TY - THES A1 - Jakob, Sissi T1 - Molecular mechanisms of early-life stress in 5-Htt deficient mice: Gene x environment interactions and epigenetic programming T1 - Molekulare Mechanismen von Entwicklungsstress bei 5-Htt defizienten Mäusen: Gen x Umwelt Interaktionen und epigenetische Programmierung N2 - Early-life stress has been shown to influence the development of the brain and to increase the risk for psychiatric disorders later in life. Furthermore, variation in the human serotonin transporter (5-HTT, SLC6A4) gene is suggested to exert a modulating effect on the association between early-life stress and the risk for depression. At the basis of these gene x environment (G x E) interactions, epigenetic mechanisms, such as DNA-methylation, seem to represent the primary biological processes mediating early-life programming for stress susceptibility or resilience, respectively. The exact molecular mechanisms however remain to be elucidated, though. In the present study, we used two different stress paradigms to assess the molecular mechanisms mediating the relationship between early-life stress and disorders of emotion regulation later in life. First, a 5-Htt x prenatal stress (PS) paradigm was applied to investigate whether the effects of PS are dependent on the 5-Htt genotype. For this purpose, the effects of PS on cognition and anxiety- / depression-related behavior were examined using a maternal restraint stress paradigm of PS in C57BL/6 wild-type (WT) and heterozygous 5-Htt deficient (5-Htt+/-) mice. Additionally, in female offspring, a genome-wide hippocampal gene expression and DNA methylation profiling was performed using the Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array and the AffymetrixGeneChip® Mouse Promoter 1.0R Array. Some of the resulting candidate genes were validated by quantitative real-time PCR. Further, the gene expression of these genes was measured in other brain regions of the PS animals as well as in the hippocampus of offspring of another, 5-Htt x perinatal stress (PeS) paradigm, in which pregnant and lactating females were stressed by an olfactory cue indicating infanticide. To assess resilience to PS and PeS, correlation studies between gene expression and behaviour were performed based on an initial performance-based LIMMA analysis of the gene expression microarray. 5-Htt+/- offspring of the PS paradigm showed enhanced memory performance and signs of reduced anxiety as compared to WT offspring. In contrast, exposure of 5-Htt+/- mice to PS was associated with increased depression-like behavior, an effect that tended to be more pronounced in female offspring. Further, 5-Htt genotype, PS and their interaction differentially affected the expression and DNA methylation of numerous genes and related pathways within the female hippocampus. Specifically, MAPK and neurotrophin signaling were regulated by both the 5-Htt+/- genotype and PS exposure, whereas cytokine and Wnt signaling were affected in a 5-Htt genotype x PS manner, indicating a gene x environment interaction at the molecular level. The candidate genes of the expression array could be validated and their expression patterns were partly consistent in the prefrontal cortex and striatum. Furthermore, the genotype effect of XIAP associated factor 1 (Xaf1) was also detected in the mice of the PeS paradigm. Concerning resilience, we found that the expression of growth hormone (Gh), prolactin (Prl) and fos-induced growth factor (Figf) were downregulated in WTPS mice that performed well in the forced swim test (FST). At the same time, the results indicated that Gh and Prl expression correlated positively with adrenal weight, whereas Figf expression correlated positively with basal corticosteron concentration, indicating an intricate relationship between depression-like behavior, hippocampal gene expression and the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis activity. Correlation studies in the PeS animals revealed a link between Gh / Prl expression and anxiety-like behavior. In conclusion, our data suggest that although the 5-Htt+/- genotype shows clear adaptive capacity, 5-Htt+/- mice, particularly females, appear to be more vulnerable to developmental stress exposure when compared to WT offspring. Moreover, hippocampal gene expression and DNA methylation profiles suggest that distinct epigenetic mechanisms at the molecular level mediate the behavioral effects of the 5-Htt genotype, PS exposure, and their interaction. Further, resilience to early-life stress might be conferred by genes whose expression is linked to HPA axis function. N2 - Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Stress während der Entwicklung die Gehirnentwicklung beinflusst und das Risiko an psychischen Störungen zu erkranken erhöht. Weiterhin wird vermutet, dass eine Variation im humanen Serotonintransportergen (5-HTT, SLC6A4) einen modulierenden Einfluss auf die Assoziation zwischen Entwicklungsstress und dem Risiko für Depression ausübt. Als Basis dieser Gene x Umwelt (GxE)-Interaktion scheinen epigenetische Mechanismen, wie DNA-Methylierung, die biologischen Prozesse darzustellen, die die Programmierung von Stressanfälligkeit oder Resilienz vermitteln. Die exakten molekularen Mechanismen sind jedoch noch unbekannt. In dieser Studie wurden zwei verschiedene Stressparadigma verwendet um die molekularen Mechanismen zu klären, die Stress während der Entwicklung und emotionalen Störungen später im Leben zu Grunde liegen. Zuerst wurde ein 5-Htt x pränatales Stress (PS)-Paradigma verwendet um zu untersuchen, ob die Effekte von pränatalem Stress abhängig von dem 5-Htt Genotypen sind. Aus diesem Grund wurden die Effekte von PS auf Kognition, Angst- und Depressions-ähnliches Verhalten untersucht indem ein “maternal restraint stress”-Paradigma in C57BL/6-Wildtyp (WT) und heterozygoten 5-Htt defizienten (5-Htt+/-) Mäusen angewandt wurde. Zusätzlich wurde mit Hilfe des Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Arrays und des AffymetrixGeneChip® Mouse Promoter 1.0R Arrays bei den weiblichen Nachkommen ein Genexpressions- und DNA-Methylierungsprofil erstellt. Einige der daraus resultierenden Kandidatengene wurden mit quantitativer real-time PCR (qRT-PCR) validiert. Weiterhin wurde die Genexpression von diesen Genen auch in anderen Gehirnregionen der PS-Mäuse und im Hippocampus von Nachkommen aus einem perinatalem (PeS) Paradigma gemessen. In dem PeS-Paradigma wurden schwangere und stillende Weibchen durch einen olfaktorischen Stimulus, der Infantizid anzeigt, gestresst und die Nachkommen (WT und 5-Htt+/-) untersucht. Um PS- und PeS-Resilienz zu messen wurden Korrelationsstudien durchgeführt. Zuvor wurde eine LIMMA-Analyse, die auf dem Verhalten von den Mäusen im Forced swim-Test (FST) beruht, gerechnet. Im Vergleich zu WT Nachkommen zeigten 5-Htt+/- Nachkommen des PS-Paradigmas verbesserte Gedächtnisleistung und Zeichen von reduzierter Angst. Im Gegensatz dazu war PS-Exposition von 5-Htt+/- Mäusen mit erhöhtem Depressions-ähnlichem Verhalten assoziiert, ein Effekt, der tendenziell eher in den weiblichen Nachkommen auffiel. Weiterhin beeinflussten der 5-Htt-Genotyp, PS und die Interaktion von beiden die Genexpression und DNA-Methylierung zahlreicher Gene und damit verbundene Signalwege im weiblichen Hippocampus. Der MAPK- und Neurotrophin-Signalweg wurden zum Beispiel durch den 5-Htt-Genotyp und PS-Exposition reguliert, wohingegen der Zytokin-und Wnt-Signalweg in einer 5-Htt x PS Art beeinflusst wurden, was Gen x Umwelt-Interaktionen auf der molekularen Ebene andeutet. Die Kandidatengene konnten zumeist validiert werden und waren zum Teil auch im präfrontalen Kortex sowie im Striatum differentiell exprimiert. Weiterhin konnte der Genotypeffekt von XIAP associated factor 1 (Xaf1) in den Mäusen des PeS-Paradigmas nachgewiesen werden. Bezüglich der Resilienz konnten wir eine Herunterregulierung der Expression des Wachstumshormons (Gh), Prolaktins (Prl) und des fos-induzierten Wachstumsfaktors (Figf) in den WTPS-Mäusen detektieren, die eine gute Leistung im FST gezeigt haben. Gleichzeitig korrelierten die Gh- und Prl-Expression positiv mit dem Gewicht der Nebennieren, wohingegen die Figf-Expression mit dem basalen Kortikosteron-Konzentration positiv korrelierte, was eine komplizierte Beziehung zwischen Depressions-ähnlichem Verhalten, hippocampaler Genexpression und der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA)-Achsenaktivität andeutet. Korrelationsstudien über die PeS-Tiere deckten einen Link zwischen der Gh- und Prl-Expression und Angst-ähnlichem Verhalten auf. Schließlich lassen unsere Daten den Schluss zu, dass, auch wenn der 5-Htt-Genotyp eine klare adaptive Kapazität aufweist, die 5-Htt+/- Mäuse, insbesondere die Weibchen im Vergleich zu den WT-Mäusen eine erhöhte Vulnerabilität für Entwicklungsstress zu zeigen scheinen. Weiterhin könnten die hippocampale Genexpressions- und DNA-Methylierungsprofile darauf schließen lassen, dass epigenetische Mechanismen auf der molekularen Ebene die Verhaltenseffekte des 5-Htt Genotyps, PS-Exposition und ihrer Interaktion vermitteln. Darüber hinaus könnte Resilienz zu Entwicklungsstress durch Gene reguliert werden, die mit der HPA-Achsen-Funktion assoziiert sind. KW - Stressreaktion KW - Serotonin KW - Epigenetik KW - pränataler Stress KW - Serotonintransporter KW - Gen Umweltinteraktion KW - prenatal stress KW - serotonin transporter KW - gene environment interaction Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74150 ER - TY - THES A1 - Rauert-Wunderlich, Hilka T1 - Apoptoseregulation durch TNF im Multiplen Myelom T1 - Regulation of apoptosis via TNF in multiple myeloma N2 - Der Tumornekrosefaktor (TNF) entfaltet seine vielfältigen biologischen Aktivitäten durch die Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren TNFR1 und TNFR2. Die TNFR1-vermittelte Signaltransduktion ist in vielen Details gut verstanden, wohingegen die TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bis heute kaum untersucht ist. Mit Hilfe einer in unserer Gruppe entwickelten hochaktiven TNFR2-spezifischen