TY - THES A1 - Peña Mosca, María Josefina T1 - Local regulation of T-cell immunity in the intestinal mucosa T1 - Lokale Regulation der T-Zell-Immunität in der Darmschleimhaut N2 - After priming in Peyer's patches (PPs) and mesenteric lymph nodes (mLN) T- cells infiltrate the intestine through lymphatic draining and homing through the bloodstream. However, we found that in mouse models of acute graft-versus-host disease (GvHD), a subset of alloreactive T-cells directly migrates from PPs to the adjacent intestinal lamina propria (LP), bypassing the normal lymphatic drainage and vascular trafficking routes. Notably, this direct migration occurred in irradiated and unirradiated GvHD models, indicating that irradiation is not a prerequisite for this observed behavior. Next, we established a method termed serial intravascular staining (SIVS) in mouse models to systematically investigate the trafficking and migration of donor T- cells in the early stages of acute GvHD initiation. We found that the direct migration of T-cells from PPs to LP resulted in faster recruitment of cells after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). These directly migrating T-cells were found to be in an activated and proliferative state, exhibiting a TH1/TH17-like phenotype and producing cytokines such as IFN-γ and TNF-α. Furthermore, we observed that the directly migrating alloreactive T-cells expressed specific integrins (α4+, αE+) and chemokine receptors (CxCR3+, CCR5+, and CCR9+). Surprisingly, blocking these integrins and chemokine-coupled receptors did not hinder the direct migration of T- cells from PPs to LP, suggesting the involvement of alternative mechanisms. Previous experiments ruled out the involvement of S1PR1 and topographical features of macrophages, leading us to hypothesize that mediators of cytoskeleton reorganization, such as Coro1a, Dock2, or Cdc42, may play a role in this unique migration process. Additionally, we observed that directly migrating T-cells created a local inflammatory microenvironment, which attracts circulating T-cells. Histological analysis confirmed that alloreactive PPs-derived T-cells and bloodborne T-cells colocalized. We employed two experimental approaches, including either photoconversion of T-cells in PPs or direct transfer of activated T-cells into the vasculature, to demonstrate this colocalization. We hypothesize that cytokines released by migrating T-cells, such as IFN-γ and TNF-α, may play a role in recruiting T-cells from the vasculature, as inhibiting chemokine-coupled receptors did not impair recruitment. N2 - Nach der Priming-Phase in den Peyer-Plaques (PPs) und mesenterialen Lymphknoten (mLN) migrieren T-Zellen über die lymphatische Drainage und den Blutkreislauf die Darmschleimhaut. Allerdings haben wir festgestellt, dass in Mausmodellen der akuten Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD) eine Untergruppe alloreaktiver T-Zellen direkt von den Peyer-Plaques in das benachbarte intestinale Lamina propria (LP) migriert, ohne lymphatische Drainage- oder vaskuläre Transportwege zu nutzen. Bemerkenswert ist, dass diese direkte Migration sowohl in bestrahlten als auch in nicht bestrahlten GvHD-Modellen auftrat, was darauf hindeutet, dass Gewebeschaden durch ionisierende Strahlung keine Voraussetzung für dieses beobachtete T-Zell-Migrationsverhalten ist. Anschließend haben wir die Methode der "serielle intravaskulären Zellmarkierung" (SIVS) für Mausmodelle etabliert, um systematisch das Migrationsverhalten von alloreaktiven Spender-T-Zellen in den frühen Stadien der akuten GvHD-Initiierung zu untersuchen. Wir beobachteten, dass die direkte Migration von T-Zellen von PPs zu LP zu einer schnelleren Rekrutierung von Zellen nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation (allo-HCT) führte. Diese direkt migrierenden T-Zellen befanden sich in einem aktivierten und proliferativen Zustand, wiesen einen TH1-/TH17- ähnlichen Phänotyp auf und produzierten Zytokine wie IFN- γ und TNF-α. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die direkt migrierenden alloreaktiven T-Zellen spezifische Integrine (α4+, αE+) und Chemokinrezeptoren (CxCR3+, CCR5+ und CCR9+) exprimierten. Überraschenderweise verhinderte die Blockierung dieser Integrine und Chemokinrezeptoren nicht die direkte Migration von T-Zellen aus PPs in LP, was auf die Beteiligung alternativer T- Zellmigrationsmechanismen schließen lässt. Vorangegangene Experimente schlossen die Beteiligung von S1PR1 und topografischer Merkmale gewebeständiger Makrophagen aus, was uns zu der Hypothese führte, dass Mediatoren der Zytoskelett- Reorganisation wie Coro1a, Dock2 oder Cdc42 eine Rolle in diesem einzigartigen Migrationsprozess spielen könnten. Zusätzlich beobachteten wir, dass direkt migrierende T-Zellen in der Darmschleimhaut ein lokales entzündliches Mikromilieu schaffen, welches zirkulierende T-Zellen anzieht. Die histologische Analyse bestätigte die Kolokalisation von direkt aus PP stammenden T-Zellen und T Zellen, welche über die Blutbahn in die Darmmukosa einwanderten. Um die direkte T-Zellmigration eindeutig zu bestätigen, wählten wir zwei experimentelle Ansätze: Die Photokonversion von T-Zellen in PPs während der Priming-Phase sowie den direkten Transfer aktivierter T-Zellen in das Gefäßsystem, um eine T-Zellkolokalisierung nachzuweisen. Aufbauend auf den Ergebnissen vermuten wir, dass Zytokine, die von migrierenden T-Zellen freigesetzt werden, wie zum Beispiel IFN-γ und TNF-α, möglicherweise eine Rolle bei der Rekrutierung von T-Zellen aus dem Gefäßsystem spielen, da die Hemmung von G- Protein-gekoppelter Rezeptoren (und somit aller Chemokinrezeptoren) die T-Zell- Rekrutierung nicht beeinträchtigte. KW - T-Lymphozyt KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Zellmigration KW - Darm KW - Peyer's patch KW - Graft versus Host disease KW - T-cell KW - Cell migration KW - Small intestine KW - Bone marrow transplantation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352665 ER - TY - THES A1 - Peter, Lisa Susanne T1 - Chronische Graft-versus-Host-Erkrankung im pädiatrischen Setting - Identifikation von Charakteristika mit Fokus auf die Immunrekonstitution dendritischer Zellen T1 - Chronic Graft-versus-Host-Disease in pediatric patients Identification of characteristics with focus on the immune reconstitution of dendritic cells N2 - Die cGvHD ist eine relevante Komplikation der aHSCT. Sie hat Einfluss auf die Morbidität und Mortalität nach der aHSCT. Die genaue Pathogenese ist unbekannt. Ein Einfluss dendritscher Zellen als Schlüsselzellen immunologischer Prozesse auf die Entstehung einer cGvHD ist wahrscheinlich. In dieser Studie erfassten wir patient:innen und aHSCT-bezogene Daten 61 stammzelltransplantierter Kinder und Jugendlicher sowie deren möglichen Einfluss auf das Auftreten einer cGvHD. Zudem wurde die Rekonstitution der Immunzellen, insbesondere der DCs, nach der aHSCT evaluiert. Die Rekonstitution der Lymphozyten sowie die Zytokinexpression der T-Zellen während der Rekonstitution verhielt sich ähnlich zu vorherigen Studien. Signifikante Unterschiede zwischen Patient:innen mit oder ohne cGvHD zeigten sich nicht konsistent. Die Rekonstitution der DCs erfolgte innerhalb von 60-100 Tagen. Stabile Werte zeigten sich jedoch frühestens ein Jahr nach der aHSCT. Während des Engraftments war der Anteil CCR7+ DCs bei Patient:innen erhöht, die eine TBI erhalten hatten. Ein hoher Anteil CCR7+ DCs wirkte sich zu jedem Zeitpunkt positiv auf das Gesamtüberleben aus. Trat eine höhergradige aGvHD auf, konnte eine verminderte absolute und relative Zellzahl 60-365 Tage nach der aHSCT für DCs insgesamt und mDCs erfasst werden, für pDCs 60-100 Tage nach aHCST. Zwischen der Rekonstitution der DCs und dem Auftreten einer cGvHD konnten wir vier Korrelationen beobachten. Der absolute und relative Zahlenwert an mDCs war während des Engraftments bis Tag 60-100 vermindert. Der absolute und relative Zahlenwert an DCs insgesamt war ab Tag 101-365 vermindert. Ein erhöhter Anteil an pDCs konnte ab Tag 101-365 sowie zu Beginn einer cGvHD bestimmt werden. Der Anteil monozytärer DCs war ab Tag 60-100 erhöht. Die Pathogenese der cGvHD bleibt weiter teilweise unklar. Unsere Daten suggerieren einen Einfluss der DCs auf die Entstehung einer cGvHD. N2 - The cGvHD is a severe complication of the aHSCT (allogenic hematopoietic stem cell transplantation) with high morbidity and mortality. The pathogenesis remains unclear. DCs seem to play an important roll in the pathogenesis of the cGvHD. We examined clinical characteristics as well as the immune reconstitution after aHSCT of 61 patients. The T-, B- and NK-cell reconstitution after aHSCT was similar to former studies. Regarding the DC reconstitution we found a fast reconstitution within 60-100 days after aHSCT. Higher CCR7 positive cell counts were found in patients receiving TBI (total body