TY - JOUR A1 - Cox-Limpens, Kimberly E. M. A1 - Vles, Johan S. H. A1 - van den Hove, Daniel L. A. A1 - Zimmermann, Luc Ji A1 - Gavilanes, Antonio W. D. T1 - Fetal asphyctic preconditioning alters the transcriptional response to perinatal asphyxia JF - BMC Neuroscience N2 - Background: Genomic reprogramming is thought to be, at least in part, responsible for the protective effect of brain preconditioning. Unraveling mechanisms of this endogenous neuroprotection, activated by preconditioning, is an important step towards new clinical strategies for treating asphyctic neonates. Therefore, we investigated whole-genome transcriptional changes in the brain of rats which underwent perinatal asphyxia (PA), and rats where PA was preceded by fetal asphyctic preconditioning (FAPA). Offspring were sacrificed 6 h and 96 h after birth, and whole-genome transcription was investigated using the Affymetrix Gene1.0ST chip. Microarray data were analyzed with the Bioconductor Limma package. In addition to univariate analysis, we performed Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) in order to derive results with maximum biological relevance. Results: We observed minimal, 25% or less, overlap of differentially regulated transcripts across different experimental groups which leads us to conclude that the transcriptional phenotype of these groups is largely unique. In both the PA and FAPA group we observe an upregulation of transcripts involved in cellular stress. Contrastingly, transcripts with a function in the cell nucleus were mostly downregulated in PA animals, while we see considerable upregulation in the FAPA group. Furthermore, we observed that histone deacetylases (HDACs) are exclusively regulated in FAPA animals. Conclusions: This study is the first to investigate whole-genome transcription in the neonatal brain after PA alone, and after perinatal asphyxia preceded by preconditioning (FAPA). We describe several genes/pathways, such as ubiquitination and proteolysis, which were not previously linked to preconditioning-induced neuroprotection. Furthermore, we observed that the majority of upregulated genes in preconditioned animals have a function in the cell nucleus, including several epigenetic players such as HDACs, which suggests that epigenetic mechanisms are likely to play a role in preconditioning-induced neuroprotection. KW - Perinatal Asphyxia KW - oxidative stress KW - microarray KW - cerebral artery occlusion KW - ischemic brain injury KW - genomic response KW - protein aggregation KW - immediate early genes KW - neuroprotection KW - tolerance KW - rat KW - expression KW - transient global ischemia KW - ubiquitination KW - epigenetics KW - fetal preconditioning KW - neonatal brain Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116185 VL - 15 ER - TY - THES A1 - Hafen, Bettina T1 - Physical contact between mesenchymal stem cells and endothelial precursors induces distinct signatures with relevance to tissue regeneration and engineering T1 - Physischer Kontakt zwischen mesenchymalen Stammzellen und endothelialen Vorläuferzellen indiziert eine bestimmte Signatur mit Relevanz für die Geweberegeneration und Tissue Engineering N2 - The goal of the project VascuBone is to develop a tool box for bone regeneration, which on one hand fulfills basic requirements (e.g. biocompatibility, properties of the surface, strength of the biomaterials) and on the other hand is freely combinable with what is needed in the respective patient's situation. The tool box will include a variation of biocompatible biomaterials and cell types, FDA-approved growth factors, material modification technologies, simulation and analytical tools like molecular imaging-based in vivo diagnostics, which can be combined for the specific medical need. This tool box will be used to develop translational approaches for regenerative therapies of different types of bone defects. This project receives funding from the European Union's Seventh Framework Program (VascuBone 2010). The present study is embedded into this EU project. The intention of this study is to assess the changes of the global gene expression patterns of endothelial progenitor cells (EPCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) after direct cell-cell contact as well as the influence of conditioned medium gained from MSCs on EPCs and vice versa. EPCs play an important role in postnatal vasculogenesis. An intact blood vessel system is crucial for all tissues, including bone. Latest findings in the field of bone fracture healing and repair by the use of tissue engineering constructs seeded with MSCs raised the idea of combining MSCs and EPCs to enhance vascularization and therefore support survival of the newly built bone tissue. RNA samples from both experimental set ups were hybridized on Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 and analyzed by microarray technology. Bioinformatic analysis was applied to the microarray data and verified by RT-PCR. This study gives detailed information on how EPCs and MSCs communicate with each other and therefore gives insights into the signaling pathways of the musculoskeletal system. These insights will be the base for further functional studies on protein level for the purpose of tissue regeneration. A better understanding of the cell communication of MSCs and EPCs and subsequently the targeting of relevant factors opens a variety of new opportunities, especially in the field of tissue engineering. The second part of the present work was to develop an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for a target protein from the lists of differentially expressed genes revealed by the microarray analysis. This project was in cooperation with Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany. The development of the ELISA aimed to have an in vitro diagnostic tool to monitor e.g. the quality of cell seeded tissue engineering constructs. The target protein chosen from the lists was klotho. Klotho seemed to be a very promising candidate since it is described in the literature as anti-aging protein. Furthermore, studies with klotho knock-out mice showed that these animals suffered from several age-related diseases e.g. osteoporosis and atherosclerosis. As a co-receptor for FGF23, klotho plays an important role in bone metabolism. The present study will be the first one to show that klotho is up-regulated in EPCs after direct cell-cell contact with MSCs. The development of an assay with a high sensitivity on one hand and the capacity to differentiate between secreted and shedded klotho on the other hand will allow further functional studies of this protein and offers a new opportunity in medical diagnostics especially in the field of metabolic bone disease. N2 - Das Ziel des durch die europäische Union geförderten Projekts VascuBone ist die Entwicklung einer tool box zur Knochenregeneration, die einerseits sämtliche Grundanforderungen erfüllt, beispielsweise an die Biokompatibilität, Oberflächenbeschaffenheit und Robustheit der Biomaterialien, und andererseits frei an den Bedarf der individuellen Patientensituation angepasst werden kann. Sie beinhaltet unterschiedlichste biokompatible Materialien und Zelltypen, FDA-zugelassene Wachstumsfaktoren, materialmodifizierende Technologien sowie Simulations- und analytische Werkzeuge, wie die auf molekularer Bildgebung basierende in-vivo-Diagnostik (MRI und PET/CT), die für den spezifischen medizinischen Bedarf kombiniert werden können. Die tool box wird für die Entwicklung translationaler Ansätze in der regenerativen Medizin für unterschiedliche Arten von Knochendefekten verwendet (VascuBone 2010). Eingebettet in dieses EU-Projekt sollten in der vorliegenden