TNF-Variante sowie einer bereits länger bekannten TNFR1-spezifischen TNF-Variante wurde in dieser Arbeit die TNF-Signaltransduktion insbesondere im Mutiplen Myelom untersucht. Mit Hilfe der beiden TNF-Varianten konnte gezeigt werden, dass die alleinige Stimulation des TNFR2 die Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges vermittelt, wohingegen TNFR1 nicht dazu in der Lage ist. So zeigte sich im Einklang mit der inhibitorischen Funktion des Adapterproteins TRAF2 in der Signaltransduktion des alternativen NFkappaB-Signalweges, dass die TNFR2-Stimulation in einer TRAF2-Depletion resultiert. Dies führt weiterhin zur Akkumulation von NIK und der Prozessierung von p100 zu seiner aktiven Form p52, den klassischen biochemisch nachweisbaren Ereignissen der Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges. Aufgrund der Rolle des NFkappaB-Systems im Multiplen Myelom (MM) und der stimulierenden Wirkung des TNFR1 und TNFR2 auf das NFkappaB-System wurde die Expression und Funktion dieser beiden Rezeptoren auf Myelomzelllinien untersucht. Insbesondere wurde analysiert, welchen Effekt eine spezifische Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren auf die apoptotische Sensitivität von Myelomzellen hat. Mit einer Ausnahme wiesen alle untersuchten Myelomzelllinien eine eindeutige TNFR2-Oberflächenexpression auf, die TNFR1-Expression hingegen war heterogen. Die TNFR1-Stimulation in den TNFR1-positiven Zelllinien zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf die Zellviabilität. Allerdings resultierte eine Vorstimulation mit TNF in einer gesteigerten Sensitivität für den CD95L-induzierten Zelltod, schützte aber gleichzeitig vor der TRAIL-vermittelten Induktion der Apoptose. Der gegenläufige Effekt der TNF-Vorstimulation auf den CD95L- und TRAIL-induzierten Zelltod konnte auf die Hochregulation der CD95-Oberflächenexpression und der gesteigerten Expression des antiapoptotischen cFLIPLong-Proteins zurückgeführt werden. Beide Effekte basieren auf der TNF-induzierten Aktivierung des klassischen NFkappaB-Signalweges. Im CD95L-induzierten Zelltod überkompensierte die Induktion der CD95-Expression offensichtlich die Hochregulation von cFLIPLong und resultierte in gesteigertem Zelltod. Der TRAIL-induzierte Zelltod hingegen wurde durch die TNF-Vorstimulation abgeschwächt, da hier lediglich die durch den klassischen NFkappaB-Signalweg vermittelte gesteigerte Expression des antiapoptotischen cFLIPLong eine Rolle spielte. Desweiteren zeigten die Analysen in dieser Arbeit, dass die TNFR2-Stimulation zu einer Depletion von TRAF2 und z. B. in JJN3-Zellen zu einer Sensitivierung für den TNFR1-induzierten Zelltod führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten in der Summe somit, dass das TNF-TNFR-Signaling durch verschiedene Mechanismen Einfluss auf den Ausgang der extrinsischen Apoptoseinduktion hat, und dass der Effekt von TNF auf das Überleben von MM-Zellen kontextabhängig ist. N2 - TNF mediates its biological functions by stimulation of the two TNF receptors TNFR1 and TNFR2. TNFR1-mediated signaling has already been studied in detail, whereas TNFR2-mediated signal transduction is poorly understood. In this work a newly developed TNFR2-specific variant and an established TNFR1-specific variant was used to study TNF signaling especially in myeloma cells. With the help of these TNF-variants it is shown here that TNFR2, but not TNFR1, induces activation of the alternative NFkappaB-pathway. Thus in consent with the inhibitory function of TRAF2 in alternative NFkappaB signal transduction, stimulation of TNFR2 resulted in depletion of TRAF2, accumulation of NIK and p100 processing to p52, the biochemical hallmarks of this pathway. Due to the relevance of the NFkappaB-system for multiple myeloma (MM) and the NFkappaB stimulatory activities of TNFR1 and TNFR2, the expression of these two receptors and their effect on apoptotic sensitivity was analyzed in myeloma cell lines. A huge majority of myeloma cell lines express TNFR2 whereas TNFR1 expression is rather restricted. Stimulation of TNFR1 in the TNFR1-positive subset of MM cell lines showed nearly no impact on cellular viability. However, TNF stimulation enhanced CD95L-induced cell death and in parallel reduced the TRAIL-mediated induction of apoptosis. This opposed regulation of TRAIL- and CD95L-induced cell death by TNF based on upregulation of the death receptor CD95 via the classical NFkappaB-pathway and by upregulation of the antiapoptotic protein cFLIPLong via the same pathway. The induction of CD95 expression appeared to overcompensate the upregulation of cFLIPLong and consequently TNF-induced NFkappaB activation resulted, in context of CD95 signaling, in apoptosis enhancement. TRAIL-mediated cell death induction, however, was reduced after TNF prestimulation, due to the fact that here only upregulation of cFLIPLong was relevant. Furthermore the experiments in this study showed that TNFR2-mediated depletion of TRAF2 resulted in a sensitization for TNFR1-induced cell death, for example in JJN3-cells. Taken together, this study revealed that the TNF-TNFR system influenced the outcome of activation of the extrinsic apoptotic pathway in myeloma cells by various mechanisms and the effect of TNF on MM cell survival is thus context dependent. KW - Apoptosis KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Plasmozytom KW - apoptosis KW - TNF KW - multiple myeloma Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73998 ER - TY - THES A1 - Deiß, Katharina T1 - Die Regulation des Kinasemodulators Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP): Einfluss von Phosphorylierung und Dimerisierung auf die Interaktion mit Raf1 und G Protein-gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2) T1 - Regulation of the kinase modulator Raf kinase inhibitor protein (RKIP): Influence of phosphorylation and dimerization on its interaction with Raf1 and G protein coupled receptor kinase 2 (GRK2) N2 - RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern ermöglicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gewählt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung für die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpräzipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass für diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molekülen notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfläche wurden die Aminosäuren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP für seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP für die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine höhere Affinität zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivität von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivität von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufklärung dieses Mechanismus erweitert unser Verständnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen. N2 - RKIP is a regulator of several distinct kinases and modulates diverse signal transduction cascades such as the signaling of G protein coupled receptors, of the Raf/MEK/ERK-cascade, of the transcription factor NFκB, and of GSK3β. Until now, it was not well understood how the specific interaction of RKIP with its diverse targets is achieved and regulated. Raf1 and GRK2 are the only known direct interaction partners of RKIP and were thus chosen to untangle the molecular mechanisms regulating the specific interaction of RKIP with these kinases. In this dissertation it is shown that RKIP dimerizes upon PKC-mediated phosphorylation of serine153 and that this dimerization is essential for RKIP/Raf1-dissociation and RKIP/GRK2-association. Co-immunoprecipitation experiments with a phosphorylation-deficient mutant revealed that the dimerization of RKIP requires the phosphorylation of two RKIP molecules. The amino acids 127-146 of RKIP were identified as dimer-interface, since RKIP-dimerization was efficiently and specifically inhibited by the peptide RKIP127-146. To elucidate the implication of this phosphorylation-induced dimerization on the target specificity of RKIP, a phosphomimetic RKIP mutant (RKIPSK153/7EE) and a dimeric RKIP mutant (RKIP∆143-6) were generated. The following results indicated that dimerization of RKIP controls its specific interaction with Raf1 or GRK2, respectively: (i) dimerization of phosphorylated RKIP occurred concomitantly with the release of RKIP from Raf1 and its association with GRK2; (ii) the RKIP mutants RKIPSK153/7EE and RKIP∆143-6, which had a higher propensity for RKIP-dimerization already under basal conditions, had a higher affinity to GRK2 than to Raf1; (iii) inhibition of RKIP-dimerization prevented only RKIP/GRK2-binding but did not interfere with RKIP/Raf1-binding; (iv) an RKIP- and GRK2-immunoreactive complex was detected in vitro as well as in mouse hearts; (v) analyses of RKIP-mediated inhibition of GRK2 and Raf showed that a higher propensity for RKIP-dimerization translates into efficient GRK2-inhibition but not into Raf-inhibition. The results of this thesis show that phosphorylation-induced dimerization of RKIP regulates its specific interaction with Raf1 and GRK2. The elucidation of this mechanism improves our understanding how specificity in the interaction of kinases and their regulatory proteins can be achieved. KW - Signaltransduktion KW - Dimerisierung KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Proteinkinase C KW - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) KW - G protein-gekoppelte Rezeptor Kinase 2 (GRK2) KW - Raf1 KW - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) KW - G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) KW - Raf1 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73884 ER - TY - THES A1 - Zheng, Peilin T1 - Ptpn22 silencing in the NOD model of type 1 diabetes indicates the human susceptibility allele of PTPN22 is a gain-of-function variant T1 - Ptpn22 knockdown im NOD Modell für Diabetes Typ 1 belegt einen Aktivitätsgewinn der humanen Krankheitsvariante N2 - PTPN22 encodes the lymphoid tyrosine phosphatase Lyp that can