irradiation) during engraftment and during the whole posttransplant period we found a correlation with an improved overall survival. In patients with a grade 2-4 aGvHD we found decreased total and relative DC and mDC counts at day 60-365 after aHSCT and decreased total and relative pDC counts at day 60-100 after aHSCT. In cGvHD patients we found four main differences in contrast to patients without cGvHD. Decreased total and relative mDC counts were found during engraftment to day 60-100. Decreased total and relative DC counts were found from day 100-365. Increased relative pDCs counts were found at day 101-365 and at the start of a cGvHD. Increased relative monocytic DC counts were found from day 60-100. The pathogenesis of the cGvHD remains unclear. Our data suggest an influence of DCs on the pathogenesis of the cGvHD. KW - Dendritische Zelle KW - Kinderheilkunde KW - Graft-versus-host-disease KW - Pädiatrie KW - Transplantat-Wirt-Reaktion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349546 ER - TY - THES A1 - Shaikh, Muhammad Haroon T1 - Nicht-hämatopoetische lymphoide Stromazellen aktivieren alloreaktive CD4\(^+\) T-Zellen in der Initiierung der akuten Graft-versus-Host Disease T1 - Non-hematopoietic lymphoid stromal cells prime alloreactive CD4\(^+\) T cells during acute graft-versus-host disease N2 - In der Initiationsphase der akuten Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD) werden CD4+ T-Zellen in den lymphatischen Organen durch hämatopoietische Antigen-präsentierende Zellen aktiviert. Im Gegensatz dazu, werden in der Effektorphase CD4+ T-Zellen von nicht-hämatopoetischen Zellen im Dünndarm aktiviert. Wir stellten die Hypothese auf, dass alloreaktive CD4+ T-Zellen nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation, welche in der Initiationsphase der aGvHD vorwiegend in die sekundären lymphatischen Organe migrieren, dort durch nicht-hämatopoetische Lymphknoten-Stromazellen über die Erkennung von MHC-Klasse II aktiviert werden. Um diese Hypothese zu testen, setzten wir ein von allogenen CD4+ T-Zellen-abhängiges MHC Major Mismatch aGvHD Mausmodell ein, um diese Zusammenhänge näher zu erforschen. Mittels Biolumineszenz-Bildgebung und dreidimensionale Lichtblattmikroskopie und Durchflusszytometrie-Analysen von früheren Zeitpunkten nach einer alloHCT bzw. im Anfangsstadium der aGvHD konnten wir zeigen, dass allogene T-Zellen exklusiv in die Milz, Lymphknoten und die Peyerschen Plaques migrieren und nicht in die intestinale Lamina propria. Indem wir transgene Mauslinien verwendeten, die keine oder eine nur partielle komplette hämatopoietische Antigenpräsentation aufwiesen, konnten wir eine sehr früh auf die alloHCT folgende allogene CD4+ T-Zellaktivierung in den lymphoiden Organen von MHCIIΔCD11c and MHCIIΔ Knochenmark-Chimären nachweisen. Aufgrund des, bei den MHCIIΔ Knochenmarks-Chimären auftretenden Versagens der negativen Thymusselektion und die daraus resultierende autoreaktive Immunreaktionen nach einer syngenen HCST stellte sich heraus, dass dies ein ungeeignetes Modell für die Untersuchung der Präsentation nicht-hämatopoetischer Antigene bei GvHD ist. Um diese Herausforderung zu bewältigen, generierten wir MHCIIΔVav1 Mäuse bei denen die MHC-Klasse-II-Expression auf allen hämatopoetischen Zellen fehlt. MHCIIΔVav1 Mäuse entwickelten eine aGvHD, wobei die Lymphknoten-Stromazellen dieser Tiere allogene CD4+ T-Zellen in gemischten Lymphozytenreaktionen aktivieren konnten. Ebenso konnten mesenteriale Lymphknoten von CD11c.DTR-Mäusen, die zuvor in eine MHCIIΔ Maus transplantiert wurden, CD4+ T-Zellen in vivo aktivieren, wodurch die Lymphknoten-Stromazellen eindeutig als nicht-hämatopoetische Antigen-präsentierende Zellen der lymphoiden Organe nachgewiesen werden konnten. Über das Cre/loxP-System konnten wir Knockout-Mäuse mit fehlender MHCII-Expression in Subpopulationen von Lymphknoten-Stromazellen generieren und verwendeten dann Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Hier wählten wir Ccl19 und VE-Cadherin aus, um unsere Analyse spezifisch auf die fibroblastischen retikulären Zellen bzw. Endothelzellen der Lymphknoten zu konzentrieren. Bei MHCIIΔCcl19 Mäusen war die Aktivierung alloreaktiver CD4+ T-Zellen in der Initiationsphase der aGvHD mäßig reduziert, während das Fehlen von MHCII auf den fibroblastischen retikulären Zellen zu einer Hyperaktivierung allogener CD4+ T-Zellen führte, was wiederum eine schlechtere Überlebensrate der Mäuse zur Folge hatte. Dieser Phänotyp wurde durch regulatorische T-Zellen moduliert, die in der Lage waren, H2-Ab1fl Mäuse von den Folgen von GvHD zu retten, jedoch nicht die MHCIIΔCcl19. Ein Knock-out von MHCII auf Endothelzellen von MHCIIΔVE-Cadherin Mäusen, führte in der Initiationsphase der GvHD nur zu einer mäßig reduzierten Aktivierung von CD4+ T-Zellen. Umgekehrt zeigten MHCIIΔVE-Cadherin Mäuse im Langzeitüberleben jedoch einen protektiven Phänotyp verglichen mit wurfgeschwister H2-Ab1fl Mäusen. Um die Bedeutung der MHCII-Antigenpräsentation der Endothelzellen zu untersuchen, generierten wir außerdem MHCIIΔVE-CadherinΔVav1 Mäuse, bei welchen eine Antigenpräsentation, weder im endothelialen noch im hämatopoetischen Kompartiment möglich war. Lymphknoten-Stromazellen von MHCIIΔVE-CadherinΔVav1 Mäusen waren nicht in der Lage, alloreaktive CD4+ T-Zellen in einer gemischten Lymphozytenreaktion zu aktivieren. Insgesamt konnten wir zum ersten Mal beweisen, dass die MHC-Klassse II auf den Lymphknoten-Stromazellen eine entscheidende Rolle bei der Modulation allogener CD4+ T-Zellen in der Initiations- und schließlich in der Effektorphase der Graft-versus-Host-Disease spielt. N2 - In the initiation phase of acute graft-versus-host disease (aGvHD), CD4+ T cells are activated by hematopoietic antigen presenting cells in secondary lymphoid organs whereas in effector phase by non-hematopoietic cells in the small intestine. We hypothesized that alloreactive CD4+ T cells primarily home to the secondary lymphoid organs subsequent to allogeneic hematopoietic cell transplantation in the initiation phase of aGvHD and are activated by the non-hematopoietic lymph node stromal cells via MHC class II. To test this hypothesis, we employed CD4+ T cell-dependent major mismatch aGvHD mouse model to study this correlation. Upon analyzing the early events following allo-HCT with bioluminescence imaging, flow cytometry and whole-mount light sheet fluorescence microscopy, we found that allogeneic T cells exclusively home to the spleen, lymph nodes and the Peyer’s patches and not to the intestinal lamina propria in the initiation phase of aGvHD. Utilizing mice devoid of partial or complete hematopoietic antigen presentation we could show allogeneic CD4+ T cells activation in the lymphoid organs of MHCIIΔCD11c and MHCIIΔ BM chimeric mice early after allo-HCT. MHCIIΔ BM chimeras failure of thymic negative selection and developing tissue wasting disease upon syn-HCT deemed them unsuitable to study non-hematopoietic antigen presentation in aGvHD. To overcome this challenge, we generated MHCIIΔVav1 mice that lack MHC class II expression on all hematopoietic cells. MHCIIΔVav1 mice were susceptible to aGvHD and LNSCs from these animals activated allogeneic CD4+ T cells in mixed lymphocyte reaction. Likewise, mesenteric lymph nodes from CD11c.DTR mice surgically transplanted into a MHCIIΔ mouse could activate CD4+ T cells in vivo, clearly demonstrating LNSCs as non-hematopoietic APCs of the lymphoid organs. We specifically target lymph node stromal cell subsets via the Cre/loxP system, we employed single cell RNA sequencing and selected Ccl19 and VE-Cadherin to specifically target the fibroblastic reticular cells and endothelial cells of the lymph nodes respectively. In MHCIIΔCcl19 mice, alloreactive CD4+ T cells activation was discreetly reduced in the initiation phase of aGvHD whereas absence of MHCII on fibroblastic reticular cells resulted in hyper-activation of allogeneic CD4+ T cells leading to poor survival. This phenotype was modulated by the regulatory T cells that were able to rescue H2-Ab1fl mice but not the MHCIIΔCcl19 subsequent to GvHD. Knock-out of MHCII on endothelial cells MHCIIΔVE Cadherin, resulted only in modest reduction of CD4+ T cells activation in the initiation phase of GvHD, conversely MHCIIΔVE Cadherin mice showed a protective phenotype compared against littermates H2-Ab1fl mice in long-term survival. Furthermore, to pin-point endothelial cells MHCII antigen presentation we generated MHCIIΔVE Cadherin ΔVav1 animals devoid of antigen presentation in both endothelial and hematopoietic compartments. LNSCs from MHCIIΔVE Cadherin ΔVav1 were unable to activate alloreactive CD4+ T cells in mixed lymphocyte reaction. Altogether, we demonstrate for the first time that MHC class II on the lymph node stromal cells plays a crucial role in the modulation of allogeneic CD4+ T cells in the