TY - THES A1 - Knies, Kerstin T1 - Neue Fanconi-Anämie-Gene als Wächter des Genoms T1 - New Fanconi anemia genes as guardians of the genome N2 - Fanconi Anämie (FA) gehört zu den seltenen Chromsomeninstabilitäts-Syndromen. Ursächlich für die Erkrankung sind biallelische Mutationen mit autosomal rezessiver Vererbung in einem der bisher bekannten 21 Genen (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U und –V). Eine Ausnahme stellen FANCB und FANCS dar, die X-chromosomal rezessiv bzw. mit einem dominant negativen Effekt vererbt werden. Die Genprodukte sind als Teil des FA/BRCA-DNA-Reparatur Netzwerks bei der Beseitigung von DNA-Interstrang-Quervernetzungen (ICL) involviert. ICLs führen zu einer Stagnation der Replikationsgabel und blockieren somit wichtige zelluläre Prozesse wie Replikation und Transkription, sodass eine Aufrechterhaltung der Genomstabilität nicht mehr gewährleistet ist. FA ist gekennzeichnet durch angeborene Fehlbildungen, fortschreitendes Knochenmarkversagen und eine erhöhte Prädisposition gegenüber Krebserkrankungen. Die Diagnose basiert auf phänotypischen Auffälligkeiten und wird auf zellulärer Ebene durch die Hypersensititvät gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen wie Mitomycin C (MMC) bestätigt. Da nicht jeder Patient einer bisher bekannten Komplementationsgruppe zugeordnet werden kann und herkömmliche molekulare Diagnostikverfahren mit der steigenden Anzahl an FA-Genen mühsam, zeitaufwändig und teuer geworden sind, war es nötig, neue molekulare Verfahren wie Whole Exome Sequencing (WES) zu etablieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential dieser Methode im Bezug auf die FA-Genotypisierung erforscht. Bei der Suche nach einer optimalen Anwendung des WES, untersuchten wir verschiedene Anreicherungs- und Sequenziertechniken. Dennoch führen Fehler in den Datenbanken sowie Pseudogene zu falschen Dateninterpretationen und –darstellungen und stellen somit eine Herausforderung dar. Trotzdem zeigen unserer Daten, dass WES eine wertvolle Methode in der Molekulardiagnostik von FA ist. Dies bestätigte sich durch die Zuordnung mehrerer, vorher unklassifizierter FA-Patienten zu den bekannten Komplementationsgruppen und der Ergänzung eines siebten Patienten zum Subtyp FA-P, im Rahmen von zwei Next Generation Sequencing (NGS) Publikationen. Außerdem wurden mit Hilfe von WES zwei neue FA-Gene (FANCQ und FANCW) im Rahmen dieser Arbeit gefunden, wobei XPF (FANCQ) das erste Gen überhaupt war, welches anhand von NGS detektiert wurde. ERCC4/XPF ist eine strukturspezifische Endonuklease, die durch ein Gen kodiert wird, welches bereits vorher mit den Krankheiten Xeroderma Pigmentosum (XP) und dem segmentalen XFE progeroid Syndrom in Verbindung gebracht wurde. Unsere Daten zeigen, dass abhängig von der Mutation in XPF, Patienten eine der drei unterschiedlichen Funktionsstörungen aufweisen. Dies hebt die multifunktionale Stellung der XPF Endonuklease im Rahmen der Genomstabilität und von humanen Erkrankungen hervor. Das zweite Gen, das während dieser Arbeit entdeckt wurde, ist die WD40-Domäne tragende E3 Ubiquitin Ligase RFWD3, die kürzlich mit DNA Reparatur und insbesondere HR verknüpft wurde. Wir konnten zeigen, dass eine RFWD3 Mutation in der WD40-Domäne bei einem FA-Patienten mit der genetischen Erkrankung Fanconi Anämie assoziiert ist. Die HR ist in RFWD3 (FANCW) mutierten Zellen gestört, was auf einer verminderten Relokalisation von mutiertem RFWD3 an das Chromatin und einer defekten Interaktion mit RPA beruht. Des Weiteren weisen Rfwd3 defiziente Mäuse typische Merkmale anderer FA-Mausmodelle auf, wie verminderte Fertilität, ovarielle und testikuläre Atrophie sowie eine reduzierte Lebenserwartung. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass neue molekulare Ansätze wie NGS ein wertvolles Hilfsmittel in der FA-Diagnostik sind um bisher unklassifizierte Patienten einer Komplementationsgruppe zuordnen zu können. Zudem konnten mit Hilfe dieser Technik zwei neue Gene identifiziert werden. Deren Charakterisierung trägt zu einer Vervollständigung und weiteren Aufklärung des FA/BRCA-DNA-Reparatur-Netzwerks bei. N2 - Fanconi anemia (FA) is a rare genomic instability syndrome. Biallelic mutations are disease causing in any one of at least 21 genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U and -V). All are inherited in an autosomal recessive way, except FANCB and FANCS, which are inherited in a X-chromosomal recessive and a dominant negative way, respectively. The gene products are involved in the FA/BRCA DNA damage response pathway to remove interstrand-crosslinks (ICL). ICLs cause stalled replication forks and hence block crucial cellular processes like replication and transcription resulting in decreased maintenance of genome stability. FA is characterized by congenital malformations, progressive bone marrow failure (BMF), and susceptibility to malignancies. Patients are diagnosed based upon phenotypical manifestations and the diagnosis of FA is confirmed by the hypersensitivity of cells to DNA interstrand crosslinking agents such as Mitomycin C (MMC). Since not every patient can be assigned to a complementation group and customary molecular diagnostics has become increasingly cumbersome, time-consuming and expensive the more FA genes have been identified new molecular approaches like Whole Exome Sequencing (WES) has been established. The potential of this method for FA genotyping has been investigated in the context of this thesis. By exploring different enrichment and sequencing techniques, we were able to identify the pathogenic mutations in each case using WES. However, database errors and pseudogenes pose challenges to interpret data correctly. Nevertheless our results show that WES is a valuable tool for molecular diagnosis of FA, since we were able to assign several previously unclassified FA patients to known complementation groups in the framework of two Next Generation Sequencing (NGS) studies. In addition WES revealed two new FA-genes, XPF and RFWD3. Extraordinarily, XPF (FANCQ) is the first gene to be detected with NGS. ERCC4/XPF is a structure specific nuclease - encoding a gene previously connected to xeroderma pigmentosum (XP) and segmental XFE progeroid syndrome. Depending on the type of ERCC4 mutation individuals present with one of the three clinically distinct disorders highlighting the multifunctional nature of the XPF endonuclease in genome stability and human disease. The second gene identified within this thesis is the WD40-containing E3 ubiquitin ligase RFWD3, which has been recently linked to the repair of DNA damage by Homologous Recombination (HR). Here, we show that an RFWD3 mutation within the WD40 domain of a patient with typical FA malformations is connected to the genetic disease Fanconi anemia (FA). Disordered HR is the result of depleted relocation of mutant RFWD3 to chromatin and defective physical interaction with RPA. In addition, Rfwd3 knockout mice show ovarian and testicular atrophy, a reduced life span and pups with sub-Mendelian birth ratios indicating embryonal-lethality. These features resemble other FA mouse models. In summary, this work showed that new molecular approaches like WES are valuable tools for FA diagnosis. Additionally, this method is a useful medium to assign FA patients to so far unknown complementation groups. Two novel genes have been identified and contribute to further completion of the FA/BRCA DNA repair network in the context of genome stability. KW - DNA Reparatur KW - Fanconi Anämie KW - Neue Fanconi Anämie Gene Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150669 ER - TY - THES A1 - Endt, Daniela T1 - Fanconi Anämie : Entwicklung von hämatopoetischen Mosaiken sowie funktionelle Studien von FANCO (RAD51C) und FANCN (PALB2) T1 - Fanconi Anämie : Development of hematopoetic mosaicism and functional studies of FANCO (RAD51C) and FANCN (PALB2) N2 - Zur Wahrung der Genomstabilität entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen führen. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi Anämie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilität führen. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowie bereits im jugendlichen Alter erhöhten Tumor-raten und Anämien geprägt. Bisher wurden Defekte in 19 verschiedenen Genen als ursächlich für diese Erkrankung diskutiert. Anhand des betroffenen Gens können nur begrenzt Rückschlüsse auf die Ausprä-gung des Phänotyps geschlossen werden, vielmehr scheinen die Art der Mutation und deren Position im Gen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Im Laufe der Zeit wurden immer mehr Patienten mit mild ausgeprägtem Erkrankungsbild beobachtet. Eine mögliche Erklärung hierfür liefern milde Mutationen, eine weitere das Vorhandensein von Mosaiken blutbildender Zellen. Zu letzterem führt die Reversion einer der beiden Mutationen. Diese Art der „natürlichen Gentherapie“ wurde bei 10-30% der FA-Patienten beobachtet. Um die Entwicklung von Reversionen besser zu verstehen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die Untersuchung verschiedener Zelllinien von 5 Patienten im Alter von 11 (Pat. 5) bis 33 (Pat. 4) Jahren. Die FA-A-Patienten 1 und 2 wurden bereits von Gross et al. 2002 als Mosaikpatienten beschrieben. Für die weiteren Patienten führten unterschiedliche Aspekte, wie normale Blutwerte, MMC-tolerante lympho-blastoide Zelllinien und gDNA-Analysen des Blutes zum Mosaikverdacht. Nähere Analysen bestätigten für die FA-D2-Patienten (Pat. 4, 5) ebenfalls das Vorliegen einer Reversion in den Blutzellen. Allen Patienten gemein war die Reversion in Form einer Rückmutation (Pat. 1: c.971T>G, Pat. 2: c.856 C>T, Pat. 4: c.3467-2A>G, Pat. 5: c.3707G>A), welche meist in einem oder in der Nähe eines Mutationsmotives vorlag. Zur Einschätzung des Mosaikstatus in den Patientenblutzellen wurden, neben der meist mehrjährigen Be-obachtung der Blutwerte (Thrombo-, Mono-, Granulo-, Lymphozyten, Hämoglobin), gDNA-, Chromoso-menbruch- und Zellzyklusanalysen durchgeführt. Chromosomenbruchanalysen von Metaphasen der T-Lymphozyten der Patienten 4 und 5 zeigten nach MMC-Behandlung die mosaik-typische bimodale Vertei-lung der Chromosomenbruchraten. Die nur moderat erhöhten Bruchraten in Metaphasen des Patienten 1 sprachen für eine starke Reversion. Zur besseren Abschätzung des Mosaikstatus wurden Zellzyklusanaly-sen an Mischungsreihen aus FA- und nicht FA- Blut durchgeführt. Die Detektionsgrenze für FA-Mosaike lag bei einem Anteil von 30% Zellen mit spontanem/MMC-induziertem G2-Phasen-Arrest. In Anlehnung an Mischungskurven wurden für die vier Patienten Reversionen von 0% (Pat. 4) bis 90-95% (Pat. 2) ange-nommen. Die gDNA-Analyse MACS-sortierter T-/B-Lympho-, Mono- und Granulozyten sowie von Fib-roblasten und lymphoblastoiden Zelllinien ermöglichte einen detaillierten Einblick in die Mosaikstatus auf molekularer Ebene. Wir fanden bei allen Patienten einen unterschiedlich stark ausgeprägten Mosaikstatus ihrer Blutzellreihen. Tendenziell scheinen die Reversionsgrade mit der Zell-Lebensdauer korrelieren, hier-bei zeigen kurzlebige Zellen (Mono-, Granulo-, B-Lymphozyten) höhere Reversionsgrade als langlebige T-Lymphozyten. Das Auftreten von gleichen Reversionen in allen Zelllinien lässt eine Reversion in einer gemeinsamen Vorläuferzelle vermuten. Als Besonderheit fanden wir, unseren Erachtens erstmalig, eine komplette Reversion einer Knochenmark-Fibroblastenzelllinie (Pat. 1). Häufig in Kultur stattfindende Re-versionen in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten wir für alle vier Patienten. Die Mosaikentstehung im Patientenblut konnte mit allen Methoden bestätigt werden. Jede Methode wies Vor- und Nachteile auf. Zur Abschätzung der Mosaikstatus empfiehlt sich deshalb eine Kombination der Methoden. Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit Interaktionen des FANCO (RAD51C) innerhalb der RAD51 Paraloge (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) und mit RAD51. Die Analysen erfolgten im Mammalian Two- und Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Die Untersuchungen bestätigten die meisten der bisher detektierten Interaktionen, welche zur Ausbildung des RAD51C-XRCC3 Komplexes und des, aus den Subkomplexen RAD51B-RAD51C (BC) und RAD51D-XRCC2 (DX2) bestehenden, BCDX2-Komplex führen. Die M3H-Analysen weisen auf eine wichtige Rolle des RAD51B-Proteins bei der Ausprägung dieses Komplexes hin. Es scheint die Ausbildung der RAD51C-RAD51D-Interaktion erst zu ermöglichen und zusätzlich, anders als bisher beobachtet, auch mit XRCC2 zu interagieren. Diese Interaktion wiederum wird durch die Anwesenheit von RAD51D stark gefördert. Unsere M2H-/M3H-Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ausbildung der Subkomplexe für die Entstehung des BDCX2-Komplexes wichtig ist und dieser vermutlich als Ringstruktur vorliegt. Zusätzlich fanden wir Hinweise auf mögliche Wechselwir-kungen zwischen den BCDX2- und den XRCC3-Komplexproteinen. Aufgrund der Beteiligung der Protei-ne an der Doppelstrangläsionsreparatur wurde die Auswirkung von MMC-induzierten DNA-Schäden un-tersucht. Diese führten innerhalb der Subkomplexe zu gegensätzlichen Änderungen der Interaktionsinten-sität. Während die Substanz im DX2-Komplex zum Sinken der Interaktionsstärke führte, erhöhte sich diese im BC-Komplex. Die in der Literatur beschriebene und charakterisierte RAD51C-FANCN-Interation war im M2H-Test nicht darstellbar. Möglicherweise würde diese jedoch durch die Anwesenheit eines drit-ten Proteins gefördert werden. Zusätzlich wurde ein RAD51C-Protein, welches die Patientenmutation R258H enthielt, überprüft. Es zeigte nur in der M3H-Analyse, mit pMRAD51D und nativem RAD51B, nach Behandlung mit MMC eine reduzierte Interaktionsstärke im Vergleich zum Wildtyp. Dies unter-streicht einmal mehr die als hypomorph beschriebene Mutation des Proteins. Das dritte Projekt, die angestrebte Strukturaufklärung des RAD51C-Proteins erwies sich als schwierig. Eine für eine Kristallisation ausreichende Proteinmenge konnte, weder im E. coli-System noch in Insektenzellen oder in Co-Expression mit seinem Interaktionspartner XRCC3, isoliert und aufgereinigt werden. Elektro-phoretische Mobility Shift Assays des CX3-Proteinkomplexes mit DNA-Strukturen (ssDNA, Open Fork, 3‘-/ 5‘-Überhang-Struktur), zeigten eine Bevorzugung des 3‘-Überhang-DNA-Substrates. Diese Art der Analyse könnte in weiterführenden Analysen zur Abschätzung der Auswirkung von Patientenmutationen herangezogen werden. bb N2 - For maintaining genomic stability several repair mechanisms have evolved. Defects in these mechanisms lead to diverse diseases. One of these Fanconi Anemia (FA), first described in 1927, evoked by deficient mechanism of interstrand crosslinks. As causative reason defects within the FA-BRCA pathway were iden-tified leading to chromosome instability. To date 19 different genes were found to cause Fanconi Anemia. Most commonly for the clinical picture of FA are congenital malformations, progressive bone marrow defects as like an increased tumor rates and anemia at a juvenile age. Knowing the affected gene only lim-ited conclusions could be considered of the phenotypical appearance. More likely the kind of mutation and the affected position within the gene seems to correlate with the severity of the disease. Over the time an elevated number of patients with mild phenotype were observed. One possible explanation may be mild mutations another a mosaic state developed within the blood forming cells. The latter was caused by rever-sion of one of both mutations. This kind of “natural gene therapy” was observed in the blood of 10 up to 30 % FA- patients. To get better insights in to the mosaic development we investigated different cell lines of five patients aged