dephosphorylate Lck, ZAP-70 and Fyn to attenuate TCR signaling. A single-nucleotide polymorphism (C1858T) causes a substitution from arginine (R) to tryptophan (W) at 620 residue (R620W). Lyp-620W has been confirmed as a susceptible allele in multiple autoimmune diseases, including type 1 diabetes (T1D). Several independent studies proposed that the disease-associated allele is a gain-of-function variant. However, a recent report found that in human cells and a knockin mouse containing the R620W homolog that Ptpn22 protein degradation is accelerated, indicating Lyp-620W is a loss-of-function variant. Whether Lyp R620W is a gain- or loss-of-function variant remains controversial. To resolve this issue, we generated two lines (P2 and P4) of nonobese diabetic (NOD) mice in which Ptpn22 can be inducibly silenced by RNAi. We found long term silencing of Ptpn22 increased spleen cellularity and regulatory T (Treg) cell numbers, replicating the effect of gene deletion reported in the knockout (KO) B6 mice. Notably, Ptpn22 silencing also increased the reactivity and apoptotic behavior of B lymphocytes, which is consistent with the reduced reactivity and apoptosis of human B cells carrying the alleged gain-of-function PTPN22 allele. Furthermore, loss of Ptpn22 protected P2 KD mice from spontaneous and Cyclophosphamide (CY) induced diabetes. Our data support the notion that Lyp-620W is a gain-of-function variant. Moreover, Lyp may be a valuable target for the treatment of autoimmune diseases. N2 - PTPN22 kodiert die lymphoid tyrosine phosphatase Lyp, die Lck, ZAP-70 und Fyn dephosphorilieren kann, um T Zell Rezeptor Signale zu vermindern. Ein Polymorphismus (C1858T) verursacht einen Aminosäurenaustausch auf Position 620 von Arginin zu Tryptophan (R620W). Lyp-620W erhöht das Risiko einer Vielfalt von Autoimmunerkrankungen, darunter auch Diabetes Typ 1 (T1D). Mehrere Studien haben belegt, dass dieses Krankheitsallel die Funktion von Lyp verstärkt. Eine neuere Studie hat andererseits gezeigt, dass die R620W Variante schneller degradiert wird, was bedeuten würde, dass das C1858T Allel einen Funktionsverlust verursachen könnte. Ob Lyp R620W die Funktion dieser Phosphatase erhöht oder mindert bleibt demnach bis jetzt ungewiss. Um diese Frage zu klären haben wir zwei transgene Mauslinien (P2 und P4) im diabetischen Hintergrund der NOD Maus generiert, in denen Ptpn22 auf induzierbare Weise durch RNAi gehemmt werden kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die langfristige Hemmung von Ptpn22 zu einer Zunahme der Milzzellularität und der Anzahl regulatorischer T Zellen führt, was dem Phänotyp des Ptpn22 knockout im B6 Hintergrund entspricht. Bemerkenswert ist, dass die Hemmung von Ptpn22 auch zu einer Zunahme der Reaktivität und des apoptotischen Verhaltens von B Lymphozyten führt, also dem entgegengesetzten Phänotypen, der in menschlichen B Zellen beobachtet wurde, die das Krankheitsallel exprimierten. Zusätzlich konnte die Ptpn22 Inhibierung NOD Mäuse vor spontanem und Cyclophosphamid-induziertem Diabetes schützen. Unsere Daten unterstützen also die Hypothese, dass Lyp-620W eine stärkere Aktivität vorweist. Dies würde auch bedeuten, dass Ptpn22 möglicherweise zu therapeutischen Zwecken inhibiert werden könnte, um Autoimmunerkrankungen zu bekämpfen. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - Genexpression KW - Ptpn22 KW - Diabetes Typ 1 KW - Type 1 diabetes KW - PTPN22 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73869 ER - TY - THES A1 - Grünewald, Benedikt T1 - Autoantikörper-vermittelte Störungen der synaptischen Übertragung im ZNS T1 - Autoantibody mediated dysfunction of synaptic transmission in the CNS N2 - Die Anzahl neurologischer Erkrankungen bei denen Autoantikörper gegen zentralnervöse An-tigene bekannt sind, hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Allerdings gibt es nur für wenige dieser Erkrankungen hinreichende experimentelle Belege für eine pathogene Wir-kung der Autoantikörper. Zwei dieser Erkrankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht: die Juvenile Neuronale Zeroid-Lipofuszinose (JNCL) mit Autoantikörpern gegen die 65 kD Isoform der Glutamatdecarboxylase und das Stiff Person Syndrom (SPS) mit Auto-antikörpern gegen Amphiphysin. Die phänotypische Charakterisierung der cln3 knockout-Maus, einem Mausmodell für die JNCL, zeigte eine progressive Verschlechterung der motorischen und koordinativen Fä-higkeiten, eingeschränktes reizbedingtes Lernen und gesteigertes angstähnliches Verhalten. Diese Symptome ähneln denen der humanen Erkrankung. Elektrophysiologisch konnte eine Antikörper-induzierte zerebelläre Dysfunktion identifiziert werden, die einer verminderten lokalen GABAergen Hemmung zugeordnet wird. Eine Reduktion der Antiköperproduktion im Tiermodell durch eine Depletion der Plasmazellen durch den Proteseinhibitor Bortezomib hatte einen positiven Effekt auf die Krankheitsentwicklung. Im zweiten experimentellen Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Autoantikörpern gegen Amphiphysin von Patienten mit SPS auf die synaptische Transmission untersucht. Es zeigte sich hierbei in Patch-Clamp Experimenten eine Störung der GABAergen Übertragung v.a. bei hochfrequenter Stimulation, was im Einklang mit dem vermuteten Antikörper-induzierten Endozytosedefekt steht. Passiver Transfer von humanen Autoantikörpern gegen Amphiphysin induzierte angst-ähnliches Verhalten in Ratten, einem weiteren Kernsymptom des SPS. Aktive Immunisierung gegen Amphiphysin und anschließende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke in Mäusen führte zu einer subklinischen Veränderung der Reflexverarbeitung von Ia Afferenzen auf Motoneurone im Rückenmark der Mäuse. Insgesamt konnten in zwei Erkrankungen des ZNS autoimmune Mechanismen identifi-ziert werden, die zu einer Antikörper-induzierten Fehlregulation der zentralen synaptischen Transmission führen. Diese Ergebnisse können wegweisend sein auch für die Erforschung der Pathophysiologie anderer Antikörper-assoziierte Erkrankungen des ZNS. N2 - A growing number of neurological disorders are associated with autoantibodies targeting an-tigens within the central nervous system. Only in few cases experimental evidence corrobo-rates a pathogenic role of the autoantibodies. Two autoantibody associated diseases were investigated in detail in this work: the Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses (JNCL) with au-toantibodies against the 65kD isoform of the glutamate decarboxylase and the Stiff Person Syndrome (SPS) with autoantibodies against amphiphysin. The analysis of cln3 knockout mice, an animal model of the JNCL, revealed a phenotype resembling the human disorder, including progressive motor decline, limited cued learning and an increase in anxiety-related behavior. Electrophysiological analysis revealed an autoan-tibody mediated cerebellar dysfunction, which is best explained by diminished local GABAer-gic inhibition. A reduction of autoantibody production in the cln3 knockout mice by depletion of plasma cells after treatment with Bortezomib had a positive effect on the disease out-come. In the second experimental part, the effect of autoantibodies to amphiphysin from SPS patients on synaptic transmission was analysed. In patch-clamp experiments the GABAergic synaptic transmission was found to be disturbed primarily during high-frequent stimulation. This is in line with the hypothesized defect of synaptic vesicle endocytosis induced by autoan-tibodies. Passive transfer of human autoantibodies to rats induced anxiety-related behavior, a key symptom of SPS. The active immunization of mice against amphiphysin and subsequent opening of the blood brain barrier led to subclinical disturbances of the Ia afferent-motor neuron reflex pathway within the spinal cord. In conclusion, for two CNS disorders autoimmune mechanisms were identified leading to antibody-induced deregulations of central synaptic transmission. These findings may have implication for the research on pathomechanisms of other putative antibody mediated dis-orders. KW - Glutamat-Decarboxylase KW - Autoantigen KW - Nervensystem KW - Krankheit KW - Synapse KW - JNCL KW - Batten disease KW - GAD65 KW - Autoantikörper KW - JNCL KW - Batten disease KW - autoantibodies KW - GAD65 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73283 ER - TY - THES A1 - Lang, Isabell T1 - Molekulare Mechanismen der CD95-Aktivierung T1 - Molecular mechanisms of CD95 activation N2 - Die Stimulation des CD95-Todesrezeptors durch seinen natürlichen membranständigen Li-ganden CD95L führt zur kontextabhängigen Aktivierung von sowohl apoptotischen als auch nicht-apoptotischen Signalwegen. Durch Proteolyse wird aus dem membranständigen CD95L löslicher trimerer CD95L freigesetzt. Die Bindung von löslichem trimerem CD95L an CD95 ist nicht ausreichend, um die CD95-Signaltransduktion effizient zu stimulieren. Die Fähigkeit von löslichen CD95L-Trimeren CD95-vermittelte Signalwege robust zu aktivieren kann jedoch durch Oligomerisierung und artifizielle Immobilisierung an eine Oberfläche drastisch gesteigert werden. In dieser Arbeit wurde zunächst bestätigt, dass nur oligomere CD95L-Varianten, die z.B. durch Antikörpervernetzung von N-terminal getaggten rekombinanten CD95L-Varianten oder durch eine gentechnisch erzwungene Hexamerisierung von CD95L-Molekülen erhalten wur-den, in der Lage sind, effizient apoptotische und nicht-apoptotische Signalwege zu aktivieren. Ferner zeigte sich dann, dass die Bindung von löslichen CD95L-Trimeren nicht ausreichend ist, um die Translokation von CD95-Molekülen in detergenzunlösliche „Lipid Raft“- Membrandomänen zu stimulieren. Die „Lipid Raft“-Translokation ist ein zentrales Ereignis bei der CD95-Aktivierung und vor allem für die Induktion der Apoptose bedeutsam. Dabei ist ein selbstverstärkender Prozess aus Caspase-8-Aktivierung und „Lipid Raft“-Assoziation des CD95 von Bedeutung. Um die Interaktion von CD95 und CD95L mit Hilfe von hoch sensitiven zellulären Bindungs-studien analysieren zu können, wurden in dieser Arbeit desweiteren CD95L-Fusionsproteine