initiation and later in the effector phase of graft-versus-host-disease. KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Graft-versus-host disease KW - Hematopoietic cell transplantation KW - CD4+ T cell activation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-252015 ER - TY - THES A1 - Scheller, Lukas T1 - Migrationsfördernde Faktoren im intestinalen T-Zell-Homing während der akuten Graft-versus-Host Erkrankung T1 - Migration-promoting factors in the intestinal T-cell homing during acute graft-versus-host disease N2 - Die akute Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD), insbesondere die Darm GvHD, stellt weiterhin eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität nach allogener SZT dar. Aktivierte, alloreaktive Spender T-Zellen infiltrieren dabei über die Blutbahn die intestinale Lamina Propria. Erst kürzlich konnten wir zeigen, dass neben der vaskulären Migration ein Teil der Spender T-Zellen auch direkt aus den PP in die angrenzende Lamina Propria migrieren. Um Faktoren, die diese direkte Migration fördern, zu untersuchen und die direkt migrierenden T-Zellen genauer zu charakterisieren, verwendeten wir ein MHC-inkompatibles Mausmodell zur Induktion einer akuten GvHD. Durch RNA Sequenzierung und Massenspektrometrie lasermikrodissezierter Darmschleimhautproben konnte eine starke Expression der Chemokine CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 und CCL5 während der akuten intestinalen GvHD aufgezeigt werden. Neben CCL4 und XCL1 wiesen verschiedene Faktoren der T-Zellaktivierung, wie CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, sowie Faktoren der zytoskelettalen Reorganisation, wie Dock2, Coro1α und Parvin-γ, eine vermehrte Expression insbesondere nahe der PP auf. Die Expression der migrationsfördernden Faktoren Coro1α und Parvin-γ in Spender T-Zellen nahe der PP konnte anschließend mittels histologischen Immunfluoreszenzfärbungen bestätigt werden. Durchflusszytometrische Analysen konnten weiterhin eine vermehrte Expression von CCR5, CCR9 und Intgerin α4β7 auf den vornehmlich Tbet+ Spender T-Zellen nahe der PP nachweisen. Funktionelle in vitro Migrationsversuche zeigten abschließend, dass in vivo aktivierte Spender T-Zellen eine gerichtete Migration in Richtung auf CXCL11 und zu späterem Zeitpunkt auch auf CCL4 vollziehen können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Bedeutung zahlreicher Chemokine für das sequenzielle T-Zell-Homing während der akuten intestinalen GvHD. Neben der insbesondere durch Faktoren der zytosekeletalen Reorganisation vermittelten amoeboiden Migration kann auch eine mesenchymale Fortbewegung über Faktoren wie CCR5, CCR9 und Integrin α4β7 die direkte Migration der T-Zellen fördern. Den direkt migrierenden vornehmlich TH1 polarisierten Zellen folgen weitere, CD27 und Integrin αLβ2 exprimierende, zytotoxische T-Zellen aus der Blutbahn. Die direkt migrierenden Zellen könnten als Initiator und Potentiator der intestinalen T-Zell Infiltration wirken und müssen für zukünftige therapeutische Strategien nicht nur der Darm GvHD, sondern der intestinalen Inflammation im Allgemeinen mitberücksichtigt werden. N2 - Acute graft-verus-host disease (GvHD), especially intestinal GvHD, remains one of the main causes of mortality and morbidity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. In this process activated alloreactive donor T cells infiltrate the intestinal lamina propria via the bloodstream. Our group could recently show that besides the vascular migration route some donor T cells migrate directly from the Peyer’s patches into the adjacent lamina propria. To investigate factors that could promote such a direct migration, and to characterize these direct migrating T cells we applied a major mismatch mouse model to induce acute GvHD. Using RNA sequencing and mass spectrometry of lasermicrodissected lamina propria samples, we detected a strong upregulation of the chemokines CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 and CCL5 during acute intestinal GvHD. Alongside CCL4 and XCL1, several factors of T cell activation, such as CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, as well as factors of cytoskeletal reorganization, such as Dock2, Coro1α und Parvin-γ, showed higher expression near the Peyer’s patches. Subsequently, we validated the expression of Coro1α and Parvin-γ on donor T cells near the Peyer’s patches with histological immunofluorescence stainings. Flow cytometry analysis further revealed high expression of CCR5, CCR9 and Intgerin α4β7 on the predominantly Tbet+ donor T cells near the Peyer’s patches. Conclusively, in vitro migration assays showed that in vivo activated donor T cells can directly migrate towards CXCL11 and subsequently also towards CCL4. The present study shows the relevance of several chemokines for the sequential T-cell homing during acute intestinal GvHD. Besides the amoeboid migration mode, which is particularly driven by cytoskeletal reorganization, a mesenchymal movement using factors, such as CCR5, CCR9 and Integrin α4β7, can promote the direct migration of donor T cells. The directly migrating cells, which are predominantly of a TH1 phenotype, are followed by cytotoxic T cells, expressing CD27 and Integrin αLβ2 (LFA-1), from the systemic circulation. Thus, these directly migrating cells may act like an initiator and potentiator for the intestinal T cell infiltration and must be considered for new therapeutic strategies not only of GvHD but of intestinal inflammation in general KW - T-Lymphozyt KW - Graft-versus-host-disease KW - Zellmigration KW - Peyersche Plaques KW - T-Zellmigration KW - Transplantat-Wirt-Reaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292909 ER - TY - THES A1 - Haßler, Markus Sebastian T1 - NFATc3 in der akuten GvHD T1 - NFATc3 in acute GvHD N2 - Bei Leukämien, Lymphomen und dem Multiplen Myelom stellt die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HCT) oft die letzte kurative Therapieoption dar. Spender-T-Zellen (v.a. CD8+-T-Zellen), die im Transplantat enthalten sind, erkennen nach Chemo-/Strahlentherapie verbliebene Reste des entarteten Empfängergewebes, eradizieren dieses und verhindern somit ein Tumorrezidiv (Graft-versus-Leukämie Reaktion/GvL). Häufig attackieren Spender-T-Zellen (v.a. CD4+-Th1-Zellen) aber auch nicht-malignes Gewebe (z.B. Haut, Leber und Darm), was bis zum Tod des Patienten führen kann (Graft-versus-Host Disease/GvHD). Calcineurin-Inhibitoren wie Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus, die oft schon prophylaktisch verabreicht werden, verhindern über eine unselektive Inhibition aller Mitglieder der NFAT-Transkriptionsfaktorfamilie (Nuclear factor of activated T-cells) die Aktivierung der Spender-T-Zellen. Es folgt eine klinische Besserung der GvHD-Symptomatik, während jedoch der GvL-Effekt ebenfalls supprimiert wird. Bisherige Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe am Mausmodell hatten gezeigt, dass die selektive Inhibition eines NFAT-Familienmitgliedes (NFATc1 oder NFATc2) in den Donor-T-Zellen zu einer signifikanten Besserung der aGvHD bei jedoch erhaltener GvL führt. Es wurde nun der Einfluss des dritten, in Lymphozyten exprimierten NFAT-Mitglieds NFATc3 im Kontext der aGvHD untersucht. Zur Basisanalyse der neu kreierten Nfatc3fl/fl.Cd4cre- und Nfatc1fl/fl.Nfatc3fl/fl.Cd4cre-Mauslinien erfolgten durchflusszytometrische und Western-Blot-Analysen. Anschließend wurden In-vivo-Untersuchungen unter Verwendung eines etablierten major-mismatch-aGvHD-Modells (H-2b→H-2d) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass durch eine NFATc3- (+/- NFATc1-) Defizienz direkt ex vivo die CD4+/CD8+-Ratio durch Abnahme der CD4+- hin zu den CD8+-T-Zellen verschoben wird. Auch zeigte sich in den entsprechenden Genotypen eine Abnahme der naiven- und dafür vice versa eine Zunahme der Effektor-T-Zellen. In den wiederholt durchgeführten aGvHD-Versuchen zeigte sich in vivo als Korrelat der (ebenfalls erneut nachgewiesenen) Abnahme des CD4+/CD8+-Quotienten in den Zielorganen eine geringere Expansion der NFAT-defizienten als der wildtypischen T-Zellen. Leider spiegelte sich dies nicht in dem clinical score zur Quantifizierung der aGvHD-Symptomatik wider. Auch das Körpergewicht der Versuchsgruppe nahm rapide ab. Ursächlich hierfür ist – als Korrelat zur direkt ex vivo nachgewiesenen Aktivierungsneigung – ein vermehrter Th1-Shift der NFATc3 (+/-NFATc1-) defizienten T-Zellen. Eine Inhibierung von NFATc3 – im Gegensatz zu NFATc1 und NFATc2 – ist demzufolge kein sinnvoller Ansatzpunkt für eine mögliche, zielgerichtetere aGvHD-Therapie. Der positive Effekt der reduzierten Proliferationsneigung der NFATc3-defizienten Lymphozyten wird durch deren vermehrte Aktivierungsneigung mit erhöhter Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen zunichte gemacht. N2 - In malignant diseases such as multiple myeloma, leukemia and