adhäsion von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) minimiert werden konnten. Spezifische Bioaktivierung wurde durch Zugabe von Peptidsequenzen zur Spinlösung erreicht, welche kovalent in die Hydrogelschicht eingebunden werden konnten und kontrollierte Zell-Faser Interaktionen ermöglichten, Um die spezifische Zelladhäsion an solchen inerten Fasern zu erzielen, wurde GRGDS kovalent auf der Faseroberfläche gebunden. Dies erfolgte durch Zugabe des Peptids zur Polymerlösung vor dem Elektrospinnen. Als Negativkontrolle wurde die Peptidsequenz GRGES an die Faseroberfläche gebunden, welche durch Zellen nicht erkannt wird. Während die Verhinderung unspezifischer Proteinadsorption für die Peptidmodifizierten Fasern erhalten blieb, konnten HDFs lediglich auf den mit GRGDS Peptid modifizierten Fasern adhärieren, proliferieren und nach zwei Wochen eine konfluente Zellschicht aus vitalen Zellen bilden. Zusätzlich konnten MSCs auf GRGDS funktionalisierten Fasern adhärieren. Liganden konnten auf Fasern quantifiziert werden, indem die ELISA Technik aus Kapitel 6 auf Faseroberflächen transferiert wurde. Um das Potential der biochemischen und strukturellen Nachbildung der ECM aufzuzeigen, wurden beide Ansätze miteinander kombiniert. Die Immobilisierung von polyLacNAc auf die Hydrogelfasern durch Inkubation und der Schichtaufbau mit His6CGL2 und FN resultierte in HDF Adhäsion.
N2  - This thesis concerned the quantification of cell adhesion molecules (CAM) in and on thin hydrogel films as surface modification of biomaterials. The established and well characterized, per se inert NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogel system which allows the easy and reproducible bioactivation with peptides was used as basis for this thesis. Two methods can be used to functionalize the coatings. Ligands can either be mixed into the prepolymer solution in prior to layer formation (mix-in method), or freshly prepared coatings can be incubated with ligand solution (incubation method). Divided into three major parts, the first part of the thesis dealt with the concentration of ligands in the bulk hydrogel, whereas the second part of the thesis focused on the surface sensitive quantification of CAMs at the biointerface. The results were correlated with cell adhesion kinetics. The third part of this thesis investigated the biochemical and the structural mimicry of the extracellular matrix (ECM). ECM proteins were presented via sugar-lectin mediated binding and cell behavior on these surfaces was analyzed. Cell behavior on three-dimensional fibers with identical surface chemistry as the coatings in the previous sections of the thesis was analyzed and correlated with the amount of peptide used for bioactivation. Overall, the main question of this work was ‘How much?’ regarding maximal as well as optimal ligand concentrations for controlled cell-hydrogel interactions. The focus in the first practical part of this thesis was to analyze the amount of ligands in NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogels using classical quantification methods. Coatings in 96-well plates as well as on glass were functionalized with GRGDS and 125I-YRGDS for radioisotopic detection (Chapter 3). Using the incubation method for functionalization, a maximal ligand binding using peptide concentrations of 600 µg/mL could be determined. When functionalization was introduced via the mix-in method, a clear tendency for higher ligand concentrations with increasing ligand to prepolymer ratio was observed, but no maximal ligand binding could be detected with a ligand to prepolymer ratio of 2/1 being the highest ratio investigated. This ratio of 2/1 was not exceeded to ensure that complete crosslinking of the hydrogel was not affected. In Chapter 4, a fluorinated amino acid and an iodinated peptide were immobilized to the hydrogels using the mix-in method and were detected by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS). In these measurements, maximal ligand binding was detected for a ligand to prepolymer ratio of 1/1. Higher ligand to prepolymer ratios did not result in any significant increase in ligand concentrations in the surface near regions of the crosslinked hydrogels. To address the question of how many ligands were actually accessible for cell interaction at the interface, surface sensitive quantification methods were applied in the second part of this thesis. For the quantification with surface plasmon resonance (SPR) and surface acoustic wave technology (SAW) (Chapter 5), the hydrogel coating procedure needed to be transferred onto cystamine functionalized gold surfaces. Characterization with ellipsometry and atomic force microscopy (AFM) revealed inhomogeneous cystamine binding to the activated surfaces, which resulted in inhomogeneous coatings. Nevertheless, it could be shown that SPR as well as SAW were suitable methods for the surface sensitive quantification of the ligand concentration on NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogels. Non-functionalized coatings resisted non-specific serum as well as streptavidin (SA) adsorption. Coatings functionalized with biocytin and GRGDSK-biotin introduced specific SA binding that was dependent on the biotin concentration at the surface. Additionally, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and enzyme linked lectin assay (ELLA) (Chapter 6) were applied to coatings in 96-well plates and on glass. Coatings were functionalized with the model molecule biocytin, the biotinylated peptide GRGDSK-biotin, the ECM protein fibronectin (FN), as well as the carbohydrates N-acetylglucosamine (GlcNAc) and N-acetyllactosamine (LacNAc). All ligands could be successfully detected with antibodies or SA via ELISA or ELLA. Maximal GRGDSK-biotin binding to the hydrogel coatings on glass was achieved at a peptide to prepolymer ratio of 1/5, which was used as reference value in Chapter 8. Last but not least, cell adhesion (Chapter 7) was quantified depending on the GRGDS concentration on hydrogel coatings on glass. Maximal adhesion of primary human dermal fibroblast (HDF) was observed at GRGDS to prepolymer ratios of 1/5, when adherent cells were counted on life cell images. Quantification of adherent cells using the CASY® cell counter revealed maximal HDF adhesion at molar ligand to prepolymer ratios of 1/2. However, cell vitality detected by intracellular enzyme activities was not dependent on the GRGDS concentration. Cells which managed to adhere were vital regardless of the amount of ligands present. Additionally, adhesion of fibroblasts from the murine cell line NIH L929 was analyzed by counting on life cell images. These cells, being much smaller than the HDF cells, needed higher GRGDS to prepolymer ratios (2/1) for proper cell adhesion. All quantification methods applied to analyze hydrogels which were functionalized by the mix-in method in Chapter 3, 4, 6 and 7, were compared in Chapter 8. Radiodetection gave information about the ligand concentrations throughout the whole hydrogel and no maximal amount of ligands could be detected when increasing the peptide to prepolymer ratio. In contrast, XPS and TOF-SIMS which only penetrated the surface near regions of the coating, a maximal ligand binding to the hydrogel was detected for 1/1 ratios. SPR and SAW were not included in this comparison, as the coatings on gold need to be optimized first. The two surface sensitive quantification methods (ELISA and HDF adhesion) could give information about the quantity of peptide which was sterically available for SA or cell binding. With these methods, maximal SA and cell binding was detected at ratios of 1/5. These results underline the importance of carefully compare the different methods. Beside ligand quantification on hydrogels, the third part of this thesis was concerned with the biochemical and structural mimicry of the ECM by advanced ECM engineering to design biomimetic biomaterials that are better accepted by cells and tissue. The subject of Chapter 9 was the biomimetic and flexible presentation of the ECM protein FN. FN was attached via sugar-lectin mediated binding to NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogels. The build-up of the covalently immobilized sugar poly-N-acetyllactosamine (polyLacNAc), the subsequent non-covalent binding of the fungal galectin His6CGL2, and FN could be elegantly proven by fluorescent staining on coatings which were functionalized with the sugar by micro contact printing (MCP). Further experiments were carried out on build-ups, where polyLacNAc was immobilized on the hydrogel by incubation. Optimal parameters for the layer build-up were determined by ELLA/ELISA. Only the complete build-up induced proper adhesion of HDFs. Compared to tissue culture polystyrene (TCPS), cells adhered and spread faster on the biomimetic surfaces. The flexible presentation of FN allowed HDFs to rearrange homogenously immobilized FN into fibrillar structures, which seemed not to be possible when FN was adsorbed on glass or covalently bound directly to the hydrogel coatings. This new approach of a flexible and biomimetic presentation of an ECM protein allows new ways to design biomaterials with best possible cell-material interactions. The work described in Chapter 10 focused on the structural mimicry of the fibrous ECM structures by electrospinning of synthetic, bioactive, and degradable fibers. Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) and NCO-sP(EO-stat-PO) were electrospun out of one solution in an easy one-step preparation resulting in fibers with an ultrathin inert hydrogel layer at the surface. By adding GRGDS to the solution prior to electrospinning, specifically interacting fibers could be obtained. In comparison to PLGA, the adsorption of bovine serum albumin (BSA) could be reduced by 99.2%. As a control, the non-active peptide GRGES was immobilized to the fiber. These fibers did not allow cell adhesion, showing that the integrity of the hydrogel coated fibers was not affected by the immobilization of peptides. HDF adhesion was obtained by functionalization with GRGDS, leading to the adhesion, spreading, and proliferation of HDFs. Also mesenchymal stem cells (MSC) could adhere to GRGDS functionalized fibers. Additionally, for ligand quantification, the ELISA technique was successfully transferred to fiber substrates. To highlight the potential of the approaches for the biochemical and structural mimicry of the ECM, the sugar polyLacNAc was immobilized on the PLGA/sP(EO-stat-PO) fibers followed by the subsequent layer build-up with His6CGL2 and FN. These fibers triggered HDF adhesion.