between 11 (pat. 5) and 33 (pat. 4) years. Both FA-A patients (pat. 1, 2) were described as mosaic patients before by Gross et al. 2002. The other patients arouse suspicion for developing mosai-cism by different aspects like normal blood counts, MMC tolerant lymphoblastiode cell lines and analyzing gDNA from blood. Detailed analyses confirmed the reversion of one mutation in blood of the FA-D2 patients (pat. 4, 5). In common for all four mosaic was the kind of reversion, a back mutation (pat. 1: c.971T>G, pat. 2: c.856 C>T, pat. 4: c.3467-2A>G, pat. 5: c.3707G>A) mostly in or near by a mutation motive. To get insights in to the mosaic state of the patients’ blood cells, gDNA, chromosomal breakage and cell cycle analyses were performed and blood cell counts of thrombo-, mono-, granulo-, lymphocytes and haemoglobin were observed for several years. Chromosomal breakage analyses of t-lymphocytes met-aphases (pat. 4, 5) treated with MMC showed a mosaicism typical bimodal distribution. The only moderate increased chromosomal breakage rate in metaphases of patient 1 points out a strong pronounced reversion. For better estimation of the Mosaic state in patient blood we performed cell cycle analysis with mixtures of FA- and non FA-blood. Thereby we observed the border for mosaic detection at a degree of 30 % cells with spontaneous /MMC induced G2-phase arrest. Compared to the mixing study reversion degrees of 0 % (pat. 4) up to 90-95 % (pat. 2) were assumed for four of the patients. At molecular base gDNA analyses of MACS sorted T-/ B- lympho, mono and granulocytes as well as from fibroblasts and lymphoblastoide cell lines allowed a more detailed insight in to the mosaic statuses. In all patients we observed different distinct of mosaic state in their blood cell lines. We observed a tendency of correlation between reversion degree and the longevity of blood cells – cells with short life spans (mono-, granulo-, B-lymphoytes) showed higher reversion degrees than log living T-lymphocytes. The fact that we detected the same rever-sion in the different cell lines of a patient suggests a reversion within a common precursor cell. Further we observed, as we know for the first time, a reversion within a bone marrow fibroblast line (pat. 1). Four of our patients showed commonly observed reversions in cultured lymphoblastoide cell lines. With each of the tested methods we could show mosaic development in blood of our patients. Every of them showed pros and cons. For this reason a combination of the different methods would be recommendable for cal-culation of the mosaic state in patient blood. The second project investigated the interactions of FANCO (RAD51C) within the group of the RAD51 paralogs (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) and with RAD51. Interactions were tested by Mammalian Two- and Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Our investigations confirm most of the up to now detected interactions leading to RAD51C-XRCC3-complex (CX3) and RAD51B-RAD51C-RAD51D-XRCC2 com-plex (BCDX2) formation – latter consisting of the subcomplexes RAD51B-RAD51C (BC) and RAD51D-XRCC2 (DX2). M3H analyses give a hint for the importance of the RAD51B protein for the BCDX2 complex formation. The protein seems to be necessary for RAD51C-RAD51D interaction and also to interact, other than intended before, with XRCC2. In turn this interaction seems to be strongly promoted by RAD51D. In M2H and M3H analyses we found evidence of the importance of subcomplex formation for the formation of the whole BCDX2 complex and that the complex may be a circular structure. Addi-tionaly we observed evidence for interdependency between the BCDX2- and the XRCC3- complex pro-teins. Because of the proteins involvement into the double strand lesion repair the effect of MMC induced DNA lesions were tested. MMC treatment leads to different changes of interaction within the subcom-plexes. We observed a decrease of interaction strength between RAD51D and XRCC2 and an increased interaction within the BC-complex. The interaction between RAD51C and FANCN was not detectable in our M2H assay but may be promoted by another protein in M3H analysis. Additionally we tested a RAD51C protein inherited the patient mutation R258H. Only in M3H analysis with pMRAD51D and native RAD51B and with additional MMC treatment reduced interaction strength was detectable compared to the wildtype RAD51C. This underlines the hypomorphic nature of the mutation described before. The third project – the elucidation of the RAD51C protein structure proved to be difficult. We could not isolate and purify enough protein for crystallization, neither by expression within a E.coli or an insect cell system not even by co-expression of the complex partner XRCC3. Electrophoretic mobility shift assays of the CX3 complex with different DNA-structures (ssDNA, open fork, 3’- and 5’- overhang structures) showed preference for the 3’-overhang DNA substrate. This method may be used for further investiga-tions of mutations in patient DNA in future. KW - Fanconi Anämie KW - Hämatopoese KW - Mosaik KW - Remission KW - Molekulargenetik KW - Fanconi Anämie KW - hämatopoetisches Mosaik KW - Reversion KW - RAD51C KW - FANCO Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127836 ER - TY - THES A1 - Schuster, Beatrice T1 - Genotyping Fanconi Anemia : From Known to Novel Genes -From Classical Genetic Approaches to Next Generation Sequencing T1 - Genotypisierung der Fanconi Anämie N2 - Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive or X-chromosomal inherited disorder, which is not only phenotypically but also genotypically very heterogeneous. While its hallmark feature is progressive bone marrow failure, many yet not all patients suffer additionally from typical congenital malformations like radial ray defects and growth retardation. In young adulthood the cumulative risk for developing hematological or other malignancies is compared to the general population several hundred-fold increased. The underlying molecular defect is the deficiency of DNA interstrand crosslink (ICL) repair. ICLs are deleterious lesions, which interfere with crucial cellular processes like transcription and replication and thereby can lead to malignant transformation, premature senescence or cell death. To overcome this threat evolution developed a highly complex network of interacting DNA repair pathways, which is conserved completely only in vertebrates. The so called FA/BRCA DNA damage response pathway is able to recognize ICLs on stalled replication forks and promotes their repair through homologous recombination (HR). Today we know 15 FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O and -P) whose products are involved in this pathway. Although more than 80% of FA patients carry biallelic mutations in either FANCA, FANCC or FANCG, there are still some who cannot be assigned to any of the known complementation groups. This work aimed to indentify the di¬sease causing mutations in a cohort of those unassigned patients. Initial screens of the candidate genes FAN1, MHF1 and MHF2 did not reveal any pathogenic alterations. Moreover, FAN1 could be excluded as FA candidate gene because patients carrying a homozygous microdeletion including the FAN1 locus did not show a phenotype comparable to FA patients. In the case of MHF1 and MHF2 the reason for the negative screening result is not clear. Mutation carriers might be rare or, regarding the diverse and also FA pathway independent protein functions, phenotypically not comparable to FA patients. Nevertheless, this study contri¬buted to the identification and characterization of the most recent members of the FA pathway - RAD51C (FANCO), SLX4 (FANCP) and XPF (FANCQ). FANCO is one of the RAD51 paralogs and is involved in crucial steps of HR. But since the only reported FA-O patient has so far not developed