lymphoma the allogenic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) often represents the final curative treatment option. Donor T cells (esp. CD8+ T cells) within the graft recognize and eradicate tumor cells which have remained after chemo- and radiotherapy. This graft-versus-leukemia (GvL) effect can prevent tumor relapses. However, donor T cells (esp. CD4+ Th1 cells) often attack non-malignant tissue (e.g. skin, liver, colon) with potentially life-threatening consequences for the host. (Graft-versus-host disease = GvHD). To prevent the development of aGvHD, calcineurin-inhibitors (CNI) like cyclosporin A (CsA) and tacrolimus are often administered prophylactically. By means of an unselective suppression of the nuclear factor of activated T cells (NFAT) transcription factors, both drugs inhibit the activation of donor T cells. While leading to a clinical improvement of the GvHD-symptoms, coevally, the GvL effect is also suppressed. Previous research of our study group showed that a selective inhibition of one NFAT family member (NFATc1 oder NFATc2) in donor T cells leads to a significant decline of aGvHD symptoms while maintaining GvL. We have now analysed the iκluence of NFATc3, the third NFAT member expressed in lymphocytes, in context of aGvHD. Initially we analysed the new created Nfatc3fl/fl.Cd4cre- and Nfatc1fl/fl.Nfatc3fl/fl.Cd4cre-mouse strains by western blot and flow cytometry. Subsequently, these were followed by in vivo studies, using an already established major-mismatch-aGvHD-model (H-2b→H-2d). It could be shown that directly ex vivo a NFATc3- (+/- NFATc1-) deficiency leads to a reduction in the CD4+/CD8+ ratio. This is mainly caused by a diminution of CD4+ T cell population, while the CD8+ population remains unaffected. Furthermore, a lower number of naive but an increased number of effector T cells has been observed. This effect (which was also present in the aGvHD-experiments) correlated in vivo with a decreased expansion of NFAT-deficient T cells – compared to wild type T cells – in target organs. Unfortunately, the expected clinical improvement could not be demonstrated. The clinical score which objectifies the aGvHD-symptoms, as well as the body weight of the mice in the experimental group declined rapidly, comparable with or even worse than in the control group due to an increased Th1-shift of the NFATc3- (+/- NFATc1) deficient T cells. This also correlates with the increased effector function which has been observed in the previous ex vivo experiments. In conclusion an inhibition of NFATc3 – in contrast to NFATc1 or NFATc2 – is not a useful target point for a more specific aGvHD-therapy. The positive effect of a reduced proliferation in NFATc3-deficient lymphocytes is over-compensated by their augmented activation. KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Gvhd KW - Transplantatabstoßung KW - NFAT KW - NFATc3 KW - GvL KW - Stammzelltransplantation KW - allogenic stem cell transplantation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323681 ER - TY - THES A1 - Uri, Anna T1 - Differential requirement for CD28 co-stimulation on donor T cell subsets in mouse models of acute graft versus host disease and graft versus tumour effect T1 - Unterschiedlicher Einfluss der CD28 Kostimulation auf Donor-T Zell-Populationen in Mausmodellen der akuten Graft-versus-Host Disease und des Graft-versus-Tumor Effekts N2 - Hematopoietic stem cell transplantation is a curative therapy for malignant diseases of the haematopoietic system. The patients first undergo chemotherapy or irradiation therapy which depletes the majority of tumour cells before they receive the transplant, consisting of haematopoietic stem cells and mature T cells from a healthy donor. The donor T cells kill malignant cells that have not been eliminated by the conditioning therapy (graft versus leukaemia effect, GvL), and, therefore, are crucially required to prevent relapse of the tumour. However, the donor T cells may also severely damage the patient’s organs causing acute graft versus host disease (aGvHD). In mice, aGvHD can be prevented by interfering with the co-stimulatory CD28 signal on donor T cells. However, experimental models using conventional CD28 knockout mice as T cell donors or αCD28 antibodies have some disadvantages, i.e. impaired T cell development in the thymus of CD28 knockout mice and systemic CD28 blockade with αCD28 antibodies. Thus, it remains unclear how CD28 co-stimulation on different donor T cell subsets contributes to the GvL effect and aGvHD, respectively. We developed mouse models of aGvHD and the GvL effect that allowed to selectively delete CD28 on certain donor T cell populations or on all donor T cells. CD4+ conventional T cells (Tconv cells), regulatory T cells (Treg cells) or CD8+ T cells were isolated from either Tamoxifen-inducible CD28 knockout (iCD28KO) mice or their wild type (wt) littermates. Allogeneic recipient mice were then transplanted with T cell depleted bone marrow cells and different combinations of iCD28KO and wt T cell subsets. Tamoxifen treatment of the recipients caused irreversible CD28 deletion on the iCD28KO donor T cell population. In order to study the GvL response, BCL-1 tumour cells were injected into the mice shortly before transfer of the T cells. CD4+ Tconv mediated aGvHD was efficiently inhibited when wt Treg cells were co-transplanted. In contrast, after selective CD28 deletion on donor Treg cells, the mice developed a late and lethal flare of aGvHD, i.e. late-onset aGvHD. This was associated with a decline in iCD28KO Treg cell numbers around day 20 after transplantation. CD28 ablation on either donor CD4+ Tconv cells or CD8+ T cells reduced but did not abrogate aGvHD. Moreover, iCD28KO and wt CD8+ T cells were equally capable of killing allogeneic target cells in vivo and in vitro. Due to this sufficient anti-tumour activity of iCD28KO CD8+ T cells, they had a therapeutic effect in our GvL model and 25% of the mice survived until the end of the experiment (day 120) without any sign of the malignant disease. Similarly, CD28 deletion on all donor T cells induced long-term survival. This was not the case when all donor T cells were isolated from wt donor mice. In contrast to the beneficial outcome after CD28 deletion on all donor T cells or only CD8+ T cells, selective CD28 deletion on donor CD4+ Tconv cells completely abrogated the GvL effect due to insufficient CD4+ T cell help from iCD28KO CD4+ Tconv cells. This study demonstrates that therapeutic inhibition of the co-stimulatory CD28 signal in either all donor T cells or only in CD8+ T cells might protect patients from aGvHD without increasing the risk of relapse of the underlying disease. Moreover, deletion of CD28 on donor Treg cells constitutes a mouse model of late-onset aGvHD which can be a useful tool in aGvHD research. N2 - Die hämatopoetische Stammzelltransplantation ist eine heilende Therapie für maligne Erkrankungen des blutbildenden Systems. Die Patienten müssen sich zuerst einer Chemotherapie oder einer Strahlentherapie unterziehen, welche den Großteil der Tumorzellen beseitigt, bevor sie das Transplantat erhalten. Dieses besteht aus hämatopoetischen Stammzellen und reifen T-Zellen eines gesunden Spenders. Die transplantierten T-Zellen töten die malignen Zellen, die zuvor durch die Chemo- bzw. Strahlentherapie nicht zerstört wurden (Graft versus Leukämie Effekt, GvL), und sind daher essenziell, um ein Rezidiv der Tumorerkrankung zu verhindern. Die T-Zellen des Spenders können aber auch die Organe des Patienten schwer schädigen und dadurch die akute Graft versus Host Disease (aGvHD) verursachen. In Mäusen kann die aGvHD verhindert werden, indem man das kostimulatorische Signal des CD28 Moleküls moduliert. Mausmodelle, in denen konventionelle CD28 Knock-out Mäuse als T-Zell-Donoren verwendet werden oder αCD28 Antikörper eingesetzt werden, haben einige Nachteile, wie zum Beispiel eine gestörte T-Zell Entwicklung in CD28 Knock-out Mäusen oder die systemische Blockade des CD28 Moleküls mit Antikörpern. Dadurch blieb bislang unklar, inwiefern CD28-Kostimulation auf verschiedenen T-Zell-Populationen zum GvL Effekt und zur aGvHD beiträgt. Wir haben Mausmodelle der aGvHD und des GvL Effekts entwickelt, die ermöglichen, das CD28 Molekül entweder nur auf bestimmten Spender-T-Zell-Populationen oder auf allen Spender-T-Zellen zu deletieren. Hierfür wurden CD4+ konventionelle T-Zellen (Tconv Zellen), regulatorische T Zellen (Treg Zellen) und CD8+ T-Zellen von Tamoxifen-induzierbaren CD28 Knockout (iCD28KO) Mäusen bzw. deren wildtypischen (wt) Wurfgeschwistern isoliert. Den allogenen Empfängermäusen wurden dann T-Zell-depletierte Knochenmarkszellen und verschiedene Kombinationen aus iCD28KO und wt Spender-T-Zellen transplantiert. Die Behandlung der Empfängertiere mit Tamoxifen führte zu einer irreversiblen Deletion von