KW  - Hydrogel
KW  - Biomaterial
KW  - Zelladhäsion
KW  - Adsorption
KW  - Ligand
KW  - Quantifizierung
KW  - Proteinadsorption
KW  - Funktionalisierung <Chemie>
KW  - protein adsorption
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74454
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bertlein, Sarah
T1  - Hydrogels as Biofunctional Coatings and Thiol-Ene Clickable Bioinks for Biofabrication
T1  - Hydrogele als biofunktionale Beschichtungen und Thiol-Ene-clickbare Biotinten für die Biofabrikation
N2  - Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von funktionalisierbaren Hydrogel Beschichtungen für Schmelz-elektrogeschriebene PCL Gerüste und von Bio-druckbaren Hydrogelen für die Biofabrikation.
Hydrogel Beschichtungen von Schmelz-elektrogeschriebenen Konstrukten ermöglichten die Kontrolle der Oberflächen-Hydrophilie und damit Zell-Material Interaktionsstudien in minimal Protein-adhäsiven Umgebungen. Zu diesem Zweck wurde ein hydrophiles sternförmiges vernetzbares Polymer verwendet und eine Optimierung der Beschichtungsbedingungen durchgeführt. Außerdem boten neu entwickelte photosensitive Konstrukte eine Zeit- und pH-unabhängige Biofunktionalisierung.
Bio-druckbare Hydrogele für die Biofabrikation basierten auf der Allyl-Funktionalisierung von Gelatine (GelAGE) und modifizierten Hyaluronsäure-Produkten, die das Hydrogel-Vernetzen mittels Thiol-En Click Chemie ermöglichen. Die Optimierung der GelAGE Hydrogel-Eigenschaften wurde durch eine detaillierte Analyse der Syntheseparameter, variierender En:SH Verhältnisse, unterschiedlicher Vernetzungsmoleküle und Photoinitiatoren erreicht. Die Homogenität der Thiol-En Netzwerke wurde mit denen der freien radikalischen Polymerisation verglichen und die Verwendbarkeit von GelAGE als Bio-Tinte für den Extrusions-basierten Bio-Druck wurde untersucht. Es wurde angenommen, dass reine Hyaluronsäure-basierte Bio-Tinten eine Beibehaltung der mechanischen und rheologischen Eigenschaften, der Zellviabilität und der Prozessierbarkeit ermöglichen trotz geringerem Polymer- und Thiol-Anteil der Hydrogele.
Hydrogel-Beschichtungen: Hoch definierte PCL Gerüste wurden mittels MEW hergestellt und anschließend mit sechs armigen sternförmigen vernetzbaren Polymeren (sP(EO-stat-PO)) beschichtet. Die Vernetzung wird durch die wässrig-induzierte Hydrolyse reaktiver Isocyanatgruppen (NCO) von sP(EO-stat-PO) bedingt. Diese Beschichtung erhöhte die Oberflächen-Hydrophilie und stellte eine Plattform für weitere Biofunktionalisierungen, in minimal Protein-adhäsiven Umgebungen, dar. Nicht nur das Beschichtungsprotokoll wurde hinsichtlich der sP(EO-stat-PO) Konzentrationen und der Beschichtungsdauern optimiert, sondern auch Vorbehandlungen der Gerüste wurden entwickelt. Diese waren essentiell um die finale Hydrophilie von sP(EO-stat-PO) beschichteten Gerüste so zu erhöhen, dass unspezifische Protein-Adhäsionen vollständig unterbunden wurden. Die sP(EO-stat-PO) Schichtdicke, von ungefähr 100 nm, ermöglicht
generell in vitro Studien nicht nur in Abhängigkeit der Gerüst-Biofunktionalisierung, sondern auch in Abhängigkeit der Gerüst-Architektur durchzuführen. Das Ausmaß der Hydrogel-Beschichtung wurde mittels einer indirekten Quantifizierung der NCO-Hydrolyse-Produkte ermittelt. Kenntnis über die NCO-Hydrolyse-Kinetik ermöglichte ein Gleichgewicht zwischen ausreichend beschichteten Gerüsten und der Präsenz der NCO-Gruppen herzustellen, welche für die anschließenden Biofunktionalisierungen genutzt wurden. Diese Zeit- und pH-abhängige Biofunktionalisierung war jedoch nur für kleine Biomoleküle möglich. Um diese Beschränkung zu umgehen und auch hochmolekulare Biomoleküle kovalent anzubinden, wurde ein anderer Reaktionsweg entwickelt. Dieser basierte auf der Photolyse von Diazirin-Gruppen und ermöglichte eine Zeit- und pH-unabhängige Biofunktionalisierung der Gerüste mit Streptavidin und Kollagen Typ I. Die Fibrillen bildende Eigenschaft von Kollagen wurde genutzt um auf den Gerüsten verschiedene Kollagen-Konformationen zu erhalten und eine erste in vitro Studie bestätigte die Anwendbarkeit für Zell-Material Interaktionsstudien.
Die hier entwickelten Gerüste könnten verwendet werden um tiefere Einblicke in die Grundlagen der zellulären Wahrnehmung zu erhalten. Insbesondere die Komplexität mit der Zellen z.B. Kollagen wahrnehmen bleibt weiterhin klärungsbedürftig. Hierfür könnten diverse Hierarchien von Kollagen-ähnlichen Konformationen an die Gerüste gebunden werden, z.B. Gelatine oder Kollagen-abgeleitete Peptidsequenzen. Dann könnte die Aktivierung der DDR-Rezeptoren in Abhängigkeit der Komplexität der angebundenen Substanzen bestimmt werden. Aufgrund der starken Streptavidin-Biotin Bindung könnten Streptavidin funktionalisierte Gerüste eine vielseitige Plattform für die Immobilisierung von jeglichen biotinylierten Molekülen darstellen.
Gelatine-basierte Bio-Tinten: Zuerst wurden die GelAGE-Produkte hinsichtlich der Molekulargewichts-Verteilung und der Integrität der Aminosäuren-Zusammensetzung synthetisiert. Eine detailliert Studie, mit variierenden molaren Edukt-Verhältnissen und Synthese-Zeitspannen, wurde durchgeführt und implizierte, dass der Gelatine Abbau am deutlichsten für stark alkalische Synthesebedingungen mit langen Reaktionszeiten war. Gelatine beinhaltet mehrere funktionalisierbare Gruppen und anhand diverser Model-Substanzen und Analysen wurde die vorrangige Amingruppen-Funktionalisierung ermittelt. Die Homogenität des GelAGE-Polymernetzwerkes, im Vergleich zu frei radikalisch polymerisierten GelMA-Hydrogelen, wurde bestätigt. Eine ausführliche
Analyse der Hydrogel-Zusammensetzungen mit variierenden funktionellen Gruppen Verhältnissen und UV- oder Vis-Licht induzierbaren Photoinitiatoren wurde durchgeführt. Die UV-Initiator Konzentration ist aufgrund der Zell-Toxizität und der potenziellen zellulären DNA-Beschädigung durch UV-Bestrahlung eingeschränkt. Das Zell-kompatiblere Vis-Initiator System hingegen ermöglichte, durch die kontrollierte Photoinitiator-Konzentration bei konstanten En:SH Verhältnissen und Polymeranteilen, die Einstellung der mechanischen Eigenschaften über eine große Spanne hinweg. Die Flexibilität der GelAGE Bio-Tinte für unterschiedliche additive Fertigungstechniken konnte, durch Ausnutzung des temperaturabhängigen Gelierungsverhaltens unterschiedlich stark degradierter GelAGE Produkte, für Stereolithographie und Extrusions-basiertem Druck bewiesen werden. Außerdem wurde die Viabilität zellbeladener GelAGE Konstrukte bewiesen, die mittels Extrusions-basiertem Bio-Druck erhalten wurden. Die Verwendung diverser multifunktioneller und makromolekularer Thiol-Vernetzungsmoleküle ermöglichte eine Verbesserung der mechanischen und rheologischen Eigenschaften und ebenso der Prozessierbarkeit. Verglichen mit dem kleinen bis-Thiol-funktionellen Vernetzungsmolekül waren geringere Thiol-Vernetzer-Konzentrationen notwendig um bessere mechanische Festigkeiten und physikochemische Eigenschaften der Hydrogele zu erhalten. Der Extrusions-basierte Bio-Druck unterschiedlicher eingekapselter Zellen verdeutlichte die Notwendigkeit der individuellen Optimierung von Zell-beladenen Hydrogel-Formulierungen.