any hematological anomalies, FANCO is tentatively designated as gene underlying an FA-like disorder. In contrast, patients carrying biallelic mutations in FANCP do not only show hematological anomalies, but as well congenital malformations typical for FA. The distinct role of FANCP in the FA pathway could not be determined, but it is most likely the coordination of structure-specific nucleases during ICL excision. One of these nucleases is the heterodimer XPF/ERCC1. XPF is probably disease causing in the complementation group FA-Q and is the first FA gene, which was identified by Next Generation Sequencing (NGS). Extraordinarily is that mutations in this gene had previously been reported to cause two other disorders, xeroderma pigmentosum and segmental progeria. Despite some overlaps, it was shown that the divergent phenotypes could clearly be distinguished and are caused by distinct functional defects of XPF. Additionally, this work aimed to improve and accelerate the genotyping process of FA patients in general. Therefore, classical approaches should be complemented or fully replaced by approa¬ches using NGS. Massively parallel sequencing of the whole exome proved to be most appro¬priate and the establishment of an FA-specific analysis pipeline facilitated improved molecular diagnostics by combining complementation group assignment and mutation analysis in one step. Consequently two NGS studies revealed the pathogenic defect in several previously unassigned FA patients and thereby added another patient to one of the most recent subtypes, FA-P. In summary, this work contributed not only to further completion of the FA/BRCA DNA repair network by adding three novel genes, it also showed that classical molecular approaches for re¬search as well as for diagnostics could be replaced by NGS. N2 - Die Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessiv oder X-chromosomal vererbte Erkrankung, deren charakteristisches diagnostisches Merkmal das progressive Versagen des Knochenmarks darstellt. Viele, jedoch nicht alle Patienten leiden zusätzlich an kongenitalen Fehlbildungen, wie Radialstrahl-Anomalien oder Minderwuchs. Im Vergleich zur normalen Bevölkerung steigt zu¬dem im jungen Erwachsenenalter das Risiko für hämatologische und auch solide Tumoren um ein Vielfaches. Verantwortlich hierfür ist sehr wahrscheinlich der zugrunde liegende Defekt in der Reparatur von DNA-Interstrang-Quervernetzungen. Diese Art der Läsion blockiert wich¬tige zelluläre Prozesse wie Transkription und Replikation, und kann daher nicht nur zur Ent¬artung oder vorzeitigen Alterung der Zellen, sondern auch zu stark erhöhten Apoptose-Raten führen. Zur Entfernung dieser Quervernetzungen hat die Evolution ein komplexes Netzwerk an verschiedenen Reparaturwegen hervorgebracht, das nur in Vertebraten vollständig konserviert ist. Der sogenannte FA/BRCA-Reparaturweg ist in der Lage Quervernetzungen an stagnierten Replikationsgabeln zu erkennen und zu entfernen. Heute kennen wir 15 Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O und -P), deren Produkte in diesem Weg involviert sind und deren pathogene Veränderung zur Ausprägung des FA-Phänotyps führen. Rund 80% aller Fälle können durch biallelische Mutationen in FANCA, FANCC und FANCG erklärt werden. Pa¬thogene Varianten in anderen Genen werden weitaus seltener gefunden und ein kleiner Anteil der Patienten kann keiner der bekannten Komplementationsgruppen zugeordnet werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, den ursächlichen genetischen Defekt in diesen Patienten aufzudecken. Untersuchungen an den Kandidatengenen FAN1, MHF1 und MHF2 konnten keine pathoge¬nen Veränderungen identifizieren. FAN1 konnte darüber hinaus gänzlich als Kandidatengen aus¬geschlossen werden, da Patienten mit einer homozygoten FAN1-Deletion keinen FA-Phänotyp zeigten. Im Fall von MHF1 und MHF2 sind Mutationsträger wahrscheinlich sehr selten oder unterscheiden sich in ihrem Phänotyp von den bisher bekannten FA Patienten. Nichtsdestotrotz trug diese Arbeit maßgeblich zur Aufklärung der genetischen Ursache in den Untergruppen FA-O, FA-P und FA-Q bei. Ursächlich für den Subtyp FA-O sind biallelische Mutationen in RAD51C, einem Paralog der Rekombinase RAD51, mit offenbar entscheidender Funktion in der homolo¬gen Rekombinationsreparatur. Da der einzige bislang beschriebene Patient zum Zeitpunkt der Veröffentlichung zwar charakteristische Fehlbildungen, aber weder hämatologische Auffälligkei¬ten, noch maligne Veränderungen zeigte, wird RAD51C (FANCO) bisher als zugrunde liegendes Gen einer FA-ähnlichen Krankheit bezeichnet. Bei der Identifizierung von SLX4 als ursächliches Gen der Untergruppe FA-P gab es hingegen keine Zweifel; alle Patienten zeigten einen sehr ty¬pischen Phänotyp. SLX4 (FANCP) scheint eine entscheidende Rolle bei der Exzision von DNA-Quervernetzungen zu spielen, indem es die Funktion oder richtige Positionierung von Struktur-spezifischen Nukleasen koordiniert. Eine dieser Nukleasen ist das Heterodimer XPF/ERCC1. XPF liegt wahrscheinlich der Komplementationsgruppe FA-Q zugrunde und ist das erste FA-Gen, das mittels Next Generation Sequencing (NGS) identifiziert wurde. Interessanterweise wurde es zuvor bereits als genetische Ursache von Xeroderma pigmentosum und segmentärer Progerie beschrieben. Diese Studie konnte jedoch belegen, dass die jeweiligen Mutationen die Proteinfunktion derart unterschiedlich beeinflussen, dass es tatsächlich zur Ausprägung von drei divergenten Phänotypen kommen kann. Neben der Kandidatengensuche war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Implementierung neuer Techniken für die FA-Genotypisierung. Klassische Methoden der Molekulargenetik sollten hier¬für durch Anwendungen des NGS ergänzt oder gänzlich ersetzt werden. Die Hochdurchsatz- Sequenzierung des gesamten Exoms erwies sich als geeignet und kann Komplementationsgrup¬pen-Zuordnung und Mutationsanalyse in einem Schritt vereinen. Durch die Etablierung einer FA-spezifischen bioinformatischen Datenanalyse konnte im Rahmen dieser Arbeit der genetische Defekt bereits mehrerer Patienten aufgeklärt werden. Im Besonderen konnte ein weiterer Patient der neuen, noch wenig charakterisierten Untergruppe FA-P zugeordnet werden. Insgesamt trug diese Arbeit also nicht nur zur weiteren Vervollständigung des FA/BRCA-Re-paraturweges bei, indem drei neue FA-Gene hinzugefügt wurden; sie zeigte außerdem, dass klas¬sische Methoden der Molekulargenetik sowohl in Forschung als auch Diagnostik künftig durch das NGS ersetzt werden könnten. KW - Fanconi Anämie KW - DNA Reparatur KW - DNS-Reparatur KW - Fanconi Anemia KW - DNA repair KW - Next generation sequencing Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85515 ER - TY - THES A1 - Buwe, Andrea T1 - Geschlechts-chromosomale Kopplung der Fanconi Anämie Gene FANCC und FANCG im Hühnergenom und die geschlechtsspezifische Sensibilität der Hühnerzellen gegenüber Mitomycin C T1 - Sex-chromosomal linking of Fanconis Anemia gene FANCC and FANCG in chicken and gender-related sensibility to mitomycin C. N2 - Fanconi Anämie ist eine seltene rezessiv vererbte Erkrankung, deren zu Grunde liegende Enzymdefekte in ein Netzwerk unterschiedlichster DNA-Reparaturproteine eingewoben sind. Phylogenetisch sind uns Vögel relativ nahe verwandt, was sie zu einem guten Modellorganismus jenseits der Säugetiermodelle macht. Eine von Hühnerzellen abgeleitete Zelllinie (DT40) wurde bereits schon breit eingesetzt um die Funktion des FA-Signalwegs zu erforschen. Nachdem auch das Hühnergenom vollständig entschlüsselt wurde, konnten zu fast allen FA-Genen Orthologe gefunden werden. Unter den zahlreichen FA-Genen sind für diese Arbeit vor allem FANCC und -G von Bedeutung, da beide Gene auf dem Z-Geschlechtschromosom des Huhns liegen und eine Inaktivierung des zweiten Z-Chromosoms beim Hahn äquivalent zur X-Inaktivierung beim Menschen nicht