CD28 auf den iCD28KO T-Zell-Populationen. Um den GvL Effekt zu untersuchen, wurden den Mäusen kurz vor dem T-Zell-Transfer BCL-1 Tumorzellen injiziert. Die von den CD4+ Tconv Zellen verursachte aGvHD konnte sehr gut kontrolliert werden, indem zusätzlich wt Treg Zellen transplantiert wurden. Im Gegensatz dazu entwickelten die Mäuse einen späten und tödlichen Schub der aGvHD, auch late-onset aGvHD genannt, wenn die CD28 Expression auf den Treg Zellen des Spenders deletiert wurde. Dies ging mit einem Rückgang der iCD28KO Treg-Zellzahlen ca. 20 Tage nach Transplantation einher. Die Deletion von CD28 auf CD4+ Tconv Zellen oder auf CD8+ T-Zellen reduzierte die aGvHD, konnte diese aber nicht vollständig verhindern. Des Weiteren waren iCD28KO und wildtypische CD8+ T-Zellen gleichermaßen in der Lage, allogene Zellen zu töten, in vivo wie auch in vitro. Aufgrund dieser hinreichenden Anti-Tumor-Antwort hatten iCD28KO CD8+ T-Zellen einen therapeutischen Effekt in unserem GvL Modell und 25 % der Tiere überlebte bis zum Versuchsende (Tag 120) ohne Anzeichen des Tumors. Ein Langzeitüberleben der Tiere wurde auch beobachtet, wenn das CD28 Molekül auf allen Spender-T-Zellen fehlte. Dies war nicht der Fall, wenn alle Spender-T-Zellen von wt Mäusen isoliert wurden. Im Gegensatz zur CD28 Deletion auf entweder allen Spender-T-Zellen oder nur auf den CD8+ T-Zellen, ging der GvL Effekt vollständig verloren, wenn CD28 nur auf den CD4+ Tconv Zellen entfernt wurde, da diese dann keine ausreichende T-Zellhilfe mehr leisten konnten. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine therapeutische Blockade des kostimulatorischen CD28 Signals entweder in allen Spender T-Zellen oder nur in CD8+ T-Zellen vor der aGvHD schützen könnte ohne gleichzeitig das Risiko eines Rezidivs zu erhöhen. Darüber hinaus steht mit der Deletion von CD28 auf Treg Zellen ein Mausmodell der late-onset aGvHD zur Verfügung, welches für die weitere Erforschung dieser Krankheit nützlich sein kann. KW - Antigen CD28 KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Maus KW - Graft versus host disease KW - GvHD Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165863 ER - TY - THES A1 - Lutz, Mathias T1 - T-Zell-Immunität gegen die tumorassoziierten Antigene HER2/neu, MUC1, PRAME und WT1 bei gesunden Blutspendern und Schwangeren als ein immuntherapeutisches Modell für die allogene Blutstammzelltransplantation T1 - T-cell immunity against the tumor-associated antigens HER2/neu, MUC1, PRAME and WT1 in healthy blood donors and pregnant women as an immunotherapeutic model for allogeneic blood stem cell transplantation N2 - Der Erfolg der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT) als Immuntherapie basiert neben den Minorantigendifferenzen zwischen Spender und Empfänger entscheidend auf einer spendervermittelten Immunität gegen tumorassoziierte Antigene (TAA), über deren Herkunft und Frequenz bei gesunden Blutspendern die derzeitige Studienlage kaum Informationen bietet. Da für viele klinisch relevante TAA eine Expression im fetalen und plazentaren Gewebe bekannt ist, wurde in dieser Arbeit die Schwangerschaft als möglicher Auslöser dieser T-lymphozytären Gedächtnisimmunantworten im Sinne eines Tumor- und Transplantationsmodells untersucht. Hierfür wurden insgesamt 114 gesunde Blutspender in drei Subgruppen aus 38 Frauen mit negativer Schwangerschaftsanamnese, 38 Frauen mit positiver Geburtenanamnese und 38 Männern in einer Querschnittsstudie betrachtet, daneben wurden 44 Frauen longitudinal während und nach ihrer ersten Schwangerschaft untersucht. Dabei wurden die CD8-positiven T-Lymphozyten der Probanden isoliert, mit Peptiden der vier klinisch relevanten TAA HER2/neu (human epidermal growth factor receptor 2), MUC1 (Mucin 1), PRAME (preferentially expressed antigen of melanoma) und WT1 (Wilms tumor protein 1) stimuliert und die Produktion von IFN-γ-mRNA mittels RT-qPCR gemessen. Daneben wurden zum Vergleich durchflusszytometrische und ELISPOT-basierte Verfahren durchgeführt. Bei den gesunden Blutspendern konnten CD8-positive Gedächtnisimmunantworten von niedriger und/oder hoher funktioneller Avidität gegen alle vier untersuchten TAA gemessen werden: Die Frequenz der dabei als „positiv“ definierten Immunantworten betrug bei HER2/neu 5 %, bei MUC1 14 %, bei PRAME 7 % und bei WT1 15 %. Männer wiesen insgesamt höhere absolute Level der Immunantworten gegen die untersuchten TAA auf, was auf eine testikuläre Expression dieser Antigene zurückzuführen sein könnte. In der Longitudinalanalyse bei den erstschwangeren Frauen ließen sich die stärksten Immunantworten zu Beginn der Schwangerschaft nachweisen, so dass es hier zu einem „Boost“ präexistenter TAA-spezifischer Autoimmunität zu kommen scheint. Durch das immunsuppressive hormonelle Milieu im Verlauf der Schwangerschaft und den Verlust der Zielantigene der feto-plazentaren Einheit durch die Geburt und Nachgeburt scheint diese Immunität aber nicht zu persistieren. Dadurch erklärt sich auch die Beobachtung, dass Frauen mit einer positiven Geburtenanamnese keine stärkeren Immunantworten gegen die untersuchten TAA aufwiesen als Frauen mit einer negativen Schwangerschaftsanamnese. Die Schwangerschaft hinterlässt diesbezüglich also ohne die Anwesenheit der vermittelnden Antigene keinen regelhaft bleibenden Effekt. Diese Resultate decken sich mit Beobachtungen aus der Tumorimmuntherapie, bei denen Vakzinierungen gegen TAA zwar eine kurzfristige Immunität generieren konnten, die aber nicht persistierte. Im Rahmen der HSZT kann eine solche TAA-spezifische Immunität vom Spender auf den Empfänger transferiert werden und vermag dann aufgrund des proinflammatorischen Immunmilieus sehr wohl zu expandieren und in einem begrenzten Ausmaß auch zu persistieren. Dementsprechend ergeben sich aus den in dieser Arbeit gewonnenen Resultaten relevante Implikationen für die allogene und in geringerem Ausmaß die autologe HSZT, daneben aber auch für innovative Tumortherapien wie die Immuncheckpoint-Blockade, da die Persistenz von tumorspezifischer Immunität letztendlich hochrelevant für eine langfristige Tumorkontrolle und damit für ein tumorfreies Überleben ist. Das vorliegende Modell trägt somit zum Verständnis der komplexen immunregulatorischen Vorgänge bei der Tumorkontrolle bei. Ob die hierbei aufgezeigten Immunantworten generell zu einer verbesserten TAA-spezifischen Immunrekonstitution und konsekutiv zu einem besseren klinischen Ergebnis beitragen, bleibt offen und wird in klinischen Studien geklärt werden müssen. N2 - Efficacy of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) as immunotherapy is mediated by donor-derived immunity against both minor histocompatibility antigens and tumor-associated antigens (TAAs). However, so far little is known about the origin and frequency of immunity against the latter in healthy blood donors. Since expression in fetal and placental tissues is known for many TAAs with clinical relevance, we investigated the pregnancy as a potential trigger for these memory-type T cell immune responses. In a cross-sectional analysis, we examined a total of 114 healthy blood donors including 38 nulligravidous women, 38 primi- or multiparous women and 38 men. In a longitudinal analysis, we investigated a total of 44 women at four time points during and after their first pregnancy. Donors’ positively isolated CD8-positive T cells were pulsed with peptides of four TAAs with known clinical relevance and placental expression: HER2/neu (human epidermal growth factor receptor 2), MUC1 (Mucin 1), PRAME (preferentially expressed antigen of melanoma) und WT1 (Wilms tumor protein 1). Quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction was applied to detect interferon-γ (IFN-γ) mRNA after this stimulation. Additionally, CD8-positive T cells were analyzed by flow cytometry and IFN-γ ELISPOT assays. In healthy blood donors, CD8-positive memory-type T cell immune responses of low and/or high avidity could be detected against all four analyzed TAAs. Frequency of positive immune responses varied from 5 % (HER2/neu) and 7 % (PRAME) to 14 % (MUC1) and 15 % (WT1). Higher absolute levels of immune responses were found in healthy men, likely due to testicular expression of the analyzed antigens. In healthy primigravidous women, strongest immune responses could be shown during pregnancy to disappear after delivery and completion of nursing. Therefore, it can be assumed that expression of TAAs in the fetoplacental unit is leading to a “boost” of pre-existing immunity against these antigens. However, these immune responses seem to be short-lived due to both permissive hormonal environment evolving during pregnancy and loss of the fetoplacental unit as driving target after delivery. Accordingly, no association between history of prior deliveries and stronger immune responses against the analyzed TAAs was observed in this work. The results