Nicht nur die Zellviabilität von eingekapselten Zellen in Extrusions-basierten biogedruckten Konstrukten sollte bewertet werden, sondern auch andere Parameter wie die Zellmorphologie oder die Kollagen- oder Glykosaminoglykan-Produktion, da diese einige der essentiellen Voraussetzungen für die Verwendung in Knorpel Tissue Engineering Konzepten darstellen. Außerdem sollten diese Studien auf die stereolithographischen Ansätze erweitert werden und letztlich wäre die Flexibilität und Zellkompatibilität der Formulierungen mit makromolekularen Vernetzern von Interesse. Makromolekulare Vernetzer ermöglichten die Reduktion des Polymeranteils und des Thiol-Gehalts und können, insbesondere in Kombination mit dem Zell-kompatibleren Vis-Initiator-System, voraussichtlich zu einer gesteigerten Zellkompatibilität beitragen, was zu klären bleibt.
Hyaluronsäure-basierte Bio-Tinten: Unterschiedliche Hyaluronsäure-Produkte (HA) wurden synthetisiert, sodass diese En- (HAPA) oder Thiol-Funktionalitäten (LHASH)
beinhalteten, um reine HA Thiol-En vernetzte Hydrogele zu erhalten. In Abhängigkeit des Molekulargewichts der HA-Produkte, der Polymeranteile und des En:SH Verhältnisses, konnte eine große Spanne an mechanischen Festigkeiten abgedeckt werden. Aufgrund der hohen Viskosität war allerdings im Falle von hochmolekularen HA (HHAPA) Produkt-Lösungen (HHAPA + LHASH) die Handhabbarkeit auf 5.0 wt.-% beschränkt. Die Verwendung der gleichen HA Thiol-Komponenten (LHASH) ermöglichte Hybrid-Hydrogele, mit HA und GelAGE, mit reinen HA-Hydrogelen zu vergleichen. Obwohl der Polymeranteil von HHAPA + LHASH Hydrogelen signifikant geringer war, als im Vergleich zu Hybrid-Hydrogelen (GelAGE + LHASH), wurden für gleiche En:SH Verhältnisse ähnliche mechanische und physikochemische Eigenschaften reiner HA-Hydrogele bestimmt. Aufgrund der geringen Viskosität niedermolekularer HA Lösungen (LHAPA + LHASH) konnten diese nicht für den Extrusions-basierten Druck verwendet werden. Das nicht temperaturabhängige HHAPA + LHASH System hingegen konnte mit nur einem Viertel des Polymeranteils der Hybrid Formulierungen gedruckt werden. Im Vergleich zu der Hybrid Bio-Tinte wurde angenommen, dass das hoch viskose Verhalten von HHAPA + LHASH Lösungen, der geringere Polymeranteil, der geringere Druck für das Drucken und eine demzufolge geringere Scherspannung, maßgeblich zu der hohen Zellviabilität in Extrusions-basiert-biogedruckten Konstrukten beisteuerten.
Die niedrigmolekulare HA Formulierung (LHAPA + LHASH) konnte zwar nicht für den Extrusions-basierten Druck verwendet werden, allerdings besitzt dieses System Potential für andere additive Fertigungstechniken wie z.B. der Stereolithographie. Um dieses System weiterzuentwickeln wäre, analog zu dem GelAGE System, eine detailliertere Studie zu den Funktionen eingekapselter Zellen hilfreich. Außerdem sollte die Initiierung dieses Systems mit dem Vis-Initiator untersucht werden.
N2  - Aim of this thesis was the development of functionalizable hydrogel coatings for melt electrowritten PCL scaffolds and of bioprintable hydrogels for biofabrication.
Hydrogel coatings of melt electrowritten scaffolds enabled to control the surface hydrophilicity, thereby allowing cell-material interaction studies of biofunctionalized scaffolds in minimal protein adhesive environments. For this purpose, a hydrophilic star- shaped crosslinkable polymer was used and the coating conditions were optimized. Moreover, newly developed photosensitive scaffolds facilitated a time and pH independent biofunctionalization.
Bioprintable hydrogels for biofabrication were based on the allyl-functionalization of gelatin (GelAGE) and modified hyaluronic acid-products, to enable hydrogel crosslinking by means of the thiol-ene click chemistry. Optimization of GelAGE hydrogel properties was achieved through an in-depth analysis of the synthesis parameters, varying Ene:SH ratios, different crosslinking molecules and photoinitiators. Homogeneity of thiol-ene crosslinked networks was compared to free radical polymerized hydrogels and the applicability of GelAGE as bioink for extrusion-based bioprinting was investigated. Purely hyaluronic acid-based bioinks were hypothesized to maintain mechanical- and rheological properties, cell viabilities and the processability, upon further decreasing the overall hydrogel polymer and thiol content.

Hydrogel coatings: Highly structured PCL scaffolds were fabricated with MEW and subjected to coatings with six-armed star-shaped crosslinkable polymers (sP(EO-stat-PO)). Crosslinking results from the aqueous induced hydrolysis of reactive isocyanate groups (NCO) of sP(EO-stat-PO) and increased the surface hydrophilicity and provided a platform for biofunctionalizations in minimal protein adhesive environments. Not only the coating procedure was optimized with respect to sP(EO-stat-PO) concentrations and coating durations, instead scaffold pre-treatments were developed, which were fundamental to enhance the final hydrophilicity to completely avoid unspecific protein adsorption on sP(EO-stat-PO) coated scaffolds. The sP(EO-stat-PO) layer thickness of around 100 nm generally allows in vitro studies not only in dependence on the scaffold biofunctionalization but also on the scaffold architecture. The hydrogel coating extent was assessed via an indirect quantification of the NCO-hydrolysis products. Knowledge of NCO-hydrolysis kinetics enabled to achieve a balance of sufficiently coated scaffolds while maintaining the presence of NCO-groups that were exploited for subsequent biofunctionalizations. However, this time and pH dependent biofunctionalization was restricted to small biomolecules. In order to overcome this limitation and to couple high molecular weight biomolecules another reaction route was developed. This route was based on the photolysis of diazirine moieties and enabled a time and pH independent scaffold biofunctionalization with streptavidin and collagen type I. The fibril formation ability of collagen was used to obtain different collagen conformations on the scaffolds and a preliminary in vitro study demonstrated the applicability to investigate cell-material interactions.
The herein developed scaffolds could be applied to gain deeper insights into the fundamentals of cellular sensing. Especially the complexity by which cells sense e.g. collagen remain to be further elucidated. Therefore, different hierarchies of collagen-like conformations could be coupled to the scaffolds, e.g. gelatin or collagen-derived peptide sequences, and the activation of DDR receptors in dependence on the complexity of the coupled substances could be determined. Due to the strong streptavidin-biotin bond, streptavidin functionalized scaffolds could be applied as a versatile platform to allow immobilization of any biotinylated molecules.