stattfindet. Somit sollte es ein ´natürliches´ Gendosisungleichgewicht zwischen den Geschlechtern geben. Im durchgeführten Southern Blot konnte keine geschlechtsspezifisch weibliche Bande (für FANCC und -G) gefunden werden. Somit ist davon auszugehen, dass die FA-Gene C und G ausschließlich auf dem Z-Chromosom lokalisiert sind. Dies wurde auch nochmals mittels FISH bestätigt - beide Gene fanden sich auf dem kurzen Arm des Z-Chromosoms (FANCC zentromernah, FANCG zentromerfern). Aus Studien mit DT40 Zellen ist bereits bekannt, dass FA defiziente Zellen ähnlich wie humane FA-Zellen eine Hypersensitivität gegenüber Substanzen zeigen, die DNA-crosslinks verursachen. In Anlehnung an die humane FA-Diagnostik wurden die neu etablierten embryonalen Fibroblasten mit unterschiedlichen Konzentrationen und Einwirkzeiten von MMC behandelt und die Schäden ausgewertet. In allen Untersuchungen trugen die weiblichen Zellen mehr Schäden davon als die männlichen. Bei niedrigen Konzentrationen zeigte sich dies nur als Trend, bei höheren MMC-Konzentrationen und längeren Einwirkzeiten fanden sich bei fast allen durchgeführten Untersuchungen auch statistisch signifikante Unterschiede. Somit ergibt sich aus dieser Arbeit ein deutlicher Hinweis auf ein funktionelles Ungleichgewicht zwischen Henne und Hahn was die DNA-Reparatur nach Schädigung durch MMC angeht. N2 - Fanconi anemia is a rare recessive disorder whose underlying enzyme deficiencies are woven into a network of various DNA repair proteins. Phylogenetically related birds are relatively close to us, which makes it a good model organism beyond the mammalian models. A cell line derived from chicken cells (DT40) has already been widely used to study the FA pathway. Even after the chicken genome was completely decoded, orthologs could be found for almost all FA genes. Among the numerous FA genes are mainly FANCC and G of importance since both genes are located on the Z sex chromosome of chicken. An inactivation of the second Z chromosome as the inactivation of the x chromosom in human does not take place. Thus there should be a 'natural' imbalance of the gen dose between the sexes. Southern blot showed no gender female band (for FANCC and G). Thus it can be assumed that the FA genes C and G are exclusively localized on the Z chromosome. This was also confirmed by FISH, both genes were located on the short arm of the Z chromosome. From studies in DT40 cells is already known that FA deficient cells, similar to a human FA cell show hypersensitivity to substances that cause DNA crosslinks. Based on the human FA diagnosis, newly established embryonic fibroblasts were treated with different concentrations of MMC and chromosomal the damage was evaluated. In all studies, the female cells contributed more damage than the male. At low concentrations, this was only shown as a trend, at higher MMC concentrations and longer exposure times there was a significant differences. Thus, results from this study, a clear indication of a functional imbalance between hen and rooster in terms of DNA repair after damage by MMC. KW - Mitomycin C KW - Fanconi Anämie KW - Fanconi Anaemia Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77593 ER - TY - THES A1 - Meier, Daniel T1 - Konservierte transkriptionelle Regulationsmechanismen der Fanconi Anämie core complex Gene T1 - Conserved regulatory mechanisms of the Fanconi anemia core complex genes N2 - Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessive, im Falle der Untergruppe FA-B X-chromosomale Erbkrankheit, die mit chromosomaler und genomischer Instabilität verbunden ist und sich durch große phänotypische und genetische Heterogenität auszeichnet. Symptomatisch sind Knochenmarksversagen, eine Vielfalt angeborener Fehlbildungen, die weit überdurchschnittliche Disposition für akute myeloische Leukämie (AML), Plattenepithelkarzinome (SCC) sowie eine zelluläre Hypersensitivität gegenüber DNA Doppelstrangvernetzenden Substanzen. FA wird kompliziert durch ein progressives Knochenmarksversagen. Die FA Proteine sind essentiell für die interstrand crosslink (ICL) repair sowie an anderen DNA Reparatursystemen, beteiligt. Bisher wurden hauptsächlich Regulationsmechanismen untersucht, die die FA Proteine betreffen. Die Regulation der Transkripte war bisher nahezu unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der sogenannten FA core complex Gene untersucht. Dabei handelt es sich um acht Gene, deren Produkte im Falle eines DNA Schadens den ersten Proteinkomplex des FA/BRCA Signalweges bilden. Für diese acht Gene wurden in dieser Arbeit die Promotoren identifiziert und ihr Aktivierungspotential charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass diese ein starkes Potential für die Transkriptionsinitiierung besitzen. Des Weiteren zeigten sich Gemeinsamkeiten in Form von Sequenzmotiven sowie Transkriptionsfaktorbindestellen, die in allen core complex Genen nahezu identisch waren. Durch diese Analysen ergaben sich Hinweise, dass die untersuchten Gene durch Mitglieder des JAK/ STAT (STAT1/4) sowie des TGF-b Signalwegs (SMAD1/4) reguliert werden. Funktionelle Untersuchungen mittels siRNA sowie Fibroblastenzelllinen, die biallelische FANCA Mutationen trugen, bestätigten diese Verbindungen. So hatte der knockdown der entsprechenden Transkriptionsfaktoren einen reduzierenden Einfluss auf die Transkriptmenge der core complex Gene. FANCA-mutierte Zelllinen weisen reduzierte mRNAs von STAT und SMAD auf. Darüber hinaus fanden sich signifikante Änderungen der Transkriptmenge in 112 verschiedenen Mitgliedern dieser Signalwege in den FA-A Zellinien. Eines dieser Mitglieder, IRF1, zeigte fast identische Ergebnisse wie sie bei STAT1/4 sowie SMAD1/4 beobachtet werden konnten. Die vorliegende Arbeit trägt dazu bei, die transkriptionelle Regulation der core complex Gene besser zu verstehen. Die auffälligen Gemeinsamkeiten ihrer Regulation liefern neue Argumente für eine Koevolution dieser Gene. N2 - Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive, in the case of subgroup B X-linked, disease that is characterized by chromosomal and genomic instability. FA reveals remarkable phenotypic and genetic heterogeneity. Clinical symptoms include the variable presence of typical congenital malformations, progressive bone marrow failure, and a pronounced predisposition for the occurrence of malignancies such as acute myelogenous leukemia (AML) and squamous cell carcinoma (SCC). The FA proteins are essential for the repair of DNA-interstrand crosslinks and are members of the DNA damage response network. This is why FA cells are hypersensitive to agents inducing doublestrand lesions. In the past, a major topic of research was the interaction of the FA proteins. In this thesis work, transcriptional regulation of the FA core complex genes was investigated. These genes include eight members that form, in response to DNA damage, the first protein complex acting in the FA/BRCA pathway. As part of this thesis, the promoters of the FA core complex genes were identified, and their potential for transcriptional activation was studied. All of them revealed strong power for transcriptional activation. There were marked similarities among them including the presence of two shared sequence motifs, of transcription factor binding sites and in the presence of repressor elements defining them as bipartite in their nature. These analyses provided clues that these genes are regulated, in part, by components of theJAK/ STAT (STAT1/4) and the TGF-ß signaling pathways. Functional studies including knockdown experiments or using fibroblast lines with biallelic mutations in FANCA confirmed these connections. Down-regulation of the designated transcription factors decreased the transcript levels of the FA core complex genes. Likewise, FANCA-mutant cell lines showed reduced amounts of mRNA of STAT and SMAD. Moreover, there were