of our study are in line with observations made in tumor immunotherapy where immunity against TAAs could be generated by vaccination strategies, but showed no long-lasting persistence. Nevertheless, the shown TAA-specific immunity could be transferred into recipients after allogeneic HSCT, where a proinflammatory environment provides capability for homeostatic expansion and persistence of these immune responses. Taken together, the findings of this work provide implications for both allogeneic and autologous HSCT. Furthermore, our results could also gain relevance for innovative immunotherapies such as immune checkpoint inhibitors since persistence of tumor-specific immunity is highly important for control of the malignant disease and consecutively for long-term survival. Whether TAA-specific immune responses as shown in our study could contribute to an improved immune reconstitution after allogeneic HSCT and consecutively to a better long-term outcome remains unclear and needs to be clarified in clinical trials. KW - Immuntherapie KW - Periphere Stammzellentransplantation KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Tumorantigen KW - Schwangerschaft KW - Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation KW - Graft-versus-Leukämie-Effekt KW - Tumorassoziierte Antigene KW - immunotherapy KW - allogeneic hematopoietic stem cell transplantation KW - graft-versus-leukemia effect KW - tumor-associated antigens KW - pregnancy Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156587 ER - TY - THES A1 - Brede, Christian T1 - Peripheral alloantigen expression directs the organ specific T cell infiltration after hematopoietic cell transplantation T1 - Die Expression von Alloantigenen im peripheren Gewebe beeinflusst die selektive Organinfiltration durch T Zellen nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation N2 - In acute graft-versus-host disease (GVHD) alloreactive donor T cells selectively damage skin, liver, and the gastrointestinal tract while other organs are rarely affected. The mechanism of this selective target tissue infiltration is not well understood. We investigated the importance of alloantigen expression for the selective organ manifestation by examining spatiotemporal changes of cellular and molecular events after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). To accomplish this we established a novel multicolor light sheet fluorescence microscopy (LSFM) approach for deciphering immune processes in large tissue specimens on a single-cell level in 3 dimensions. We combined and optimized protocols for antibody penetration, tissue clearing, and triple-color illumination to create a method for analyzing intact mouse and human tissues. This approach allowed us to successfully quantify changes in expression patterns of mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) and T cell responses in Peyer’s patches following allo-HCT. In addition, we proofed that LSFM is suitable to map individual T cell subsets after HCT and detected rare cellular events. We employed this versatile technique to study the role of alloantigen expression for the selective organ manifestation after allo-HCT. Therefore, we used a T cell receptor (TCR) transgenic mouse model of GVHD that targets a single peptide antigen and thereby mimics a major histocompatibility complex (MHC)-matched single antigen mismatched (miHAg-mismatched) HCT. We transplanted TCR transgenic (OT-I) T cells into myeloablatively conditioned hosts that either express the peptide antigen ovalbumin ubiquitously (βa-Ova) or selectively in the pancreas (RIP-mOva), an organ that is normally not affected by acute GVHD. Of note, at day+6 after HCT we observed that OT-I T cell infiltration occurred in an alloantigen dependent manner. In βa-Ova recipients, where antigen was ubiquitously expressed, OT-I T cells infiltrated all organs and were not restricted to gastrointestinal tract, liver, and skin. In RIP-mOva recipients, where cognate antigen was only expressed in the pancreas, OT-I T cells selectively infiltrated this organ that is usually spared in acute GVHD. In conditioned RIP-mOva the transfer of 100 OT-I T cells sufficed to effectively infiltrate and destroy pancreatic islets resulting in 100% mortality. By employing intact tissue LSFM in RIP-mOva recipients, we identified very low numbers of initial islet infiltrating T cells on day+4 after HCT followed by a massive T cell migration to the pancreas within the following 24 hours. This suggested an effective mechanism of effector T cell recruitment to the tissue of alloantigen expression after initial antigen specific T cell encounter. In chimeras that either expressed the model antigen ovalbumin selectively in hematopoietic or in parenchymal cells only, transplanted OT-I T cells infiltrated target tissues irrespective of which compartment expressed the alloantigen. As IFN-γ could be detected in the serum of transplanted ovalbumin expressing recipients (βa-Ova, βa-Ova-chimeras and RIP-mOva) at day+6 after HCT, we hypothesized that this cytokine may be functionally involved in antigen specific OT-I T cell mediated pathology. In vitro activated OT-I T cells responded with the production of IFN-γ upon antigen re-encounter suggesting that IFN-γ might be relevant in the alloantigen dependent organ infiltration of antigen specific CD8+ T cell infiltration after HCT. Based on these data we propose that alloantigen expression plays an important role in organ specific T cell infiltration during acute GVHD and that initial alloreactive T cells recognizing the cognate antigen propagate a vicious cycle of enhanced T cell recruitment that subsequently culminates in the exacerbation of tissue restricted GVHD. N2 - In der akuten Graft-Versus-Host Disease (GVHD) infiltrieren allogene Spender T Zellen Haut, Leber und den Magen-Darm-Trakt des Empfängers und attackieren das Gewebe. Andere Organe sind dagegen interessanterweise nur selten betroffen. Die Mechanismen dieser selektiven Organinfliltration sind bisher weitestgehend unbekannt. In meiner Dissertationsarbeit untersuchte ich den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation während der GVHD. Um komplexe Immunprozesse die nach allogener Stammzelltransplantation auftreten, besser zu verstehen, entwickelten wir eine Lichtblattmikroskopietechnik (LSFM) die zelluläre und molekulare Veränderungen im intakten Gewebe detektieren kann. Wir etablierten eine neuartigen mehrfarben LSFM-Methodik, die es ermöglicht, Immunprozesse in großen Gewebsstücken von Maus und Mensch in Einzelzellauflösung dreidimensional darzustellen. Dazu kombinierten und optimierten wir Protokolle, um eine Penetration von Antikörpern tief in das Gewebe sowie die Aufklärung und die dreifache Beleuchtung des Gewebes zu ermöglichen. Diese Methode erlaubte uns die erfolgreiche Quantifizierung der Proteinexpression des Adressins mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) als auch die Quantifizierung der T Zell Antwort im intakten Peyer’s Plaque nach allogener hämatopoetischer Transplantation (HCT). Weiterhin konnten wir die Methode zur Untersuchung der Migration unterschiedlicher T Zell-Subpopulationen nach HCT erfolgreich einsetzen und konnten einzelne, organinfiltrierende Zellen detektierten und quantifizieren. Wir benutzten die LSFM Methode um den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation zu studieren. Dazu verwendeten wir ein Transplantationsmodell, in dem der Haupthistokompatibilitätskomplex übereinstimmt (MHC-matched) und eine Diskrepanz nur in einem einzelnen Peptid Antigen (miHAG-mismatch) zwischen Spender und Empfänger bestand. Wir transplantierten T Zell Rezeptor (TCR) transgene (OT-I) T Zellen in myeloablativ bestrahlte Empfänger, die das Peptidantigen Ovalbumin entweder in allen Geweben (βa-Ova) oder selektiv in der Bauchspeicheldrüse (RIP-mOva) exprimieren. Die Bauchspeicheldrüse ist ein Organ, das normalerweise nicht von der akuten GVHD betroffen ist. An Tag 6 nach allogener HCT waren alle Organe die das Alloantigen exprimieren auch von Spender T Zellen infiltriert. In myeloablativ bestrahlten RIP-mOva Empfängern reichten bereits 100 transferierte OT-I T Zellen aus, um Alloantigen-exprimierende pankreatische Inselzellen zu zerstören. Dies führte zu einer Mortalität von 100% der Empfänger und spricht für eine sehr effiziente Alloantigendetektion und Gewebsinfiltration durch die Spender T Zellen. Um die Kinetik der Organinfiltration der Spender T Zellen detailliert zu untersuchen, verwendeten wir die neue Lichtblattmikroskopietechnik, welche die Analyse intakter Organe ermöglicht. In RIP-mOva Empfängern identifizierten wir erste wenige Spender T Zellen im Pankreas an Tag 4 nach Transplantation, gefolgt von einer massiven Pankreasinfiltration durch Spender T Zellen innerhalb von 24 Stunden. Dies deutet auf eine gezielte Rekrutierung der Spender T Zellen