Gelatin-based bioinks: First the GelAGE products were synthesized with respect to molecular weight distributions and amino acid composition integrity. A detailed study was conducted with varying molar ratios of reactants and synthesis durations and implied that gelatin degradation was most dominant for high alkaline synthesis conditions with long reaction times. Gelatin possesses multiple functionalizable groups and the predominant functionalization of amine groups was confirmed via different model substances and analyses. Polymer network homogeneity was proven for the GelAGE system compared to free radical polymerized hydrogels with GelMA. A detailed analysis of hydrogel compositions with varying functional group ratios and UV- or Vis-light photoinitiators was executed. The UV-initiator concentration is restricted due to cytotoxicity and potential cellular DNA damages upon UV-irradiation, whereas the more cytocompatible Vis- initiator system enabled mechanical stiffness tuning over a wide range by controlling the photoinitiator concentration at constant Ene:SH ratios and polymer weight percentages. Versatility of the GelAGE bioink for different AM techniques was proved by exploiting the thermo-gelling behavior of differently degraded GelAGE products for stereolithography and extrusion-based printing. Moreover, the viability of cell-laden GelAGE constructs was demonstrated for extrusion-based bioprinting. By applying different multifunctional thiol-macromolecular crosslinkers the mechanical and rheological properties improved concurrently to the processability. Importantly, lower thiol-crosslinker concentrations were required to yield superior mechanical strengths and physico-chemical properties of the hydrogels as compared to the small bis-thiol-crosslinker. Extrusion-based bioprinting with distinct encapsulated cells underlined the need for individual optimization of cell-laden hydrogel formulations.
Not only the viability of encapsulated cells in extrusion-based bioprinted constructs should be assessed, instead other parameters such as cell morphology or production of collagen or glycosaminoglycans should be considered as these represent some of the crucial prerequisites for cartilage Tissue Engineering applications. Moreover, these studies should be expanded to the stereolithographic approach and ultimately the versatility and cytocompatibility of formulations with macromolecular crosslinkers would be of interest. Macromolecular crosslinkers allowed reducing polymer weight percentages and amounts of thiol groups and are thus expected to contribute to increased cytocompatibility, especially in combination with the more cytocompatible Vis-initiator system, which remains to be elucidated.

Hyaluronic acid-based bioinks: Different molecular weight hyaluronic acid (HA) products were synthesized to bear ene- (HAPA) or thiol-functionalities (LHASH) to enable pure HA thiol-ene crosslinked hydrogels. Depending on the molecular weight of modified HA products, polymer weight percentages and Ene:SH ratios, a wide range of mechanical stiffness was covered. However, the manageability of high molecular weight HA (HHAPA) product solutions (HHAPA + LHASH) was restricted to 5.0 wt.-% as a consequence of the high viscosity. Based on the same HA thiol component (LHASH), hybrid hydrogels of HA with GelAGE were compared to pure HA hydrogels. Although the overall polymer weight percentage of HHAPA + LHASH hydrogels was significantly lowered compared to hybrid hydrogels (GelAGE + LHASH), similar mechanical and physico-chemical properties of pure HA hydrogels were determined with maintained Ene:SH ratios. Low viscous low molecular weight HA precursor solutions (LHAPA + LHASH) prevented the applicability for extrusion-based bioprinting, whereas the non-thermoresponsive HHAPA + LHASH system could be bioprinted with only one-fourth of the polymer content of hybrid formulations. The high viscous behavior of HHAPA + LHASH solutions, lower polymer weight percentages, decreased printing pressures and consequently declined shear stress during printing, were hypothesized to contribute to high cell viabilities in extrusion-based bioprinted constructs compared to the hybrid bioink.
The low molecular weight HA precursor formulation (LHAPA + LHASH) was not applicable for extrusion-based printing, but this system has potential for other AM techniques such as stereolithography. Similar to the GelAGE system a more detailed study on the functions of encapsulated cells would be useful to further develop this system. Moreover, the initiation with the Vis-initiator should be conducted.
KW  - Biomaterial
KW  - Bioink
KW  - hydrogel
KW  - biofabrication
KW  - Hydrogel
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174225
ER  - 
TY  - THES
A1  - Blum, Carina
T1  - A first step to an integral biointerface design for the early phase of regeneration
T1  - Ein erster Schritt zur Etablierung eines integralen biologischen Grenzflächendesigns für die frühe Phase der Regeneration
N2  - The implantation of any foreign material into the body automatically starts an immune reaction that serves as the first, mandatory step to regenerate tissue. The course of this initial immune reaction decides on the fate of the implant: either the biomaterial will be integrated into the host tissue to subsequently fulfill its intended function (e.g., tissue regeneration), or it will be repelled by fibrous encapsulation that determines the implant failure. Especially neutrophils and macrophages play major roles during this inflammatory response and hence mainly decide on the biomaterial's fate. For clinically relevant tissue engineering approaches, biomaterials may be designed in shape and morphology as well as in their surface functionality to improve the healing outcome, but also to trigger stem cell responses during the subsequent tissue regeneration phase. 
The main focus of this thesis was to unravel the influence of scaffold characteristics, including scaffold morphology and surface functionality, on primary human innate immune cells (neutrophils and macrophages) and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to assess their in vitro immune response and tissue regeneration capacity, respectively. The fiber-based constructs were produced either via melt electrowriting (MEW), when the precise control over scaffold morphology was required, or via solution electrospinning (ES), when the scaffold design could be neglected. All the fiber-based scaffolds used throughout this thesis were composed of the polymer poly(ε caprolactone) (PCL).
A novel strategy to model and alleviate the first direct cell contact of the immune system with a peptide-bioactived fibrous material was presented in chapter 3 by treating the material with human neutrophil elastase (HNE) to imitate the neutrophil attack. The main focus of this study was put on the effect of HNE towards an RGDS-based peptide that was immobilized on the surface of a fibrous material to improve subsequent L929 cell adhesion. The elastase efficiently degraded the peptide-functionality, as evidenced by a decreased L929 cell adhesion, since the peptide integrated a specific HNE-cleavage site (AAPV-motif). A sacrificial hydrogel coating based on primary oxidized hyaluronic acid (proxHA), which dissolved within a few days after the neutrophil attack, provided an optimal protection of the peptide-bioactivated fibrous mesh, i.e, the hydrogel alleviated the neutrophil attack and largely ensured the biomaterial's integrity. Thus, according to these results, a means to protect the biomaterial is required to overcome the neutrophil attack.
Chapter 4 was based on the advancement of melt electrowriting (MEW) to improve the printing resolution of MEW scaffolds in terms of minimal inter-fiber distances and a concomitant high stacking precision. Initially, to gain a better MEW understanding, the influence of several parameters, including spinneret diameter, applied pressure, and collector velocity on mechanical properties, crystallinity, fiber diameter and fiber surface morphology was analyzed. Afterward, innovative MEW designs (e.g., box-, triangle-, round , and wall-shaped scaffolds) have been established by pushing the printing parameters to their physical limits. Further, the inter-fiber distance within a standardized box-structured scaffold was successfully reduced to 40 µm, while simultaneously a high stacking precision was maintained. In collaboration with a co-worker of my department (Tina Tylek, who performed all cell-based experiments in this study), these novel MEW scaffolds have been proven to facilitate human monocyte-derived macrophage polarization towards the regenerative M2 type in an elongation-driven manner with a more pronounced effect with decreasing pore sizes. 
Finally, a pro-adipogenic platform for hMSCs was developed in chapter 5 using MEW scaffolds with immobilized, complex ECM proteins (e.g., human decellularized adipose tissue (DAT), laminin (LN), and fibronectin (FN)) to test for the adipogenic differentiation potential in vitro. Within this thesis, a special short-term adipogenic induction regime enabled to more thoroughly assess the intrinsic pro-adipogenic capacity of the composite biomaterials and prevented any possible masking by the commonly used long-term application of adipogenic differentiation reagents. The scaffolds with incorporated DAT consistently showed the highest adipogenic outcome and hence provided an adipo-inductive microenvironment for hMSCs, which holds great promise for applications in soft tissue regeneration.
Future studies should combine all three addressed projects in a more in vivo-related manner, comprising a co-cultivation setup of neutrophils, macrophages, and MSCs. The MEW-scaffold, particularly due to its ability to combine surface functionality and adjustable morphology, has been proven to be a successful approach for wound healing and paves the way for subsequent tissue regeneration.
N2  - Die Implantation eines Biomaterials löst stets eine Immunreaktion im Körper aus, die den ersten zwingenden Schritt zur Geweberegeneration darstellt. Der Verlauf dieser anfänglichen Immunreaktion entscheidet über das Schicksal des Implantats: Entweder wird das Biomaterial in das Wirtsgewebe integriert, um anschließend seine vorgesehene Funktion (z.B. Geweberegeneration) zu erfüllen, oder aber es findet eine Abstoßungsreaktion durch Einkapselung des Implantats statt. Insbesondere Neutrophile und Makrophagen spielen für die Immunantwort eine wichtige Rolle und entscheiden daher hauptsächlich über das Schicksal des Biomaterials. Für klinisch relevante Ansätze der Gewebezüchtung können Biomaterialien sowohl in ihrer Morphologie als auch in ihrer Oberflächenfunktionalität so gestaltet werden, dass sie zum einen die Wundheilung verbessern, zum anderen auch Stammzellreaktionen während der anschließenden Geweberegenerationsphase auslösen.