Arbeit die molekularen Grundlagen und Änderungen der globalen Genexpressionsmuster von endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) nach direktem Zell-Zell-Kontakt sowie nach Gabe von konditioniertem Medium untersucht werden. EPCs spielen eine wichtige Rolle in der postnatalen Vaskulogenese. Ein intaktes Blutgefäßsystem ist überlebensnotwendig für alle Gewebe, einschließlich Knochen. Neueste Erkenntnisse in der Knochenheilung und -regeneration durch die Nutzung von Tissue-Engineering-Konstrukten, die mit MSCs besiedelt wurden, förderten die Idee, MSCs und EPCs zu kombinieren, um die Vaskularisierung – und somit das Überleben – des neu gebildeten Knochengewebes zu begünstigen. Die RNA-Proben aus beiden Versuchsansätzen wurden für die Microarray-Analysen auf Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 hybridisiert. Die Array-Daten wurden bioinformatisch ausgewertet und mittels RT-PCR verifiziert. Die vorliegende Arbeit gibt detailliert Aufschluss darüber, wie MSCs und EPCs miteinander kommunizieren, und erlaubt somit wichtige Einblicke in Signalwege des muskuloskelettalen Systems. Dies wiederum ermöglicht weitere funktionelle Studien auf Proteinebene zum Zwecke der Geweberegeneration. Das bessere Verständnis der Zellkommunikation zwischen MSCs und EPCs und somit die gezielte Adressierung von relevanten Faktoren eröffnet völlig neue Möglichkeiten in der klinischen Anwendung, insbesondere im Bereich Tissue Engineering. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte in Kooperation mit der Firma Immundiagnostik AG, Bensheim, ein ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) aufgebaut werden. Ziel war es, für ein geeignetes Protein aus den zu erwartenden Listen regulierter Gene ein in-vitro-diagnostisches Nachweisverfahren zu entwickeln, das ggf. später als Qualitätsnachweis für erfolgreich besiedelte Tissue-Engineering-Konstrukte herangezogen werden könnte. Als geeigneter Kandidat wurde Klotho ausgewählt. Klotho gilt als anti-aging-Protein, da Klotho-knock-out-Mäuse alle alterstypischen Erkrankungen wie Osteoporose oder Arteriosklerose zeigen. Als Co-Rezeptor für FGF23 spielt Klotho außerdem eine wichtige Rolle im Knochenstoffwechsel. Diese Studie ist die erste, die zeigt, dass in EPCs nach direktem Zell-Zell-Kontakt mit MSCs Klotho hochreguliert wird. Die Entwicklung eines sensitiven und differenzierten Nachweises von sezerniertem Klotho sowie der von der Membran proteolytisch abgespaltenen Form von Klotho, eröffnet völlig neue Möglichkeiten in der klinischen Diagnostik, insbesondere im Bereich der Knochenstoffwechselerkrankungen KW - MSC KW - EPC KW - bone regeneration KW - microarray KW - Vorläuferzelle KW - Endothel KW - Mesenchymzelle KW - Knochenregeneration Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119417 ER - TY - THES A1 - Heitmann, Maximilian T1 - Vergleich der genetischen Eigenschaften von Bone Marrow derived Mesenchymal Stem Cells und Trabecular Bone derived Mesenchymal Stem Cells T1 - Comparison of the genetic character of Bone Marrow derived Mesenchymal Stem Cells and Trabecular Bone derived Mesenchymal Stem Cells N2 - Technische Neuerungen und steigende Ansprüche an die Gesundheit stellen die moderne Medizin immer wieder vor neue Herausforderungen und führen zur Entwicklung von neuen Therapiekonzepten wie dem Tissue Engineering. Vielfach kommen dabei adulte pluripotente Stammzellen zum Einsatz. Bei der Regeneration mesenchymalen Gewebes wie Knochen, Knorpel und Muskulatur leisten Mesenchymale Stammzellen (MSCs) einen entscheidenden Beitrag. Diese lassen sich aus allen mesenchymalen Geweben des Körpers gewinnen und stellen daher zwar keine homogene Zellpopulation dar, doch sie lassen sich aufgrund phänotypischer und molekularbiologischer Gemeinsamkeiten charakterisieren. In großer Zahl lassen sich MSCs aus dem Knochenmark gewinnen und werden als stromale MSCs bzw. mhMSCs (marrow-derived human MSCs) bezeichnet. Auf der Suche nach homogenen Subpopulationen von MSCs wurde in dieser Arbeit eine Zellpopulation aus Knochentrabekeln gewonnen, sogenannte bhMSCs (trabecular bone-derived MSCs), und anhand ihrer Genexpression mit mhMSCs verglichen. Dafür wurde RNA aus beiden Populationen in einem Microarray mit anschließender SAM (significance analysis of microarrays) analysiert um unterschiedliche Expressionsmuster zwischen mhMSCs und bhMSCs aufzuzeigen. Diese Ergebnisse wurden durch konventionelle Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) bestätigt, wobei das Augenmerk vor allem auf solche Gene gerichtet wurde, die differentiell exprimiert waren und zudem als Markergene ein Differenzierungspotential in bestimmte Gewebe wie Muskel und Knochen vorhersagen. Dabei konnte sowohl eine gute Übereinstimmung zwischen Microarray und RT-PCR demonstriert als auch die Hoffnung auf eine homogene (trabekuläre) MSC-Population mit anderen Differenzierungseigenschaften geweckt werden. Im Verlauf weitergehender Untersuchungen der SAM fiel eine unerklärlich hohe Expression von Immunglobulinketten in der mhMSC-Kultur (Passage 0) auf, die letztlich auf eine Kontamination der Zellkultur mit Plasmazellen schließen ließ. Da die Ergebnisse des Microarrays (Passage 0 Kultur) somit zu hinterfragen waren, wurde die Kontamination der Plasmazellen durch Passagieren der mhMSC-Zellkultur (Passage 1) beseitigt und erneut ein Microarray mit SAM durchgeführt. Dabei relativierten sich fast alle Expressionsunterschiede, die somit auf die Kontamination der Plasmazellen zurückgeführt werden mussten. Einzig drei Gene (CD24, TRIB2, AHNAK) wurden in diesem zweiten Array differentiell exprimiert, was sich bei CD24 und TRIB2 auch durch RT-PCR untermauern ließ. Es lässt sich also schlussfolgern, dass bhMSCs wahrscheinlich in der Zukunft des Tissue Engineering keinen Stellenwert haben werden, zumal ihre Gewinnung im Vergleich zu mhMSC deutlich aufwendiger ist. N2 - Technical innovations and increasing demands on health confront modern medicine constantly with new challenges and lead to the development of new therapeutic concepts such as tissue engineering. Often adult pluripotent stem cells are used thereby. In the regeneration of mesenchymal tissues such as bone, cartilage and muscle Mesenchymal stem cells (MSCs) make a significant contribution. These can be harvested from all mesenchymal tissues of the body and do not represent a homogeneous cell population, but they can be characterized due to phenotypic and molecular similarities. In large numbers MSCs can be harvested from the bone marrow and are called stromal MSCs or mhMSCs (marrow-derived human MSCs). Looking for homogeneous subpopulations of MSCs in this thesis was harvested a cell population derived from bone trabeculae, called bhMSCs (trabecular bone-derived MSCs), and was compared with mhMSCs based on their gene expression. RNA was isolated from both populations and analyzed in a microarray followed by SAM (significance analysis of microarrays) to point out different expression patterns between mhMSCs and bhMSCs. These results were confirmed by conventional reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). The attention was directed primarily to those genes that were differentially expressed and also predicted the differentiation potential to certain tissues such as muscle and bone as so-called marker genes. Both equivalence between microarray and RT-PCR was demonstrated and the hope of a homogeneous (trabecular) MSC population with other differentiating features was awakened. In the course of further investigations of the SAM an inexplicably high expression of immunoglobulin chains in the mhMSC culture (passage 0) was noticed, which indicated a contamination of the cell culture with plasma cells. Since the results