nach erstem Antigenkontakt in das Gewebe mit Alloantigenexpression. Um zu untersuchen, ob die Alloantigenexpression vom parenchymalen Gewebe oder aber durch hämatopoetische Zellen zur spezifischen Organinfiltration führt, transplantierten wir OT-I T Zellen in chimäre Empfänger, in denen das Alloantigen entweder nur im Gewebsparenchym oder ausschließlich von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. An Tag 6 nach der allogenen HCT fanden wir Spender T Zellen in allen Geweben, unabhängig davon welches Empfängerzellkompartment das Alloantigen präsentierte. Wir detektierten hohe IFN-γ-Werte im Serum von Ovalbumin exprimierenden Empfänger (βa-Ova, βa- Ova-Chimären und RIP-mOva). Weiterhin fanden wir, dass nach erneutem Kontakt mit dem spezifischen Alloantigen, OT-I T Zellen die in vitro aktiviert wurden, IFN-γ produzierten. Wir schließen aus diesen Beobachtungen, dass für die antigenabhängige Gewebeinfiltration IFN-γ wichtig ist. Zusammenfassend postulieren wir, dass die Alloantigenexpression im Gewebe eine wichtige Rolle in der organspezifischen Infiltration durch Spender T Zellen spielt, und dass T Zellen die Alloantigen spezifisch erkennen, dafür verantwortlich sind, dass weitere Effektor-T Zellen in das Gewebe rekrutiert werden. KW - Alloantigen KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Genexpression KW - Blutstammzelle KW - Graft versus Host Disease KW - Hematopoietic Cell Transplantation KW - Alloantigen Expression KW - Light Sheet Fluorescence Microscopy KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Hämatopoetische Stammzelltransplantation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85365 ER - TY - THES A1 - Bäuerlein, Carina T1 - Identification of new predictive markers for an early diagnosis of an imminent acute Graft-versus-Host Disease T1 - Bestimmung neuer prädiktiver Marker zur Früherkennung einer drohenden akuten Graft-versus-Host Disease N2 - Acute graft-versus-host disease (aGvHD) is an immune syndrome associated with allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT) that is mediated by alloreactive donor T cells attacking the gastrointestinal tract, liver, and skin of the host. Early diagnosis remains problematic and to date mainly relies on clinical symptoms and histopathology. Previously, different groups demonstrated that in order to cause aGvHD, alloreactive T cells require the expression of appropriate homing receptors to efficiently migrate from their priming sites to their target tissues. Therefore, the development of a predictive test based on the homing receptor expression profile of peripheral blood T cells seems attractive to identify patients at risk before the onset of aGvHD. The aim of this study was to analyze migrating alloreactive donor T cell kinetics in the peripheral blood early after allo-HCT in a murine model across minor histocompatibility antigens (miHAg) followed by a precise characterization of the homing receptor expression profile of migrating donor lymphocytes in order to identify suitable predictive markers. Combining daily bioluminescence imaging (BLI) and flow cytometry (FC) allowed defining two weeks of massive alloreactive donor T cell migration before clinical aGvHD symptoms became apparent. Peripheral blood donor T lymphocytes highly up-regulated the homing markers α4β7 integrin, and P- and E-selectin-ligand at peak time points of cell migration. The combination with the activation markers CD25 and CD69 and low expression levels of L-selectin allowed alloreactive donor T cell definition. Based on this migration phase we postulated a potential diagnostic window to precisely identify alloreactive donor T cells upon their homing receptor expression profile. Consequently, targeted pre-emptive treatment with rapamycin starting at the earliest detection time point of alloreactive donor T cells in the peripheral blood (day+6) significantly prolonged survival of treated mice. Based on this data, we propose a potential diagnostic window for alloreactive cell detection based on their homing receptor expression profile for a timely and effective therapeutic intervention before the clinical manifestation of aGvHD. N2 - Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ist oft die einzig mögliche Behandlungsmethode für maligne und nicht-maligne hämatologische Erkrankungen. Die Graft-versus-Host Disease stellt den größten, limitierenden Faktor dieser Therapie dar. Bei diesem Immunsyndrom greifen alloreaktive Spender-T-Zellen gezielt Organe des Empfängers an, insbesondere den Gastrointestinaltrakt, die Leber und die Haut. Die frühe Diagnose einer bevorstehenden, akuten GvHD gestaltet sich nach wie vor schwierig und basiert heutzutage hauptsächlich auf dem Auftreten klinischer Symptome und histopathologischen Befunden. Die Entwicklung eines prädiktiven Tests zur Früherkennung gefährdeter Patienten hat daher hohe Priorität. Verschiedene Gruppen zeigten kürzlich, dass Spender-T-Zellen spezifische Rezeptoren, sogenannte Homing-Rezeptoren, exprimieren müssen, um in die Zielorgane einwandern zu können. Deshalb scheint die Entwicklung eines auf dem spezifischen Homing-Rezeptor-Expressionsmuster der T-Zellen im peripheren Blut basierenden Tests vielversprechend, um gezielt Patienten zu identifizieren, die möglicherweise eine aGvHD entwickeln werden. Das Ziel dieser Arbeit war die genaue Analyse der Migrationskinetik alloreaktiver Spender-T-Zellen im peripheren Blut in einem klinisch relevanten Mausmodell mit Unterschieden in minor Histokompatibilitätsantigenen. Es folgte eine präzise Charakterisierung des Homing-Rezeptor-Expressionsprofils der migrierenden Spenderlymphozyten zu ausgewählten Zeitpunkten nach Transplantation, um mögliche, geeignete Rezeptoren für einen prädiktiven Test zu identifizieren. Die Kombination von täglicher in vivo Bildgebung der transplantierten Mäuse mit durchflusszytometrischen Analysen des peripheren Blutes ermöglichte es, eine zweiwöchige Phase massiver Spenderzellmigration vor dem Auftreten klinischer aGvHD Symptome zu definieren. Die detektierten Spenderlymphozyten zeigten eine stark erhöhte Expression des für die Migration in den Gastrointestinaltrakt wichtigen Moleküls α4β7 Integrin sowie der Liganden für P- und E-Selektin, die in das Haut-Homing involviert sind. Die Kombination dieser Marker mit der stark reduzierten Expression von L-Selektin, einem Marker für naive T-Zellen, sowie der signifikant höheren Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 im Vergleich zu syngen transplantierten Kontrolltieren ermöglichte die Definition von alloreaktiven Spender-T-Zellen. Eine gezielte, vorbeugende Behandlung mit Rapamycin, beginnend am Tag der Detektion erster alloreaktiver T-Zellen (Tag+6), erhöhte die Überlebensrate der behandelten Mäuse. Aufgrund dieser Daten schlagen wir ein potentielles, diagnostisches Fenster zur Anwendung prädiktiver Tests vor, um Patienten, mit erhöhtem aGvHD-Risiko rechtzeitig zu identifizieren und vorbeugend behandeln zu können. KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Graft-versus-host disease KW - Mausmodell KW - T-Zellhoming KW - Graft-versus-host disease KW - mouse model KW - T cell homing KW - Maus KW - Blutstammzelle Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78489 ER - TY - THES A1 - Stühler, Claudia T1 - Strategies to prevent graft-versus-host disease and augment anti-fungal immunity in allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients T1 - Strategien zur Prävention von Graft-versus-Host-Disease und zur Verbesserung der anti-fungalen Immunität nach allogener hämatopoietischer Stammzell-Transplantation N2 - Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is often the only effective treatment for patients with hematological malignancies, but its curative potential is often limited by the development of acute or chronic graft-versus-host disease (GvHD). Although extensive immunosuppressive therapy is highly efficient in the prevention or treatment of GvHD, it greatly increases the risk for life-threatening opportunistic fungal or viral infections and the recurrence of malignant disease. The possibility to selectively deplete alloreactive T cells from donor grafts prior or after transplantation would greatly diminish the need for immunosuppressive therapy in the transplant recipient and thereby greatly improve its clinical outcome. The molecular chaperone heat shock protein of 90 kDa (Hsp90) has been previously shown to stabilize many signal transduction proteins involved in T lymphocyte activation and proliferation and is furthermore able to exert anti-apoptotic effects in different cell types. The aim of this study was therefore to investigate the possibility to selectively target activated, proliferating T cells in lymphocyte populations by inhibition of Hsp90, without compromising viability and function of non-reactive T cell populations including