Der Fokus dieser Doktorarbeit lag auf der Beurteilung des Einflusses von Morphologie und Oberflächenfunktionalität fasriger Scaffolds auf die frühe Phase der Geweberegeneration. Insbesondere wurde die in vitro-Immunantwort von primären humanen Immunzellen (Neutrophile und Makrophagen) sowie die Geweberegenerationskapazität von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) untersucht. Die hierfür verwendeten faserbasierten Poly(ε-Caprolacton) (PCL) Scaffolds wurden entweder mittels Solution Electrospinning (ES) oder Melt Electrowriting (MEW) hergestellt. Während ES eine zufällig orientierte Faserablage zur Folge hat, erlaubt MEW eine präzise Kontrolle der Scaffold-Morphologie. 
Zunächst wurde eine neue Strategie zur Nachahmung und Abmilderung des ersten direkten Zellkontakts während der Immunreaktion vorgestellt. Dabei wurde die Interaktion zwischen Neutrophilen mit einem Peptid-bioaktivierten Fasermaterial untersucht (Kapitel 3), wobei der sog. Neutrophilen-Angriff mittels des Enzyms Neutrophilen Elastase (HNE) nachgeahmt wurde. Das an der Faseroberfläche immobilisierte CGGGAAPVGGRGDS-Peptid verfügte über eine spezifische HNE-Schnittstelle (AAPV-Motiv), an welcher die Elastase das Peptid effizient degradieren konnte. Das Degradationsverhalten des Enzyms wurde anschließend über L929 Zelladhärenz analysiert, welche über das RGDS-Motiv im Peptid vermittelt wurde. Im Rahmen der Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der Neutrophilen-Angriff und die damit einhergehende Verringerung des RGDS-Motivs zu einer reduzierten Zelladhärenz führte. Die Einbettung des Scaffolds in ein Hydrogel auf der Basis von Aldehyd-haltiger Hyaluronsäure (proxHA) bot während des Neutrophilen-Angriffs einen optimalen Schutz der Peptidfunktionalität. Um diese wiederum anschließend für Adhäsionsversuche verfügbar zu machen, konnte das Hydrogelsystem derartig eingestellt werden, dass sich dieses innerhalb weniger Tage auflöste. Auf diese Weise konnte das Hydrogel den Neutrophilen-Angriff abmildern und so die Integrität des Biomaterials weitestgehend gewährleisten.
Kapitel 4 behandelt die Präzisierung der Faserablage, insbesondere die Verringerung des Faserabstands, während des MEW-Prozesses. Zunächst wurde der Einfluss verschiedener Parameter (Spinndüsendurchmesser, angelegter Luftdruck und Kollektorgeschwindigkeit) auf die mechanischen Eigenschaften, die Kristallinität, den Faserdurchmesser und die Faseroberflächenmorphologie analysiert. Durch Optimierung der Druckparameter konnten innovative MEW-Designs (u.a. mit runder Porengeometrie) gedruckt werden. Der Abstand zwischen den Fasern in einem Scaffold mit standardisierter kastenförmiger Porengeometrie wurde erfolgreich auf 40 µm reduziert, während gleichzeitig eine hohe Stapelpräzision gewährleistet wurde. In Zusammenarbeit mit einer Kollegin am Lehrstuhl (Tina Tylek, die alle zellbasierten Experimente in dieser Studie durchführte) wurde nachgewiesen, dass diese innovativen MEW-Scaffolds die Polarisierung menschlicher Makrophagen in Richtung des regenerativen M2-Typs förderten. Die Makrophagen-Polarisierung ging einher mit einer Zellelongation, wobei dieser Effekt verstärkt für kleinere Porengrößen auftrat.
Abschließend stand die Untersuchung der pro-adipogenen Wirkung von faserfunktionalisierten MEW-Scaffolds im Fokus (Kapitel 5), welche mit ECM-Proteinen, wie beispielsweise dezellularisiertes Fettgewebe (DAT), beschichtet wurden. Das pro-adipogene Potential dieser Materialien wurde mit Hilfe einer adipogenen Kurzzeitinduktion näher analysiert, da eine Langzeitapplikation der Differenzierungsreagenzien diesen Effekt überdeckte. Die Scaffolds mit der DAT-Beschichtung zeigten durchweg die höchste adipogene Differenzierung und boten somit für Stammzellen eine adipo-induzierende Mikroumgebung, weshalb sie für die Anwendung in der Weichgeweberegeneration sehr vielversprechend sind.
An diese Arbeit anschließende Experimente sollten alle drei Projekte in einem Co-Kulturansatz von Neutrophilen, Makrophagen und MSCs kombinieren, um so einen stärkeren in vivo-Bezug herzustellen. Hierfür erweist sich das MEW-Scaffold insbesondere durch seine Kombinationsfähigkeit der Oberflächenfunktionalität und Morphologie als Ansatz für einen erfolgreichen Wundheilungsprozess und ebnet damit den Weg für eine bestmögliche Geweberegeneration.
KW  - Scaffold <Tissue Engineering>
KW  - Biomaterial
KW  - tissue regeneration
KW  - melt electrowriting
KW  - Scaffold
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212117
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lorson, Thomas
T1  - Novel Poly(2-oxazoline) Based Bioinks
T1  - Neuartige Poly(2-oxazolin) Basierte Biotinten
N2  - Motivated by the great potential which is offered by the combination of additive manufacturing and tissue engineering, a novel polymeric bioink platform based on poly(2 oxazoline)s was developed which might help to further advance the young and upcoming field of biofabrication. In the present thesis, the synthesis as well as the characteristics of several diblock copolymers consisting of POx and POzi have been investigated with a special focus on their suitability as bioinks. 
In general, the copolymerization of 2-oxazolines and 2-oxazines bearing different alkyl side chains was demonstrated to yield polymers in good agreement with the degree of polymerization aimed for and moderate to low dispersities.
For every diblock copolymer synthesized during the present study, a more or less pronounced dependency of the dynamic viscosity on temperature could be demonstrated. Diblock copolymers comprising a hydrophilic PMeOx block and a thermoresponsive PnPrOzi block showed temperature induced gelation above a degree of polymerization of 50 and a polymer concentration of 20 wt%. Such a behavior has never been described before for copolymers solely consisting of poly(cyclic imino ether)s.
Physically cross linked hydrogels based on POx b POzi copolymers exhibit reverse thermal gelation properties like described for solutions of PNiPAAm and Pluronic F127. However, by applying SANS, DLS, and SLS it could be demonstrated that the underlying gel formation mechanism is different for POx b POzi based hydrogels. It appears that polymersomes with low polydispersity are formed already at very low polymer concentrations of 6 mg/L. Increasing the polymer concentration resulted in the formation of a bicontinuous sponge like structure which might be formed due to the merger of several vesicles. For longer polymer chains a phase transition into a gyroid structure was postulated and corresponds well with the observed rheological data.
Stable hydrogels with an unusually high mechanical strength (G’ ~ 4 kPa) have been formed above TGel which could be adjusted over a range of 20 °C by changing the degree of polymerization if maintaining the symmetric polymer architecture. Variations of the chain ends revealed only a minor influence on TGel whereas the influence of the solvent should not be neglected as shown by a comparison of cell culture medium and MilliQ water.
Rotationally as well as oscillatory rheological measurements revealed a high suitability for printing as POx b POzi based hydrogels exhibit strong shear thinning behavior in combination with outstanding recovery properties after high shear stress.
Cell viability assays (WST-1) of PMeOx b PnPrOzi copolymers against NIH 3T3 fibroblasts and HaCat cells indicated that the polymers were well tolerated by the cells as no dose-dependent cytotoxicity could be observed after 24 h at non-gelling concentrations up to 100 g/L. 