of the microarray (passage 0 culture) were thus to question the contamination of the plasma cells was removed by passaging the mhMSC cell culture (passage 1) and a second microarray with SAM was performed. In this case, we could not find these expression differences between both populations anymore. Due to the contamination with plasma cells in the MSC culture all previous results were not valid any more. Only three genes (CD24, Trib2, AHNAK) were differentially expressed in this second array. It can be concluded, therefore, that bhMSCs likely in the future tissue engineering have no value, especially since their harvesting compared to mhMSC is much more complex. KW - Mesenchymale Stammzelle KW - Polymerase-Kettenrektion KW - Microarray KW - Differenzierung KW - Adulte Stammzelle KW - Mesenchymale Stammzelle KW - Polymerase Kettenreaktion KW - Microarray KW - Differenzierung KW - Trabekuläre Mesenchymale Stammzelle KW - mesenchymal stem cell KW - polymerase chain reaction KW - microarray KW - differentiation KW - trabecular bone-derived mesenchymal stem cell Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108612 ER - TY - JOUR A1 - Keller, Andreas A1 - Leidinger, Petra A1 - Vogel, Britta A1 - Backes, Christina A1 - ElSharawy, Abdou A1 - Galata, Valentina A1 - Mueller, Sabine C. A1 - Marquart, Sabine A1 - Schrauder, Michael G. A1 - Strick, Reiner A1 - Bauer, Andrea A1 - Wischhusen, Jörg A1 - Beier, Markus A1 - Kohlhaas, Jochen A1 - Katus, Hugo A. A1 - Hoheisel, Jörg A1 - Franke, Andre A1 - Meder, Benjamin A1 - Meese, Eckart T1 - miRNAs can be generally associated with human pathologies as exemplified for miR-144* JF - BMC MEDICINE N2 - Background: miRNA profiles are promising biomarker candidates for a manifold of human pathologies, opening new avenues for diagnosis and prognosis. Beyond studies that describe miRNAs frequently as markers for specific traits, we asked whether a general pattern for miRNAs across many diseases exists. Methods: We evaluated genome-wide circulating profiles of 1,049 patients suffering from 19 different cancer and non-cancer diseases as well as unaffected controls. The results were validated on 319 individuals using qRT-PCR. Results: We discovered 34 miRNAs with strong disease association. Among those, we found substantially decreased levels of hsa-miR-144* and hsa-miR-20b with AUC of 0.751 ( 95% CI: 0.703-0.799), respectively. We also discovered a set of miRNAs, including hsa-miR-155*, as rather stable markers, offering reasonable control miRNAs for future studies. The strong downregulation of hsa-miR-144* and the less variable pattern of hsa-miR-155* has been validated in a cohort of 319 samples in three different centers. Here, breast cancer as an additional disease phenotype not included in the screening phase has been included as the 20th trait. Conclusions: Our study on 1,368 patients including 1,049 genome-wide miRNA profiles and 319 qRT-PCR validations further underscores the high potential of specific blood-borne miRNA patterns as molecular biomarkers. Importantly, we highlight 34 miRNAs that are generally dysregulated in human pathologies. Although these markers are not specific to certain diseases they may add to the diagnosis in combination with other markers, building a specific signature. Besides these dysregulated miRNAs, we propose a set of constant miRNAs that may be used as control markers. KW - peripheral blood KW - microna profiles KW - disease KW - signature KW - expression KW - miRNA KW - microarray KW - biomarker KW - bioinformatics KW - lung-cancer KW - multiple sclerosis KW - gene KW - serum Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114349 SN - 1741-7015 VL - 12 ER - TY - THES A1 - Mäurer, André Germar Paul T1 - Analysis of the Chlamydophila pneumoniae and host transcriptome in the acute and iron depletion-mediated persistent infection T1 - Analyse des Transkriptoms von Chlamydophila pneumoniae und der Wirtszelle während der akuten und der durch Eisenmangel vermittelten persistenten Infektion N2 - The obligate intracellular gram-negative bacterium, Chlamydophila pneumoniae (Cpn), has a significant impact as an acute and chronic disease-causing pathogen. Its potential to undergo persistent infections has been linked to chronic diseases. Several in vitro cell culture models are used to study persistent conditions, mainly IFN_ stimulation, treatment with antibiotics and iron depletion. Little is known about changes in the Cpn transcriptome during the acute and persistent infection. Therefore, the Cpn transcriptome during its acute developmental cycle and iron depletion-mediated persistence was examined in this study. Based on expression profiles, genes with similar expression changes formed 12 clusters using the self-organizing map algorithm. While other studies define genes based on their onset of transcription, here the important feature for clustering was the expression profile. This turned out to be more appropriate for comparing the time specific relevance of a certain cluster of genes to their proposed functions in the cycle. The Cpn clusters were grouped into the 'Early', 'Mid' and 'Late' classes as described for Ctr. Additionally, a new gene expression class containing genes with steadily increasing expression at the end of the developmental cycle was defined and termed 'Tardy' class. Comparison of the Cpn clusters to published proteomics data showed that genes encoding elementary body (EB) proteins peaked in the 'Late' gene cluster. This indicated that genes of the ‘Late’ and ‘Tardy’ class have different roles in RB to EB re-differentiation. Moreover, using lexical comparison the EB mRNA profile was significantly linked to the ‘Tardy’ cluster class. This provided evidence that initial translation in the cycle might be directed from stable transcripts present in the infectious EB form. Based on these criteria the novel ‘Tardy’ class was separated from the ‘Late’ class. The gene ontologies were used to identify specific pathways and physiological functions active during the different phases of development. Additionally, the transcriptome of Cpn in the persistent stage was compared to that of the acute developmental cycle. The Cpn transcriptome was altered in the iron-depletion mediated persistence. Genes upregulated were linked to clusters at the beginning of the developmental cycle, and genes down-regulated were linked to clusters at the end of the developmental cycle. These data provided strong evidence that the Cpn transcriptome during persistence is a gene expression arrest in mid-development. In early acute infection convergently or divergently oriented gene pairs preferentially had an antagonistic expression profile, whereas tandemly oriented gene pairs showed a correlated expression profile. This suggests that the Cpn genome is organized mainly in tandemly arranged operons and in convergently or divergently oriented genes with favored antagonistic profiles. The microarray studies done with the Cpn strain CWL029 also showed expression signals for several genes annotated only for the Cpn strains AR39 and J138. BLAST comparison verified that these genes are also coded in the CWL029 genome. Several of these genes were convergently arranged with their neighboring gene and shared overlapping genome information. Among these were parB, involved in DNA segregation and rpsD, an alternative sigma factor responsible for the transcription at late stages of the developmental cycle. Both genes have been described to have major roles in the chlamydial cycle. These genes had an antagonistic expression profile at the beginning of the acute developmental cycle and in persistence, as described before to be predominant for convergently oriented