entwickelt und hergestellt, an welche N-terminal eine Gaussia princeps Luziferase (GpL)- Reporterdomäne gekoppelt ist. So konnte mit den GpL-CD95L-Fusionsproteinen gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von CD95L-Trimeren keinen Effekt auf die Ligandenbele-gung des CD95 hat. Dies spricht dafür, dass die höhere spezifische Aktivität von oligomeri-sierten CD95L-Trimeren nicht auf einer Aviditäts-vermittelten Zunahme der apparenten Affi-nität beruht, sondern dies deutet darauf hin, dass die sekundäre Aggregation von sich initial bildenden trimeren CD95L-CD95-Komplexen eine entscheidende Rolle in der CD95-Aktivierung spielt. Durch Scatchard-Analysen zeigte sich ferner, dass trimerer CD95L mit mindestens zwei zellulären Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität interagiert. Bindungs-studien mit löslichen monomeren und trimeren GpL-CD95-Rezeptoren an membranständigen CD95L, als auch Inhibitionsstudien ergaben, dass trimerer CD95 weitaus besser an CD95L bindet. Dies legt nahe, dass es sich bei den zuvor beobachteten hoch- und niederaffinen Bindungsstellen für CD95L um monomere bzw. prä-assemblierte CD95-Moleküle handelt. Die GpL-CD95L-Fusionsproteine wurden auch genutzt, um die CD95-Translokation in „Lipid Rafts“ zu analysieren. So wurde trimerer GpL-CD95L als „Tracer“ zur Markierung von inaktiven CD95-Molekülen eingesetzt. Nach Aktivierung der übrigen freien CD95-Moleküle mit hoch aktivem hexameren Fc-CD95L konnte eine Zunahme der inaktiven GpL-CD95L-markierten Rezeptoren in „Lipid Rafts“ beobachtet werden. Offensichtlich stimulieren also aktivierte CD95-Moleküle in „trans“ die Ko-Translokation inaktiver CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Dies bestätigte sich auch in Experimenten mit Transfektanten, die einen chimären CD40-CD95-Rezeptor exprimieren. Letzterer ist nach Stimulation mit CD40L in der Lage, intrazellu-läre CD95-vermittelte Signalwege zu aktivieren. Die Aktivierung von CD95-assoziierten Sig-nalwegen durch Stimulation von endogenem CD95 in CD40-CD95-Transfektanten resultierte nun in der Ko-Translokation von unstimulierten CD40-CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Vice versa zeigte sich die Ko-Translokation von endogenem CD95 nach spezifischer Aktivierung des chimären CD40-CD95-Rezeptors. Schlussendlich erwiesen sich eine funktionsfähige Todesdomäne und die Aktivierung der Caspase-8 als essentiell für die „Lipid Raft“-Assoziation von aktivierten CD95-Molekülen und auch für die durch diese Rezeptorspezies induzierte Ko-Translokation von inaktiven Rezeptoren in „Lipid Rafts“. N2 - Membrane-bound CD95L activates the CD95 death receptor to induce context-dependent apoptotic and non-apoptotic signaling pathways. In contrast, soluble trimeric CD95L, which is released by proteolysis, is not sufficient to stimulate CD95-induced signaling. However, the ability of soluble CD95L trimers to activate robust CD95 mediated signaling pathways can be increased drastically by oligomerization and artificial immobilization on the cell surface. In this work, it has been confirmed that only the oligomeric CD95L-variants, produced by an-tibody crosslinking of N-terminal tagged recombinant CD95L-variants or by genetic engineer-ing-enforced formation of hexamers, are able to efficiently activate both apoptotic and non-apoptotic signaling pathways. Moreover, it has been shown that binding of soluble trimeric CD95L is not sufficient to stimulate translocation of CD95 molecules to the “lipid raft”-containing compartment of the cell membrane. This translocation of CD95 to “lipid rafts” is a pivotal event in CD95 activation and mainly meaningful, especially for induction of apoptosis. Thereby an auto-amplification-loop of caspase-8 activation and association of CD95 with “lipid rafts” is of importance. To analyze CD95-CD95L interactions, highly sensitive cellular binding studies using CD95L fusion proteins linked to the N-terminal Gaussia princeps luciferase (GpL) have been per-formed. With GpL-CD95L fusion proteins it has been demonstrated that oligomerization of CD95L trimers has no major effect on CD95 occupancy. Therefore higher specific activity of oligomerized CD95L trimers is not related to an avidity-driven increase in apparent affinity. This suggests that a process of secondary aggregation of the initially formed trimeric CD95L-CD95 complexes is crucial for CD95 activation. Furthermore, the data obtained from scat-chard analysis showed that trimeric CD95L interacts with at least two binding sites of different affinity. This was further examined by performing binding studies of soluble monomeric and trimeric GpL-CD95 receptors to membrane-bound CD95L and neutralization assays. It was observed that trimeric CD95 receptor can bind to CD95L much better. These results suggest that the high and low affinity binding sites concern to monomeric or rather pre-assembled CD95 molecules. Moreover, GpL-CD95L fusion proteins have been employed to analyze translocation of CD95 to “lipid rafts”. In these experiments, GpL-CD95L trimers were applied to “mark” inactive CD95 molecules. Upon activation of the remaining free CD95 molecules using highly active Fc-CD95L, an increased association of these inactive receptors with “lipid rafts” was observed. Apparently activated CD95 molecules stimulate in “trans” the co-translocation of inactive CD95 receptors to “lipid rafts”. This has also been confirmed in experiments with transfectants expressing chimeric CD40-CD95 receptors. These chimeric receptors are able to activate CD95-mediated signaling pathways after stimulation with CD40L. After stimulation of endogenous CD95 in CD40-CD95 transfectants the unstimulated chimeric CD40-CD95 receptors co-translocated to “lipid rafts”. Conversely, activation of CD95-associated pathways by specific stimulation of chimeric CD40-CD95 receptors resulted in co-translocation of the endogenous CD95. In conclusion, it has been shown that a functional death domain and caspase-8 activation turned out to be essential for both “lipid raft” association of signaling-active CD95 molecules and co-translocation of inactive CD95 receptors induced by active receptor species. KW - Fas-Ligand KW - Apoptosis KW - Antigen CD95 KW - CD95 KW - CD95L KW - Apoptose KW - "Lipid Rafts" KW - FAS KW - CD95 KW - CD95L KW - apoptosis KW - "Lipid Rafts" Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73339 ER - TY - THES A1 - Köthe, Susanne T1 - Masernvirus-Infektion von Dendritischen Zellen und Virus-Transmission an T-Zellen T1 - Measles virus infection of dendritic cells and virus transmission to T cells N2 - Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen, die Pathogene erkennen und nach erfolgreicher Reifung spezifische adaptive Immunität induzieren. Die Infektion unreifer DCs durch Masernviren (MV) erfolgt CD150-abhängig und DC-SIGN-unterstützt. Infizierte DCs vermitteln wahrscheinlich den MV-Transport vom Respirationstrakt in sekundäre lym-phatische Gewebe, wo die MV-spezifische Immunität und die generalisierte Immunsuppressi-on initiiert werden sowie die MV-Transmission an T-Zellen stattfinden kann, die wesentlich für die Dissemination des Virus ist. Die MV-Infektion von iDCs initiierte deren Ausreifung begleitet von der moderaten Hochre-gulierung der CD150-Oberflächenexpression. Die Akkumulation viraler Proteine als auch die Freisetzung viraler Partikel waren in DCs im Vergleich zu Virus-produzierenden B-Zelllinie B95a beeinträchtigt. Diese Arbeit verglich die subzelluläre Verteilung der viralen Proteine in DCs und B95a-Zellen. In DC wiesen Matrix (M)-Proteine eine prominente Assoziation mit den Komponenten des Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexes auf. Die ausgeprägte Relokali-sierung des Tetraspanins CD81 zu Phospho (P)-Protein-Kompartimenten und die Inhibition der räumliche Interaktion der untersuchten Tetraspanine waren spezifisch für B95a-Zellen. Weder in B95a-Zellen noch für DC konnte für MV ein virus-containing compartment (VCC) detektiert werden, das für HIV-1 zuvor beschrieben wurde. Um den zellulären Transport des M-Proteins in infizierten, lebenden DCs untersuchen zu können, wurde das Protein carboxyterminal mit dem Tetracystein (TC)-Tag fusioniert. Das M-TC Fusionsprotein zeigte alle untersuchten biologischen Eigenschaften des Wildtyp-Proteins bezüglich seiner subzellulären Verteilung, der Assoziation mit DRMs sowie der Generierung und Freisetzung von virus-like particles (VPLs). Innerhalb des Viruskontextes interferierte der TC-Tag allerdings stark mit der Virusreplikation bzw. Freisetzung. Durch die Verminderung der Partikelproduktion in DCs wird eine spezielle MV-Transmissionsstruktur für die effiziente Übertragung an T-Zellen benötigt. Die MV-Transmission an autologe T-Zellen basierte vorwiegend auf Infektion von DCs (cis-Infektion) und weniger auf DC-SIGN-gebundenen Virus (trans-Infektion). Die Interaktion zwischen dem MV-Glykoprotein H mit seinem Rezeptor CD150 war wichtig für die Transmission. Die Transmission von MV erfolgte hauptsächlich durch die Bildung von Kontaktflächen, entspre-chend den beschriebenen virologischen Synapsen, wo virale Proteine akkumulierten und CD150 aktinabhängig rekrutiert wurde, und seltener über aktinreiche Filopodien. Die HIV-VS Markerproteine ICAM-1, aktiviertes LFA-1, CD81, DC-SIGN und der phosphorylierte Ezrin / Radixin / Moesin (ERM)-Proteinkomplex polarisierten zur MV-VS. Moesin und der Substanz P Rezeptor (SPR), die Prozesse des MV-Eintritts oder der Aufnahme unterstützen, akkumulierten ebenfalls in den Transmissionsstrukturen. Zusammengefasst zeigte diese Arbeit, dass die gebildete Plattform für MV-Transmission (MV-VS) wichtige Gemeinsamkeiten mit der HIV-VS teilt. In der MV-VS akkumulierten Proteine, die Aktindynamiken regulieren, die die Konjugatstabilität verstärken und die die Membranfusion unterstützen, die einen effizienten Eintritt des MV in T-Zellen ermöglichen. N2 - Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells (APCs) that recognise pathogens and upon maturation induce specific adaptive immunity. Measles virus (MV) infects