TY  - THES
A1  - Hirschbeck, Maria Wenefriede
T1  - Structure-based drug design on the enoyl-ACP reductases of Yersinia pestis and Burkholderia pseudomallei
T1  - Struktur-basiertes Wirkstoffdesign an Enoyl-ACP Reductase von Yersinia pestis und Burkholderia pseudomallei
N2  - Spreading drug resistances among Gram-negative pathogens and the paucity of new agents on the antibacterial drug market against these tenacious bacteria create a pressing need for the development of new antibiotics. The bacterial fatty acid biosynthesis pathway FAS-II, especially the enoyl-ACP reductase catalyzing the last step of the elongation cycle, is an established drug target against tuberculosis but has not been extensively exploited for drug design against other bacterial pathogens. In this thesis the enoyl-ACP reductases of the Gram-negative biothreat organisms Burkholderia pseudomallei and Yersinia pestis were targeted in a structure-based drug design approach. The structure of the most recently identified enoyl-ACP isoenzyme FabV was characterized by X-ray crystallography and could be determined in three different states. FabV from B. pseudomallei was obtained in the apo-form of the enzyme, whereas FabV from Y. pestis was characterized in a binary complex with the cofactor NADH as well as in a ternary complex with NADH and the triclosan-based 2-pyridone inhibitors PT172 and PT173. Analysis of the FabV structure revealed the typical fold of the short chain dehydrogenase/reductase superfamily with the NADH-binding Rossmann fold and a substrate-binding pocket with a conserved active site geometry compared to the related isoenzyme FabI. Additional structural elements of FabV are located around the active site. The monomeric form of the enzyme is thereby stabilized and the substrate-binding loop is kept in a closed, helical conformation. The ternary complexes of FabV exhibited a similar inhibitor-binding mode as observed for triclosan inhibition in FabI and point to a potential substrate-binding mechanism. B. pseudomallei possesses FabI as an additional enoyl-ACP reductase isoenzyme, which was structurally characterized in the apo form and in ternary complexes with NAD+ and the diphenyl ether inhibitors triclosan, PT02, PT12 or PT404 as well as the 4-pyridone inhibitor PT155. The structural data of the ternary enoyl-ACP reductases complexes of B. pseudomallei and Y. pestis hold the promise for the possibility to develop antibacterials targeting FabV or even both isoenzymes, FabI and FabV, based on the triclosan scaffold.
N2  - Die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen in Gram-negativen Pathogenen sowie der Mangel neuer Medikamente auf dem Arzneimittelmarkt gegen diese hartnäckigen Bakterien weist einen dringenden Bedarf an neuen Antibiotika auf. Die bakterielle Fettsäurebiosynthese (FAS-II), speziell die Enoyl-ACP-Reduktase, welche den finalen Schritt des Elongationszyklus katalysiert, ist ein etablierter Angriffspunkt in der Tuberkulosetherapie. Sie wurde jedoch bisher noch nicht für die gezielte Wirkstoffentwicklung gegen andere bakterielle Krankheitserreger genutzt. In dieser Dissertation waren die Enoyl-ACP Reduktasen aus Burkholderia pseudomallei und Yersinia pestis Gegenstand des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Struktur des zuletzt gefundenen Isoenzyms der Enoyl-ACP-Reduktase, FabV, wurde röntgenstrukturanalytisch charakterisiert und konnte in drei verschiedenen Zuständen bestimmt werden. Die Struktur des FabV Proteins aus B. pseudomallei wurde in der Apo-Form gelöst, während FabV aus Y. pestis in binären und ternären Komplexen mit NADH bzw. NADH und einem Triclosan-basierten 2-Pyridon-Inhibitor, PT172 bzw. PT173 charakterisiert wurde. FabV weist die typische Struktur eines Mitglieds der Short-Chain-Dehydrogenase/Reduktase Superfamilie mit einer NADH-bindenden Rossmann-Faltung und einer Substratbindetasche auf mit einer, im Vergleich zu dem verwandten Isoenzym FabI, konservierte Geometrie des aktiven Zentrums. Zusätzliche strukturelle Elemente sind um das aktive Zentrum gefaltet und stabilisieren damit das Enzym in seiner monomeren Form. Darüber hinaus halten sie den Substratbindeloop in einer geschlossenen helikalen Gestalt. Die ternären FabV Komplexe zeigen Übereinstimmungen mit dem bekannten Bindungsmechanismus des Inhibitors Triclosan in FabI und deuten auf einen möglichen Substratbindungsmechanismus hin. B. pseudomallei besitzt FabI als zusätzliches Isoenzym der Enoyl-ACP-Reduktasen. Dieses Isoenzym wurde in der Apo-Form und in ternären Komplexen mit NAD+ und den Diphenylether-Inhibitoren Triclosan, PT02, PT12 und PT404 sowie dem 4-Pyridon-Inhibitor PT155 strukturell charakterisiert. Die strukturellen Daten der ternären Enoyl-ACP-Reduktase Komplexe von B. pseudomallei und Y. pestis stellen die Möglichkeit in Aussicht Antibiotika zu entwickeln, welche FabV oder auch beide Isoenzyme, FabI und FabV, inhibieren.
KW  - Yersinia
KW  - Burkholderia
KW  - Arzneimitteldesign
KW  - Fettsäurestoffwechsel
KW  - Struktur-basiertes Wirkstoff Design
KW  - Fettsäurebiosynthese
KW  - Triclosan
KW  - FabI
KW  - FabV
KW  - Yersinia pestis
KW  - Burkholderia pseudomallei
KW  - FAS-II
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70869
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nono, Justin
T1  - Immunomodulation through Excretory/Secretory Products of the parasitic Helminth Echinococcus multilocularis
T1  - Immunmodulation durch Exkretorisch/Sekretorischen Produkten der parasitären Helminthen Echinococcus multilocularis
N2  - Die Alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Zoonose, die durch das Metazestoden-Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis ausgelöst wird. Nach Eintritt des Parasiten in den Zwischenwirt wird zunächst eine potentiell anti-parasitische, Th1-dominierte Immunantwort ausgelöst, welche anschließend in der chronischen Phase graduell durch eine permissive, Th2-dominierte Antwort ersetzt wird. Als Ergebnis einer zugrunde liegenden Immunmodulation durch den Parasiten können Echinococcus-Larven für Jahre bis Jahrzehnte im Wirt persistieren und verhalten sich ähnlich einem perfekt transplantierten Organ. Über die molekulare Basis der Immunmodulation durch den Parasiten ist derzeit wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden geeignete Kultursysteme für verschiedene E. multilocularis Larvenstadien verwendet, um den Einfluss exkretorisch/sekretorischer Metaboliten (E/S-Produkte) auf Wirts-Immuneffektor-Zellen zu studieren. E/S-Produkte kultivierter Larven, die die frühe (Primärzellen) und chronische (Metazestode) Phase der Infektion repräsentieren induzierten Apoptose und tolerogene Eigenschaften in Dendritischen Zellen (DC) des Wirts, während solche von Kontroll-Larven (Protoskolizes) keine derartigen Effekte zeigten. Dies zeigt, dass die frühen infektiösen Stadien von E. multilocularis in DC ein tolerierendes Milieu erzeugen, welches sehr wahrscheinlich die initiale Etablierung des Parasiten in einer Phase begünstigt, in der er höchst sensitiv gegenüber Wirtsangriffen ist. Interessanterweise förderten E/S-Produkte des Metazestoden in vitro die Konversion von CD4+ T-Zellen in Foxp3+, regulatorische T-Zellen (Treg) während E/S-Produkte von Primärzellen oder Protoskolizes dies nicht vermochten. Da Foxp3+ Tregs generell als immunosuppressorisch bekannt sind, deuten diese Daten an, dass der Metazestode aktiv eine Induktion von Tregs herbeiführt, um eine permissive Immunsuppression während einer Infektion zu erreichen. Eine substantielle Zunahme von Anzahl und Frequenz Foxp3+ Tregs konnte zudem in Peritoneal-Exsudaten von Mäuuen nach intraperitonealer Injektion von Parasitengewebe gemessen werden, was anzeigt, dass eine Expansion von Foxp3+ Tregs auch während der in vivo Infektion von Bedeutung ist. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit ein Activin-Orthologes des Parasiten, EmACT, identifiziert werden, weleches vom Metazestoden sekretiert wird und ähnlich wie humanes Activin in der Lage ist, eine TGF-β-abhängige Expansion von Tregs in vitro zu induzieren. Dies zeigt an, dass E. multilocularis evolutionsgeschichtlich konservierte Zytokine nutzt, um aktiv die Wirts-Immunantwort zu beeinflussen. Zusammenfassend deuten die gewonnenen Daten auf eine wichtige Rolle Foxp3+ Tregs, welche u.a. durch EmACT induziert werden, im immunologischen geschehen der AE hin. Ein weiterer Parasiten-Faktor, EmTIP, mit signifikanten Homologien zum T-cell Immunomodulatory Protein (TIP) des Menschen wurde in dieser Arbeit näher charakterisiert. EmTIP konnte in der E/S-Fraktion von Primärzellen nachgewiesen werden und induzierte die Freisetzung von IFN-γ in CD4+ T-Helferzellen. Durch Zugabe von anti-EmTIP-Antikörpern konnte zudem die Entwicklung des Parasiten zum Metazestoden in vitro gehemmt werden. EmTIP dürfte daher einerseits bei der frühen Parasiten-Entwicklung im Zwischenwirt eine Rolle spielen und könnte im Zuge dessen auch die Ausprägung der frühen, Th-1-dominierten Immunantwort während der AE begünstigen. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei E. multilocularis E/S-Faktoren identifiziert, EmACT und EmTIP, die ein hohes immunmodulatorisches Potential besitzen. Die hier vorgestellten Daten liefern neue, fundamentale Einsichten in die molekularen Mechanismen der Parasiten-induzierten Immunmodulation bei der AE und sind hoch relevant für die Entwicklung anti-parasitischer Immuntherapien.