genes. Real time RT-PCR analysis showed that full-length rpsD mRNA transcripts were down-regulated, whereas short-length rpsD mRNA transcripts were up-regulated during the persistent infection. This demonstrated that the rpsD promoter is activated during the persistent infection and that because of the collision of the RNA polymerases full length transcripts were down-regulated. This sigma factor-independent mechanism is known as ‘Transcriptional Interference’. This is the first description on how the alternative sigma factor rpsD might be down-regulated during persistent infections. Finally, the host cell transcriptome was analyzed in the acute and persistent infection mediated by the depletion of iron. Cpn infection triggered the upregulation of relB, involved in an alternative NF-KB signaling pathway. Several genes coding for cell cycle proteins were triggered, including cyclin G2 and cyclin D1 and inhibitors of CDK4. Taken together, this work provides insights into the modulation of the pathogen and the host transcriptome during the acute infection and the iron mediated persistent infection. N2 - Das obligat intrazelluläre, gram-negative Bakterium Chlamydophila pneumoniae (Cpn) wird mit akuten und chronischen Krankheiten in Verbindung gebracht. Besonders sein Potential persistente Infektionen zu durchlaufen ist mit chronischen Krankheiten korreliert worden und deshalb von besonderem Interesse. Verschiedene in vitro Zellkulturmodelle werden verwendet um persistente Infektionen zu untersuchen, darunter IFN_ Stimulation, Antibiotika Behandlung und Eisenmangel. Über die Genregulation von Cpn als auch der Wirtzelle in der akuten und persistenten Infektion ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde das Cpn Transkriptom als auch das von epithelialen Wirtszellen in der akuten und in der durch Eisenmangel induzierten Infektion untersucht. Mittels eines Algorithmuses für ‚selbstorganisierende Netzwerke’ (SOM) wurden signifikant regulierte Gene aufgrund ihres Expressionsprofiles in 12 Cluster gegliedert. Diese 12 Cluster wurden wiederum in die Klassen der ‘Frühen’ (engl.: ‘Early’), ‘Mittleren’ (engl.: ‘Mid’) und ‘Späten’ (engl.: ‘Late’) Gene eingeteilt. Diese Unterteilung lehnt sich an schon beschriebenen Genexpressionsstudien für Ctr an. Weiterhin wurde die neue Klasse der ‘Verspäteten’ (engl.: ‘Tardy’) Gene eingeführt. Diese hatten am Ende des Entwicklungszykluses ein kontinuierlich ansteigendes Expressionsprofil. Mit publizierten Proteinen aus chlamydialen Elementarkörperchen (EK) korrelierten vor allem Gene aus den ‘Späte’ jedoch nicht aus den ‘Verspätete’ Klassen. Gene dieser beiden Klassen müssen also eine unterschiedliche Rolle im EK Redifferenzierungsprozess spielen. Weiterhin waren überdurchschnittlich viele mRNA Transkripte aus der Klasse der ‘Verspäteten’ Gene in den EK vorhanden. Dies führte zu der Annahme, daß ein Teil der initiale Proteinexpression von stabilen mRNA-Transkripten aus der infektiösen EK Form erfolgt. Anschließend wurden, Gene, die für spezifische Signalwege und physiologische Funktionen von Cpn kodieren, basierend auf der ‚Gene Ontology’ während des Entwicklungszykluses untersucht. Weiterhin wurde das Transkriptom von Cpn in der Persistenz mit dem Transkriptom der akuten Infektion verglichen. Unter Persistenzbedingungen zeigte Cpn ein verändertes Expressionsprofil. Hochregulierte Gene konnten akuten Clustern am Anfang des akuten Entwicklungszykluses und herunterregulierte Gene Clustern am Ende des akuten Entwicklungszykluses zugeordnet werden konnten. Dies legt nahe, daß es sich bei der Persistenz nicht um ein neues Transkriptionsprofil handelt, sondern eher um eine Arretierung des Transkriptomes in der Mitte des akuten Entwicklungszykluses. Weiterhin zeigten konvergent und divergent orientierte Gene am Anfang des Zyklus bevorzugt ein antagonistisches Expressionsprofil, während in Reihe angeordnete (‘tandem’) Gene ein korreliertes Expressionsprofil aufwiesen. Bei den mit dem Cpn Stamm CWL029 durchgeführten Mikroarrayexperimenten konnten auch Expressionswerte für einige ausschließlich für die Stämme AR39 und J138 beschriebenen Gene gemessen werden. Ein Vergleich mittels BLAST zeigte, daß diese Gene auch im CWL029 Genom kodiert sind. Dazu gehörten mehrere Gene, welche konvergent zu ihren Nachbargenen orientiert waren und eine Sequenzüberlappung mit diesen aufwiesen. Darunter fielen parB, welches eine Rolle für die Trennung der DNA in der Zellteilung spielt, und rpsD, ein alternativer Sigma-Faktor, der für die Transkription in der späten Phase des Entwicklungszyklus verantwortlich ist. Für beide Genpaare konnte in der frühen akuten und in der persistenten Infektion ein antagonistisches Expressionsprofil beobachtet werden, wie es bei konvergent orientierten Genpaaren überwiegt. Mittels quantitativer qRT-PCR wurde für rpsD gezeigt, dass vollständige mRNA-Fragmente in der Persistenz herunterreguliert, während kurze mRNA-Fragmente hochreguliert waren. Als Erklärung für diesen Effekt dient ein Modell, welches auf einer Kollision der RNA Polymerasen basiert. Dieser Sigma-Faktor unabhängige Mechanismus ist in der Literatur als ‘Transkriptionelle Interferenz’ bekannt und führt so trotz einer Promoteraktivierung zu einer verminderten Anzahl an vollständigen mRNA Transkripten. Die Herunterregulation von RpsD auf Proteinebene in der Cpn Persistenz ist beschrieben worden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Wirtszelltranskriptom in der akuten und persistenten Infektion untersucht.Infektion mit Cpn führte zu einer Hochregulation von relB, welches an alternativen NF-KB Signalwegen beteiligt ist und das anti-apoptotische Potential verstärkt. Weiterhin waren Gene differentiell exprimiert, welche für die Zellzyklusproteine Cyclin-G2 und Cyclin-D1 sowie Inhibitoren von CDK4 kodieren. Zusammenfassend gibt diese Arbeit gibt einen Einblick sowohl in das Transkriptom des Pathogens als auch der Wirtszelle während der akuten und durch Eisenmangel ausgelösten persistenten Infektion als auch potentiellen Mechanismen zu Persistenzentstehung auf der Ebene der Genregulation. KW - Chlamydia pneumoniae KW - Infektion KW - Transkriptom KW - Eisenmangel KW - Transkiptom KW - Eisen KW - Chlamydien KW - Chlamydophila pneumoniae KW - Mikroarray KW - transkiptome KW - iron KW - Chlamydia KW - Chlamydophila pneumoniae KW - microarray Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21415 ER - TY - THES A1 - Niehus, Eike T1 - Untersuchungen zur Regulation Motilitäts-assoziierter Gene in Helicobacter pylori T1 - Regulation of Motility-Associated Genes in Helicobacter pylori N2 - Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten. N2 - The gastric human pathogen Helicobacter pylori is a fastidious bacterium, chronically colonizing the stomach of more than half of the world population, leading to severe diseases in some individuals such as ulcers or gastric cancer. H. pylori flagella-driven motility has been shown to be essential for the initial colonization of the human gastric mucosa and for the long-term persistence of the infection. The 2-8 flagella are arranged at one pole of the bacterium and covered by a membranous sheath. The flagella and chemotaxis system comprises more than forty genes. In contrast to the highly ordered gene organization in other organisms, they are scattered along the genome. The aim of this study was to comprehensively characterize the network of transcriptional regulation of flagellar biogenesis with possible links to other cell functions in H. pylori. H. pylori possesses two different flagellin genes, flaA and flaB, the transcription of the corresponding genes is controlled by sigma28 and sigma54 promoters respectively. To characterize the specific