human immature DCs in a CD150- and DC-SIGN-dependent manner. Infected DCs possibly mediate MV transport from the respiratory tract to secondary lymphatics where induction of MV-specific immunity, generalized immunosuppression and MV transmission to T lymphocytes occurs, which is essential for viral dissemination. MV infection of DCs was accompanied by DC maturation and moderate upregulation of CD150 surface display. The accumulation of viral proteins and the release of infectious parti-cles were restricted in DCs as compared to the MV producing B cell line B95a. This work compared subcellular distribution of viral proteins in DCs in B95a cells. The association of the matrix (M) protein with components of the ribonucleoprotein (RNP) complex was more prominent in DCs. The distinctive redistribution of CD81 to P protein compartments as well as the inhibition of spatial tetraspanin interaction was confined to B95a cells. A virus contain-ing compartment (VCC) as described for HIV-1 earlier was neither detectable for MV in DCs nor in B95a cells. To monitor intracellular trafficking of de novo synthesised M protein in infected DCs, a tetra-cysteine (TC)-tag was fused to the c-terminus of the M protein. The M-TC fusion protein did not differ from the unmodified protein with regard to all biological properties examined such as intracellular distribution, DRM association and formation and release of virus like particles (VPLs). In the context of virus infection, the tag strongly interfered with virus replication and/or release. Because MV production is restricted in DCs, these require an organized structure for virus transmission to T cells. MV transmission to autologous T cells mainly relied on the DC infec-tion (referred to as cis-infection) while MV trapping by DC-SIGN and subsequent transmis-sion (referred to as trans-infection) played a minor role. Transmission essentially involved interaction between the viral glycoprotein H with its receptor CD150. In addition to rare asso-ciation with actin rich filopodial structures, viral proteins accumulated at DC/T cell contact interfaces consistent with that of the virological synapse (VS) to which also CD150 was re-cruited in an actin dependent manner. The HIV VS marker proteins ICAM-1, activated LFA-1, CD81, DC-SIGN and phosphorylated ezrin / radixin / moesin (ERM) protein complex also redistributed towards the MV VS. Moesin and substance P receptor which were implicated in assisting in MV entry earlier, also accumulated in the transmission structure. Taking together, this work showed that the forming platforms for MV transmission (MV VS) shares similarities with the HIV VS where proteins accumulate that may regulate actin dynamics, enhance conjugate stability and facilitate membrane fusion as required for efficient entry of MV into target T cells. KW - Masernvirus KW - Dendritische Zelle KW - Transmission KW - Masernvirus-Infektion KW - Virologische Synapse KW - Virus-Transmission KW - measles virus infection KW - dendritic cells KW - virological synapse KW - virus transmission Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73108 ER - TY - THES A1 - Koetschan, Christian T1 - The Eukaryotic ITS2 Database - A workbench for modelling RNA sequence-structure evolution T1 - Die Eukaryotische ITS2 Datenbank - Eine Plattform zur Modellierung von RNA Sequenzstruktur Evolution N2 - In den vergangenen Jahren etablierte sich der Marker „internal transcribed spacer 2" (ITS2) zu einem häufig genutzten Werkzeug in der molekularen Phylogenetik der Eukaryoten. Seine schnell evolvierende Sequenz eignet sich bestens für den Einsatz in niedrigeren phylogenetischen Ebenen. Die ITS2 faltet jedoch auch in eine sehr konservierte Sekundärstruktur. Diese ermöglicht die Unterscheidung weit entfernter Arten. Eine Kombination aus beiden in einer Sequenzstrukturanalyse verbessert die Auflösung des Markers und ermöglicht die Rekonstruktion von robusteren Bäumen auf höherer taxonomischer Breite. Jedoch war die Durchführung solch einer Analyse, die die Nutzung unterschiedlichster Programme und Datenbanken vorraussetzte, für den klassischen Biologen nicht einfach durchführbar. Um diese Hürde zu umgehen, habe ich den „ITS2 Workbench“ entwickelt, eine im Internet nutzbare Arbeitsplattform zur automatisierten sequenzstrukturbasierten phylogenetischen Analyse basierend auf der ITS2 (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de). Die Entwicklung begann mit der Längenoptimierung unterschiedlicher „Hidden Markov Model“ (HMM)-Topologien, die erfolgreich auf ein Modell zur Sequenzstrukturvorhersage der ITS2 angewandt wurden. Hierbei wird durch die Analyse von Sequenzbestandteilen in Kombination mit der Längenverteilung verschiedener Helixregionen die Struktur vorhergesagt. Anschließend konnte ich HMMs auch bei der Sequenzstrukturgenerierung einsetzen um die ITS2 innerhalb einer gegebenen Sequenz zu lokalisieren. Dieses neu implementierte Verfahren verdoppelte die Anzahl vorhergesagter Strukturen und verkürzte die Laufzeit auf wenige Tage. Zusammen mit weiteren Optimierungen des Homologiemodellierungsprozesses kann ich nun erschöpfend Sekundärstrukturen in mehreren Interationen vorhersagen. Diese Optimierungen liefern derzeit 380.000 annotierte Sequenzen einschließlich 288.000 Strukturvorhersagen. Um diese Strukturen für die Berechnung von Alignments und phylogenetischen Bäumen zu verwenden hab ich das R-Paket „treeforge“ entwickelt. Es ermöglicht die Generierung von Sequenzstrukturalignments auf bis zu vier unterschiedlich kodierten Alphabeten. Damit können erstmals auch strukturelle Basenpaarungen in die Alignmentberechnung mit einbezogen werden, die eine Schätzung neuer Scorematrizen vorraussetzten. Das R-Paket ermöglicht zusätzlich die Rekonstruktion von „Maximum Parsimony“, „Maximum Likelihood“ und „Neighbour Joining“ Bäumen auf allen vier Alphabeten mittels weniger Zeilen Programmcode. Das Paket wurde eingesetzt, um die noch umstrittene Phylogenie der „chlorophyceae“ zu rekonstruieren und könnte in zukünftigen Versionen des ITS2 workbench verwendet werden. Die ITS2 Plattform basiert auf einer modernen und sehr umfangreichen Web 2.0 Oberfläche und beinhaltet neuste AJAX und Web-Service Technologien. Sie umfasst die HMM basierte Sequenzannotation, Strukturvorhersage durch Energieminimierung bzw. Homologiemodellierung, Alignmentberechnung und Baumrekonstruktion basierend auf einem flexiblen Datenpool, der Änderungen am Datensatz automatisch aktualisiert. Zusätzlich wird eine Detektion von Sequenzmotiven ermöglicht, die zur Kontrolle von Annotation und Strukturvorhersage dienen kann. Eine BLAST basierte Suche auf Sequenz- und Strukturebene bietet zusätzlich eine Vereinfachung des Taxonsamplings. Alle Funktionen sowie die Nutzung der ITS2 Webseite sind in einer kurzen Videoanleitung dargestellt. Die Plattform lässt jedoch nur eine bestimmte Größe von Datensätzen zu. Dies liegt vor allem an der erheblichen Rechenleistung, die bei diesen Berechnungen benötigt wird. Um die Funktion dieses Verfahrens auch auf großen Datenmengen zu demonstrieren, wurde eine voll automatisierte Rekonstruktion des Grünalgenbaumes (Chlorophyta) durchgeführt. Diese erfolgreiche, auf dem ITS2 Marker basierende Studie spricht für die Sequenz-Strukturanalyse auf weiteren Daten in der Phylogenetik. Hier bietet der ITS2 Workbench den idealen Ausgangspunkt. N2 - During the past years, the internal transcribed spacer 2 (ITS2) was established as a commonly used molecular phylogenetic marker for the eukaryotes. Its fast evolving sequence is predestinated for the use in low-level phylogenetics. However, the ITS2 also consists of a very conserved secondary structure. This enables the discrimination between more distantly related species. The combination of both in a sequence-structure based analysis increases the resolution of the marker and enables even more robust tree reconstructions on a broader taxonomic range. But, performing such an analysis required the application of different programs and databases making the use of the ITS2 non trivial for the typical biologist. To overcome this hindrance, I have developed the ITS2 Workbench, a completely web-based tool for automated phylogenetic sequence-structure analyses using the ITS2 (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de). The development started with an optimization of length modelling topologies for Hidden Markov Models (HMMs), which were successfully applied on a secondary structure prediction model of the ITS2 marker. Here, structure is predicted by considering the sequences' composition in combination with the length distribution of different helical regions. Next, I integrated HMMs into the sequence-structure generation process for the delineation of the ITS2 within a given sequence. This re-implemented pipeline could more than double the number of structure predictions and reduce the runtime to a few days. Together with further optimizations of the homology modelling process I can now exhaustively predict secondary structures in several iterations. These modifications currently provide 380,000 annotated sequences including 288,000 structure predictions. To include these structures in the calculation of alignments and phylogenetic trees, I developed the R-package "treeforge". It generates sequence-structure alignments on up to four different coding alphabets. For the first time also structural bonds were considered in alignments, which required the estimation of new scoring matrices. Now, the reconstruction of Maximum Parsimony, Maximum Likelihood as well as Neighbour Joining trees on all four alphabets requires just a few lines of code. The package was used to resolve the controversial chlorophyceaen dataset and could be integrated into future versions of the ITS2 workbench. The platform is based on a modern, feature-rich Web 2.0 user interface equipped with the latest AJAX and Web-service technologies. It performs HMM-based sequence annotation, structure prediction by energy minimization or homology modelling, alignment calculation and tree reconstruction on a