N2  - Alveolar echinococcosis (AE) is a severe and life-threatening disease caused by the metacestode larva of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis. Parasite entry into the host evokes an early and potentially parasiticidal Th1 immune response that is gradually replaced by a permissive Th2 response. An immunoregulatory environment has also been reported in the host as the disease progresses. As a result of immunomodulation, E. multilocularis larvae persist in the host for decades without being expelled, and thus almost act like a perfect transplant. Very little is currently known on the molecular basis of the host immunomodulation by E. multilocularis. In this work, in vitro cultivation systems were used to assess the influence of metabolites released by the parasite larvae (E/S products) on host immune effector cells. E/S products of cultivated larvae that respresent the early (primary cells) and chronic (metacestode vesicles) phase of AE induced apoptosis and tolerogenic properties (poor responsiveness to LPS stimulation) in host dendritic cells (DC) whereas those of control larvae (protoscoleces) failed to do so. These findings show that the early infective stage of E. multilocularis induces tolerogenicity in host DC, which is most probably important for generating an immunosuppressive environment at an infection phase in which the parasite is highly vulnerable to host attacks. Interestingly, metacestode E/S products promoted the conversion of naïve CD4+ T-cells into Foxp3+ regulatory T-cells in vitro, whereas primary cell and protoscolex E/S products failed to do it. Since Foxp3+ regulatory T-cells are generally known to mediate immunosuppression, the present finding indicates that Foxp3+ regulatory T-cells, expanded by E/S products of the metacestode larva, could play a role in the parasite-driven immunomodulation of the host observed during AE. Furthermore, a substantial increase in number and frequency of suppressive Foxp3+ regulatory T-cells could be observed within peritoneal exudates of mice following intraperitoneal injection of E. multilocularis metacestodes, indicating that Foxp3+ regulatory T-cells could also play an important role in E. multilocularis-driven immunomodulation in vivo. Interestingly, a parasite activin ortholog, EmACT, secreted by metacestodes, was shown to expand host regulatory T-cells in a TGF-β-dependent manner, similarly to mammalian activin A. This observation indicated that E. multilocularis utilizes evolutionarily conserved TGF-β superfamily ligands, like EmACT, to expand host regulatory T-cells. Taken together, the present findings suggest EmACT, a parasite activin secreted by the metacestode and capable of expanding host regulatory T-cells, as an important player in the host immunomodulation by E. multilocularis larvae. Another parasite factor EmTIP, homologous to mammalian T-cell immunomodulatory protein (TIP) was characterized in this work. EmTIP could be detected in the secretions of the parasite primary cells and localized to the intercellular space within the parasite larvae. EmTIP blockade inhibited the proliferation of E. multilocularis primary cells and the formation of metacestode vesicles indicating a major role for parasite development. Furthermore, EmTIP evoked a strong release of IFN-γ by CD4+ T-cells hence suggesting that the secretion of this factor as a result of its role in parasite development could “secondarily” induce a potentially protective Th1 response. In conclusion, this work identified two molecules, EmACT and EmTIP, with high immunomodulatory potential that are released by E. multilocularis larvae. The data presented do provide insights into the mechanisms of parasite-driven host immunomodulation during AE that are highly relevant for the development of anti-parasitic immune therapies.
KW  - Immunmodulation
KW  - Fuchsbandwurm
KW  - Regulatorischer T-Lymphozyt
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Immunomodulation
KW  - Helminths
KW  - Tapeworm
KW  - Echinococcus
KW  - Regulatory T-cell
KW  - Dendritic cell
KW  - Würmer
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85449
ER  - 
TY  - THES
A1  - Förster, Sabine
T1  - Nuclear Hormone Receptors and Fibroblast Growth Factor Receptor Signaling in Echinococcus multilocularis
T1  - Signalwege in Echinococcus multilocularis am Beispiel der Nukleären Hormonrezeptoren und des Fibroblast Growth Factor Rezeptors
N2  - Parasitic helminths share a large degree of common genetic heritage with their various hosts. This includes cell-cell-communication mechanisms mediated by small peptide cytokines and lipophilic/steroid hormones. These cytokines are candidate molecules for host-parasite cross-communication in helminth diseases. In this work the function of two evolutionary conserved signaling pathways in the model cestode Echinococcus multilocularis has been studied. First, signaling mechanisms mediated through fibroblast growth factors (FGF) and their cognate receptors (FGFR) which influence a multitude of biological functions, like homeostasis and differentiation, were studied. I herein investigated the role of EmFR which is the only FGFR homolog in E. multilocularis. Functional analyses using the Xenopus oocyte expression system clearly indicate that EmFR can sense both acidic and basic FGF of human origin, resulting in an activation of the EmFR tyrosine kinase domain. In vitro experiments demonstrate that mammalian FGF significantly stimulates proliferation and development of E. multilocularis metacestode vesicles and primary cells. Furthermore, DNA synthesis and the parasite’s Erk-like MAPK cascade module was stimulated in the presence of exogenously added mammalian FGF. By using the FGFR inhibitor BIBF1120 the activity of EmFR in the Xenopus oocyte system was effectively blocked. Addition of BIBF1120 to in vitro cultivated Echinococcus larval material led to detrimental effects concerning the generation of metacestode vesicles from parasite stem cells, the proliferation and survival of metacestode vesicles, and the dedifferentiation of protoscoleces towards the metacestode. In conclusion, these data demonstrate the presence of a functional EmFR-mediated signaling pathway in E. multilocularis that is able to interact with host-derived cytokines and that plays an important role in larval parasite development. Secondly, the role of nuclear hormone receptor (NHR) signaling was addressed. Lipophilic and steroid hormone signaling contributes to the regulation of metazoan development. By means of in silico analyses I demonstrate that E. multilocularis expresses a set of 17 NHRs that broadly overlaps with that of the related flatworms Schistosoma mansoni and S. japonicum, but also contains several NHR encoding genes that are unique to this parasite. One of these, EmNHR1, is homolog to the DAF-12/HR-96 subfamily of NHRs which regulate cholesterol homeostasis in metazoans. Modified yeast-two hybrid analyses revealed that host serum contains a ligand which induces homodimerization of the EmNHR1 ligand-binding domain. Also, a HNF4-like homolog, EmHNF4, was characterized. Human HNF4 plays an important role in liver development. RT-PCR experiments showed that both isoforms of the EmHNF4 encoding gene are expressed stage-dependently suggesting distinct functions of the two isoforms in the parasite. Moreover, specific regulatory mechanisms on the convergence of NHR signaling and TGF-β/BMP signaling pathways in E. multilocularis have been identified. On the one hand, EmNHR1 directly interacted with the EmSmadC and on the other hand EmHNF4b interacted with EmSmadD, EmSmadE which are all downstream signaling components of the TGF-β/BMP signaling pathway. This suggests cross-communication in order to regulate target gene expression. With these results, further studies on the role of NHR signaling in the cestode will be facilitated. Also, the first serum-free in vitro cultivation system for E. multilocularis was established using PanserinTM401 as medium. Serum-free co-cultivation with RH-feeder cells and an axenic cultivation method have been established. With the help of this serum-free cultivation system investigations on the role of specific peptide hormones, like FGFs, or lipophilic/steroid hormones, like cholesterol, for the development of helminths will be much easier.
N2  - Parasitäre Würmer weisen eine große genetische Verwandtschaft mit ihren Wirten auf. Diese schließt auch Zell-Zell-Kommunikationsmechanismen ein, die sowohl durch Peptidhormone als auch durch lipophile/steroidale Hormone vermittelt werden. Man vermutet, dass diese Stoffe eine wichtige Rolle bei der Wirt-Parasiten-Kreuzkommunikation spielen. Deshalb untersuchte diese Arbeit die Funktion von zwei konservierten Signalwegen im Modellorganismus Echinococcus multilocularis. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit den Fibroblast Growth Factors (FGF). Diese steuern durch die Bindung an spezifische FGF-Rezeptoren (FGFR) eine Vielzahl von biologischen Funktionen, wie beispielsweise Homöostase- und Differenzierungsprozesse. Zunächst wurde EmFR, das einzige FGFR-Homolog im Fuchsbandwurm in Xenopus Oozyten heterolog exprimiert. Dabei wurde nachgewiesen, dass der Rezeptor sowohl acidic als auch basic FGF erkennen kann und dies zur Aktivierung der Tyrosinkinasedomäne führt. Außerdem förderte im in vitro Experiment die exogene Zugabe dieser Wirtsfaktoren die Proliferation und Entwicklung von Metacestodenvesikeln und Primärzellen. Darüber hinaus wurden die DNA-Synthese und die Erk-MAPK-Kaskade des Parasiten stimuliert. Im Gegensatz dazu konnte durch die Hinzugabe des FGFR-Inhibitor BIBF1120 die Aktivität des Rezeptors im Xenopus Oozytensystem erfolgreich blockieret werden. Durch den Inhibitor wurde die Regeneration von Metacestodenvesikeln aus Stammzellen, die Proliferation und das Überleben von Metacestodenvesikeln verhindert und eine Dedifferenzierung von Protoskolizes verursacht. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass E. multilocularis einen funktionellen durch EmFR-vermittelten Signalweg besitzt, welcher in der Lage ist, mit Wirtszytokinen zu interagieren und eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Echinococcus Larvenstadien spielt. Außerdem wurde die Bedeutung der Nukleären Hormon Rezeptoren (NHR) für den Parasiten untersucht. Lipophile und steroidale Hormone regulieren viele Entwicklungsprozesse in Metazoen. Mittels in silico Analyse konnten 17 Rezeptoren der NHR-Familie in E. multilocularis identifiziert werden, die größtenteils mit dem NHR Repertoire von Schistosoma mansoni und S. japonicum übereinstimmen. Allerdings wurden auch Rezeptoren identifiziert, die einzigartig für E. multilocularis sind. Einer dieser Rezeptoren, EmNHR1, ist homolog zur DAF-12/HR-96 Familie, die den Cholesterinstoffwechsel in Metazoen reguliert. Yeast-Two Hybrid Experimente zeigten, dass Wirtsserum den putativen Liganden von EmNHR1 enthält, da dessen Zugabe zur Homodimerisierung der EmNHR1-Liganden-bindungsdomäne führte. Außerdem wurde mit EmHNF4 ein weiterer Rezeptor charakterisiert, dessen humanes Homolog die Entwicklung der Leber beeinflusst. RT-PCR-Experimente zeigten, dass die zwei entdeckten Isoformen von EmHNF4 stadienspezifisch exprimiert werden, was auf mögliche Funktionsunterschiede deutet. Darüber hinaus wurde sowohl für EmNHR1, als auch für EmHNF4 beobachtet, dass die DNA-Bindungsdomänen mit Komponenten des TGF-β/BMP-Signalwegs direkte Proteininteraktionen eingehen. Während EmNHR1 mit EmSmadC interagiert, zeigte EmHNF4b eine Reaktion mit EmSmadD und EmSmadE, was auf eine Kreuzkommunikation zwischen beiden Signalwegen deutet. Diese Ergebnisse werden zukünftige Studien bezüglich der Funktion von NHR-Signalwegen in Zestoden deutlich erleichtern. Weiterhin wurde in dieser Arbeit das erste serum-freie in vitro Kultivierungssystem für E. multilocularis etabliert. PanserinTM401 diente als Medium sowohl für die Kultur mit Fütterzellen als auch für eine axenische Kulturmethode. Mit Hilfe dieses Systems können in Zukunft Untersuchungen über die Rolle von Peptidhormonen wie FGF, oder lipophilen bzw. steroidalen Substanzen, wie Cholesterin, bei der Parasitenentwicklung besser untersucht werden.