significant changes in the expression of 112 members of the corresponding signaling pathways in FA-A cell lines. The present work contributes to a better overall understanding of the transcriptional regulation of the FA core complex genes. Shared similarities provide arguments in favor of a co-evolution of these genes. KW - Fanconi Anämie KW - Genregulation KW - DNS-Reparatur KW - Fanconi Anämie KW - Genregulation KW - DNA-Reparatur KW - Fanconi Anemia KW - Genregulation KW - DNA-Repair Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65552 ER - TY - THES A1 - Endres, Karlheinz T1 - Zellzykluseffekte von Mitomycin C T1 - cellcycle effects of mitomycin C N2 - ZELLZYKLUSEFFEKTE VON MITOMYCIN C Im Rahmen dieser Arbeit sollten die durch Mitomycin C (MMC) exogen induzierten Zellzyklusstörungen mit den endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fanconi-Anämie in unterschiedlichen Zellsystemen (periphere Blutlymphozyten, lymphoblastoide Zellen und Fibroblasten) verglichen werden. Die Zellzyklusanalysen wurden mit der zweidimensionalen Durchflusszytometrie nach dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren durchgeführt. Mit diesem Verfahren ist es möglich zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen (Ellwart, Stunkel et al. 1981) zu unterscheiden und Verteilungen der Zellen in bis zu vier Zellzyklusphasen mit quantitativer Analyse der Populationen während der G0-G1-, G1-, S- und G2-Phasen zu erfassen (Kubbies 1989). Das Ausscheiden von Zellen aus dem Zellzyklus kann dabei über die Akkumulation in den entsprechenden Phasenanteilen des Zellzyklus erfasst werden. Die Induktion von Zellzyklusstörungen erfolgte mit dem bifunktionellen Alkylanz Mitomycin C. Die Applikation von Mitomycin C (MMC) führte dabei vor allem zu einer dosisabhängigen Zunahme der G2-Phasenanteile der Zellzyklen, was als Akkumulation von Zellen innerhalb dieses Kompartiments zu verstehen ist. Diese Akkumulation konnte bei den durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen mit der abgeleiteten Größe Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) proliferationsunabhängig erfasst werden. Die konzentrationsabhängige Zunahme der G2-Phasenakkumulation und die unterschiedliche Verteilung innerhalb der Zellzyklen wurden mit den beiden Parametern Increased S G2+G2`/GF und Increased S G2/GF festgehalten und ausgewertet. Die Untersuchungen mit peripheren Blutlymphozyten, lymphoblastoiden Zellen (B-LCL) und Fibroblasten von gesunden Kontrollpersonen zeigten, dass sich die durch Mitomycin C induzierten DNA-Schädigungen bei durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen vor allem als G2-Phasenakkumulation darstellen. Demgegenüber lagen die ermittelten Werte der S G2/GF von Fa-Individuen bereits bei Standardzellkulturen über denen der gesunden Versuchspersonen. Vor allem bei den Zellzyklusstudien mit peripheren Blutlymphozyten von Fanconi-Anämie Patienten zeigten sich bereits endogen eine massive Erhöhung der G2-Phasenanteile. Im Vergleich zu den untersuchten Kontrollen war die Mitomycin C induzierte Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen nicht beliebig steigerbar. Die untersuchten Zellsysteme zeigten verschiedene Proliferationsmuster und reagierten mit einer unterschiedlich starken Arretierung von Zellen in den G2-Phasen bei Zugabe von Mitomycin C. Als sensitivste Zellart reagierten subkutane menschliche Fibroblasten bei Applikation von Mitomycin C. Bei den durchgeführten Zellzyklusanalysen zeigte sich aber auch, dass bei hohen Konzentration von Mitomycin C (MMC) die zytoxischen Effekte von Mitomycin C überwiegen und es zu einem starken Rückgang des Zellwachstums kommt. Da die exogen induzierten Zellzyklusstörungen durch Mitomycin C bei gesunden Kontrollpersonen mit den typischen endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fa-Individuen vergleichbar waren, kann als mögliche Ursache für Fanconi-Anämie auf einen DNA-Reparaturdefekt geschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch Zellen von obligat heterozygoten Fa-Individuen mit dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren untersucht. War bei Fa-homozygoten Patienten bereits endogen die Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen deutlich gegenüber den gesunden Kontrollpersonen erhöht, so konnte dies für Fa-heterozygote Individuen nicht gezeigt werden. Die ermittelten Werte der Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) lagen zwar dabei vor allem bei den untersuchten peripheren Blutlymphozyten und subkutanen Fibroblasten etwas über den Kontrollen. Mit den hier vorgelegten Daten aus den Zellzyklusanalysen war aber keine Unterscheidung zwischen den obligat heterozygoten Fa-Individuen und den gesunden Probanden möglich. Die Ergebnisse stehen dennoch im Einklang mit den zytogenetischen Untersuchungen auf erhöhte Chromosomenbruchraten bei Verdacht auf Fanconi-Anämie. N2 - CELL CYCLE EFFECT`S OF MITOMYCIN C With this work the exogen induced effects of mitomycin C were compared in different cell systems (human blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and dermal fibroblasts) with the endogen existing cell cycle defects in Fanconi Anaemia. The cell cycle analysis were done via the BrdU/Hoechst flow cytometry. With this technique it is possible to detect and quantitate proliferating and non-proliferating fractions in the cell cycle (Ellwart, Stunkel et al. 1981). The method also allows to get information about the population of cells within the G0-G1-, G1-, S- and G2- phase (Kubbies 1989). The separation of cells during the cell cycle can be measured as an accumulation in the correspondent fraction. The induction of cell cycle arrest were done with the alkylating agent mitomycin C. After the application of mitomycin C cell cycle analysis showed an increase of the G2- phase, depending on the concentration of this agent. With the parameters sum of G2 / growth fraction (S G2/GF) and Increased S G2+G2`/GF and Increased S G2/GF the effects of mitomycin C were characterised. The cell cycle analysis with human blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and dermal fibroblasts from healthy persons showed, that the damage induced by mitomycin C is like an accumulation of cells in the G2- phase. Already the studies with cells from Fanconi Anaemia patients without treatment of mitomycin C showed elevated values for the sum of G2 / growth fraction (S G2/GF). Over all the arrest of cells in the G2- phase were mainly seen with cell cultures from human blood lymphocytes. In relation to healthy persons the mitomycin C induced accumulation of cells in the G2- phase couldn’t intensify as will by a higher concentration of the alkylating agent. The cell cycle analysis with blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and fibroblasts showed different cellular proliferation and arrest in the G2- phase under the treatment of mitomycin C. As the most sensitive react dermal fibroblasts under the treatment with mitomycin C. Also the result of the cell cycle analysis demonstrate that at high levels of mitomycin C the cytotoxic effects predominate and the cell proliferation decrease. In the respect that the exogen induced effects by mitomycin C can compared with the endogen cell cycle defects in Fanconi Anaemia it is possible that a deficient DNA repair caused Fanconi Anaemia. Furthermore with this work cells from FA- heterozygotes were analysed. The data of the cell cycle analysis showed that it is not possible to decide between a healthy persons and a FA- heterozygotes. But the results correspondent with the cytogenetic analysis of higher chromosomal breakage level in Fanconi Anaemia. KW - Zellzykluseffekte KW - Mitomycin C KW - Zellzyklus KW - G2 Phase KW - Fanconi Anämie KW - cellcycle effects KW - mitomycin c KW - cellcycle KW - g2 phase KW - Fanconi Anaemia Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12647 