flexible data pool that repeats calculations according to data changes. Further, it provides sequence motif detection to control annotation and structure prediction and a sequence-structure based BLAST search, which facilitates the taxon sampling process. All features and the usage of the ITS2 workbench are explained in a video tutorial. However, the workbench bears some limitations regarding the size of datasets. This is caused mainly due to the immense computational power needed for such extensive calculations. To demonstrate the validity of the approach also for large-scale analyses, a fully automated reconstruction of the Chlorophyta (Green Algal) Tree of Life was performed. The successful application of the marker even on large datasets underlines the capabilities of ITS2 sequence-structure analysis and suggests its utilization on further datasets. The ITS2 workbench provides an excellent starting point for such endeavours. KW - Ribosomale RNA KW - Datenbank KW - Marker KW - Phylogenie KW - Evolution KW - Sequenz KW - Struktur KW - Hidden Markov Model KW - Evolution KW - ribosomal RNA KW - workbench KW - sequence-structure Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73128 ER - TY - THES A1 - Dwertmann, Anne T1 - Impact of the Tumor Suppressor Arf on Miz1 and Sumoylation of Myc and Miz1 T1 - Wirkung des Tumorsuppressors Arf auf Miz1 und Sumoylierung von Myc und Miz1 N2 - Upon oncogenic stress, the tumor suppressor Arf can induce irreversible cell cycle arrest or apoptosis, depending on the oncogenic insult. In this study, it could be shown that Arf interacts with Myc and the Myc-associated zinc-finger protein Miz1 to facilitate repression of genes involved in cell adhesion. Formation of a DNA-binding Arf/Myc/Miz1 complex disrupts interaction of Miz1 with its coactivator nucleophosmin and induces local heterochromatinisation, causing cells to lose attachment and undergo anoikis. The assembly of the complex relies on Myc, which might explain why high Myc levels trigger apoptosis and not cell cycle arrest in the Arf response. This mechanism could play an important role in eliminating cells harboring an oncogenic mutation. Arf furthermore induces sumoylation of Miz1 at a specific lysine by repressing the desumoylating enzyme Senp3. A sumoylation-deficient mutant of Miz1 however does not show phenotypic differences under the chosen experimental conditions. Myc can also be modified by Sumo by multisumoylation at many different lysines, which is unaffected by Arf. The exact mechanism and effect of this modification however stays unsolved. N2 - Der Tumorsuppressor Arf wird durch onkogenen Stress induziert und kann entweder einen irreversiblen Zellzyklusarrest oder Apoptose auslösen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arf mit Myc und dem Myc-interagierenden Zinkfingerprotein Miz1 assoziiert und dadurch Gene der Zelladhäsion reprimiert. Die Ausbildung eines DNA-bindenden Arf/Myc/Miz1 Komplexes verhindert eine Interaktion von Miz1 mit seinem Koaktivator Nucleophosmin und führt zur lokalen Ausbildung von Heterochromatin, was zum Ablösen der Zellen und schließlich zur Anoikis führt. Die Komplexbildung setzt die Beteiligung von Myc voraus, was erklären könnte warum hohe Mengen an Myc über Arf Apoptose und nicht Zellzyklusarrest auslösen. Dieser Mechanismus könnte eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Zellen mit einer onkogenen Mutation spielen. Arf induziert darüber hinaus die Sumoylierung von Miz1 an einem bestimmten Lysin indem es das desumoylierende Enzyme Senp3 inhibiert. Eine Mutante von Miz1 die nicht mehr sumoyliert werden kann zeigt jedoch in den durchgeführten Untersuchungen keinen anderen Phänotyp als Wildtyp Miz1. Myc kann ebenfalls an vielen verschiedenen Lysinen mit Sumo modifiziert werden, wobei Arf jedoch keine Rolle spielt. Der genaue Mechanismus und Effekt dieser Modifikation konnte jedoch nicht geklärt werden. KW - Apoptosis KW - Myc KW - Repression KW - Anoikis KW - Zelladhäsion KW - Miz1 KW - Sumo KW - Sumoylierung KW - arf KW - anoikis KW - cell adhesion KW - Miz1 KW - sumo KW - sumoylation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71876 ER - TY - THES A1 - Zhang, Guoliang T1 - Phytochemical Research on Two Ancistrocladus Species, Semi-Synthesis of Dimeric Naphthylisoquinoline Alkaloids, and Structure Optimization of Antitumoral Naphthoquinones T1 - Phytochemische Untersuchungen an zwei Ancistrocladus-Arten, Semi-Synthese dimerer Naphthylisochinolin-Alkaloide und Strukturoptimierung von antitumoralen Naphthochinonen N2 - Plant-derived natural products and their analogs continue to play an important role in the discovery of new drugs for the treatment of human diseases. Potentially promising representatives of secondary metabolites are the naphthylisoquinoline alkaloids, which show a broad range of activities against protozoan pathogens, such as plasmodia, leishmania, and trypanosoma. Due to the increasing resistance of those pathogens against current therapies, highly potent novel agents are still urgently needed. Thus, it is worthy to discover new naphthylisoquinoline alkaloids hopefully with pronounced bioactivities by isolation from plants or by synthesis. The naphthylisoquinoline alkaloids are biosynthetically related to another class of plant-derived products, the naphthoquinones, some of which have been recently found to display excellent anti-multiple myeloma activities without showing any cytotoxicities on normal blood cells. Multiple myeloma still remains incurable, although remissions may be induced with co-opted therapeutic treatments. Therefore, more potent naphthoquinones are urgently required, and can be obtained by isolation from plants or by synthesis. In detail, the results in this thesis are listed as follows: 1) Isolation and characterization of naphthylisoquinoline alkaloids from the stems of a Chinese Ancistrocladus tectorius species. Nine new naphthylisoquinoline alkaloids, named ancistectorine A1 (60), N-methylancistectorine A1 (61), ancistectorine A2 (62a), 5-epi-ancistectorine A2 (62b), 4'-O-demethylancistectorine A2 (63), ancistectorine A3 (64), ancistectorine B1 (65), ancistectorine C1 (66), and 5-epi-ancistrolikokine D (67) were isolated from the Chinese A. tectorius and fully characterized by chemical, spectroscopic, and chiroptical methods. Furthermore, the in vitro anti-infectious activities of 60-62 and 63-66 have been tested. Three of the metabolites, 61, 62a, and 62b, exhibited strong antiplasmodial activities against the strain K1 of P. falciparum without showing significant cytotoxicities. With IC50 values of 0.08, 0.07, and 0.03 μM, respectively, they were 37 times more active than the standard chloroquine (IC50 = 0.26 μM). Moreover, these three compounds displayed high antiplasmodial selectivity indexes ranging from 100 to 3300. According to the TDR/WHO guidelines, they could be considered as lead compounds. In addition, seven alkaloids, 69-74 (structures not shown here), were isolated from A. tectorius that were known, but new to the plant, together with another fourteen known compounds (of these, only the structures of the three main alkaloids, 5a, 5b, and 78 are shown here), which had been previously found in the plant. The three metabolites ancistrocladine (5a), hamatine (5b), and (+)-ancistrocline (78) were found to show no or moderate activities against the MM cell lines. 2) Isolation and characterization of naphthylisoquinoline alkaloids from the root bark of a new, botanically yet undescribed Congolese Ancistrocladus species. An unprecedented dimeric Dioncophyllaceae-type naphthylisoquinoline alkaloid, jozimine A2 (84), as first recognized by G. Bauckmann from an as yet undescribed Ancistrocladus species, was purified and characterized as part of this thesis. Its full structural assignment was achieved by spectroscopic and chiroptical methods, and further confirmed by an X-ray diffraction analysis, which had never succeeded for any other dimeric naphthylisoquinoline alkaloids before. Structurally, the dimer is composed of two identical 4'-O-demethyldioncophylline A halves, coupled through a sterically hindered central axis at C-3',3'' of the two naphthalene moieties. Pharmacologically, jozimine A2 (84) showed an extraordinary antiplasmodial activity (IC50 = 1.4 nM) against the strain NF54 of P. falciparum. Beside jozimine A2 (85), another new alkaloid, 6-O-demethylancistrobrevine C (84), and four known ones, ancistrocladine (5a), hamatine (5b), ancistrobrevine C (86), and dioncophylline A (6) were isolated from the Ancistrocladus species, the latter in a large quantity (~500 mg), showing that the plant produces Ancistrocladaceae-type, mixed-Ancistrocladaceae/Dioncophyllaceae-type, and Dioncophyllaceae-type naphthyl- isoquinoline alkaloids. Remarkably, it is one of the very few plants, like A. abbreviatus, and A. barteri, that simultaneously contain typical representatives of all the above three classes of alkaloids. 