In summary, copolymers consisting of POx and POzi significantly increased the accessible range of properties of POx based materials. In particular thermogelation of aqueous solutions of diblock copolymers comprising PMeOx and PnPrOzi was never described before for any copolymer consisting solely of POx or POzi. In combination with other characteristics, e.g. very good cytocompatibility at high polymer concentrations and comparably high mechanical strength, the formed hydrogels could be successfully used for 3D bioprinting. Although the results appear promising and the developed hydrogel is a serious bioink candidate, competition is tough and it remains an open question which system or systems will be used in the future.
N2  - Motiviert durch das große Potential, das die Kombination aus additiver Fertigung und künstlicher Geweberegeneration bietet, wurde eine neuartige polymerbasierte Biotintenplattform auf Basis von Poly(2 oxazolin)en entwickelt. Diese soll zukünftig dazu beitragen das noch junge, aber aufstrebende Forschungsfeld der Biofabrikation weiterzuentwickeln.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Synthese sowie die Eigenschaften von mehreren Diblock Copolymeren, bestehend aus POx und POzi, untersucht, wobei der Hauptfokus auf deren Eignung als Biotinte lag. 
Grundsätzlich konnte gezeigt werden, dass Copolymere, bestehend aus 2 Oxazolinen und 2 Oxazinen, die unterschiedliche Alkylseitenketten besitzen, synthetisiert werden können. Dabei lagen die ermittelten Polymerisationsgrade nahe am zuvor errechneten Wert. Die Polymere wiesen mittlere bis niedrigere Dispersitäten auf.
Für jedes der im Rahmen der vorliegenden Arbeit synthetisierten Diblock Copolymere konnte eine mehr oder weniger starke Abhängigkeit der dynamischen Viskosität von der Temperatur gezeigt werden. Allerdings ist es nicht möglich, aus den thermischen Eigenschaften des Bulkmaterials Rückschlüsse auf das temperaturabhängige Verhalten in Lösung zu ziehen. Diblock Copolymere mit einem hydrophilen PMeOx Block und einem thermoresponsiven PnPrOzi Block bildeten oberhalb einer Kettenlänge von 50 Einheiten und einer Polymerkonzentration von 20 Gew% ein physikalisches Gel. Solch ein Verhalten wurde bisher noch nicht für Copolymere, die ausschließlich auf POx oder seinen höheren Homologen basieren, beschrieben.
Physikalische Hydrogele, basierend auf POx b POzi Copolymeren, weisen eine umgekehrte thermische Gelierung wie auch wässrige Lösungen von PNiPAAm und Pluronic F127 auf. Allerdings konnte durch die komplementäre Verwendung von SANS, DLS und SLS gezeigt werden, dass sich der zugrundeliegende Gelbildungsmechanismus für POx b POzi basierte Hydrogele deutlich von den beiden zuvor genannten unterscheidet. Es wird davon ausgegangen, dass sich zunächst bei einer sehr geringen Polymerkonzentration von 6 mg/L Vesikel mit geringer Polydispersität ausbilden. Eine Erhöhung der Konzentration resultiert in der Ausbildung eines bikontinuierlichen Netzwerks mit schwammartiger Struktur. Dieses bildet sich vermutlich durch die Fusion mehrerer Vesikel. Des Weiteren wird für höhere Polymerisationsgrade ein Phasenübergang zu einer gyroidalen Struktur postuliert der sich sehr gut mit den gewonnenen rheologischen Daten deckt.
Stabile Hydrogele mit außergewöhnlich hoher mechanischer Stärke (G‘ ≈ 4kPa) bildeten sich oberhalb der Tgel, die über eine Temperaturspanne von 20 °C durch Änderung des Polymerisationsgrades eingestellt werden konnte. Veränderung der Kettenenden zeigten nur einen geringen Einfluss auf die TGel, wobei der Einfluss des verwendeten Lösemittels nicht unterschätzt werden sollte. Dies konnte durch den direkten Vergleich von MilliQ Wasser und Zellkulturmedium gezeigt werden.
Rheologische Untersuchungen, die sowohl im rotierenden als auch im oszillierenden Modus durchgeführt wurden, zeigten eine gute Eignung der POx b POzi basierten Hydrogele für Extrusion basierte Druckverfahren. Insbesondere aufgrund des stark ausgeprägten scherverdünnenden Verhaltens und der ausgezeichneten Strukturerholung nach hoher Scherbelastung sollten gute Druckergebnisse erzielbar sein.
Zellviabilität-Assays (WST-1) von PMeOx b PnPrOzi Copolymeren an NIH 3T3 Fibroblasten und HaCat-Zellen zeigten, dass die Polymere bei Konzentrationen von bis zu 100 g/L und Inkubationszeiten von 24 h keine dosisabhängige Zytotoxizität besitzen.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Copolymerisation von POx und POzi den verfügbaren Eigenschaftsbereich von POx basierten Materialien deutlich vergrößert hat. Insbesondere die temperaturinduzierte Gelierung von wässrigen Polymerlösungen wurde noch nie zuvor für ein anderes Copolymer auf Basis von POx und POzi beschrieben. Aufgrund ihrer herausragenden Eigenschaften, wozu unter anderem eine sehr gute Zytokompatibilität bei hohen Polymerkonzentrationen und eine vergleichsweise hohe mechanische Festigkeit zählen, konnten die entwickelten Hydrogele erfolgreich für den 3D Biodruck verwendet werden. Obwohl die beschriebenen Ergebnisse sehr vielversprechend sind und die entwickelte Hydrogelplattform folglich als ernstzunehmender Biotintenkandidat angesehen werden sollte, ist die Konkurrenz sehr groß und es bleibt abzuwarten, welche Tinte bzw. Tinten in Zukunft zum Einsatz kommen.
KW  - Polymere
KW  - Ringöffnungspolymerisation
KW  - Lichtstreuung
KW  - Biomaterial
KW  - 3D-Druck
KW  - Poly(2-oxazolin)e
KW  - poly(2-oxazoline)s
KW  - Biofabrikation
KW  - biofabrication
KW  - Biotinten
KW  - bioinks
KW  - Hydrogel
KW  - hydrogel
KW  - Ringöffnungspolymerisation
KW  - ring-opening polymerization
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-180514
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nahm, Daniel
T1  - Poly(2-oxazine) Based Biomaterial Inks for the Additive Manufacturing of Microperiodic Hydrogel Scaffolds
T1  - Poly(2-oxazine) Basierte Biomaterialtinten für die Additive Fertigung von Mikroperiodischen Hydrogelstrukturen
N2  - The aim of this thesis was the preparation of a biomaterial ink for the fabrication of chemically crosslinked hydrogel scaffolds with low micron sized features using melt electrowriting (MEW). By developing a functional polymeric material based on 2-alkyl-2-oxazine (Ozi) and 2-alkyl-2-oxazoline (Ox) homo- and copolymers in combination with Diels-Alder (DA)-based dynamic covalent chemistry, it was possible to achieve this goal. This marks an important step for the additive manufacturing technique melt electrowriting (MEW), as soft and hydrophilic structures become available for the first time. The use of dynamic covalent chemistry is a very elegant and efficient method for consolidating covalent crosslinking with melt processing. It was shown that the high chemical versatility of the Ox and Ozi chemistry offers great potential to control the processing parameters. The established platform offers straight forward potential for modification with biological cues and fluorescent markers. This is essential for advanced biological applications. The physical properties of the material are readily controlled and the potential for 4D-printing was highlighted as well. The developed hydrogel architectures are excellent candidates for 3D cell culture applications. In particular, the low internal strength of some of the scaffolds in combination with the tendency of such constructs to collapse into thin strings could be interesting for the cultivation of muscle or nerve cells. In this context it was also possible to show that MEW printed hydrogel scaffolds can withstand the aspiration and ejection through a cannula. This allows the application as scaffolds for the minimally invasive delivery of implants or functional tissue equivalent structures to various locations in the human body.
N2  - Das Ziel dieses Projekts war die Herstellung einer Biomaterialtinte, welche die Herstellung chemisch vernetzter, mikrostrukturierter Hydrogelgerüste mittels Melt Electrowriting (MEW) ermöglicht. Die Verwendung von speziell auf den schmelzbasierten 3D Druck angepassten polyoxazinbasierten Polymeren und die Anwendung von dynamisch kovalenter Chemie ermöglichte es, dieses Ziel zu erreichen. Dies ist ein wichtiger Schritt für die aufstrebende, additive Fertigungstechnologie MEW, da nun erstmals weiche und hydrophile Strukturen erzeugt werden können. Speziell die Verwendung der dynamischen Diels-Alder (DA) Chemie ist ein effizienter Weg, die Fertigung von kovalent vernetzten Strukturen mit der Schmelzprozessierung zu vereinen. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die hier etablierte Materialplattform die Möglichkeit zur Modifikation mit biologischen und chemischen Signalen bietet. Dies ist besonders für biologische Anwendungen unerlässlich. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Materials lassen sich leicht auf potentielle Anwendungen anpassen und das Potential für den 4D Druck wurde ebenfalls hervorgehoben. Alles in Allem legt diese Arbeit den Grundstein für eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungen sowohl in der Biomedizin als auch in anderen Bereichen.