KW  - Signaltransduktion
KW  - Fuchsbandwurm
KW  - Echinococcus multilocularis
KW  - Alveoläre Echinokokkose
KW  - FGF
KW  - Nukleäre Hormonrezeptoren
KW  - Echinococcus multilocularis
KW  - Alveolar Echinococcosis
KW  - FGF Signaling
KW  - Hormone Receptor Signaling
KW  - Fibroblastenwachstumsfaktor
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85832
ER  - 
TY  - THES
A1  - Thakur, Chitra
T1  - Lineage tracing of metastasis in a mouse model for Non-small cell lung cancer (NSCLC)
T1  - Untersuchung metastatischer Prozesse durchgenetische Zellmarkierung in einem Mausmodelldes nichtkleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC)
N2  - Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the deadliest form of lung cancer and has a poor prognosis due to its high rate of metastasis. Notably, metastasis is one of the leading causes of death among cancer patients. Despite the clinical importance, the cellular and molecular mechanisms that govern the initiation, establishment and progression of metastasis remain unclear. Moreover, knowledge gained on metastatic process was largely based on cultured or in vitro manipulated cells that were reintroduced into immune-compromised recipient mice. In the present study, a spontaneous metastasis mouse model for NSCLC was generated with a heritable fluorescent tag (DsRed) driven by CAG (combination of cytomegalovirus early enhancing element and chicken beta actin) promoter in alveolar type II cells (SpC-rtTA/TetO-Cre/LSL-DsRed). This approach is essential, keeping in mind the reprogramming nature of Myc oncogene (Rapp et al, 2009). Such genetic lineage tracing approach not only allowed us to monitor molecular and cellular changes during development of primary tumor but also led us to identify the different stages of secondary tumor development in distant organs. Upon combined expression of oncogenic C Raf-BXB and c-Myc (MYC-BXB-DsRed) in lung alveolar type II epithelial cells, macroscopic lung tumors arose comprising of both cuboidal and columnal cellular features. C Raf-BXB induced tumors (CRAF-DsRed) exhibit cuboidal morphology and is non-metastatic whereas Myc-BXB induced lung tumors (Myc-BXB-DsRed) present cuboidal-columnar cellular features and is able to undergo metastasis mainly in liver. Surprisingly, cystic lesions which were negative for SpC (Surfactant protein C) and CCSP (Clara cell secretory protein), strongly expressed DsRed proteins indicating its origin from lung alveolar type II cells. Moreover, early lung progenitor markers such as GATA4 (GATA-binding protein 4) and TTF1 (Thyroid Transcription Factor 1) were still expressed in these early cystic lesions suggesting metastasis as a faulty recapitulation of ontogeny (Rapp et al, 2008). Interestingly, mixed cystic lesions and metastatic tumors contained DsRed and SpC positive cells. These results demonstrate secondary tumor progression from cystic, mixed cystic to malignant transformation. Our results shed tremendous light on reprogramming of metastasizing cells during secondary tumor development. Moreover, such fluorescent tagged metastatic mice model can also be used to track the migration ability of metastatic cancer cell to different organs and its potential to differentiate into other cell types such as blood vessel or stromal cell within the primary tumor.
N2  - Das nichtkleinzellige Lungenkarzinom (‚non-small cell lung cancer‘, NSCLC) ist die tödlichste Form des Lungenkrebses mit schlechter Prognose aufgrund hoher Metastasierungsneigung. Metastasierung ist eine der häufigsten Todesursachen bei Krebspatienten. Trotz ihrer klinischen Bedeutung sind die zellulären und molekularen Mechanismen der Entstehung, Etablierung und Progression von Metastasen weiterhin unklar. Darüberhinaus basiert das bisherige Wissen über den Metastasierungsprozess überwiegend auf Zellen, die entweder in vitro kultiviert oder manipuliert und danach in immundefiziente Mäuse rückübertragen wurden.In der vorliegenden Studie wurde ein Mausmodell mit erblichem Fluoreszenzmarker (DsRed) zur spontanen Metastasierung bei NSCLC entwickelt, der durch den CAG-Promotor (‚combination of cytomegalovirus early enhancing element and chicken beta actin‘) in alveolären Typ II-Zellen (SpC-rtTA/TetO-Cre/LSL-DsRed) exprimiert wird. Aufgrund des Reprogrammierungscharakters des Myc-Onkogens war dieser Ansatz essentiell (Rapp et al, 2009). Die Markierung der Zellpopulation auf genetischem Weg erlaubte uns zum einen, die molekularen und zellulären Veränderungen während der Bildung des Primärtumors zu verfolgen, zum anderen konnte so die Entwicklung von Sekundärtumoren unterschiedlicher Stadien in entfernten Organen identifiziert werden. Bei kombinierter Expression von onkogenem C Raf-BXB und c-Myc (MYC-BXB-DsRed) in Lungenalveolar-Epithelzellen vom Typ II entstanden makroskopische Tumore in der Lunge, die auf zellulärer Ebene sowohl kuboidalen als auch kolumnaren Charakter aufwiesen und Metastasen, vorwiegend in der Leber, ausbildeten. Durch C Raf-BXB (CRAF-DsRed) induzierte Tumore erschienen morphologisch als kuboidal ohne Metastasierungsneigung. Überraschenderweise exprimierten zystische Läsionen in der Leber, obwohl negativ für SpC (‚surfactant protein C‘) und CCSP (‚Clara cell secretory protein‘), als Kennzeichen für deren Ursprung aus Lungenalveolarzellen Typ II stark das DsRed-Protein. Darüberhinaus sind in den frühen zystischen Läsionen Marker für frühe Lungenvorläuferzellen wie GATA4 (‚GATA-binding protein 4‘) und TTF1 (‚thyroid transcription factor 1‘) weiterhin exprimiert, was auf den Metastasierungsprozess als gestörte Rekapitulation der Ontogenese hindeutet (Rapp et al, 2008). Metastatische Tumore und Mischformen zu zystischen Läsionen enthielten DsRed- und SpC-positive Zellpopulationen. Diese Ergebnisse weisen in Sekundärtumoren den Übergang von zystischer Läsion zur Mischform mit zystischem Anteil und zur malignen Transformation nach.Unsere Resultate werfen ein neues Licht auf Reprogrammierungsprozesse metastasierender Zellen bei der Bildung von Sekundärtumoren. Das vorgestellte fluoreszenzmarkierte und metastasenbildende Mausmodell kann zum einen zur Untersuchung der Migrationsfähigkeit metastasierender Krebszellen in unterschiedliche Organe verwendet werden. Darüberhinaus ermöglicht dieses Mausmodell die Untersuchung des Differenzierungspotenzials markierter Zellen in andere Zelltypen wie Blutgefäße oder Stromazellen im Primärtumor.