ER - TY - THES A1 - Stimmler, Patrick T1 - Zytogenetischer und durchflusszytometrischer Nachweis von Mosaizismus bei Fanconi Anämie T1 - xxx N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs FA-Patienten und eine Patientin, bei der eine Fanconi Anämie ausgeschlossen wurde, auf das Vorhandensein eines Mosaizismus untersucht. Dabei wurde bei allen Patienten eine zytogenetische Chromosomenbruchanalyse durchgeführt und die Ergebnisse mit den Daten der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse verglichen. Bei einer FA-Patientin konnte weder in der Chromosomenbruchanalyse noch in der Zellzyklusanalyse das Vorhandensein eines Mosaizismus nachgewiesen werden. Bei drei FA-Patienten gab es in der Auswertung der Metaphasen auf Chromosomenbrüchigkeit den Hinweis auf das Vorliegen einer Mosaik-Konstellation, wobei dies in einem Fall (Proband 5) besonders ausgeprägt war. Die Zellzyklusanalyse konnte das Vorhandensein eines Mosaizismus jedoch in allen drei Fällen nicht bestätigen. Bei einer FAPatientin zeigten sich die Chromosomen in der Chromosomenbruchanalyse nahezu unauffällig. Die erfolgreiche und komplette Selbstkorrektur spiegelte sich auch eindeutig in der Zellzyklusanalyse wider. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die zytogenetische Chromosomenbruchanalyse zum Nachweis eines Mosaizismus besser geeignet ist als die Zellzyklusanalyse, da sie eine höhere Sensitivität zu haben scheint. Um eine definitive Aussage sowohl über die Sensitivität, als auch die Spezifität beider Untersuchungen machen zu können, ist es nötig FAPatienten im Verlauf mehrmals zu untersuchen. Dabei müsste sowohl eine Chromosomenbruchanalyse als auch eine Durchflusszytometrie durchgeführt werden und die Ergebnisse dann mit dem klinischen Befinden bzw. den Blutwerten (Hämatokrit/Hämoglobinwert, Leukozyten-und Thrombozytenzahl) verglichen werden. Da das Vorhandensein eines Mosaizismus Konsequenzen für die Diagnose und eventuell Therapiefestlegung hat, erscheinen weitere Untersuchungen diesbezüglich sinnvoll. KW - Fanconi Anämie KW - Mosaizismus KW - Durchflusszytometrie KW - Chromosomenbruchanalyse KW - Zellzyklusanalyse KW - fanconi anemia KW - mosaicism KW - flow KW - cytometrie KW - chromosome KW - breakage KW - cell cycle studies Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8927 ER - TY - THES A1 - Groß, Michaela T1 - Genomic changes in Fanconi anemia: implications for diagnosis, pathogenesis and prognosis T1 - Genomische Veränderungen bei Fanconi-Anämie N2 - Fanconi anemia (FA) is a genetically and phenotypically heterogenous autoso- mal recessive disease associated with chromosomal instability, progressive bone marrow failure, typical birth defects and predisposition to neoplasia. The clinical phenotype is similar in all known complementation groups (FA-A, FA-B, FA-C,FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G). The cellular phenotype is characterized by hypersensitivity to DNA crosslinking agents (MMC,DEB), which is exploited as a diagnostic tool. Alltogether, the FA proteins constitute a multiprotein pathway whose precise biochemical function(s) remain unknown. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF and FANCG interact in a nuclear complex upstream of FANCD2. Complementation group FA-D1 was recently shown to be due to biallelic mutations in the human breast cancer gene 2 (BRCA2). After DNA damage, the nuclear complex regulates monoubiquitylation of FANCD2, result- ing in targeting of this protein into nuclear foci together with BRCA1 and other DNA damage response proteins. The close connection resp. identity of the FA genes and known players of the DSB repair pathways (BRCA1, BRCA2, Rad51) firmly establishs an important role of the FA gene family in the maintenance of genome integrity. The chapter 1 provides a general introduction to the thesis describing the current knowledge and unsolved problems of Fanconi anemia. The following chapters represent papers submitted or published in scientific literature. They are succeeded by a short general discussion (chapter 7). Mutation analysis in the Fanconi anemia genes revealed gene specific mutation spectra as well as different distributions throughout the genes. These results are described in chapter 1 and chapter 2 with main attention to the first genes identified, namely FANCC, FANCA and FANCG. In chapter 2 we provide general background on mutation analysis and we report all mutations published for FANCA, FANCC and FANCG as well as our own unpublished mutations until the year 2000. In chapter 3 we report a shift of the mutation spectrum previously reported for FANCC after examining ten FA-patients belonging to complementation group C. Seven of those patients carried at least one previously unknown mutation, whereas the other three patients carried five alleles with the Dutch founder mu- tation 65delG and one allele with the Ashkenazi founder mutation IVS4+4A>T, albeit without any known Ashkenazi ancestry. We also describe the first large deletion in FANCC. The newly detected alterations include two missense mu- tations (L423P and T529P) in the 3´-area of the FANCC gene. Since the only previously described missense mutation L554P is also located in this area, a case can be made for the existence of functional domain(s) in that region of the gene. In chapter 4 we report the spectrum of mutations found in the FANCG gene com- piled by several laboratories working on FA. As with other FA genes, most muta- tions have been found only once, however, the truncating mutation, E105X, was identified as a German founder mutation after haplotype analysis. Direct compar- ison of the murine and the human protein sequences revealed two leucine zipper motifs. In one of these the only identified missense mutation was located at a conserved residue, suggesting the leucine zipper providing an essential protein-protein interaction required for FANCG function. With regard to genotype-phenotype correlations, two patients carrying a homozygous E105X mutation were seen to have an early onset of the hematological disorder, whereas the missense mutation seems to lead to a disease with later onset and milder clinical course. In chapter 5 we explore the phenomenon of revertant mosaicism which emerges quite frequently in peripheral blood cells of patients suffering from FA. We de- scribe the types of reversion found in five mosaic FA-patients belonging to com- plementation groups FA-A and FA-C. For our single FA-C-patient intragenic crossover could be proven as the mechanism of self-correction. In the remaining four patients (all of them being compound heterozygous in FANCA), either the paternal or maternal allele has reverted back to WT sequence. We also describe a first example of in vitro phenotypic reversion via the emergence of a compensat- ing missense mutation 15 amino acids downstream of the constitutional mutation explaining the MMC-resistance of the lymphoblastoid cell line of this patient. In chapter 6 we report two FA-A mosaic patients where it could be shown that the spontaneous reversion had taken place in a single hematopoietic stem cell. This has been done by separating blood cells from both patients and searching for the reverted mutation in their granulocytes, monocytes, T- and B-lymphocytes as well as in skin fibroblasts. In both patients, all hematopoietic lineages, but not the fibroblasts, carried the reversion, and comparison to their increase in erythrocyte and platelet counts over time demonstrated that reversion must have taken place in a single hematopoietic stem cell. This corrected stem cell then has been able to undergo self-renewal and also to create a corrected progeny, which over time repopulated all hematopoietic lineages. The pancytopenia of these patients has been cured due to the strong selective growth advantage of the corrected cells in vivo and the increased apoptosis of the mutant hematopoietic cells. N2 - Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch hetero- gene, autosomal rezessive Erkrankung dar. Charakteristische Merkmale dieser Erkrankung sind die chromosomale Instabilität, ein fortschreitendes Knochen- marksversagen, multiple kongenitale Abnormalitäten und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Dieser klinische Phänotyp ist bei allen bisher bekannten Komplementationsgruppen (FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G) ähnlich, ebenso wie der zelluläre Phänotyp, der durch Hy- persensitivität zu DNA-quervernetzenden Substanzen, wie MMC und DEB, gekennzeichnet ist. Diese Hypersensitivität wird dementsprechend in der FA-Diagnostik verwandt. Alle FA-Proteine arbeiten in einem "Multiprotein- Pathway" zusammen, dessen exakte biochemische Funktion noch nicht geklärt ist. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF und FANCG interagieren in einem nukleären Komplex, der nach DNA-Schädigung die Monoubiquitylierung von FANCD2 reguliert, woraufhin man FANCD2 zusammen mit BRCA1 und anderen DNA-Reparaturproteinen in nukleären Foci detektieren kann. Die Komplemen- tationsgruppe FA-D1 wurde kürzlich biallelischen Mutationen im menschlichen Brustkrebsgen BRCA2 zugeordnet. Die enge Verbindung zwischen den FA- Genen und den Doppelstrangbruch(DSB)-Reparaturgenen (BRCA1, BRCA2, Rad51) deutet auf eine wichtige Rolle der FA-Genfamilie in der Erhaltung der genomischen Stabilität hin. Kapitel 1 gibt eine allgemeine Einleitung dieser Promotionsarbeit. Es liefert Hintergrundinformationen zu Fanconi Anämie basierend auf Publikationen bis einschließlich Mai 2002. In den darauffolgenden Kapiteln 2-6 sind eigene Veröf- fentlichungen zur Fanconi Anämie wiedergegeben, die entweder schon publiziert oder zur Veröffentlichung eingereicht worden sind. Zusätzlich zu den Diskussionsabschnitten in den einzelnen Veröffentlichungen werden diese fünf Arbeiten in Kapitel 7 kurz gemeinsam diskutiert. Die Mutationsanalyse in den diversen FA-Genen lieferte genspezifische Mutations- spektren sowie genspezifische Mutations-Verteilungen. Diese werden in Kapitel 1 und 2 beschrieben, wobei Kapitel 2 nur auf die zuerst entdeckten FA-Gene, FANCC, FANCA und FANCG, eingeht. In Kapitel 2 werden allgemeine Hinter- grundinformationen zur Mutationsanalyse geliefert und alle bis zum Jahr 2000 für FANCA, FANCC und FANCG publizierten Mutationen sowie unsere eigenen bis dato unveröffentlichten Veränderungen dargestellt. In Kapitel 3 berichten wir über eine bemerkenswerte Verschiebung des bisher beschriebenen FANCC-Mutationsspektrums. Von den zehn von uns untersuchten FA-C-Patienten trugen acht zumindest eine neue Mutation, wohingegen die drei restlichen Patienten fünf 65delG-Allele und ein IVS4+4A>T-Allel besaßen. Inter- essanterweise fanden wir auch erstmals große Deletionen im FANCC-Gen, deren Existenz bisher nur für FANCA beschrieben war. Weiterhin werden zwei bisher nicht bekannte Missense Mutationen (L423P und T529P) im 3´-Bereich des Gens beschrieben. In dieser Region findet sich auch der bisher einzige pathogene Aminosäureaustausch, L554P, was auf die Existenz einer funktionellen Domäne in dieser Genregion hindeutet. Außerdem scheinen unsere neu detektierten Muta- tionen vielmehr verstreut im Gen vorzuliegen als dies bisher angenommen worden war. Denn die bisher beschriebenen Veränderungen betreffen vor allem den Exon-bereich 5-6 sowie das amino- und carboxyterminale Ende von FANCC. Kapitel 4 beschreibt das Mutationsspektrum für FANCG, zusammengetragen von verschiedenen FA-Arbeitsgruppen. Wie in den anderen FA-Genen traten die meisten Mutationen auch hier nur einmal auf. Allerdings konnte die trunkierende Mutation, E105X, nach einer Haplotyp-Analyse als deutsche Gründermutation beschrieben werden. Ein direkter Vergleich der Proteinsequenzen von Men- sch und Maus ergab Hinweise auf konservierte Genabschnitte sowie auf zwei Leuzin-Zipper-Motive. Die einzige beschriebene Missense Mutation befindet sich in einem konservierten Bereich eines dieser beiden Leuzin-Zipper, was auf eine wichtige Rolle dieses Motivs für FANCG in Bezug auf Protein-Protein- Interaktionen schließen läßt. Obwohl die Anzahl der Patienten mit vergleichbaren Mutationen zu gering für statistisch signifikante Aussagen war, so fiel doch auf, dass bei den beiden Patienten mit einer homozygoten E105X-Mutation wesentlich früher hämatologische Probleme auftraten als bei dem Patienten mit der heterozygoten Missense Mutation, für den ein milder klinischer Verlauf sowie ein späteres Einsetzen hämatologischer Probleme berichtet wurde. Kapitel 5 und 6 behandeln das Phänomen des reversen Mosaizismus, der sehr häu- fig im Blut von FA-Patienten zu diagnostizieren ist. In Kapitel 5 beschreiben wir die Reversionsmechanismen von fünf Patienten, von denen einer der Komplemen- tationsgruppe C und die anderen vier der Komplementationsgruppe A angehören. Der Mechanismus, welcher der Selbstkorrektur des FA-C-Patienten zugrunde lag, konnte als intragene Rekombination definiert werden. Bei den verbleibenden vier compound heterozygoten FA-A-Patienten war jeweils eine Rückmutation zum Wildtyp auf dem mütterlichen bzw. väterlichen Allel ursächlich für die phäno- typische Gesundung der Blutzellen. Desweiteren beschreiben wir eine in vitro-Reversion in der lymphoblastoiden Linie eines unserer Patienten erstmals den Mechanismus einer sekundären Missense Mutation 15 Aminosäuren nach der kon- stitutionellen Mutation. Diese "kompensatorische" Mutation ist für die MMC- Resistenz der Zellinie verantwortlich. 4 von 5 der untersuchten Mosaik-Patienten zeigten eine eindeutige Verbesserung ihrer Blutwerte. Die Diagnose "Mosaizis-mus" verbessert offenbar die Prognose des Krankheitsbildes vor allem dann, wenn die Reversion eines Allels in einem frühen Stadium der Hämatopoiese auftritt. In Kapitel 6 berichten wir von zwei Mosaik-Patienten, bei denen untersucht wurde, wann in der Hämatopoiese die Reversion stattgefunden haben muss. Es konnte gezeigt werden, dass die Reversion in einer einzelnen hämatopoietischen Stammzelle erfolgte. Der Nachweis wurde durch die Isolierung einzelner Blutzell- typen, wie Granulozyten, Monozyten, T- und B-Zellen, aus dem peripheren Blut unserer Patienten sowie durch das Vorhandensein bzw. Nichtvorhanden- sein der Reversion in diesen Zellen geführt. Zum Vergleich wurden Hautfibrob- lasten herangezogen, da diese bei Mosaizismus im Blut nicht revertiert sind. In beiden Patienten trugen alle isolierten Blutzellen, nicht jedoch die Hautzellen, die Reversion. Dies und ein zusätzlicher Vergleich mit den zu diesem Zeit- punkt angestiegenen Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen zeigten, dass die Reversion in einer einzigen hämatopoietischen Stammzelle stattgefunden haben muss. Dieser revertierten Stammzelle sind alle jeweils phänotypisch korrigierten Blutzellen zuzuschreiben, die dann die gesamte Hämatopoiese übernahmen und aufgrund eines in vivo Wachstumsvorteils sowie der erhöhten Apoptoserate der mutierten Zellen die Panzytopenie beider Patienten im Sinne einer "natürlichen" oder "spontanen" Gentherapie zur Ausheilung brachten. KW - Fanconi-Anämie KW - Genmutation KW - Fanconi Anämie KW - Mutationen KW - Mosaizismus KW - Reversion KW - Fanconi anemia KW - mutations KW - mosaicism KW - reversion Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6579 ER - TY - THES A1 - Orlitsch, Carolin T1 - Zellzyklusdiagnostik bei Fanconi Anämie T1 - Cellcyclediagnostic in Fanconi Anaemia N2 - In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Fanconi Anämie Diagnostik am Humangenetischen Institut der Universität Würzburg des Jehres 1999 analysiert und validiert. N2 - Cellcyclediagnostic in Fanconi Anaemia KW - Fanconi Anämie KW - Zellzyklusdiagnostik KW - Fanconi Anaemia KW - Cellcycle blockage Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6456 ER -