transcriptional regulation of these flagellar genes, which belong to two different regulons, transcript levels were monitored throughout the growth curve of H. pylori. A bioluminescence-based reporter gene system was successfully established in H. pylori for the first time. It was utilized to measure the activity of the newly constructed flaA- and flaB-promoter fusions. Furthermore growth-phase dependent transcript levels of the two flagellin genes were confirmed by Northern blot hybridizations and RT-PCR analysis. The results revealed a growthphase dependent differential transcriptional control of flaA and flaB in H. pylori. In agreement with the structural succession of FlaB and FlaA in the filament, as well as the affiliation of the genes to different flagellar regulons, flaA to flaB expression ratio was strongly increasing with the progression of the growth curve. An H. pylori microarray working platform was established to be able to perform genome-wide analyses on this organism. A custom made PCR-product microarray with 1590 H. pylori specific probes was constructed in cooperation with the Max-Planck-Institute for Infection Biology in Berlin. In addition, a commercially available H. pylori-specific oligonucleotide based microarray system was utilized for the first time and validated. By using the microarray technology, a set of different key regulators of the H. pylori flagellar system was analysed on a genome-wide scale for the first time. They are comprising the alternative sigma factors FliA and RpoN, the anti-sigma-factor FlgM, the RpoN specific two component system FlgS/R and the components of the flagellar basal body, FlhA and FlhF. While the fliA mutant revealed a phenotype with truncated flagella, the flgM mutant had a slightly enhanced number of flagella, correlating with their antagonistic function. Mutations in all other regulators lead to loss of flagella and motility. Based on the microarray analyses of the FliA and RpoN regulons, the flagellar regulatory classes 2 and 3 could be newly defined and enlarged by ten additional genes. The microarray studies on early flagellar components revealed a role for FlhA and FlhF as functional equivalents to master regulators. They are governing the transcription of flagellar regulatory classes 2 and 3 and a newly defined intermediate regulon. The latter comprised 24 flagellar and non-flagellar genes controlled by more than one promoter. Furthermore, studies on double mutants of the early regulators with the flagellar antisigma factor FlgM provided evidence for the complex regulatory interconnection of this factor with the determined flagellar feedback regulation of FlhA and FlhF. Based on the results of this study, a revised model of regulation pathways of flagellar biogenesis in H. pylori could be constructed. It is composed of three regulatory classes of flagellar genes and one intermediate class, governed by the three H. Pylori specific sigma factors sigma80, sigma54 and sigma28 and the associated regulators FlgS/R and FlgM. The transcriptional feedback regulation on class 3 genes is mediated by the anti-sigma factor FlgM, which is also involved in FlhA-dependent transcriptional control of class 2 flagellar genes. FlhF-dependent transcriptional control on class 2 genes is independent from FlgM. In contrast to other organisms, flagellar class 1 genes in H. pylori include flagellar motor and chemotaxis components and are coregulated with housekeeping genes. This coincides with the specific ecological adaptation of H. pylori to its niche and the necessity for the pathogen to be continuously motile to maintain a persistent infection. KW - Helicobacter pylori KW - Geißel KW - Genregulation KW - Helicobacter pylori KW - Flagellen KW - Genregulation KW - Motilität KW - Microarray KW - Helicobacter pylori KW - regulation KW - flagella KW - motility KW - microarray Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11141 ER - TY - THES A1 - Reinboth, Jennifer T1 - Cellular Factors Contributing to Host Cell Permissiveness in Support of Oncolytic Vaccinia Virus Replication T1 - Beteiligung zellulärer Faktoren an der Permissivität von Wirtszellen in Unterstützung der onkolytischen Vaccinia Virus Replikation N2 - In initial experiments, the well characterized VACV strain GLV-1h68 and three wild-type LIVP isolates were utilized to analyze gene expression in a pair of autologous human melanoma cell lines (888-MEL and 1936 MEL) after infection. Microarray analyses, followed by sequential statistical approaches, characterized human genes whose transcription is affected specifically by VACV infection. In accordance with the literature, those genes were involved in broad cellular functions, such as cell death, protein synthesis and folding, as well as DNA replication, recombination, and repair. In parallel to host gene expression, viral gene expression was evaluated with help of customized VACV array platforms to get better insight over the interplay between VACV and its host. Our main focus was to compare host and viral early events, since virus genome replication occurs early after infection. We observed that viral transcripts segregated in a characteristic time-specific pattern, consistent with the three temporal expression classes of VACV genes, including a group of genes which could be classified as early-stage genes. In this work, comparison of VACV early replication and respective early gene transcription led to the identification of seven viral genes whose expression correlated strictly with replication. We considered the early expression of those seven genes to be representative for VACV replication and we therefore referred to them as viral replication indicators (VRIs). To explore the relationship between host cell transcription and viral replication, we correlated viral (VRI) and human early gene expression. Correlation analysis revealed a subset of 114 human transcripts whose early expression tightly correlated with early VRI expression and thus early viral replication. These 114 human molecules represented an involvement in broad cellular functions. We found at least six out of 114 correlates to be involved in protein ubiquitination or proteasomal function. Another molecule of interest was the serine-threonine protein kinase WNK lysine-deficient protein kinase 1 (WNK1). We discovered that WNK1 features differences on several molecular biological levels associated with permissiveness to VACV infection. In addition to that, a set of human genes was identified with possible predictive value for viral replication in an independent dataset. A further objective of this work was to explore baseline molecular biological variances associated with permissiveness which could help identifying cellular components that contribute to the formation of a permissive phenotype. Therefore, in a subsequent approach, we screened a set of 15 melanoma cell lines (15-MEL) regarding their permissiveness to GLV-1h68, evaluated by GFP expression levels, and classified the top four and lowest four cell lines into high and low permissive group, respectively. Baseline gene transcriptional data, comparing low and highly permissive group, suggest that differences between the two groups are at least in part due to variances in global cellular functions, such as cell cycle, cell growth and proliferation, as well as cell death and survival. We also observed differences in the ubiquitination pathway, which is consistent with our previous results and underlines the importance of this pathway in VACV replication and permissiveness. Moreover, baseline microRNA (miRNA) expression between low and highly permissive group was considered to provide valuable information regarding virus-host