KW  - Lungenkrebs
KW  - Metastase
KW  - Lungenkrebs
KW  - Metastasierung
KW  - Lung Cancer metastasis
KW  - Maus
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85420
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nowotny, Boris
T1  - Etablierung von zellulären Testsystemen für die Identifizierung von neuartigen Inhibitoren des HIV-1 Vif-induzierten APOBEC3G-Abbaus
T1  - Establishment of cellular test systems for the identification of novel inhibitors of the HIV-1 Vif-induced APOBEC3G- degradation
N2  - Als einer der ersten gegen HIV gerichteten Restriktionsfaktoren konnte die Cytidindeaminase APOBEC3G isoliert werden. Dieses zelluläre Enzym hemmt äußerst effizient die Replikation von HIV. Weiterführende Untersuchungen konnten demonstrieren, dass die Hemmung der Virusreplikation hauptsächlich auf einer Deaminase-katalysierten G zu A-Hypermutation des viralen Genoms während der Reversen Transkription beruht. Als Gegenstrategie zur antiretroviralen Wirkung von A3G kodiert HIV-1 das Protein Vif (virion infectivity factor), welches durch eine direkte Wechselwirkung den Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau von A3G bewirkt. Vor diesem Hintergrund wird der Inhibition des Vif induzierten A3G- Abbaus großes Potential als neuartiges Wirkstoffziel bei der Behandlung von HIV Infektionen vorhergesagt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb in der Etablierung von zellulären Screening-Assays für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus. Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt vier fluoreszenzbasierte zelluläre Assays erfolgreich entwickelt und als Screeningsysteme für die Wirkstoffsuche etabliert werden. Drei dieser Assays basieren auf stabilen Zelllinien, von denen eine Vif und ein mit EYFP markiertes A3G ko-exprimiert. Dieser sogenannte A3G-Abbauassay stellt den primären Assay für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus dar und wird durch zwei weitere Zelllinien-basierte Assays ergänzt. Diese sekundäre Assays erlauben die Detektion von Substanzen, die falsch-positive oder falsch-negative Signale im A3G-Abbauassays generieren. Zusammengenommen ermöglichen die drei Assays die präzise Identifizierung von Inhibitoren, die spezifisch auf den A3G-Abbau wirken und stellen damit eine wesentliche Verbesserung bereits existierender Screeningsysteme dar. Weiterhin wurde ein auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) basierendes Testsystem entwickelt. Besagtes System misst die direkte Interaktion zwischen Vif und ElonginC in lebenden Zellen und repräsentiert damit ein weiteres Testsystem für die Identifizierung von Inhibitoren der Vif induzierten A3G-Degradation. Den zweiten Teil dieser Arbeit umfasste die Analyse von Derivaten des Vif Antagonisten RN-18 und neu entwickelten niedermolekularen Inhibitoren der Vif-ElonginC- Interaktion. Als ein wichtiges Ergebnis der Derivat-Analyse ergab sich, dass RN-18 zytotoxisch wirkt und im hier etablierten A3G-Abbauassay ein falsch-positives Signal generiert. Unter den analysierten Vif-ElonginC-Interaktionsinhibitoren fand sich eine Verbindung, die in einem initialen Screening, unter Verwendung des A3G-Abbauassays, eine deutliche Inhibition der Vif induzierten A3G-Degradation bewirkte. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Promotionsprojektes erfolgreich mehrere Screeningsysteme für die Identifizierung von spezifischen Inhibitoren des A3G-Abbaus etabliert werden. Diese Systeme werden zukünftig dazu beitragen, dass Auffinden von neuartigen Therapeutika für die Behandlung von HIV-Infektionen zu beschleunigen.
N2  - One of the first cellular HIV restriction factors isolated was the cytosine deaminase APOBEC3G. This cellular enzyme was shown to efficiently inhibit the replication of HIV and other viruses. Further research revealed that restriction of the viral replication is primarily based on a deaminase-catalyzed G to A hypermutation of the viral genome during reverse transcription. As a mode of counteraction, the HIV-1 encoded accessory protein Vif (virion infectivity factor) binds to A3G leading to its ubiquitin-dependent proteasomal degradation. It has been hypothesized that inhibition of the A3G degradation rescues the antiviral properties of the APOBEC3 protein and thus represents an attractive target for novel antiretroviral drugs. Therefore, the goal of this study was to establish cellular screening assays for the identification of inhibitors of the Vif mediated A3G degradation. Four fluorescent based cellular assays have been established for the screening of small organic compounds. Three of these assays are based on stable cell lines, one of which co-expresses Vif and an EYFP tagged A3G protein. This so-called A3G degradation assay represents the primary assay for identification of degradation inhibitors and is complemented by two additional cell line based assays. These secondary assays enable the detection of compounds generating false-positive or false-negative signals in the A3G degradation assay. These systems allow the precise identification of true-positive A3G degradation inhibitors and thus representing a significant improvement of existing screening platforms. Furthermore, a cellular assay based on the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) was developed. The BiFC-assay measures the direct interaction between Vif and ElonginC in living cells and can be used as a new screening platform for identification of inhibitors targeting the Vif- ElonginC interaction, which is an essential step in the A3G degradation sequence. The aim of the second part of the project was the application of the established screening assays for testing of derivatives of the Vif antagonist RN-18 and rational designed inhibitors targeting the direct interaction between Vif and ElonginC. As a result of the compound testing it was shown, that RN-18 is cytotoxic and generates a false-positive signal in the A3G degradation assay. In case of the Vif-ElonginC interaction inhibitors one compound exhibited a strong inhibitory effect on A3G degradation in an initial screen. Taken together, screening assays for the precise identification of specific inhibitors of the A3G degradation were successfully established. These screening assays will accelerate the identification of novel anti-HIV agents.
KW  - Inhibitor
KW  - Screening
KW  - HIV
KW  - APOBEC3G
KW  - HIV-1 Vif
KW  - Inhibitor
KW  - Screening
KW  - APOBEC3G
KW  - HIV-1 Vif
KW  - Inhibitor
KW  - Screening
KW  - Restriktionsenzym
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70477
ER  - 
TY  - THES
A1  - Maric, Hans-Michael
T1  - Molecular Basis of the Multivalent Glycine and γ-Aminobutyric Acid Type A Receptor Anchoring
T1  - Molekulare Basis der Multivalenten Verankerung der Glycin und γ-Aminobuttersäure Typ A Rezeptoren
N2  - γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren vom Typ A (GABAARs) und Glyzin-Rezeptoren (GlyRs) sind die wichtigsten Vermittler der schnellen synaptischen Inhibition im zentralen Nervensystem. Von wesentlicher Bedeutung für ihre ordnungsgemäße Funktion in der inhibitorischen Signalübertragung ist ihre präzise Lokalisation und Konzentration innerhalb der neuronalen Oberflächenmembran. Diese Eigenschaften werden durch Gerüstproteine vermittelt, welche direkt an die großen intrazellulären Schleifen der Rezeptoren, sowie an Bausteine des neuronalen Zytoskeletts binden. In meiner Dissertation habe ich die molekularen Details mehrerer zugrunde liegenden Protein-Protein Wechselwirkungen untersucht. Im Speziellen habe ich die Interaktion ausgewählter GABAAR und GlyR Untereinheiten mit den Gerüstproteinen Gephyrin, Radixin und Collybistin analysiert. Ich habe kurze lineare Aminosäuren-Motive innerhalb der großen intrazellulären Schleifen der Rezeptoren identifiziert, welche die direkten und Untereinheit-spezifischen Interaktionen vermitteln. Die Quantifizierung der jeweiligen Bindungsstärke ergab, dass Gephyrins E-Domäne vor allem an die GABAAR α1 (Kd = 17 M) und α3 (Kd = 5 M) -Untereinheiten bindet, wohingegen die SH3-Domäne von Collybistin hauptsächlich mit der GABAAR α2-Untereinheit interagiert (Kd = 1 M). Demgegenüber bindet die FERM-Domäne von Radixin fest an die α5-Untereinheit des GABAAR (Kd = 8 µM). Weiterhin zeigt meine Arbeit, dass diese einfache Beziehung durch (i) fehlende oder (ii) überlappende Bindungsspezifitäten zwischen den Gerüstproteinen und den Rezeptor-Untereinheiten komplex reguliert wird. Ferner beschreibe ich hier, wie im Folgenden ausgeführt, die Möglichkeit einer (iii) negativen Modulation mittels posttranslationaler Modifikation, sowie einer Verstärkung der Bindung durch (iv) Aviditäts-Effekte. (i) Als erstes habe ich mit Hilfe biochemischer Methoden die Radixin-GABAAR α5 Interaktion im Detail untersucht. Meine Strukturanalyse und Kompetitionsstudien legen den Schluss nahe, dass Radixin die betreffende Rezeptor-Untereinheit mittels einer universellen Bindungstasche in der F3 Subdomäne innerhalb seiner FERM Domäne bindet. Diese Bindungsstelle wird durch zwei markante Strukturelemente gebildet: Einer α-Helix, die eine große hydrophobe Tasche bildet, welche eine Vielzahl unterschiedlicher hydrophober Reste in verschiedenen Konformationen akzeptiert, sowie ein β-Strang, der Peptidrückgrat-Interaktionen eingehen kann. Es überrascht nicht, dass eine Vielzahl an Studien die Beteiligung dieser Bindungsseite mit unterschiedlichen Liganden beschrieben hat. Diese Promiskuität unterstreicht die Bedeutung des Aktivierungsmechanismus der zuvor für die Radixin FERM GABAAR α5-Untereinheit beschrieben wurde und impliziert weitere Regulationsmechanismen, die eine koordinierte Interaktion in vivo ermöglichen. (ii) Weiterhin habe ich mich ausführlich der Analyse der Gephyrin-vermittelten GABAAR Clusterbildung gewidmet. Meine röntgenkristallographischen Studien und Bindungsstudien zeigen, dass Gephyrin mit den GABAAR α1, α2 und α3 Untereinheiten über eine universelle Bindungsstelle interagiert, welche auch die Wechselwirkungen mit der β-Untereinheit des GlyR vermittelt. Mittels Struktur-basierter Mutagenesestudien konnte ich die Schlüsselreste innerhalb von Gephyrin und der Rezeptor-Untereinheiten identifizieren, die einen entscheidenden Beitrag zur Gesamt-Bindungsstärke liefern. Insbesondere zwei konservierte aromatische Reste in der N-terminalen Hälfte der Rezeptorbindungsregion gehen entscheidende hydrophobe Wechselwirkungen mit Gephyrin ein. Dementsprechend konnte J. Mukherjee, ein Mitarbeiter in der Gruppe unseres Kooperationspartners Steven J. Moss, zeigen, dass der Austausch dieser Reste innerhalb der α2-Untereinheit des GABAAR ausreicht, um einen deutlichen Rückgang der Rezeptor Cluster-Anzahl und ihrer Größe in primären hippokampalen Neuronen zu verursachen. Die Ausweitung meiner Rezeptor-Interaktions-Studien auf Collybistin (CB) ergab, dass dieses Protein im Vergleich zu Gephyrin eine umgekehrte, aber dennoch überlappende Rezeptor-Untereinheiten-Präferenz aufweist. Die GABAAR α3-Untereinheit bindet ausschließlich an Gephyrin (Kd = 5 µM), während die GABAAR α1-Untereinheit zwar vor allem Gephyrin bindet (Kd = 17 µM), zusätzlich jedoch eine schwache Affinität (Kd ≈ 400 µM) für die SH3-Domäne von CB aufweist. Im Gegensatz dazu bindet die GABAAR α2-Untereinheit hochaffin an die SH3-Domäne von CB (Kd = 1 µM) und zeigt zusätzlich eine schwache Gephyrin Affinität (Kd ≈ 500 µM). Interessanterweise konnte ich Synergieeffekte zwischen der GABAAR α2-Untereinheit, Gephyrins E-Domäne und CBs SH3-Domäne ausschließen und statt dessen zeigen, dass diese Rezeptor-Untereinheit exklusiv entweder Gephyrin oder CB bindet. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Rolle von CB in der Rezeptor-Anhäufung allein durch die konkurrierenden Bindungs-Ereignisse seiner konstituierenden Domänen bestimmt wird. Die intramolekulare Assoziation zwischen der PH und der DH-Domäne mit der SH3-Domäne von CB konkurriert mit unterschiedlichen intermolekularen Wechselwirkungen von CB. Und zwar mit der GABAAR α2-Untereinheit-Bindung an die SH3-Domäne, mit der PIP2-Bindung an die PH-Domäne, sowie mit der Gephyrin-Bindung, welche vermutlich von der PH und DH-Domäne von CB vermittelt wird. (iii) Interessanterweise bestätigen frühere Studien, dass die Rezeptor-Motive, die ich hier identifiziert habe und welche direkt mit den Gerüst-Proteinen wechselwirken, in vivo posttranslational modifiziert vorliegen. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Gephyrin-Bindemotive der GABAAR α1-Untereinheit und GlyR β-Untereinheiten Ziele des ERK/MAPK und PKC-Phosphorylierungs-Weges sind, während das Radixin-Bindungs-Motiv innerhalb der GABAAR α5-Untereinheit ubiquitiniert vorliegt. In dieser Dissertation habe ich im Besonderen die ERK-Phosphorylierung von Thr348 in der GABAAR α1-Untereinheit untersucht. Tatsächlich konnten meine Bindungs-Assays eine starke Reduktion der direkten Gephyrin Bindungsstärke beim Einbringen eines phosphomimetischen Restes bestätigen. Darüber hinaus konnte J. Mukherjee eine signifikante Reduktion der Cluster-Anzahl und Größe beim Einführen der gleichen Mutation in die α1-Untereinheit beinhaltenden GABAARs in hippokampalen Neuronen beobachten. Der ERK/MAPK-Regulation-Weg ist daher ein aussichtsreicher Kandidat für die Regulation der GABAergen-Signalübertragung. (iv) In vivo bildet Gephyrin vermutlich durch Selbstorganisation seiner G (GephG) und E-Domänen (GephE) ein multivalentes Gerüst. Angesichts der multimeren Natur Gephyrins und der pentameren Rezeptorarchitektur habe ich die Möglichkeit von Aviditäts-Effekten im Prozess der synaptischen Neurotransmitter-Rezeptor-Anhäufung untersucht. Die Kristallstrukturen von GephE im Komplex mit ausgewählten Peptiden zeigen zwei Rezeptor-Bindungsstellen in räumlicher Nähe (15 Å). Auf der Basis dieser Information habe ich bivalente Peptide entworfen, welche beide Rezeptor-Bindungsstellen in Gephyrin simultan besetzen können und, wie erwartet, konnte ich mit Hilfe verschiedener biophysikalischen Methoden eine unübertroffen hohe, durch Avidität potenzierte, Gephyrin-Affinität nachweisen. Mir gelang es diesen Aviditäts-Effekt für einen schwachen Gephyrin Liganden, ein GABAAR-abgeleitetes Peptid, welcher nicht mit herkömmlichen monomeren Liganden untersucht werden konnte, nutzbar zu machen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass diese Verbindung gezielt die Rezeptor-Bindungsstelle in GephE besetzt und auf diese Weise hemmend auf Gephyrins Rezeptorbindungsaktivität wirkt. Eine weitere Entwicklung dieser Verbindung könnte die Möglichkeit eröffnen, spezifisch die Wirkung der Entkopplung der Gephyrin Rezeptor-Interaktion in der Zellkultur-Experimenten zu analysieren ohne dabei die Anzahl oder die Funktion der Proteine zu beeinträchtigen, was einen Nebeneffekt von konventionellen Methoden wie Gen „knock-out“, RNA-Interferenz oder den Einsatz von Antikörpern darstellt.
N2  - γ-Aminobutyric acid type A receptors (GABAARs) and glycine receptors (GlyRs) are the major mediators of fast synaptic inhibition in the central nervous system. For proper synaptic function their precise localization and exact concentration within the neuronal surface membrane is essential. These properties are mediated by scaffolding proteins which directly contact the large intracellular loops of the receptors and tether them to cytoskeletal elements of the neuronal cells. In my thesis I deciphered the molecular details of several underlying protein-protein interactions, namely the interaction of a subset of GABAAR and GlyR subunits with the scaffolding proteins gephyrin, radixin and collybistin. I determined short linear motifs within the large intracellular loops of the receptors that directly engage in subunit specific scaffold protein interactions. My quantitative binding studies revealed that gephyrins E domain primarily recognizes the GABAAR α1 (Kd = 17 M) and α3 (Kd = 5 M) subunits, in contrast, the SH3 domain of collybistin mainly interacts with the GABAAR α2 subunit (Kd = 1 µM), while the FERM domain of radixin tightly binds to the GABAAR α5 subunit (Kd = 8 µM). My work additionally demonstrated that this simple relationship is complicated by (i) missing or (ii) overlapping binding specificities between the scaffold proteins and the receptor subunits. Moreover, this thesis addressed the possibility of (iii) posttranslational negative regulation as well as amplification generated by (iv) avidity effects as summarized below. (i) First, using biochemical methods I mapped the radixin-GABAAR α5 interaction in detail. My structural analysis and competition assays suggest that radixin mediates the receptor subunit binding via a universal binding site within the F3 subdomain of its FERM domain. This binding site is formed by an α-helix that offers a large hydrophobic pocket, which accepts a variety of different hydrophobic residues adopting different conformations, and a β-strand that readily engages in peptide backbone interactions. Not surprisingly, this binding site has been implicated in a wide variety of different scaffold interactions, thus emphasizing the importance of the essential FERM activation mechanism described earlier and suggesting additional pathways to allow tight regulation of this interaction. (ii) Next, I analyzed in detail the process of gephyrin-mediated GABAAR clustering. My X-ray crystallographic studies and binding assays revealed that gephyrin mediates binding of the GABAAR α1, α2 and α3 subunit via a universal binding site that also mediates the interactions with the GlyR β subunit. Using structure-guided mutagenesis I identified key residues within gephyrin and the receptor subunits that act as major contributors to the overall binding strength. Namely, two conserved aromatic residues within the N-terminal half of the receptor binding region engage in crucial hydrophobic interactions with gephyrin. Accordingly, J. Mukherjee from the group of our collaborator Steven J. Moss verified a substantial decrease in GABAAR cluster number and size in primary hippocampal neurons upon exchange of these residues within the GABAAR α2 subunit. Extension of my studies to collybistin (CB) revealed an overlapping but reciprocal subunit preference for this protein in comparison to gephyrin. The GABAAR α3 subunit exclusively binds gephyrin, in contrast the GABAAR α1 subunit mainly targets gephyrin (Kd = 17 µM) but additionally displays a moderate affinity (Kd ≈ 400 µM) towards the SH3 domain of CB. The GABAAR α2 subunit binds tightly to the SH3 domain of CB (Kd = 1 µM) and additionally displays a weak gephyrin affinity (Kd ≈ 500 µM). Notably, I could exclude the possibility of synergistic effects between gephyrins E domain, the SH3 domain of CB and the GABAAR α2 subunit. Instead, I found that the GABAAR α2 subunit binds gephyrin and CB in a mutually exclusive manner. These results suggest that CBs role in receptor clustering is solely determined by competing binding events of its constituting domains. Namely, the intra-molecular association between the PH/DH domain and the SH3 domain within CB competes with different inter-molecular interactions of CB: GABAAR α2 binding to the SH3 domain, PIP2 binding to the PH domain and gephyrin presumably binding to the PH and DH domain of CB. (iii) Interestingly, the receptor motifs, which have been mapped in my thesis to directly interact with the scaffold proteins, were shown in earlier studies to be posttranslationally modified in vivo. In particular, the GABAAR α1 and GlyR β subunits have been implicated as targets of the ERK/MAPK and PKC phosphorylation-pathways, respectively, while the GABAAR α5 subunit motif was shown to be ubiquitinated. In this dissertation, I analyzed Thr348, a possible ERK phosphorylation site within GABAAR α1. My binding assays verified a severe reduction of the direct gephyrin binding strength upon introduction of the respective phosphomimetic residue. The relevance of this in vitro result was highlighted by J. Mukherjee who confirmed a significant reduction in GABAAR cluster number and size upon introduction of the same mutation. The ERK/MAPK pathway is therefore a promising candidate for regulation of GABAergic transmission. (iv) In vivo, gephyrin presumably forms a multivalent scaffold, which is based on the self-association of its G (GephG) and E domains (GephE). Given the multimeric nature of gephyrin and the pentameric receptor architecture, I tested the possibility of avidity in the clustering of inhibitory neurotransmitter receptors. Cocrystallization of selected minimum peptides with GephE and their crystal structure analyses enabled me to define a receptor-derived peptide that offers a maximized gephyrin affinity. The structure of the GephE-GlyR  receptor complex reveals two receptor-binding sites in close spatial vicinity (15 Å). I therefore designed bivalent peptides that enable to target both GephE sites at the same time and, as expected, a variety of biophysical methods verified an avidity-potentiated and unmatched high gephyrin affinity for these bidentate compounds. Notably, I could extend the dimerization approach to low affinity gephyrin ligands, namely short GABAAR-derived peptides that could not be studied using conventional monomeric ligands. Additionally, I verified that this compound specifically targets GephEs receptor binding site, and that it thereby inhibits its receptor binding activity. Further development of this molecule may offer the possibility to specifically analyze the effect of uncoupling the gephyrin-receptor interaction in cell culture-based assays, without altering protein function or expression level that accompanies conventional methods such as protein knock-out, RNA interference or the usage of antibodies.