3) Semi-synthesis of jozimine A2 (85), 3'-epi-85, jozimine A3 (93) and other alkaloids from dioncophylline A (6). The dimeric naphthylisoquinoline alkaloids, jozimine A2 (85) and 3'-epi-85, constitute rewarding synthetic targets for a comparative analysis of their antiplasmodial activities and for a further confirmation of the assigned absolute configurations of the isolated natural product of 85. They were semi-synthesized in a four-step reaction sequence from dioncophylline A (6) in cooperation with T. Büttner. The key step was a biomimetic phenol-oxidative dimerization at C-3' of the N,O-dibenzylated derivative of 89 by utilizing Pb(OAc)4. This is the first time that the synthesis of such an extremely sterically hindered (four ortho-substituents) naphthylisoquinoline alkaloid – with three consecutive biaryl axes! – has been successfully achieved. A novel dimeric naphthylisoquinoline, jozimine A3 (93), bearing a 6',6''-central biaryl axis, was semi-synthesized from 5'-O-demethyldioncophylline A (90) by a similar biomimetic phenol-oxidative coupling reaction as a key step, by employing Ag2O. HPLC analysis with synthetic reference material of 3'-epi-85 and 93 for co-elution revealed that these two alkaloids clearly are not present in the crude extract of the Ancistrocladus species from which jozimine A2 (85) was isolated. This evidences that jozimine A2 (85) is very specifically biosynthesized by the plant with a high regio- and stereoslectivity. Remarkably, the two synthetic novel dimeric naphthylisoquinoline alkaloids 3'-epi-85 and 93 were found to display very good antiplasmodial activities, albeit weaker than that of the natural and semi-synthetic product 85. Additionally, the two compounds 3'-epi-85 and 93 possessed high or moderate selectivity indexes, which were much lower than that of 85. However, they can still be considered as new lead structures. Two unprecedented oxidative products of dioncophylline A, the diastereomeric dioncotetralones A (94a) and B (94b), were synthesized from dioncophylline A (6) in a one-step reaction. Remarkably, the aromatic properties in the “naphthalene” and the “isoquinoline” rings of 94a and 94b are partially lost and the “biaryl” axis has become a C,C-double bond, so that the two halves are nearly co-planar to each other, which has never been found among any natural or synthetic naphthylisoquinoline alkaloid. Their full structural characterization was accomplished by spectroscopic methods and quantum-chemical CD calculations (done by Y. Hemberger). The presumed reaction mechanism was proposed in this thesis. In addition, one of the two compounds, 94a, exhibited a highly antiplasmodial activity (IC50 = 0.09 μM) with low cytotoxicity, and thus, can be considered as a new promising lead structure. Its 2'-epi-isomer, 94b, was inactive, evidencing a significant effect of chirality on the bioactivity. Of a number of naphthylisoquinoline alkaloids tested against the multiple-myeloma cell lines, the three compounds, dioncophylline A (6), 4'-O-demethyldioncophylline A (89), and 5'-O-demethyldioncophylline A (90) showed excellent activities, even much stronger than dioncoquinones B (10), C (102), the epoxide 175, or the standard drug melphalan. 4) Isolation and characterization of bioactive naphthoquinones from cell cultures of Triphyophyllum peltatum. Three new naphthoquinones, dioncoquinones C (102), D (103), and E (104), the known 8-hydroxydroserone (105), which is new to this plant, and one new naphthol dimer, triphoquinol A (107), were isolated from cell cultures of T. peltatum in cooperation with A. Irmer. Dioncoquinone C (102) showed an excellent activity against the MM cells, very similar to that of the previously found dioncoquinone B (10), without showing any inhibitory effect on normal cells. The other three naphthoquinones, 103105, were inactive or only weakly active. 5) Establishment of a new strategy for a synthetic access to dioncoquinones B (10) and C (102) on a large scale for in vivo experiments and for the synthesis of their analogs for first SAR studies. Before the synthesis of dioncoquinone B (10) described in this thesis, two synthetic pathways had previously been established in our group. The third approach described here involved the preparation of the joint synthetic intermediate 42 with the previous two routes. The tertiary benzamide 135 was ortho-deprotonated by using s-BuLi/TMEDA, followed by transmetallation with MgBr2▪2Et2O, and reaction with 2-methylallyl bromide (139). It resulted in the formation of ortho-allyl benzamide 140, which was cyclized by using methyl lithium to afford the naphthol 42. This strategy proved to be the best among the established three approaches with regard to its very low number of steps and high yields. By starting with 136, this third strategy yielded the related bioactive natural product, dioncoquinone C (102), which was accessed by total synthesis for the first time. To identify the pharmacophore of the antitumoral naphthoquinones, a library of dioncoquinone B (10) and C (102) analogs were synthesized for in vitro testing. Among the numerous naphthoquinones tested, the synthetic 7-O-demethyldioncoquinone C (or 7-O-hydroxyldioncoquinone B) (145), constitutes another promising basic structure to develop a new anti-MM agent. Furthermore, preliminary SAR results evidence that the three hydroxy functions at C-3, C-5, and C-6 are essential for the biological properties as exemplarily shown through the compounds 10, 102, and 145. All other mixed OH/OMe- or completely OMe-substituted structures were entirely inactive. By a serendipity the expoxide 175 was found to display the best anti-MM activity of all the tested isolated metabolites from T. peltatum, the synthesized naphthoquinones, and their synthetic intermediates. Toxic effects of 175 on normal cells were not observed, in contrast to the high toxicities of all other epoxides. Thus, the anti-MM activity of 175 is of high selectivity. The preliminary SAR studies revealed that the 6-OMe group in 175 is required, thus differed with the above described naphthoquinones (where 6-OH is a requisite in 10, 102, and 145), which evidenced potentially different modes of action for these two classes of compounds. 6) The first attempted total synthesis of the new naturally occurring triphoquinone (187a), which was recently isolated from the root cultures of T. peltatum in our group. A novel naphthoquinone-naphthalene dimer, 187a (structure shown in Chapter 10), was isolated in small quantities from the root cultures of T. peltatum. Thus, its total synthesis was attempted for obtaining sufficient amounts for selected biotestings. The key step was planned to prepare the extremely sterically hindered (four ortho-substituents) binaphthalene 188 by a coupling reaction between the two 2-methylnaphthalene derivatives. Test reactions involving a system of two simplified 2-methylnaphthylboron species and 2-methylnaphthyl bromide proved the Buchwald ligand as most promising. The optimized conditions were then applied to the two true - highly oxygenated - coupling substrates, between the 2-methylnaphthylboron derivatives 210, 211, 213, or 214 and the 2-methylnaphthyl iodides (or bromides) 215 (206), 215 (206), 212 (205), or 212 (205), respectively. Unfortunately, this crucial step failed although various bases and solvent systems were tested. This could be due to the high electron density of the two coupling substrates, both bearing strongly OMOM/OMe-donating function groups. Therefore, a more powerful catalyst system or an alternative synthetic strategy must be explored for the total synthesis of 187a. 7) Phytochemical investigation of the Streptomyces strain RV-15 derived from a marine sponge. Cyclodysidins A-D (216-219), four new cyclic lipopeptides with a- and ß-amino acids, were isolated from the Streptomyces strain RV15 derived from a marine sponge by Dr. U. Abdelmohsen. Their structures were established as cyclo-(ß-AFA-Ser-Gln-Asn-Tyr-Asn-Ser-Thr) by spectroscopic analysis using 2D NMR techniques and CID-MS/MS in the course of this thesis. In conclusion, the present work contributes to the discovery of novel antiplasmodial naphthylisoquinoline alkaloids and antitumoral naphthoquinones, which will pave the way for future studies on these two classes of compounds. N2 - Naturstoffe pflanzlichen Ursprungs und deren Derivate waren seit jeher eine wichtige Quelle für die Entdeckung neuer Arzneistoffe. Darunter stellen die Naphthylisochinolin-Alkaloide eine besonders bedeutsame Klasse an Sekundärmetaboliten dar, die gegen eine breite Vielfalt an pathogenen Protozoen, wie z.B. Plasmodien, Leishmanien und Trypanosomen, aktiv sind. Die zunehmende Resistenz dieser Krankheitserreger gegen vorhandene Therapeutika macht die Erschließung neuer hochwirksamer Substanzen – durch direkte Isolierung aus Pflanzenmaterial oder chemische Synthese – zu einer lohnenswerten Aufgabe. Kürzlich wurde entdeckt, dass Naphthochinone, eine biosynthetisch eng mit den Naphthylisochinolin-Alkaloiden verwandte Naturstoffklasse, exzellente Aktivitäten gegen das Multiple Myelom aufweist. Diese Krebserkrankung ist mit gegenwärtigen Arzneimitteln nicht heilbar, wenngleich unterstützende Therapeutika zu einer Remission führen können. Die Suche nach pharmakologisch wirksamen Naphthochinonen, mittels Isolierung aus Pflanzen oder durch chemische Synthese, ist daher dringend geboten. Die Ergebnisse dieser Arbeit umfassen im Detail die folgenden Teilbereiche: 1) Isolierung diverser Naphthylisochinolin-Alkaloide aus dem Stamm der chinesischen Ancistrocladus tectorius Spezies. Es Wurch neun neue Naphthylisochinlin-Alkaloide aus der in China beheimateten Pflanze A. tectorius. Diese umfassten die sechs 5,1'-gekuppelten Verbindungen Ancistectorin A1 (60), N-Methylancistectorin A1 (61), Ancistectorin A2 (62a), 5-epi-Ancistectorin A2 (62b), 4'-O-Demethylancistectorin A2 (63), Ancistectorin A3 (64), das 7,1'-gekuppelte Ancistectorin B1 (65), das 7,8'-verknüpfte Ancistectorin C1 (66), sowie das 5,8'-verknüpfte 5-epi-Ancistrolikokin D (65) die allesamt vollständig charakterisiert und auf ihre antiplasmodiale Aktivität untersucht wurden. Drei dieser Metabolite, 61, 62a, und 62b, zeigten eine starke antiplasmodiale Aktivität gegen den Stamm K1 von P. falciparum und dennoch keine signifikante Cytotoxizität. Mit IC50-Werten von 0.08, 0.07 und 0.03 μM waren sie 37 mal aktiver als der Standard Chloroquin (IC50 = 0.26 μM). Darüber hinaus verfügten diese drei Verbindungen über einen hohen antiplasmodialen Index von 100 bis 300. Laut WHO-Richtlinien können diese erfolgversprechenden Antimalaria-Wirkstoffe als neue Leitstrukturen angesehen werden. Des Weiteren wurden sieben bekannte Alkaloide, 69-74 (nicht abgebildet), erstmals aus A. tectorius isoliert. 14 weitere, aus dieser Pflanze bereits bekannte, Verbindungen (z.B. 5a, 5b, und 78) wurden ebenfalls gefunden. Die drei Hauptalkaloide Ancistrocladin (5a), Hamatin (5b) und (+)-Ancistroclin (78) hatten jedoch keine bzw. nur mäßige Aktivitäten gegen MM-Zelllinien. 