pathogen-specific T lymphocytes. It could be shown in this work, that activated T cells are indeed more prone to apoptotic cell death in the presence of Hsp90 inhibitors than resting cells and that treatment of mixed lymphocyte cultures with such inhibitors eliminates the proliferation of alloreactive cells. In contrast, T cells remaining in a resting state during inhibitor treatment remain viable and also display functional virus-specific responses after inhibitor removal. These data suggest, that Hsp90 could represent a novel target for selective depletion of alloreactive T cells and that application of Hsp90 inhibitors could be a potential approach to prevent or treat GvHD without impairing pathogen-specific T cell immunity. In the second part of this work, the immune responses to strictly defined antigens of the opportunistic pathogenic fungus Aspergillus fumigatus were characterized. Opportunistic fungal infections are highly prevalent in immunocompromized and immunosuppressed individuals, especially in HSCT recipients suffering from GvDH. Although antifungal treatment is permanently improved, invasive fungal infections are still often fatal. In healthy individuals clinical disease is rare, because innate and adaptive immunity act in conjunction to protect the host. Therefore one possible strategy to prevent and treat life-threatening fungal infections in immunocompromized patients is to improve host resistance by augmenting the antifungal functions of the immune system, for example by vaccination or adoptive transfer of antigen-specific T cells. Based on previous findings, the objective of this dissertation was to identify and characterize distinct immunogenic A. fumigatus antigens that could be used for clinical application like vaccination or ex vivo generation of antigen-specific T cells and to characterize the interaction of this antigen-specific lymphocytes with cells of the innate immune system. First, memory T cell responses to different recombinant A. fumigatus proteins in healthy individuals were evaluated. The majority of tested donors displayed stable CD4+ TH1 responses to the Crf1 protein, whereas responses to the other antigens tested could only be detected in a limited number of donors, qualifying Crf1 as potential candidate antigen for clinical use. It was also possible to identify an immunodominant MHC class II DRB1*04-restricted epitope of Crf1 and to generate T cell clones specific for this epitope. This Crf1-specific T cell clones could be specifically activated by dendritic cells fed with synthetic peptide, recombinant protein or germinating A. fumigatus conidia or outgrown hyphae. Interestingly, these A. fumigatus-specific T cell clones also responded to stimulation with Candida albicans, which likewise causes opportunistic infections in immunocompromized patients and encodes for a glucosyltransferase similar to A. fumigatus Crf1. It was also possible to show that supernatant harvested from activated Crf1-specific T cell cultures was able to significantly increase fungal killing by monocytes. These data indicate that the specified FHT epitope of the A. fumigatus protein Crf1 could be potentially used as antigen for vaccination protocols or for the generation of Aspergillus-specific effector T cells for adoptive transfer. N2 - Allogene, hämatopoietische Stammzelltransplantation ist häufig die einzige, effektive Behandlungsmethode für Patienten mit hämatologischen Erkrankungen, aber deren Erfolg ist häufig durch das Auftreten einer „Graft-versus-Host“-Erkrankung (GvHD) gefährdet. Obwohl durch eine weitreichende, immunsuppressive Therapie eine GvHD erfolgreich verhindert oder behandelt werden kann, erhöht diese jedoch beträchtlich das Risiko für das Auftreten lebensbedrohender opportunistischer Virus- und Pilz- Infektionen und das Wiederauftreten der malignen Erkrankung. Die Möglichkeit der selektiven Depletion alloreaktiver T-Zellen eines Transplantates bevor oder nach der Transplantation würde die Notwendigkeit immunsuppressiver Therapien des Empfängers deutlich reduzieren und dadurch den Behandlungserfolg enorm verbessern. Für das molekulare Chaperon-Protein „Hitzeschock-Protein von 90 kDa“ (Hsp90) konnte bereits zuvor gezeigt werden, dass es viele Signal-Transduktions-Proteine, die an der Aktivierung von T-Lymphozyten beteiligt sind stabilisiert und außerdem in verschiedenen Zelltypen einen anti-apoptotischen Effekt auszuüben scheint. Deshalb war es das Ziel dieser Untersuchung festzustellen, ob es möglich ist, durch Inhibition von Hsp90 spezifisch nur die aktivierten, proliferierenden T-Zellen in einer Lymphozyten-Population zu erreichen, ohne dabei die Viabilität und Funktionalität der nicht-reaktiven T-Zell-Population, einschließlich Pathogen-spezifischen TLymphozyten, zu beeinträchtigen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass unter dem Einfluss von Hsp90-Inhibitoren in aktivierten T-Zellen tatsächlich eher Apoptose induziert wird, als in ruhenden Zellen und dass die Behandlung von gemischten Lymphozyten-Kulturen mit diesen Inhibitoren die Proliferation von alloreaktiven Zellen verhindert. Im Gegensatz dazu bleiben TZellen, die zum Zeitpunkt der Inhibitor-Behandlung in einem ruhenden Zustand waren überlebensfähig und zeigen zudem nach Entfernung des Inhibitors immer noch Virusspezifische Immunantworten. Wie diese Daten zeigen, könnte Hsp90 ein neues Angriffsziel für die selektive Depletion von alloreaktiven T-Zellen sein und Hsp90- Inhibitoren deshalb möglicherweise für die Vorbeugung oder Behandlung von GvHD eingesetzt werden, ohne dabei die pathogen-spezifische Immunität zu beeinträchtigen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Immunantworten auf definierte Antigene das opportunistisch pathogenen Pilzes Aspergillus fumigatus charakterisiert. Opportunistische Pilzinfektionen sind eine häufige Begleiterscheinung bei Personen mit beeinträchtigtem Immunsystem und immunsupprimierten Patienten, vor allem bei Patienten die sich einer allogenen Stammzell-Transplantation unterziehen müssen und unter einer GvHD leiden. Trotz ständiger Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten, verlaufen invasive Pilzinfektionen häufig immer noch tödlich. Gesunde Menschen erkranken nur äußerst selten symptomatisch, da sowohl die angeborene als auch die erworbene Immunabwehr dazu beitragen, eine akute Infektion effektiv zu verhindern. Eine Möglichkeit, lebensbedrohliche Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten zu verhindern könnte deshalb die Stärkung der Immunabwehr durch Verbesserung der Funktionen des Immunsystems sein, beispielsweise durch Vakzinierung oder den adoptiven Transfer antigenspezifischer TZellen. Ziel dieser Arbeit war, aufbauend auf früheren Forschungsergebnissen, die Identifikation und Charakterisierung definierter immunogener A. fumigatus Antigene, die für die klinische Anwendung als Impfstoff oder für die ex vivo Generierung antigenspezifischer T-Zellen Verwendung finden könnten. Außerdem sollte die Interaktion dieser antigenspezifischen T-Lymphozyten mit den Zellen des angeborenen Immunsystems untersucht werden. Zunächst wurden hierfür die T-Zell-Antworten gesunder Spender auf verschiedene rekombinante A. fumigatus-Proteine untersucht. Die große Mehrheit der getesteten Spender reagierte auf das Protein Crf1 mit einer stabilen TH1 Antwort, während die übrigen getesteten Proteine nur in vereinzelten Spendern eine signifikante T-Zell- Antwort auslösten. Die offensichtlich weite Verbreitung von Crf1-spezifischen Gedächtnis-Zellen in der Bevölkerung lässt dieses Antigen als gut geeignet für potenzielle klinische Anwendungen erscheinen. Des weiteren wurde ein immundominantes Epitop von Crf1 identifiziert, das durch das relativ weit verbreite MHC Klasse II DRB1*04-Allel präsentiert wird. T-Zell-Klone, die spezifisch dieses Antigen erkennen, konnten mit dendritischen Zellen, die zuvor mit synthetischem Peptid, rekombinantem Protein oder ausgekeimten A. fumigatus Conidien oder Hyphen inkubiert worden waren aktiviert werden. Interessanterweise reagierten diese A. fumigatus-spezifischen T-Zell-Klone auch auf Stimulation mit Candida albicans, das ebenfalls opportunistische Infektionen in immunsupprimierten Patienten auslöst und für eine ähnliche Glucosyl-Transferase wie Crf1 in A. fumigatus codiert. Die Kultur-Überstände von aktivierten Crf1-spezifischen TZell- Klonen waren außerdem in der Lage, das Abtöten des Pilzes durch Monozyten deutlich zu verbessern. Diese Daten deuten darauf hin, dass das hier beschriebene FHT-Epitop des A. fumigatus Proteins Crf1 potenziell als Antigen für die Vakzinierung oder die Generierung von Aspergillus-spezifischen Effektor-T-Zellen für den adoptiven Transfer geeignet sein könnte. KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Immuntherapie KW - Aspergillus fumigatus Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51957 ER -