KW  - Gephyrin
KW  - Neurotransmitter-Rezeptor
KW  - GABAA-Rezeptor
KW  - Glyzinrezeptor
KW  - Gephyrin
KW  - Neurotransmitter Rezeptoren
KW  - GABA A Rezeptoren
KW  - Rezeptor Verankerung
KW  - Glyzin Rezeptoren
KW  - Gephyrin
KW  - Neurotransmitter Receptors
KW  - GABA A Receptors
KW  - Receptor Anchoring
KW  - Glycine Receptors
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85712
ER  - 
TY  - THES
A1  - Romer Roche, Paula Sofia
T1  - Separation from self explains failure of circulating T-cells to respond to the CD28 superagonist TGN1412
T1  - Verlust der "Selbst"-Erkennung erklärt die fehlende Reaktion zirkulierender T-Zellen auf den CD28-Superagonisten TGN1412
N2  - Stimulatory or superagonistic (SA) CD28-specific monoclonal antibodies (mAbs) are potent polyclonal activators of regulatory T cells and have proven highly effective as treatment in a wide range of rodent models for autoimmune and inflammatory diseases. In these models, a preferential activation of regulatory T cells was observed by in vivo administration of CD28SA. In stark contrast, human volunteers receiving TGN1412, a humanized CD28-specific mAb, experienced a life-threatening cytokine release syndrome during the first-in-man trial. Preclinical tests employing human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) failed to announce the rapid cytokine release measured in the human volunteers in response to TGN1412. The aim of this thesis project was to find an explanation of why standard PBMC assays failed to predict the unexpected TGN1412-induced "cytokine storm" observed in human volunteers. CD28 superagonists can activate T cells without T cell receptor (TCR) ligation. They do depend, however, on “tonic” TCR signals received by MHC scanning, signals that they amplify. PBMC do not receive these signals in the circulation. Short-term in vitro preculture of human PBMC at a high cell density (HDC) resulted in massive cytokine release during subsequent TGN1412 stimulation. Restoration of reactivity was cell-contact dependent, associated with TCR polarization and tyrosine-phosphorylation, and blocked by HLA-specific mAb. In HDC, both CD4 T cells and monocytes functionally mature in a mutually dependent fashion. However, only CD4 memory T-cells proliferate upon TGN1412 stimulation, and were identified as the main source of pro-inflammatory cytokines. Importantly, responses to other T-cell activating agents were also enhanced if PBMC were first allowed to interact under tissue-like conditions. A new in vitro protocol is provided that returns circulating T-cells to a tissue-like status where they respond to TGN1412 stimulation, and it might represent a more reliable preclinical in vitro test for both activating and inhibitory immunomodulatory drugs. Finally, the surprising observation was made that the IgG1 “sibling” of TGN1412, which is of the poorly Fc receptor-binding IgG4 isotype, has a much lower stimulatory activity. We could exclude steric hindrance as an explanation and provide evidence for removal of TGN1112 from the T-cell surface by trans-endocytosis.
N2  - Stimulatorische oder superagonistische (SA) CD28-spezifische monoklonale Antikörper (mAbs) (CD28SA) haben sich in diversen Nagetiermodellen für Autoimmunerkrankungen sowie für inflammatorische Erkrankungen als effektive Behandlungsmöglichkeit erwiesen. In diesen Modellen konnte nachgewiesen werden, dass CD28SA-Injektionen zu einer verstärkten Aktivierung regulatorischer T-Zellen in führen. Entgegen diesen Beobachtungen im Tiermodell reagierten die Teilnehmer einer ersten klinischen Studie auf die Administration des humanisierten CD28SA TGN1412 mit einer akut lebensbedrohlichen systemischen Zytokinausschüttung. Vorklinische Studien an humanen mononukleären Zellen des Blutes (PBMC) hatten keinen Hinweis auf eine mögliche plötzliche Zytokinausschüttungen als Reaktion auf TGN1412 gegeben. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht eine Erklärung zu finden, warum PBMC-basierte Tests, wie sie vorklinischen Studien als Standard eingesetzt werden, nicht auf den unerwarteten TGN1412-induzierten „Zytokinsturm“ der Probanden hinwiesen. CD28SA aktivieren T-Zellen ohne Ligation des T-Zell Rezeptors (TCR). Jedoch werden zur CD28SA-abhängigen Aktivierung von T-Zellen „tonische“ TCR Signale benötigt, die durch MHC Scanning der T-Zellen an der Oberfläche anderer Zellen erzeugt werden. PBMC, welche sich in der Zirkulation befinden, erhalten diese „tonischen“ TCR Signale nicht. Kurzzeitige Vorkultur humaner PBMC bei hoher Zelldichte (high-density culture, HDC) führte zu einer starken Zytokinantwort bei nachfolgender TGN1412 Stimulation. Diese wiedererlangte Reaktivität gegenüber TGN1412 ging mit Tyrosin-Phospholrylierung sowie der Polarisierung von TCR Molekülen einher, war abhängig von Zellkontakten und konnte durch HLA-spezifische mAbs geblockt werden. Während der HDC durchlaufen sowohl CD4 T-Gedächtniszellen, als auch Monozyten eine voneinander abhängige funktionelle Reifung. TGN1412-induzierte Zellproliferation beschränkt sich jedoch auf CD4 T-Gedächtniszellen, die auch die Hauptquelle der proinflammatorische Zytokine sind. Antworten auf weitere T-Zell aktivierende Agenzien waren ebenfalls erhöht, wenn PBMC zunächst auf gewebeartige Bedingungen zurückgesetzt wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt damit ein neuartiges in vitro Protokoll für humane PBMC, welches T-Zellen der Zirkulation in einen gewebeartigen funktionellen Status versetzt, in welchem sie auf TGN1412 antworten. Dieses Protokoll könnte auch einen verlässlicheren vorklinischen in vitro Test sowohl für aktivierende als auch für inhibierende immunmodulatorische Medikamente darstellen. Im letzten Teil der Arbeit wird die erstaunliche Beobachtung vorgestellt, dass TGN1112, ein IgG1 Antikörper mit gleicher Spezifität wie der IgG4 Antikörper Antikörper TGN1412, trotz seiner höheren Affinität für Fc-Rezeptoren eine viel geringere stimulatorische Aktivität zeigt. Sterische Hinderung konnte als eine mögliche Erklärung ausgeschlossen werden. Vielmehr scheint das Entfernen von TGN1112/CD28 Komplexen von der T-Zelloberfläche durch Trans-Endozytose eine mögliche Erklärung für die geringere Aktivität zu sein.
KW  - T-Lymphozyten-Rezeptor
KW  - Antigen CD28
KW  - Monoklonaler Antikoerper
KW  - CD28-Superagonist
KW  - TGN1412
KW  - T cell receptor
KW  - CD28 antigen
KW  - monoclonal antibody
KW  - CD28-superagonist
KW  - TGN1412
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74933
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gupta, Shuchi
T1  - The role of the Canonical transient receptor potential 6 (TRPC6) channel and the C terminal LIM domain protein of 36 kDa (CLP36) for platelet function
T1  - Die Rolle des Canonical transient receptor potential 6 (TRPC6) Kanals und des 36 kDa C-terminalen LIM Domänenproteins (CLP36) in der Thrombozytenfunktion
N2  - Platelet activation and aggregation are essential to limit posttraumatic blood loss at sites of vascular injury, but also contribute to arterial thrombosis, leading to myocardial infarction and stroke. Thrombus formation is the result of well-defined molecular events, including agonist-induced elevation of intracellular calcium ([Ca2+]i) and series of cytoskeletal rearrangements. With the help of genetically modified mice, the work presented in this thesis identified novel mechanisms underlying the process of platelet activation in hemostasis and thrombosis. Store-operated calcium entry (SOCE) through Orai1 was previously shown to be the main Ca2+ influx pathway in murine platelets. The residual Ca2+ entry in the Orai1 deficient platelets suggested a role for additional non-store-operated Ca2+ (non-SOC) and receptor operated Ca2+ entry (ROCE) in maintaining platelet calcium homeostasis. Canonical transient receptor potential channel 6 (TRPC6), which is expressed in both human and murine platelets, has been attributed to be involved in SOCE as well as in diacylglycerol (DAG)-triggered ROCE. In the first part of the study, the function of TRPC6 in platelet Ca2+ signaling and activation was analyzed by using the TRPC6 knockout mice. In vitro agonist induced Ca2+ responses and in vivo platelet function were unaltered in Trpc6-/- mice. However, Trpc6-/- mice displayed a completely abolished DAG mediated Ca2+-influx but a normal SOCE. These findings identified TRPC6 as the major DAG operated ROC channel in murine platelets, but DAG mediated ROCE has no major functional relevance for hemostasis and thrombosis. In the second part of the thesis, the involvement of the PDLIM family member CLP36 in the signaling pathway of the major platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI was investigated. The GPVI/FcR-chain complex initiates platelet activation through a series of tyrosine phosphorylation events downstream of the FcR-chain-associated immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). GPVI signaling has to be tightly regulated to prevent uncontrolled intravascular platelet activation, but the underlying mechanisms are not fully understood. The present study reports the adaptor protein CLP36 as a major inhibitor of GPVI-ITAM signaling in platelets. Platelets from mice expressing a truncated form of CLP36, (Clp36ΔLIM) and platelets from mice lacking the entire protein (Clp36-/-) displayed profound hyper-activation in response to GPVI-specific agonists, whereas GPCR signaling pathways remained unaffected. These alterations translated into accelerated thrombus formation and enhanced pro-coagulant activity of Clp36ΔLIM platelets and a pro-thrombotic phenotype in vivo. These studies revealed an unexpected inhibitory function of CLP36 in GPVI-ITAM signaling and established it as a key regulator of arterial thrombosis.