2) Isolierung der Naphthylisochinolin-Alkaloide aus der Stammrinde einer neuen und botanisch noch unbeschriebenen, kongolesichen Ancistrocladus Spezies. Ein beispielloses dimeres Naphthylisochinolin-Alkaloid aus der Klasse der Dioncophyllaceae, Jozimin A2 (85), wurde aus einer bis dahin noch nicht beschriebenen Ancistrocladus Spezies in Zusammenarbeit mit G. Bauckmann isoliert. Mithilfe von spektroskopischen und chiroptischen Methoden erfolgte die vollständige Strukturaufklärung. Zum ersten Mal bei einem dimeren Naphthylisochinolin-Alkaloid wurde darüber hinaus dessen Struktur mittels Röntgenstrukturanalyse verifiziert. Die Struktur weist zwei identische miteinander verknüpfte 4'-O-Demethyldioncophyllin A Hälften auf, die in den Naphthalin-Einheiten an C-3' und C-3'' sterisch so stark gehindert sind, dass eine dritte rotationsstabile – und daher chirale – Achse vorliegt. Jozimin A2 (85) ragt pharmakologisch betrachtet durch die beste bis dahin gemessene antiplasmodiale Aktivität (IC50 = 1.4 nM, P. falciparum NF54) aller natürlichen monomeren und dimeren Naphthylisochinoline heraus. Neben Jozimin A2 (85) wurde ein weiteres neues Alkaloid, 6-O-Demethylancistrobrevin C (84), und die vier bekannten Monomere Ancistrocladin (5a), Hamatin (5b), Dioncophyllin A (6), und Ancistrobrevin C (86) aus dieser Ancistrocladus Spezies isoliert. Man konnte zeigen, dass die Pflanze Naphthylisochinolin-Alkaloide vom Ancistrocladaceae Typ, vom gemischten Ancistrocladaceae/Dioncophyllaceae Typ und vom Dioncophyllaceae Typ produziert. Dies ist umso bemerkenswerter, als dass nur wenige Pflanzen wie A. abbreviatus und A. barteri bekannt sind, die typische Vertreter aller drei Alkaloid-Klassen beinhalten. 3) Semi-Synthese des dimeren Naphthylisochinolin-Alkaloids Jozimine A2 (85) und seiner Derivate. Aufgrund seiner exzellenten antiplasmodialen Aktivität stellte das Naphthylisochinolin-Alkaloid Jozimin A2 (85), eine lohneswerte Zielstruktur für eine Synthese dar. Die Verbindung wurde durch Semisynthese in vier Stufen aus Dioncophyllin A (6) in Zusammenarbeit mit T. Büttner erschlossen. Als Schlüsselschritt erwies sich die biomimetische, oxidative Kupplung von 89 an C-3’ unter Verwendung von Pb(OAc)4. Der Aufbau einer solch sterisch gehinderten, zentralen Achse mit vier ortho-Substituenten wurde zum ersten Mal an Naphthylisochinolin-Alkaloiden erfolgreich durchgeführt. Zusammen mit Jozimin A2 (85) erhielt man sein 3',3''-Atropisomer 3'-epi-85. Parallel dazu wurde Jozimine A3 (93) dargestellt, dessen 6',6''-Zentral-Achse ebenfalls ausgehend von Dioncophyllin A (6) in einer Schlüsselsequenz mittels Ag2O aufgebaut wurde. HPLC-Coelutionsexperimente der synthetisch erhaltenen Verbindungen 3'-epi-85 und 93 zeigten zweifelsfrei, dass die beiden Alkaloide nicht im Rohextrakt der bisher unbestimmten Ancistrocladus-Art, aus welcher Jozimin A2 (85) isoliert wurde, vorhanden waren. Die Biosynthese von 85 erfolgt in der Pflanze offensichtlich mit hoher Spezifität. Die neuen synthetisch hergestellten, dimeren Naphthylisochinolin-Alkaloide 3'-epi-85 und 93 zeigten sehr gute, wenn auch im Vergleich zum natürlichen und semi-synthetisch erhaltenen 85 schwächere, antiplasmodiale Aktivitäten. Desweiteren besitzen die beiden Verbindungen 3'-epi-85 und 93 hohe bzw. moderate Selektivitäts-Indices, welche allerdings weit unter dem Wert von 85 liegen. Nichtsdestotrotz können sie als neue Leitstrukturen betrachtet werden. Im Verlauf der Synthese von Jozimin A2-Derivaten wurden des weiteren die zwei unbekannten Diastereoisomere, Dioncophynon A (94a) and B (94b), synthetisiert. Man erhielt diese in einer Stufe aus Dioncophyllin A (6). Die Strukturen von 94a und 94b zeichneten sich durch einen partiellen Verlust der Aromatizität am Naphthalin-Ring und eine C,C-Doppelbindung an der früheren Biarylachse aus. Die gefundenen Strukturmotive waren bis dahin weder von natürlichen noch von synthetischen Naphthylisochinolinen bekannt. Die vollständige Charakterisierung gelang durch spektroskopische Methoden und quantenchemische CD-Berechnungen (Y. Hemberger). Ein möglicher Mechanismus zur Bildung dieser Moleküle wurde ebenfalls in dieser Arbeit vorgestellt. Darüber hinaus zeigte eine dieser Verbindungen, 94a, eine hohe antiplasmodiale Aktivität (IC50 = 0.09 μM) bei gleichzeitig nur geringer Toxizität und konnte daher als vielversprechende Leitstruktur betrachtet werden. Dagegen war 94b inaktiv, was den signifikanten Effekt stereogener Elemente auf die Bioaktivität unterstrich. Aus einer ganzen Reihe von Naphthylisochinolin-Alkaloiden, die bzgl. ihrer Aktivität gegen das Multiple Myelom getestet wurden, zeigten v.a. drei Verbindungen, nämlich Dioncophyllin A (6), 4'-O-Demethyldioncophyllin A (89) und 5'-O-Demethyldioncophyllin A (90), exzellente Wirksamkeiten und übertrafen dabei sogar die Dioncochinone B (10) und C (102), das Epoxid 175 und die Referenzsubstanz Melphalan. 4) Isolierung der bioaktiven Naphthochinone aus Zellkulturen von Triphyophyllum peltatum. Drei neue Dioncochinone C (102), D (103) und E (104), das für diese Pflanze noch unbekannte 8-Hydroxydroseron (105) und ein neues Naphthalin-Dimer 107 wurden aus Zellkulturen von T. peltatum in Kooperation mit A. Irmer isoliert. Dioncochinon C (102) wies eine ausgezeichnete Aktivität gegen MM-Zellen, ähnlich zu der von Dioncochinon B, auf, wobei jedoch kein inhibierender Effekt auf normale Zellen beobachtet wurde. Die anderen drei Naphthochinone 103105 waren inaktiv oder nur sehr schwach aktiv gegenüber MM-Zellen. 5) Etablierung neuer Strategien für einen Zugang zu den Dioncochinonen B und C im großen Maßstab für In-vivo-Biotests sowie Synthese von Dioncochinon B-Analoga für SAR-Untersuchungen. Vor Beginn dieser Arbeiten zur Synthese von Dioncochinon B (10) existierten bereits zwei, in unserem Arbeitskreis erschlossene, Synthesewege. Die hier beschriebene dritte Möglichkeit zur Darstellung von Dioncochinon B (10) etablierte einen neuen Zugang zu dem gemeinsamen Intermediat 42. Man ortho-deprotonierte zunächst das tertiäre Amid 135 mit sec-BuLiTMEDA, führte anschließend eine Transmetallierung mit MgBr2▪2Et2O durch und setzte das Intermediat mit 2-Methylallylbromid (139) zum ortho-Allylbenzamid 140 um, welches schließlich mit Methyllithium zum Naphthol 42 zyklisiert wurde. Diese Strategie war den beiden früheren Ansätzen hinsichtlich der hohen Ausbeute und der geringen Anzahl an Synthesestufen überlegen. Darauf aufbauend gelang die erste Totalsynthese des bioaktiven Naturstoffes Dioncochinon C (102). Zur Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehung und zur Identifizierung des Pharmakophors der antitumoralen Naphthochinone wurden ca. 30 Analoga von Dioncochinon B (10) und C (102) synthetisiert und auf ihre Anti-MM-Wirkung getestet. Unter den zahlreichen dabei untersuchten Derivaten stellte die synthetische Verbindung 7-O-Demethyldioncochinon C (oder 7-O-Hydroxyldioncochinon B) (145) eine weitere vielversprechende Leitstruktur für die Entwicklung neuer Anti-MM-Kandidaten dar. Als besonders bemerkenswert erwiesen sich die antitumoralen Eigenschaften der Verbindungen 10, 102, und 145. Diese besitzen drei Hydroxygruppen an C-3, C-5 und C-6, die für Ihre biologischen Eigenschaften essentiell zu sein scheinen, da alle anderen Strukturen mit einem gemischten OH/OMe-Muster und jene vollständig OMe-substituierten Verbindungen inaktiv waren. Das Expoxid 175, zeigte unter allen natürlich vorkommenden als auch synthetischen Naphthochinonen und deren Derivaten die beste Aktivität gegen das Multiple Myelom. Gleichzeitig wurde keine Toxizität gegenüber normalen Zellen festgestellt. Dies stand im Gegensatz zu anderen Epoxiden, die über recht hohe Toxizitäten verfügten, wenngleich bei sehr guten Anti-MM-Aktivitäten. Umso bemerkenswerter ist die hohe Selektivität von 175 gegenüber Multiple-Myelom-Zellen. Einleitende SAR Studien zu 175 zeigten, dass die O-Me-Gruppe unbedingt erforderlich ist. Dies lässt auf einen von den Naphthochinonen 10, 102 und 145 verschiedenen Wirkmechanismus schließen, da die drei genannten Verbindungen an C-6 eine OH-Funktionalität tragen. 6) Die erste Totalsynthese eines neuen natürlichen Dimers aus T. peltatum, bestehend aus einer Naphthalin- und einer 1,2-Naphthochinon-Einheit. Man isolierte nur in Spuren ein neuartiges Naphthochinon-Naphthalin-Dimer 187a aus Wurzelkulturen von T. peltatum. Die Totalsynthese von 187a sollte deshalb ausreichende Mengen für ausgewählte Biotests verfügbar machen. Den Schlüsselschritt stellte die Kupplung von zwei sterisch sehr stark gehinderten 2-Methylnaphthalin-Ringen mit jeweils zwei ortho-Substituenten dar. Die Kupplung der 2-Methylnaphthylboronsäure -Derivate mit 2-Methylnaphthylbromid führte unter Verwendung des von Buchwald entwickelten Liganden 196, Pd2(dba)3 und geeigneten Lösungsmitteln und Basen zum racemischen Produkt. Die für das oben beschriebene System optimierten Bedingungen wurden auf die beiden genuinen – hoch-oxygenierten – Substrate die 2-Methylnaphthyl boronsäure-Derivate 210, 211, 213, oder 214 und 2-Methylnaphthyliodide (oder -bromide) 215 (206), 215 (206), 212 (205) oder 212 (205) angewandt. Leider führten zahlreiche Versuche unter Erprobung diverser Basen- und Lösungsmittelsysteme nicht zum Erfolg. Eine mögliche Erklärung liegt in der hohen Elektronendichte der beiden Kupplungspartner, die von den zwei bzw. drei Sauerstoffsubstituenten herrührt. Eine alternative Synthesestrategie oder der Einsatz eines leistungsfähigeren Katalysatorsystems muss deshalb zur Totalsynthese von 187a in Erwägung gezogen werden. 7) Phytochemische Untersuchung des marinen Streptomyces-Stammes RV-15 aus Schwämmen. Die vier neuen cyclischen Lipopeptide Cyclodysidin A-D (216219), welche sowohl aus - als auch - Aminosäuren aufgebaut sind, wurden aus RV-15, einem Streptomyces- Stamm, der mit Schwämmen vergesellschaft ist, isoliert. In Zusammenarbeit mit Dr. U. Abdelmohsen identifizierte man deren Struktur als Cyclo-(ß-AFA-Ser-Gln-Asn-Tyr-Asn- Ser-Thr) mithilfe von 2D-NMR-Spektroskopie und CID-MS/MS. KW - Ancistrocladus KW - dimerer Naphthylisochinolin-Alkaloide KW - Naphthochinonen KW - Ancistrocladus KW - Dimeric Naphthylisoquinoline Alkaloids KW - Naphthoquinones Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72734 ER -