co-existence. In our data set, we identified six miRNAs that featured varying baseline expression between low and highly permissive group. Finally, copy number variations (CNVs) between low and highly permissive group were evaluated. In this study, when investigating differences in the chromosomal aberration patterns between low and highly permissive group, we observed frequent segmental amplifications within the low permissive group, whereas the same regions were mostly unchanged in the high group. Taken together, our results highlight a probable correlation between viral replication, early gene expression, and the respective host response and thus a possible involvement of human host factors in viral early replication. Furthermore, we revealed the importance of cellular baseline composition for permissiveness to VACV infection on different molecular biological levels, including mRNA expression, miRNA expression, as well as copy number variations. The characterization of human target genes that influence viral replication could help answering the question of host cell response to oncolytic virotherapy and provide important information for the development of novel recombinant vaccinia viruses with improved features to enhance replication rate and hence trigger therapeutic outcome. N2 - Die Replikationseffizienz von VACVs spielt eine maßgebliche Rolle für deren antitumorale Wirkung und onkolytische Effizienz. Ferner hängt die Permissivität einer Wirtszelle gegenüber der Behandlung mit onkolytischen VACVs maßgeblich von einer erfolgreichen viralen Replikation und Vermehrung ab. Darauf basierend, war der Fokus der vorliegenden Arbeit, zelluläre Eigenschaften zu erforschen, welche die VACV-Replikation beeinflussen und die Wirtszell-Permissivität gegenüber einer Behandlung mit VACV prognostizieren können. Für initiale Genexpressionsanalysen wurden zwei autologe, humane Melanom-Zelllinien (888-MEL und 1936 MEL), sowie der ausgiebig charakterisierte VACV-Stamm GLV-1h68 und drei wildtypische LIVP Isolate verwendet. Mit Hilfe von Microarray Analysen und einem sequenziellen statistischen Ansatz konnten humane Gene charakterisiert werden, deren Transkription eigens durch VACV-Infektion beeinflusst wird. Erwartungsgemäß zeigten diese Gene eine Anreicherung in globalen zellulären Signalwegen und Funktionen. Die frühe virale Gentranskription kann als repräsentative Bestimmungsgröße für virale Replikation betrachtet werden. Darauf basierend resultierte der Vergleich von früher VACV Replikation und entsprechender früher Gentranskription in der Identifikation von sieben viralen Genen, deren Expression und Replikation stark korrelierten. Aus diesem Grund wurde die frühe Expression der sieben VACV-Gene als kennzeichnend für virale Replikation angesehen und diese Gene als virale Replikations-Indikatoren (VRIs) definiert. Zur Aufklärung von Zusammenhängen zwischen Wirts-Transkription und viraler Replikation wurde die frühe virale VRI-Expression mit der frühen humanen Genexpression in Beziehung gesetzt. Mit Hilfe von Vergleichsanalysen wurden 114 humane Transkripte identifiziert, deren frühes Expressionsmuster eng mit demjenigen der VRIs korrelierte und dementsprechend ebenso mit der viralen Replikation. Von den 114 Korrelaten spielen mindestens sechs eine Rolle in der Protein-Ubiquitinierung oder in der proteasomalen Signalgebung. Ein weiteres Molekül, welches besonderes Interesse weckte, war die Serin-Threonin Proteinkinase WNK Lysin-defizientes Protein 1 (WNK1). Für WNK1 wurden Unterschiede, die mit der VACV-Infektions-Permissivität zusammenhängen, auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen nachgewiesen. Desweiten wurde in dieser Arbeit eine Anzahl humaner Gene identifiziert, welche virale Replikation in einem unabhängigen Datensatz prognostizieren konnten. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, molekularbiologische Unterschiede, welche mit Infektions-Permissivität von Zellen assoziiert sind, auf Basisebene zu ergründen. Diese könnten dabei helfen, zelluläre Komponenten zu identifizieren, welche einen so genannten permissiven Phänotyp kennzeichnen. Aus diesem Grund wurden in einem weiteren Versuchsansatz 15 Melanom-Zelllinien (15-MEL) bezüglich ihrer Permissivität gegenüber GLV-1h68 anhand von GFP Expression untersucht. Die vier Zelllinien mit der höchsten und diejenigen vier mit der niedrigsten Permissivität wurden je einer Gruppe zugeordnet (hochpermissive und niedrigpermissive Gruppe). Die Gruppen hoher und niedriger Permissivität wurden bezüglich ihrer Basislevel-Transkription verglichen. Unterschiedlich exprimierte Gene waren, zumindest zum Teil, in globale zelluläre Prozesse involviert. Darüber hinaus wurde microRNA (miRNA) Basislevel-Expression von hoch- und niedrigpermissiver Gruppe untersucht. In dieser Arbeit wurden sechs miRNAs identifiziert, deren Basislevel-Expression zwischen niedrig und hochpermissiver Gruppe differiert. Abschließend wurden Veränderungen der Kopienzahl von Genen (copy number variations, CNVs) im Vergleich zwischen niedrig- und hochpermissiver Gruppe untersucht. Betrachtung chromosomaler Veränderungen zeigte eine Anreicherung von Segment-Amplifikationen in der niedrigpermissiven Gruppe, während gleiche Abschnitte der hochpermissiven Gruppe größtenteils keine Veränderungen aufwiesen. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine mutmaßliche Korrelation zwischen viraler Replikation, früher Genexpression und der entsprechenden Wirtsantwort gezeigt werden und somit eine mögliche Beteiligung humaner Wirtsfaktoren an der viralen Replikation. Zusätzlich wurden wichtige Aspekte der Basiskomposition von Zellen für die Permissivität gegenüber VACV-Infektion auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen aufgedeckt, einschließlich mRNA-Expression, miRNA-Expression sowie Kopienzahl-Variationen. Die Charakterisierung humaner Zielgene, welche die virale Replikation beeinflussen, könnte dabei helfen, die Wirtszellantwort auf onkolytische Virotherapie aufzuklären und wichtige Informationen zu liefern für die Entwicklung neuartiger rekombinanter Vaccinia-Viren mit verbesserten Eigenschaften und verbesserter Replikationseffizienz und somit einem gesteigerten Therapieerfolg. KW - Vaccinia-Virus KW - Microarray KW - Melanom KW - onkolytische Virotherapie KW - Vaccinia Virus Replikation KW - vaccinia virus KW - microarray KW - malignant melanoma KW - oncolytic virotherapy KW - vaccinia virus replication KW - Onkolyse Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85392 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Karin T1 - Charakterisierung des BvgAS1,2-Regulons von Bordetella petrii T1 - Characterization of the BvgAS1,2 regulon of Bordetella petrii N2 - Die Gattung Bordetella, die phylogenetisch in die Gruppe der β-Proteobakterien eingeordnet und zur Familie der Alcaligenaceae gezählt wird, umfasst nach heutigem Wissenstand neun Gram-negative Arten. Die klassischen Bordetella-Arten B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica werden im sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zusammengefasst. Der strikt humanpathogene Erreger B. pertussis stellt als Verursacher des Keuchhustens das wohl bedeutendste Mitglied der Gattung dar. B. parapertussis ist der Verursacher von respiratorischen Erkrankungen in Menschen und Schafen, während B. bronchiseptica für Atemwegserkrankungen in verschiedenen Säugetieren verantwortlich gemacht wird. Zudem kann B. bronchiseptica für einen längeren Zeitraum in der Umwelt überleben. Die in den letzte Jahren identifizierten „neuen“ Bordetella-Arten, B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum und B. ansorpii, wurden alle human- oder tierassoziiert isoliert und besitzen