N2  - Die Aktivierung und die Aggregation von Thrombozyten (Blutplättchen) sind essentielle Prozesse, um Blutverluste nach Verletzungen zu begrenzen, sie spielen jedoch auch eine Rolle bei der arteriellen Thrombose, die zu Herzinfarkt und Schlaganfall führen kann. Die Thrombusbildung ist das Ergebnis wohldefinierter molekularer Vorgänge, die die Agonisten-induzierte Konzentrationserhöhung von intrazellulärem Kalzium ([Ca2+]i) und eine Reihe von Umlagerungen des Zytoskeletts mit einschließen. Die Ergebnisse dieser Arbeit, die mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien erzielt wurden, decken neue Mechanismen der Thrombozytenaktivierung in Thrombose und Hämostase auf. Es wurde bereits gezeigt, dass der durch Orai1 vermittelte Store-operated calcium entry (SOCE) den Haupteintrittsweg für Ca2+ in Mausthrombozyten darstellt. Der verbleibende Ca2+ Einstrom führte zur Annahme, dass zusätzlich non-store-operated Ca2+ (non-SOC) und receptor operated Ca2+ entry (ROCE) eine Rolle in der Aufrechterhaltung der Ca2+ Homöostase spielen. Dem Canonical transient receptor potential channel 6 (TRPC6), der in Thrombozyten des Menschen als auch der Maus exprimiert wird, wurde eine Rolle in dem SOCE und diacylglycerol (DAG)-vermitteltem ROCE zugeschrieben. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion von TRPC6 im Ca2+ Signaling und der Aktivierung von Thrombozyten mit Hilfe der TRPC6 defizienten Mauslinie untersucht. Die Funktion der Trpc6-/- Thrombozyten waren in vitro (z.B. Agonisten-induzierte Ca2+-Antworten) als auch in vivo unverändert. Jedoch zeigten Thrombozyten von Trpc6-/- Mäusen einen komplett fehlenden DAG vermittelten Kalziumeinstrom, aber normalen SOCE. Diese Ergebnisse identifizierten TRPC6 als den Haupt-DAG-aktivierten ROC Kanal in Mausthrombozyten. Jedoch hatte diese DAG vermittelte ROCE keine größere funktionelle Relevanz für Thrombose und Hämostase. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle von CLP36, einem Mitglied der PDLIM Proteinfamilie, im Signalweg des Haupt-Kollagenrezeptors, Glykoprotein (GP) VI, auf Thrombozyten untersucht. Der GPVI/FcRKette Komplex initiiert die Thrombozytenaktivierung durch eine Reihe von Tyrosinphosphorylierungen, die dem FcR-Kette-assoziiertem immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) nachgeschaltet sind. GPVI-vermittelte Signale müssen sorgfältig reguliert sein, um eine unkontrollierte intravaskuläre Thrombozytenaktivierung zu verhindern. Jedoch sind die zugrunde liegenden Mechanismen nicht komplett verstanden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass das Adapterprotein CLP36 als ein wichtiger Inhibitor des GPVI-ITAM Signalwegs wirkt. Thrombozyten von Mäusen, welche eine trunkierte Form von CLP36 exprimieren, der die LIM-Domäne fehlt (Clp36ΔLIM), als auch von Mäusen, denen das komplette Protein fehlt (Clp36-/-), zeigten eine deutlich verstärkte Aktivierung als Antwort auf GPVI-spezifische Agonisten. Andere Signalwege aber waren nicht beeinflusst. Diese Veränderungen resultierten in einer schnelleren Thrombusbildung und erhöhten prokoagulatorischen Aktivität von Clp36ΔLIM Thrombozyten, welche sich letztendlich als prothrombotischer Phänotyp in vivo bemerkbar machten. Diese Ergebnisse deckten eine unerwartete inhibitorische Funktion von CLP36 im GPVI-ITAM Signalweg auf und etablierten CLP36 als einen wichtigen Regulator der arteriellen Thrombose.
KW  - Thrombozytenaggregation
KW  - Platelet activating Factor
KW  - thrombosis
KW  - TRPC6
KW  - Calciumtransport
KW  - Domänenprotein
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72262
ER  - 
TY  - THES
A1  - Emami-Nemini, Alexander Darius
T1  - Differential parathyroid hormone receptor signaling directed by adaptor proteins
T1  - Steuerung differenzieller Signalgebung des Parathormon Rezeptors durch Adapterproteine
N2  - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR) regulates numerous physiological and pathophysiological processes. Hence GPCRs are of significant interest for pharmacological therapy. Embedded into cytoplasmic membranes, GPCRs represent the core of large signaling complexes, which are critical for transduction of exogenous stimuli towards activation of downstream signaling pathways. As a member of the GPCR family B, the parathyroid hormone receptor (PTHR) activates adenylyl cyclases, phospholipases C β as well as mitogen-activated protein kinase-dependent signaling pathways, thereby mediating endocrine and paracrine effects of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), respectively. This regulates, calcium homeostasis, bone metabolism and bone development. Paradoxically, PTH is able to induce both catabolic and anabolic bone metabolism. The anabolic effect of PTH is successfully applied in the therapy of severe osteoporosis. Domination of anabolic or catabolic bone-metabolism is entailed by temporal and cell-type specific determinants. The molecular bases are presumably differential arrangements of adaptor proteins within large signaling complexes that may lead to differential activation of signaling pathways, thereby regulating physiological effects. The molecular mechanisms are largely unclear; thus, there is significant interest in revealing a better understanding of PTHR-related adaptor proteins. To identify novel adaptor proteins which direct PTHR signaling pathways, a proteomic screening approach was developed. In this screening, vav2, a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for small GTPases which regulates cytoskeleton reorganization, was found to interact with intracellular domains of PTHR. Evidence is provided that vav2 impairs PTH-mediated phospholipase C β (PLCβ) signaling pathways by competitive interactions with G protein αq subunits. Vice versa, PTH was shown to regulate phosphorylation and subsequent GEF activity of vav2. These findings may thus shed new light on the molecular mechanisms underlying the effects of PTH on bone metabolism by PLC-signaling, cell migration and cytoskeleton organization. In addition to the understanding of intracellular molecular signaling processes, screening for ligands is a fundamental and demanding prerequisite for modern drug development. To this end, ligand binding assays represent a fundamental technique. As a substitution for expensive and potentially harmful radioligand binding, fluorescence-based ligand-binding assays for PTHR were developed in this work. Based on time-resolved fluorescence, several assay variants were established to facilitate drug development for the PTHR.
N2  - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) reguliert eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, was sie bedeutend für die Pharmakotherapie macht. Eingebettet in die Zytoplasmamembran sind GPCRs das Zentrum von Signalkomplexen, die eine Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen ermöglichen. Der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor (PTHR) aktiviert Adenylyl-Zyklasen-, Phospholipasen Cβ- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-abhängige Signalwege, wodurch endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-ähnlichen Peptides (PTHrP) vermittelt werden. Dies ermöglicht die Regulation der Calcium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Knochenentwicklung. Paradoxerweise kann PTH sowohl katabole als auch anabole Effekte auf den Knochenstoffwechsel induzieren. Den anabolen Effekt von PTH nutzt man erfolgreich in der Therapie der schweren Osteoporose. Ob ein anaboler oder kataboler Knochenmetabolismus überwiegt, wird durch zeitliche und Zelltyp-spezifische Faktoren bestimmt. Dem zugrunde liegt vermutlich unter anderem eine differenzielle Anordnung verschiedener Adapterproteine innerhalb der Signalkomplexe, die zur differenziellen Aktivierung von Signalwegen führen und so eine Steuerung bestimmter physiologischer Effekte ermöglichen. Die molekularen Mechanismen sind jedoch noch weitgehend unklar, weshalb großes Interesse besteht, ein besseres Verständnis über die PTHR-assoziierten Adapterproteine zu entwickeln. Zur Identifizierung neuer Adapterproteine, die PTHR-Signalwege beeinflussen, wurde in dieser Arbeit ein auf dem Proteom-basierender Screening-Ansatz entwickelt. Dieser führte zur Entdeckung einer Interaktion von intrazellulären Domänen des PTHR mit vav2, einem Guanin-Nukleotid Austauschfaktor (GEF) für kleine GTPasen, der die Zytoskelett-Reorganisation steuert. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass vav2 über kompetitive Interaktionen mit G Protein αq Untereinheiten PTH-vermittelte Phospholipase Cβ (PLCβ)-abhängige Signalwege beeinflusst. Umgekehrt wurde gezeigt, dass PTH die Phosphorylierung und damit die GEF Aktivität von vav2 reguliert. Diese Befunde können Aufschluss über molekulare Mechanismen geben, die den Wirkungen von PTH auf den Knochenstoffwechsel durch PLC-Signalwege, Zellmigration und Zytoskelett-Reorganisation zugrunde liegen. Neben dem Verständnis über molekulare Prozesse der intrazellulären Signalgebung ist die Suche nach Liganden eine herausfordernde Grundvoraussetzung für die aktuelle Arzneistoffentwicklung. Liganden-Bindungs-Experimente stellen dafür elementare Techniken dar. Zur Substitution kostenintensiver und potentiell gesundheitsschädlicher Radioliganden-Bindungen, wurden in dieser Arbeit Fluoreszenz-basierte Liganden-Bindungs-Experimente für den PTHR entwickelt. Basierend auf Zeit-aufgelöster Fluoreszenz wurden mehrere Varianten dieser Experimente etabliert, um die Arzneistoffentwicklung am PTHR zu unterstützen.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Parathormon
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Parathormon
KW  - vav2
KW  - Guanin Nukleotid Austauschfaktor
KW  - G protein coupled receptor
KW  - parathyroid hormone
KW  - vav2
KW  - guanine nucleotide exchange factor
KW  - Guaninnucleotid-Austauschfaktoren
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72369
ER  - 
TY  - THES
A1  - Döhler, Anja
T1  - Regulation der Toleranzinduktion von steady-state migratorischen Dendritischen Zellen durch den Transkriptionsfaktor RelB
T1  - Regulation of tolerance induction by steady-state migratory dendritic cells through the transcription factor RelB