KW  - Polymere
KW  - Ringöffnungspolymerisation
KW  - Biomaterial
KW  - 3D-Druck
KW  - biofabrication
KW  - poly(2-oxazoline)s
KW  - poly(2-oxazine)s
KW  - ring-opening polymerization
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245987
ER  - 
TY  - THES
A1  - Shan, Junwen
T1  - Tailoring Hyaluronic Acid and Gelatin for Bioprinting
T1  - Modifikation von Hyaluronsäure und Gelatine für die Anwendung im Biodruck
N2  - In the field of biofabrication, biopolymer-based hydrogels are often used as bulk materials with defined structures or as bioinks. Despite their excellent biocompatibility, biopolymers need chemical modification to fulfill mechanical stability.
In this thesis, the primary alcohol of hyaluronic acid was oxidized using TEMPO/TCC oxidation to generate aldehyde groups without ring-opening mechanism of glycol cleavage using sodium periodate. For crosslinking reaction of the aldehyde groups, adipic acid dihydrazide was used as bivalent crosslinker for Schiff Base chemistry. This hydrogel system with fast and reversible crosslinking mechanism was used successfully as bulk hydrogel for chondrogenic differentiation with human mesenchymal stem cells (hMSC). 
Gelatin was modified with pentenoic acid for crosslinking reaction via light controllable thiol-ene reaction, using thiolated 4-arm sPEG as multivalent crosslinker. Due to preservation of the thermo responsive property of gelatin by avoiding chain degradation during modification reaction, this gelatin-based hydrogel system was successfully processed via 3D printing with low polymer concentration. Good cell viability was achieved using hMSC in various concentrations after 3D bioprinting and chondrogenic differentiation showed promising results.
N2  - Im Bereich der Biofabrikation werden Hydrogele auf Biopolymerbasis häufig als Bulkmaterial mit definierten Strukturen oder als Biotinten verwendet. Obwohl Biopolymere eine hervorragende Biokompatibilität aufweisen, müssen sie jedoch chemisch modifiziert werden, um gewisse mechanische Stabilität für den Einsatz in der Biofabrikation zu erreichen. In dieser Arbeit wurde der primäre Alkohol der Hyaluronsäure mit Hilfe der TEMPO/TCC-Oxidation oxidiert, um Aldehydgruppen zu generieren. Dabei findet kein Ringöffnungsmechanismus statt, wie er bei der Glykolspaltung mit Natriumperiodat vorkommt. Für die Vernetzungsreaktion der Aldehydgruppen wurde Adipinsäuredihydrazid als bivalenter Vernetzer für die Bildung der Schiffschen Base verwendet. Dieses Hydrogelsystem mit schnellem und reversiblem Vernetzungsmechanismus wurde erfolgreich als Bulkhydrogel für die chondrogene Differenzierung mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) erfolgreich eingesetzt. Als Mikrogele könnte das System in künftigen Forschungsarbeiten auf seine Verdruckbarkeit getestet werden.
Gelatine wurde mit Pentensäure modifiziert, um die Vernetzungsreaktion über eine lichtkontrollierbare Thiol-En-Reaktion durchzuführen, bei der thioliertes 4-armiges sPEG als multivalenter Vernetzer verwendet wurde. Da die thermoresponsive Eigenschaft der Gelatine erhalten blieb, indem der Kettenabbau während der Modifizierungsreaktion vermieden wurde, konnte dieses Hydrogelsystem auf Gelatinebasis erfolgreich im 3D-Druck mit niedriger Polymerkonzentration verarbeitet werden. Mit hMSC in verschiedenen Konzentrationen wurde nach dem 3D-Biodruck eine gute Zellviabilität erreicht und die chondrogene Differenzierung zeigte vielversprechende Ergebnisse.
KW  - Hydrogel
KW  - Biomaterial
KW  - Biofabrication of hydrogels
KW  - Biomaterial
KW  - Chemical modification of biopolymers
KW  - Chondrogenic differentiation
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298256
ER  - 
TY  - THES
A1  - Tylek, Tina
T1  - Establishment of a Co-culture System of human Macrophages and hMSCs to Evaluate the Immunomodulatory Properties of Biomaterials
T1  - Etablierung eines Co-Kultur-Systems von humanen Makrophagen und hMSCs zur Bewertung der Immunmodulatorischen Eigenschaften von Biomaterialien
N2  - The outcome of the innate immune response to biomaterials mainly determines whether the material will be incorporated in the body to fulfill its desired function or, when it gets encapsulated, will be rejected in the worst case. Macrophages are key players in this process, and their polarization state with either pro- (M1), anti-inflammatory (M2), or intermediate characteristics is crucial for deciding on the biomaterial’s fate. While a transient initial pro-inflammatory state is helpful, a prolonged inflammation deteriorates the proper healing and subsequent regeneration. Therefore, biomaterial-based polarization may aid in driving macrophages in the desired direction. However, the in vivo process is highly complex, and a mono-culture of macrophages in vitro displays only one part of the cellular system, but, to this date, there is a lack of established co-cultures to assess the immune response to biomaterials. Thus, this thesis aimed to establish a functional co-culture system of human macrophages and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to improve the assessment of the immune response to biomaterials in vitro. Together with macrophages, hMSCs are involved in tissue regeneration and inflammatory reactions and can modulate the immune response. In particular, endogenously derived hMSCs considerably contribute to the successful engrafting of biomaterials. This thesis focused on poly(ε-caprolactone) (PCL) fiber-based scaffolds produced by the technique of melt electrowriting (MEW) as biomaterial constructs. Via this fabrication technique, uniform, precisely ordered scaffolds varying in geometry and pore size have been created in-house.
To determine the impact of scaffold geometries and pore sizes on macrophages, mono-cultures incubated on scaffolds were conducted. As a pre-requisite to achieve a functional co-culture system on scaffolds, setups for direct and indirect systems in 2D have initially been established. These setups were analyzed for the capability of cell-cell communication. In parallel, a co-culture medium suitable for both cell types was defined, prior to the establishment of a step-by-step procedure for the co-cultivation of human macrophages and hMSCs on fiber-based scaffolds. 

Regarding the scaffold morphologies tested within this thesis to improve M2-like polarization, box-shaped scaffolds outperformed triangular-, round- or disordered-shaped ones. Upon further investigation of scaffolds with box-shaped pores and precise inter-fiber spacing from 100 µm down to only 40 µm, decreasing pore sizes facilitated primary human macrophage elongation accompanied by their differentiation towards the M2 type, which was most pronounced for the smallest pore size of 40 µm. To the best of my knowledge, this was the first time that the elongation of human macrophages in a 3D environment has been correlated to their M2-like polarization. Thus, these results may set the stage for the design, the assessment, and the selection of new biomaterials, which can positively affect the tissue regeneration.

The cell communication of both cell types, detected via mitochondria exchange in direct and indirect co-cultures systems, took place in both directions, i.e., from hMSCs to macrophages and vice versa. Thereby, in direct co-culture, tunneling nanotubes enabled the transfer from one cell type to the respective other, while in indirect co-culture, a non-directional transfer through extracellular vesicles (EVs) released into the medium seemed likely. Moreover, the phagocytic activity of macrophages after 2D co-cultivation and hence immunomodulation by hMSCs increased with the highest phagocytic rate after 48 h being most pronounced in direct co-cultivation. 

As the commonly used serum supplements for macrophages and hMSCs, i.e., human serum (hS) and fetal calf serum (FCS), respectively, failed to support the respective other cell type during prolonged cultivation, these sera were replaced by human platelet lysate (hPL), which has been proven to be the optimal supplement for the co-cultivation of human macrophages with hMSCs within this thesis. Thereby, the phenotype of both cell types, the distribution of both cell populations, the phagocytic activity of macrophages, and the gene expression profiles were maintained and comparable to the respective standard mono-culture conditions. This was even true when hPL was applied without the anticoagulant heparin in all cultures with macrophages, and therefore, heparin was omitted for further experiments comprising hPL and macrophages.