unterschiedliches pathogenes Potential, das zum Teil noch näher untersucht werden muss. Eine Ausnahme stellt der aus einer anaeroben dechlorinierten Flusssediment-Anreicherungskultur isolierte Keim B. petrii dar. Dieser ist bis zum heutigen Zeitpunkt der einzige Umweltkeim der Gattung Bordetella (von Wintzingerode, Schattke et al. 2001). In evolutionärer Hinsicht ist B. petrii besonders interessant, da er sowohl für orthologe Gene einiger Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert, als auch die typischen Eigenschaften eines Umweltkeims aufweist und somit als Bindeglied zu fungieren scheint. Ein solcher Virulenzfaktor ist das BvgAS-System, das in den pathogenen Bordetellen den Hauptregulator der Virulenzgenexpression darstellt, aber in B. petrii strukturell komplexer aufgebaut ist. Neben dem auf Aminosäureebene hoch konservierten Response Regulator bvgA, finden sich in B. petrii Gene für zwei Histidinkinasen, bvgS1 und bvgS2, sowie eine unabhängige hpt-Domäne. Eine periplasmatische Sensordomäne fehlt in beiden Kinasen, und nur in BvgS1 konnte eine PAS-Domäne identifiziert werden. In den letzten Jahren wurden zunehmend B. petrii-Isolate aus den verschiedensten Habitaten isoliert, wie z.B. das Schwammisolate R521 (Sfanos, Harmody et al. 2005) und das klinisches Isolat aus einem Patienten mit mandibulärer Osteomyelitis (Fry, Duncan et al. 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurde über einen PCR-Ansatz versucht, mit aus der Wildtypsequenz abgeleiteten Oligonukleotiden das BvgAS1,2-System der Isolate zu sequenzieren, aber nur im klinischen Isolat konnte ein orthologes Genfragment zum Response Regulator bvgA identifiziert werden. Ein Nachweis der Histidinkinasen sowie der hpt-Domäne schlug in allen untersuchten Isolaten fehl. Die vergleichenden Genomanalysen mittels DNA-Microarrays konnten aufgrund fehlender Hybridisierungen keine weiteren Gemeinsamkeiten und Unterschiede auf DNA-Ebene zwischen den Isolaten und B. petrii DSM 12804 aufzeigen. B. petrii ist ein hoch variabler Umweltkeim, der sich an verschiedene Lebensbedingungen anpassen kann. Dies konnte auch durch die Isolation dreier phänotypisch unterscheidbare Varianten während eines Langzeitwachstumsversuches gezeigt werden (Lechner 2008). Durch die Genomsequenzierung von B. petrii DSM 12804 konnten wenigsten sieben genomischen Inseln beschrieben werden (Gross, Guzman et al. 2008), die durch unterschiedliche Exzision für die Entstehung der Varianten und daraus resultierend für die Variabilität in B. petrii verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Größe der einzelnen genomischen Inseln im Genom von B. petrii durch vergleichende Genomanalysen mittels DNA-Microarrays, mit Ausnahme von GI1, GI5 und GI6, im Vergleich zu den bioinformatischen Vorhersagen bestätigt werden. Diese Inseln zeigten in den Microarray-Analysen eine Vergrößerung bzw. Verkleinerung im Vergleich zu den zuvor beschrieben putativen Grenzen. Die große Instabilität des Genoms von B. petrii DSM 12804 konnte in dieser Arbeit auch durch Microarray-Analysen einzelner Klone aufgezeigt werden, die unterschiedliche Variationen im Bereich der genomischen Inseln aufwiesen. In den Analysen von B. petrii 12804 ΔbvgA bzw. ΔbvgAS konnten zusätzlich zu den gezielten Manipulation im BvgAS1,2-Lokus weitere Deletionen im Bereich von bpet0196-0200, bpet4219-4235 und bpet4176 detektiert werden. Die Re-Integration dieser Genbereiche nach Klonierung einer BvgA-Komplementationsmutante deutet auf eine extrachromosomale plasmid-ähnliche Struktur dieser Bereiche hin. Dies konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend bestätigt werden und bleibt weiter zu untersuchen. Im Verlauf der evolutionären Entwicklung der Bordetellen wurde das BvgAS-System, das ursprünglich für die Adaption an Umweltbedingungen mit verschiedenen Sauerstoff-konzentrationen und/oder Temperaturen zuständig war, mit der Regulation der Expression der Virulenzgene verknüpft (von Wintzingerode, Gerlach et al. 2002). In den Transkriptomanalysen zur Untersuchung der Funktionalität des BvgAS1,2-Systems in B. petrii konnte aufgezeigt werden, dass die Temperatur ein wichtiger Signalgeber für die Expression des Flagellen- und Chemotaxisoperons ist. In B. bronchiseptica wird die Motilität, bei Temperaturen unter 25°C, negativ durch das BvgAS-System reguliert. Auch in B. petrii konnte in den Untersuchungen eine negative Regulation der Flagellen- und Chemotaxisgene durch das BvgAS1,2-System unter diesen Bedingungen detektiert werden. Ob aber in B. petrii die gleiche hierarchische Struktur zur Regulation der Motilität besteht wie in B. bronchiseptica, bleibt zu untersuchen. Im Verlauf der Untersuchungen konnte dem BvgAS-Zwei-Komponentensystem in B. petrii auch eine Funktion im Energiestoffwechsel eingeräumt werden, um auf wechselnde Sauerstoffbedingungen reagieren zu können. Die Messung des Sauerstoffgehaltes der Umgebung und damit eine Regulation der aeroben bzw. anaeroben Atmung erfolgt in B. petrii wahrscheinlich ebenfalls über das BvgAS1,2-System. Die in der Histidinkinase BvgS1 vorhergesagte PAS-Domäne scheint laut den Analysen für diesen Vorgang von großer Bedeutung zu sein. Desweiteren scheint das System auch die Zusammensetzung der Cytochromoxidase zur optimalen Anpassung an aerobe, mikroaerophile und anaerobe Bedingungen zu regulieren. N2 - The genus Bordetella phylogenetically grouped within the beta-subclass of Proteobacteria and belonging to the family of the Alcaligenaceae comprises to date nine gram negative species. The classical Bordetella species B. pertussis, B. parapertussis and B. bronchiseptica are integrated in the so called B. bronchiseptica-cluster. The obligate human pathogen B. pertussis, as the agent of whooping cough, is the most important member of the genus. B. parapertussis is the agent of respiratory diseases in humans and sheep, whereas B. bronchiseptica causes respiratory diseases in various mammalian species. In addition, B. bronchiseptica has the ability to survive in the environment for a certain period of time. The in recent years identified “new” Bordetella species, B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum and B. ansorpii, have all been isolated in association with humans and animals and exhibit different pathogenic potential, which partly have to be examined further. An exception is the species B. petrii, which was isolated from an anaerobic dechlorinating bioreactor culture enriched by river sediment. Up to date B. petrii represents the first environmental isolate of the genus Bordetella (von Wintzingerode, Schattke et al. 2001). B. petrii encodes both for several orthologous genes to virulence factors of the pathogenic Bordetellae and also shows the typical features of environmental bacteria, it might represent some sort of evolutionary missing link. A putative virulence factor is the BvgAS-systems, which demonstrates to be the master regulator for virulence gene expression in the pathogenic Bordetellae, but in B. petrii this system built-on in a much more complex way. In B. petrii could be identified a response regulator bvgA, which is conserved on amino acid level, two histidine kinase genes, bvgS1 and bvgS2, and a separate gene for the hpt-domain. A periplasmatic sensing domain is missing in both kinases and a PAS-domain could only identified in BvgS1. In the recent years an increasing number of B. petrii isolates could be isolated from various habitats, for example the sponge isolate R521 (Sfanos, Harmody et al. 2005) and the clinical isolate from a patient with mandibular osteomyelitis (Fry, Duncan et al. 2005). In this work a PCR approach, with oligonucleotides derived from the B. petrii wildtyp sequence, was used to sequence the BvgAS1,2-system