N2  - Toleranz gegenüber Selbstantigenen in den peripheren Geweben kann durch CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) vermittelt werden. Diese Zellen entstehen entweder in Folge der thymischen T-Zellselektion (natürlich vorkommende Tregs, nTreg) oder durch Konversion aus naiven T-Zellen in den peripheren lymphatischen Organen (induzierte Tregs, iTregs). Im Vorfeld der Arbeit war bereits bekannt, dass Dendritische Zellen (DZ) eine wichtige Rolle bei der Generierung von iTreg spielen. Allerdings bestand weitestgehend Unklarheit darüber, welche DZ in welchem Reifungszustand dazu in der Lage sind, iTregs gegen peripher-exprimierte Selbstantigene zu induzieren. Steady-state migratorische DZ (ssmDZ) gelten in dieser Hinsicht als potentielle Kandidaten, da bekannt ist, dass diese DZ bereits unter homöostatischen Bedingungen Selbstantigene aus peripheren Geweben in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort T-Zellen präsentieren können. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, den Phänotyp und die tolerogene Kapazität der ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten näher zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass ssmDZ einen semireifen MHC IIint CD40hi CD80/CD86int CCR7+ Phänotyp aufweisen und in vitro mit Hilfe von endogenem TGF-β iTregs induzieren können. Darüber hinaus belegt diese Arbeit zusammen mit weiteren Daten aus unserer Arbeitsgruppe, dass ssmDZ in transgenen K5mOVA-Mäusen zellassoziertes epidermales OVA aus der Haut in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort an CD4+ OVA-spezifische TZR-transgene OT-II T-Zellen präsentieren können. Innerhalb der ssmDZ konnten die Langerin+ dermalen DZ als die DZ-Subpopulation eingegrenzt werden, die für die Konversion von naiven OT-II T-Zellen in CD4+ CD25+ Foxp3+ iTregs verantwortlich war. Ferner zeigte sich, dass CD103 nicht als Marker für ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten herangezogen werden kann. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war, herauszufinden, welchen Einfluss der Transkriptionsfaktor RelB auf die partielle Reifung und Migration der ssmDZ hat. RelB ist ein Mitglied der NF-κB-Familie und wird mit der Reifung von DZ in Verbindung gebracht. Erste Experimente zeigten eine nukleäre Translokation von RelB in ssmDZ sowie eine verringerte Frequenz dieser DZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von relB+/- Mäusen und Mäusen mit einer Defizienz für den RelB-Bindungspartner p52. Allerdings konnte bei Mäusen mit einer DZ-spezifischen RelB-Inaktivierung (RelBDCko Mäuse) eine erhöhte Frequenz an ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten festgestellt, die nicht auf einer Zunahme an DZ in der Haut der Tiere zurückzuführen war. Diese Ergebnisse legen einerseits die Vermutung nahe, dass es sich bei den beobachteten Effekte in den relB+/- Mäusen um DZ-extrinsische Auswirkungen auf die ssmDZ handelt. Andererseits scheint RelB unter homöostatischen Bedingungen die Erhaltung und Migration der ssmDZ eher negativ zu beeinflussen. Weitere durchflusszytometrische Analysen wiesen zudem darauf hin, dass RelB in ssmDZ die Expression von Reifungsmarkern nur partiell reguliert. So konnte auf den ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von RelBDCko Mäusen eine erhöhte Expression von CD40 beobachtet werden, während andere Reifungsmarker wie MHC II, CD80 und CD86 nicht signifikant in ihrer Expression betroffen waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem untersucht, wie sich eine RelB-Defizienz in DZ auf die Homöostase und Induktion von Tregs auswirkt. Die hierzu analysierten RelBDCko Mäuse wiesen eine erhöhte Frequenz und absolute Zellzahl an Tregs in allen untersuchten lymphatischen Organen (hautdrainierende Lymphknoten, Milz und Thymus) auf. Darüber hinaus war in diesen Organen auch eine verstärkte Proliferation der Tregs gegenüber den Kontrolltieren festzustellen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Proliferation der Tregs in RelBDCko Mäusen in den hautdrainierenden Lymphknoten sogar stärker ausfiel als in der Milz. RelB scheint somit die tolerogene Kapazität der DZ zur Regulation der Treg-Expansion im Thymus und in der Peripherie zu beeinflussen. Unter Verwendung von neutralisierenden αIL-2-Antikörpern konnte zudem belegt werden, dass die periphere Proliferation der Tregs in den RelBDCko Mäusen von IL-2 abhängig ist. Damit einhergehend zeigten erste Vorversuche eine erhöhte IL-2-Produktion in den peripheren lymphatischen Organen von RelBDCko Mäusen. Zusammenfassend legen die Daten dieser Arbeit den Schluss nahe, dass ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten in der Lage sind, Toleranz durch Induktion von iTregs gegen epidermale Selbstantigene zu induzieren. Untersuchungen an neuartigen Mäusen mit einer konditionalen RelB-Inaktivierung spezifisch in DZ deuten darauf hin, dass die Migration und Reifung von ssmDZ partiell durch RelB reguliert wird. Da Tregs eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der peripheren Toleranz einnehmen, ist die Beobachtung, dass eine RelB-Defizienz in allen DZ zu einer verstärkten Treg-Proliferation und somit zu einer veränderten Treg-Homöostase führt, ein intererssanter Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen.
N2  - Tolerance against self-antigens from peripheral tissues can be mediated through CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells (Tregs). These cells develop either during thymic T cell selection (nTregs) or by conversion from naive CD4+ CD25- Foxp3- T cells in peripheral lymphoid organs (induced Tregs, iTregs). During the last years, a role for dendritic cells (DC) in the generation of iTregs has been clearly established. However, the precise DC subset and maturation stage which are required to induce iTregs against peripheral self-antigens remain unknown. Steady-state migratory DC (ssmDC) are a good candidate to carry out such function, since these cells are able to transport self-antigen from peripheral tissues to draining lymph nodes under steady-state conditions. Thus one aim of this thesis was to define the phenotype and tolerogenic capacity of ssmDC in skin-draining lymph nodes. Here, we show that ssmDC display a partially mature MHC IIint CD40hi CD80/CD86int CCR7+ phenotype and that these DC used endogenous TGF-β to convert naive T cells into iTregs in vitro. This study, together with former data generated in our laboratory, demonstrate that in transgenic K5mOVA mice, ssmDC transport and present cell-associated epidermal OVA to CD4+ OVA-specific TCR-transgenic OT-II T cells in the skin-draining lymph nodes. We also identified langerin+ dermal DC cells among the different subsets of ssmDC, as the subset which mediates the conversion of naïve OT-II T cells into CD4+ CD25+ Foxp3+ iTregs. Furthermore, we observed that CD103 was not a suitable marker for ssmDC in skin-draining lymph nodes despite that it has been correlated with tolerogenic DC in the intestine. An additional aim of this work was to investigate the impact of the transcription factor RelB on the partial maturation and migration of ssmDC. RelB is a member of the NF-κB family and has been associated with DC maturation. Initial experiments showed nuclear translocation of RelB in ssmDC and in addition, relB+/- mice as well as mice with a deficiency of the RelB-binding partner p52 had a reduced migration of ssmDC to skin-draining lymph nodes. Nevertheless, the analysis of mice with a DC-specific ablation of RelB (RelBDCko mice) revealed an increased frequency of ssmDC in skin-draining lymph nodes which was not due to an increased number or altered distribution of DC in the skin. On the one hand, these data suggest that the effects on ssmDC seen in the relB+/- mice were mediated by DC-extrinsic mechanisms. On the other hand, the increase of ssmDC in RelBDCko mice indicated that RelB might be rather a negative regulator of ssmDC migration under homeostatic conditions. Moreover, RelB also affected the maturation of ssmDC partially, since ssmDC in the skin-draining lymph nodes of RelBDCko mice expressed more CD40 on their surface, while other maturation markers as MHC II, CD80 and CD86 were not significantly altered. Finally, it was investigated how RelB deficiency in DC affects the induction and homeostasis of Tregs. To this aim we examined RelBDCko mice in which we observed an increased frequency and absolute number of Tregs in all lymphatic organs analyzed (skin-draining lymph nodes, spleen and thymus). Furthermore, Tregs showed an increased proliferation in these organs compared to control mice. In particular, Tregs in RelBDCko mice proliferated more vigorously in the skin-draining lymph nodes compared to the spleen. Thus, RelB seems to influence the tolerogenic DC capacity by regulating the expansion of Tregs generated in the thymus as well as their peripheral maintenance. By using a neutralizing anti-IL-2 antibody, we could also demonstrate that the peripheral proliferation of Tregs in the RelBDCko mice was dependent on IL-2, indicating that production of IL-2 either by conventional T cells or DC themselves is affected through RelB deficiency. In accordance with this observation, preliminary experiments showed an increased IL-2 production in the peripheral lymphoid organs of RelBDCko mice. Taken together, the data of this study strongly suggest that ssmDZ are potent inducers of iTregs in response to epidermal self-antigens in skin-draining lymph nodes. Moreover, the analysis of a novel conditional mouse model with a DC-specific deletion of RelB indicated that the migration and maturation of ssmDC is partially regulated by RelB. Since Tregs play a key role in the maintenance of peripheral tolerance, our finding that a deficiency of RelB in all DC affects the proliferation and therefore the homeostasis of Tregs provides an interesting starting-point for further investigation.
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Nuklearfaktor Kappa B
KW  - Immuntoleranz
KW  - regulatorische T-Zellen
KW  - dendritic cell
KW  - NF-kappaB
KW  - regulatory T cells
KW  - immunologic tolerance
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72343
ER  -