Accordingly, a step-by-step operating procedure for the co-cultivation on fiber-based scaffolds has been established comprising the setup for 3D cultivation as well as the description of methods for the analysis of phenotypical and molecular changes upon contact with the biomaterial. The evaluation of the macrophage response depending on the cultivation with or without hMSCs and either on scaffolds or on plastic surfaces has been successfully achieved and confirmed the functionality of the suggested procedures. 

In conclusion, the functional co-culture system of human macrophages and hMSCs established here can now be employed to assess biomaterials in terms of the immune response in a more in vivo-related way. Moreover, specifically designed scaffolds used within the present thesis showed auspicious design criteria positively influencing the macrophage polarization towards the anti-inflammatory, pro-healing type and might be adaptable to other biomaterials in future approaches.
Hence, follow-up experiments should focus on the evaluation of the co-culture outcome on promising scaffolds, and the suggested operating procedures should be adjusted to further kinds of biomaterials, such as cements or hydrogels.
N2  - Der Verlauf der angeborene Immunantwort auf Biomaterialien bestimmt maßgebend, ob das Material vom Körper angenommen wird, um so seine gewünschte Funktion zu erfüllen, oder ob es zur Einkapselung und im schlimmsten Fall zur Abstoßung kommt. Makrophagen spielen in diesem Prozess eine Schlüsselrolle, und ihr Polarisationszustand, entweder pro (M1), antiinflammatorisch (M2) oder ein dazwischenliegender Subtyp, ist dabei von entscheidender Bedeutung. Während ein vorübergehender proinflammatorischer Anfangszustand hilfreich ist, verschlechtert eine anhaltende Entzündung eine zeitnahe Heilung und die anschließende Regeneration. Daher könnte eine durch Biomaterialien beeinflusste Polarisation hilfreich sein, um die Makrophagen in die gewünschte Richtung zu lenken. Die in vivo Reaktion ist jedoch äußerst komplex und die Kultivierung von Makrophagen in vitro stellt nur einen Teil des Prozesses dar. An etablierten Co-Kultursystem zur Untersuchung der immunmodulierenden Eigenschaften von Biomaterialien mangelt es jedoch. Daher war es Ziel dieser Arbeit ein funktionelles Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) zu etablieren um die in vitro Bewertung der Immunantwort nach Kontakt mit Biomaterialien zu verbessern. Von Interesse sind hMSCs hierbei, da sie zusammen mit Makrophagen an der Geweberegeneration und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Zudem weisen MSCs immunmodulierende Eigenschaften in Hinblick auf Makrophagen auf und sind aktiv am Verlauf der Fremdkörperreaktion nach der Transplantation von Biomaterial beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Poly(ε-caprolactone) (PCL)-Scaffolds auf Faserbasis als Biomaterialkonstrukte verwendet, welche mit der Technik des Melt Electrowriting (MEW) hergestellt wurden. Mit dieser Technik kann sowohl die Form der Scaffolds als auch die Porengröße variiert werden. 
Um Unterschiede der Scaffoldgeometrien und Porengrößen in Hinblick auf die Makrophagenreaktion zu untersuchen, wurden zunächst Versuche mit Makrophagen-Monokulturen durchgeführt. Zur Etablierung eines funktionellen Co-Kultursystem, wurde zu Beginn ein Aufbau für ein direktes und indirektes System in 2D erstellt. Dieser Aufbau wurde anschließend auf die Möglichkeit der Zell-Zell-Kommunikation darin analysiert. Weiterhin wurde ein, für beide Zelltypen, geeignetes Kulturmedium definiert, gefolgt von der Etablierung eines Protokoll für die Co-Kultivierung beider Zelltypen auf faserbasierten Scaffolds.

Im Bezug zu dieser Arbeit wurden Scaffolds mit unterschiedlicher Geometrie mittels der Technik des Melt Electrowriting hergestellt um die Veränderung der Makrophagenpolarisation zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine verstärkte M2-Polarisation auf Scaffolds mit einer kastenförmigen Morphologie, verglichen mit dreieckigen, runden oder ungeordnet-strukturierten Scaffolds. Die weitere Untersuchung von Scaffolds mit kastenförmigen Poren und präzisen Faserabständen von 100 µm bis zu 40 µm zeigte das kleinere Porengrößen die Elongation primärer menschlicher Makrophagen förderten. Begleitet wurde die verstärkte Elongation mit einer gesteigerten Polarisation in Richtung des M2 Typs. Dieser Effekt war nach Kultivierung von Makrophagen auf Scaffolds mit 40 µm Poren am stärksten ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit erstmals eine länglichen Morphologie humaner Makrophagen mit einer Polarisierung in den M2 Typ korreliert werden. Diese Ergebnisse könnten daher für das Design neuer Biomaterialien, welche sich positiv auf die Geweberegeneration auswirken sollen, von Bedeutung sein.

Die Zellkommunikation beider Zelltypen, welche über Mitochondrienaustausch im direkten und indirekten Co-Kultur-System nachgewiesen wurde, fand sowohl ausgehend von Makrophagen als auch von hMSCs statt. Dabei ermöglichten „Tunneling Nanotubes“ in der direkten Co-Kultur den Transfer von Mitochondrien von einem Zelltyp zum jeweils anderen, während in der indirekter Co-Kultur ein ungerichteter Transfer durch in das Medium freigesetzte extrazelluläre Vesikel (EVs) stattfand. Darüber hinaus wurde die phagozytotische Aktivität von Makrophagen nach Co-Kultivierung untersucht, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von hMSCs nachzuweisen, wobei die höchste phagozytotische Aktivität nach 48 stündiger Co-Kultivierung festgestellt wurde. 

Da die üblicherweise verwendeten Serumzusätze für Makrophagen (humanes Serum (hS)) und hMSCs (fötales Kälberserum (FCS)) bei längerer Kultivierung den jeweils anderen Zelltyp nicht unterstützen konnten, wurden diese Seren durch humanes Thrombozytenlysat (hPL) ersetzt. Dieses erwies sich im Rahmen dieser Arbeit als optimale Ergänzung für die gemeinsame Kultivierung beider Zelltypen in der Co-Kultur. Dabei wurden der Phänotyp und die Populationsverteilung beider Zelltypen, sowie die phagozytotische Aktivität und die Veränderung des Genexpressionsprofils von Makrophagen untersucht und mit den jeweiligen Standard-Monokulturbedingungen verglichen. Des Weiteren konnte gezeigt werde, dass eine Zugabe von Heparin in Zellkulturen mit Makrophagen und hPL nicht nötig ist. Daher wurde auf den Zusatz von Heparin für alle weitere Experimente, die hPL und Makrophagen umfassten, verzichtet. 

Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll für die Co-Kultivierung auf MEW Scaffolds erstellt. Neben der Etablierung eines Setups für die 3D-Kultivierung wurden sowohl Protokolle zur Bewertung phänotypischer als auch molekularer Veränderungen entwickelt. Durch Feststellung von Unterschieden in der Makrophagenreaktion in Abhängigkeit zu der Kultivierung mit / ohne hMSCs und entweder auf Scaffolds oder Plastik-Kulturschalen konnte die Funktionalität der Protokolle nachgewiesen werden.

Mit dem in dieser Arbeit etabliertem funktionellen Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und hMSCs können zukünftig Biomaterialien mit einem stärkeren in vivo -Bezug in Hinblick auf die Immunantwort bewertet werden. Darüber hinaus deuten Ergebnisse auf speziell konstruierte MEW-Scaffolds ein vielversprechendes Designkriterium für neu entwickelte Biomaterialien an, wobei die Polarisation der Makrophagen in Richtung des entzündungshemmenden, heilungsfördernden Typens durch eine gesteuerte Morphologieänderung beeinflusst werden kann.
An diese Arbeit anschließende Experimente sollten sich auf die Untersuchung vielversprechender Scaffolds mittels Co-Kultivierung sowie auf die Anpassung der etablierten Protokolle an andere Biomaterialgruppen, wie beispielsweiße für Zemente oder Hydrogele, konzentrieren.
KW  - Makrophage
KW  - Biomaterial
KW  - Co-culture system
KW  - Mesenchymal stromal cells
KW  - Macrophages
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203570
ER  -