of the isolates but only in the clinical isolate an orthologous gene fragment of the Response Regulator bvgA could be identified. A detection of the histidine kinases or the hpt-domain failed in all investigated isolates. The comparative genome analysis with DNA-microarrays showed no further similarities and differences between the isolates and B. petrii DSM 12804 because of missing hybridization. B. petrii is a highly variable environmental bacterium capable of adapting to different living conditions. This could be demonstrated by isolation of three phenotypically distinguishable variants during a long-term growth experiment (Lechner 2008). By genome sequencing of B. petrii DSM 12804, at least seven genomic islands could be described (Gross, Guzman et al. 2008), which are responsible for the development of variants and therefore for the variability of B. petrii by different excision. During this study, the size of each genomic island of B. petrii could be confirmed by comparative genome analysis with DNA-microarrays with the exception of GI1, GI5 und GI6 compared to bioinformatic predictions. These islands showed an extension and reduction in the microarray analysis, respectively. The high instability of the genome of B. petrii DSM 12804 could also be demonstrated by microarray analysis of individual clones in this doctorate, which show variations in the area of the genomic island. The analysis of B. petrii 12804 ΔbvgA and ΔbvgAS, respectively, illustrate the specific manipulations in the BvgAS1,2 locus and additional deletions in the area of bpet0196-0200, bpet4219-4235 and bpet4176. The re-integration of these genes into genome after cloning of a BvgA complement thereupon points to that these areas build a plasmid structure. During this work this could not be confirmed and needs to be investigated exhaustively. In progress of the evolutionary development of the Bordetellae, the BvgAS-system, originally envolved in adaption to environmental conditions with different concentrations of oxygen and/or temperatures, was connected with the regulation of the virulence gene expression (von Wintzingerode, Gerlach et al. 2002). In the transcriptomic analysis to evaluate the functionality of the BvgAS1,2-system of B. petrii it could be proofed that the temperature is an important factor for the expression of the flagella and chemotaxis operon. In B. bronchiseptica, the motility is negatively regulated by the BvgAS-system by temperatures below 25°C. Also, a negative regulation of the flagella and chemotaxis genes was detected in the investigation of B. petrii under these conditions. If there is the same hierarchic structure of the regulation of the motility in B. petrii like in B. bronchiseptica may be investigated. During the investigations the BvgAS two-component-system of B. petrii could admit a function in the respiratory control to respond to changing oxygen conditions. The sensing of the environment´s oxygen content and a regulation of the aerobic and anaerobic respiration, respectively, can be awarded to the BvgAS1,2-system in B. petrii. The predicted PAS-domain in the histidine kinase BvgS1 are obviously important during this process according to the analysis. In addition, the system seems to regulate the composition of the cytochrome oxidase well for optimal adaption to aerobic, microaerophilic and anaerobic environmental conditions. KW - Bordetella KW - Bordetella bronchiseptica KW - Microarray KW - Nitratatmung KW - Motilität KW - Genregulation KW - Bordetella petrii KW - BvgAS-System KW - Microarray KW - B. petrii-Isolate KW - B. petrii-Varianten KW - Bordetella petrii KW - BvgAS system KW - microarray KW - isolates of B. petrii KW - variants of B. petrii Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53603 ER - TY - JOUR A1 - Schröder, Wiebke A1 - Bernhardt, Jörg A1 - Marincola, Gabriella A1 - Klein-Hitpass, Ludger A1 - Herbig, Alexander A1 - Krupp, Guido A1 - Nieselt, Kay A1 - Wolz, Christiane T1 - Altering gene expression by aminocoumarins: the role of DNA supercoiling in Staphylococcus aureus JF - BMC Genomics N2 - BACKGROUND: It has been shown previously that aminocoumarin antibiotics such as novobiocin lead to immediate downregulation of recA expression and thereby inhibit the SOS response, mutation frequency and recombination capacity in Staphylococcus aureus. Aminocoumarins function by inhibiting the ATPase activity of DNA gyrase subunit B with a severe impact on DNA supercoiling. RESULTS: Here, we have analysed the global impact of the DNA relaxing agent novobiocin on gene expression in S. aureus. Using a novobiocin-resistant mutant, it became evident that the change in recA expression is due to gyrase inhibition. Microarray analysis and northern blot hybridisation revealed that the expression levels of a distinct set of genes were increased (e.g., recF-gyrB-gyrA, the rib operon and the ure operon) or decreased (e.g., arlRS, recA, lukA, hlgC and fnbA) by novobiocin. The two-component ArlRS system was previously found to decrease the level of supercoiling in S. aureus. Thus, downregulation of arlRS might partially compensate for the relaxing effect of novobiocin. Global analysis and gene mapping of supercoiling-sensitive genes did not provide any indication that they are clustered in the genome. Promoter fusion assays confirmed that the responsiveness of a given gene is intrinsic to the promoter region but independent of the chromosomal location. CONCLUSIONS: The results indicate that the molecular properties of a given promoter, rather than the chromosomal topology, dictate the responsiveness to changes in supercoiling in the pathogen Staphylococcus aureus. KW - aminocoumarins KW - novobiocin KW - microarray KW - Voronoi tree map KW - spacer KW - arlR KW - gyrase KW - supercoiling KW - staphylococcus aureus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121609 SN - 1471-2164 VL - 15 IS - 291 ER - TY - JOUR A1 - Shityakov, Sergey A1 - Dandekar, Thomas A1 - Förster, Carola T1 - Gene expression profiles and protein-protein interaction network analysis in AIDS patients with HIV-associated encephalitis and dementia JF - HIV/AIDS: Research and Palliative Care N2 - Central nervous system dysfunction is an important cause of morbidity and mortality in patients with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection and acquired immunodeficiency virus syndrome (AIDS). Patients with AIDS are usually affected by HIV-associated encephalitis (HIVE) with viral replication limited to cells of monocyte origin. To examine the molecular mechanisms underlying HIVE-induced dementia, the GSE4755 Affymetrix data were obtained from the Gene Expression Omnibus database and the differentially expressed genes (DEGs) between the samples from AIDS patients with and without apparent features of HIVE-induced dementia were identified. In addition, protein–protein interaction networks were constructed by mapping DEGs into protein–protein interaction data to identify the pathways that these DEGs are involved in. The results revealed that the expression of 1,528 DEGs is mainly involved in the immune response, regulation of cell proliferation, cellular response to inflammation, signal transduction, and viral replication cycle. Heat-shock protein alpha, class A member 1 (HSP90AA1), and fibronectin 1 were detected as hub nodes with degree values >130. In conclusion, the results indicate that HSP90A and fibronectin 1 play important roles in HIVE pathogenesis. KW - microarray KW - differentially expressed genes KW - protein-protein interaction network KW - gene ontology KW - encephalitis dementia KW - human immunodeficiency virus Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149494 VL - 7 ER -