TY - THES A1 - Kurz, Hendrikje T1 - Regulation of ion conductance and cAMP/cGMP concentration in megakaryocytes by light T1 - Regulation der Ionenleitfähigkeit und cAMP/cGMP Konzentration in Megakaryozyten durch Licht N2 - Platelets play an essential role in haemostasis. Through granule secretion of second wave mediators and aggregation, they secure vascular integrity. Due to incorrect activation, platelet aggregation and subsequent thrombus formation can cause blood vessel occlusion, leading to ischemia. Patients with defects in platelet production have a low platelet count (thrombocytopenia), which can cause an increased bleeding risk. In vitro platelet generation is still in its development phase. So far, no convincing results have been obtained. For this reason, the health care system still depends on blood donors. Platelets are produced by bone marrow megakaryocytes (MKs), which extend long cytoplasmic protrusions, designated proplatelets, into sinusoidal blood vessels. Due to shear forces, platelets are then released into the bloodstream. The molecular mechanisms underlying platelet production are still not fully understood. However, a more detailed insight of this biological process is necessary to improve the in vitro generation of platelets and to optimise treatment regimens of patients. Optogenetics is defined as “light-modulation of cellular activity or of animal behaviour by gene transfer of photo-sensitive proteins”. Optogenetics has had a big impact on neuroscience over the last decade. The use of channelrhodopsin 2 (ChR2), a light-sensitive cation channel, made it possible to stimulate neurons precisely and minimally invasive for the first time. Recent developments in the field of optogenetics intend to address a broader scope of cellular and molecular biology. The aim of this thesis is to establish optogenetics in the field of MK research in order to precisely control and manipulate MK differentiation. An existing “optogenetic toolbox“ was used, which made it possible to light-modulate the cellular concentration of specific signalling molecules and ion conductance in MKs. Expression of the bacterial photoactivated adenylyl cyclase (bPAC) resulted in a significant increase in cAMP concentration after 5 minutes of illumination. Similarly, intracellular cGMP concentrations in MKs expressing photoactivated guanylyl cyclase (BeCyclop) were elevated. Furthermore, proplatelet formation of MKs expressing the light-sensitive ion channels ChR2 and anion channelrhodopsin (ACR) was altered in a light-dependent manner. These results show that MK physiology can be modified by optogenetic approaches. This might help shed new light on the underlying mechanisms of thrombopoiesis. N2 - Thrombozyten sind für die primäre Hämostase verantwortlich und unterstützen die Blutgerinnung. Durch ihre Aggregation und die Synthese bzw. Freisetzung von in Granula gespeicherten second wave Mediatoren, sichern sie die Integrität der Blutgefäße. Werden Thrombozyten fälschlicherweise aktiviert, kann es zu einem Gefäßverschluss durch Thrombusbildung mit daraus resultierender Ischämie kommen. Patienten mit einer defekten Thrombozytopoese weisen eine reduzierte Thrombozytenzahl (Thrombozytopenie) auf, die mit einer erhöhten Blutungsneigung assoziiert ist. Bisher gibt es keine überzeugenden Ansätze, die eine Thrombozytenproduktion in vitro ermöglichen. Aus diesem Grund ist das Gesundheitswesen, in der Versorgung der bedürftigen Patienten mit Thrombozytenkonzentraten, auf Blutspender angewiesen. Thrombozyten werden im Knochenmark von ihren Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs) produziert. Diese bilden lange zytoplasmatische Fortsätze aus, die Proplättchen genannt werden. Durch die Scherkräfte des Blutstroms in den sinuosoidalen Blutgefäßen, schnüren sich Thrombozyten von den Proplättchen ab. Bisher sind die molekularen Prozesse der Thrombozytenproduktion noch weitgehend unverstanden. Ein besseres Verständnis des Vorgangs ist die Voraussetzung für eine Weiterentwicklung der in vitro Thrombozytengenerierung und einer optimierten Patientenbehandlung. Unter Optogenetik versteht man die Übertragung lichtempfindlicher Proteine in zuvor nicht lichtempfindliche Zellen. Dadurch wird eine nicht-invasive Beeinflussung von Zellvorgängen oder des Verhaltens von Tieren durch Licht ermöglicht. Das Feld der Optogenetik, besonders der lichtempfindliche Kanal Channelrhodopsin 2 (ChR2), hatte einen großen Einfluss auf die neuronale Forschung. Durch ihn war es möglich, Neuronen gezielt nicht-invasiv zu aktivieren und Kreisläufe zu untersuchen. Mittlerweile wurde das Spektrum auf eine Vielzahl von Forschungsgebieten und Zelltypen ausgeweitet. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Methoden der Optogenetik in MKs zu etablieren. Dadurch soll ein Weg gefunden werden, die Megakaryozytenreifung gezielt zu kontrollieren bzw. zu manipulieren. Die bereits vorhandene „optogenetische Toolbox“ wurde verwendet, um die intrazellulären Konzentrationen bestimmter Signalmoleküle und Ionen in MKs zu verändern. Durch die Expression der bakteriellen fotoaktivierbaren Adenylatzyklase (bPAC), wurde die cAMP Konzentration nach 5 min Lichtgabe signifikant erhöht. Ebenfalls ist es durch die Expression der fotoaktivierbaren Guanylatzyklase (BeCyclop) gelungen, die intrazelluläre cGMP Konzentration in MKs durch Belichtung zu erhöhen. Darüber hinaus konnte der Vorgang der Proplättchenformierung in MKs, welche die lichtempfindlichen Ionenkanäle ChR2 und Anion Channelrhodopsin (ACR) exprimierten, durch Licht beeinflusst werden. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Beeinflussung der Megakaryozytenphysiologie durch Optogenetik möglich ist. Die Erkenntnisse können dazu beitragen, die Vorgänge der Thrombozytopoese in Zukunft besser zu verstehen. KW - optogenetics KW - megakaryocytes KW - Optogenetik KW - Megakaryozyt KW - proplatelets KW - second messenger Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216947 ER - TY - THES A1 - Rumpf, Florian T1 - Optogenetic stimulation of AVP neurons in the anterior hypothalamus promotes wakefulness T1 - Optogenetische Stimulation von AVP Neuronen im vorderen Hypothalamus induziert Wachheit N2 - The mammalian central clock, located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the anterior hypothalamus, controls circadian rhythms in behaviour such as the sleep-wake cycle. It is made up of approximately 20,000 heterogeneous neurons that can be classified by their expression of neuropeptides. There are three major populations: AVP neurons (arginine vasopressin), VIP neurons (vasoactive intestinal peptide), and GRP neurons (gastrin releasing peptide). How these neuronal clusters form functional units to govern various aspects of rhythmic behavior is poorly understood. At a molecular level, biological clocks are represented by transcriptional-posttranslational feedback loops that induce circadian oscillations in the electrical activity of the SCN and hence correlate with behavioral circadian rhythms. In mammals, the sleep wake cycle can be accurately predicted by measuring electrical muscle and brain activity. To investigate the link between the electrical activity of heterogeneous neurons of the SCN and the sleep wake cycle, we optogenetically manipulated AVP neurons in vivo with SSFO (stabilized step function opsin) and simultaneously recorded an electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely moving mice. SSFO-mediated stimulation of AVP positive neurons in the anterior hypothalamus increased the total amount of wakefulness during the hour of stimulation. Interestingly, this effect led to a rebound in sleep in the hour after stimulation. Markov chain sleep-stage transition analysis showed that the depolarization of AVP neurons through SSFO promotes the transition from all states to wakefulness. After the end of stimulation, a compensatory increase in transitions to NREM sleep was observed. Ex vivo, SSFO activation in AVP neurons causes depolarization and modifies the activity of AVP neurons. Therefore, the results of this thesis project suggest an essential role of AVP neurons as mediators between circadian rhythmicity and sleep-wake behaviour. N2 - Die zentrale Uhr von Säugetieren, die sich im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) des vorderen Hypothalamus befindet, steuert zirkadiane Verhaltensrhythmen wie den Schlaf-Wach-Rhythmus. Sie besteht aus etwa 20.000 heterogenen Neuronen, die nach ihrer Expression von Neuropeptiden klassifiziert werden können. Es gibt drei große Populationen: AVP-Neuronen, VIP-Neuronen und GRP-Neuronen. Wie diese Neuronengruppen funktionelle Einheiten bilden, um verschiedene Aspekte des rhythmischen Verhaltens zu steuern, ist nur unzureichend bekannt. Bei Säugetieren kann der Schlaf-Wach-Zyklus durch Messung der elektrischen Muskel- und Gehirnaktivität genau vorhergesagt werden. Um den Zusammenhang zwischen der elektrischen Aktivität heterogener Neuronen des SCN und dem Schlaf-Wach-Zyklus zu untersuchen, wurden AVP-Neuronen in vivo mit SSFO optogenetisch manipuliert und gleichzeitig ein Elektroenzephalogramm (EEG) und ein Elektromyogramm (EMG) bei frei beweglichen Mäusen aufgezeichnet. Die SSFO-vermittelte Stimulation von AVP-positiven Neuronen im vorderen Hypothalamus erhöhte den Gesamtanteil der Wachheit während der Stunde der Stimulation. Interessanterweise führte dieser Effekt zu einem Ansteigen des Schlafes in der Stunde nach der Stimulation. Eine Markov-Ketten-Analyse der Schlafphasenübergänge zeigte, dass die Depolarisierung der AVP-Neuronen durch SSFO den Übergang von allen Zuständen zum Wachsein fördert. Nach dem Ende der Stimulation wurde ein kompensatorischer Anstieg der Schlafphasenübergänge zum NREM-Schlaf beobachtet. Ex vivo verursachte die SSFO-Aktivierung in AVP-Neuronen eine Depolarisation und veränderte die Aktivität der AVP-Neuronen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit könnten auf die Rolle der AVP-Neuronen als Vermittler zwischen zirkadianer Rhythmik und Schlaf-Wach-Verhalten hinweisen. KW - Schlaf KW - Tagesrhythmus KW - Hypothalamus KW - Optogenetik KW - Sleep KW - Hypothalamus KW - Circadian KW - Optogenetics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-315492 ER -