TY - THES A1 - Wu, Rongxue T1 - Treatment with integrin alpha v inhibitor abolishes compensatory cardiac hypertrophy due to altered signal transduction and ECM gene expression T1 - xxx N2 - Integrine sind Transmembranrezeptoren, welche mechanische Signale von der extrazellulären Matrix (ECM) zum Zytoskelett übermitteln ("outside-in-signaling"). Viele molekulare Defekte in der Verbindung zwischen Zytoskelett und ECM erzeugen bekanntermaßen Kardiomyopathien. alpha v Integrin scheint eine Hauptrolle in verschiedenen Prozessen der kardialen Reorganisation zu spielen, wie z.B. Regulation der Zellproliferation, -migration und -differenzierung. Unsere Hypothese war, dass alpha v -Integrin-vermittelte Signale notwendig für die kompensatorische Hypertrophie nach Aortenkonstriktion sind und assoziiert mit der Modulation der Expression von ECM-Proteinen. Dazu wurden Mäuse mit einem spezifischen alpha v Integrin-Inhibitor behandelt und einer Aortenkonstriktion (AB) unterzogen. Nach zwei Tagen und nach sieben Tagen wurden die Mäuse echokardiographisch untersucht und eingehende hämodynamische Untersuchungen wurden durchgeführt. Die Behandlung mit dem alpha v -Integrin-Inhibitor führte zu einer dilatativen Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz in den AB-Mäusen, gekennzeichnet durch einen dilatierten linken Ventrikel, schlechte linksventrikuläre Funktion und einer Lungenstauung, wohingegen die scheinbehandelten Tiere eine kompensatorische Hypertrophie des linken Ventrikels zeigten. Untersuchungen der beteiligten Signalwege zeigten eine Aktivierung des p38 MAP-Kinase-Signalwegs, von ERK 1 und -2, der Focal Adhesion Kinase FAK und Tyrosin-Phosphorylierung von c-Src in den Kontrollherzen, was in den Inhibitor-behandelten Herzen fehlte. mRNA-Expressionsanalysen für 96 Gene mittels "Micro-Arrays" ermittelten verschiedene genomische Ziele des alpha v -Integrin-aktivierten Signalwegs. 18 für ECM-Proteine codierende Gene wurden mehr als 2-fach hochreguliert, z.B. Kollagen (8,11-fach ± 2,2), Fibronectin (2,32 ± 094), SPARC (3,78 ± 0,12), ADAMTS-1 (3,51 ± 0,81) und TIMP2 (2,23 ± 0,98), wohingegen die Aktivierung dieser Gene in Inhibitor-behandelten Tieren aufgehoben war. Wir folgern daraus, dass Signalwege unterhalb von alpha v -Integrin, mediiert durch MAP-Kinasen, FAK und c-Src, zu einer verstärkten Expression von ECM-Komponenten führt, welche für die kompensatorische Antwort auf Druckbelastung nötig sind. N2 - Integrins are transmembrane receptors transmitting mechanical signals from the extracellular matrix (ECM) to the cytoskeleton (outside-in-signaling). Many molecular defects in the link between cytoskeleton and ECM are known to induce cardiomyopathies. alpha v integrin appears to play a major role in several processes relevant to remodeling, such as binding and activation of matrix metalloproteinases as well as regulation of cell proliferation, migration, and differentiation. We hypothesized that alpha v integrin-mediated signaling is required for the compensatory hypertrophy after aortic banding (AB) and associated with the modulation of ECM protein expression. Mice were treated in vivo with a specific integrin alpha v inhibitor or vehicle via osmotic minipumps starting 1 day prior to aortic banding (AB). At day 2 and day 7 following AB or sham-operation, the mice were examined by echocardiography and hemodynamic analyses were performed. Treatment of alpha v Integrin inhibitor led to a dilated cardiomyopathy and congestive heart failure in AB mice (dilated left ventricle, depressed LV function, and pulmonary congestion), but not to hypertrophy as observed in mice without inhibitor treatment. Investigation of downstream signaling revealed significant activation of the p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK), the Extracellular signal-Regulated Kinases 1 and 2 (Erk 1/2), Focal Adhesion Kinase (FAK) and tyrosine-phosphorylation of c-Src in mice 7 days after AB. This response was blunted in mice treated with integrin alpha v inhibitor. Microarrays probing for a total of 96 cell adhesion and ECM genes identified various genomic targets of integrin alpha v mediated signalling. 7 days after AB 18 ECM genes were up-regulated more than 2-fold (n=6), e.g. collagen (8.11 ± 2.2), fibronectin (2.32 ± 0.94), secreted protein, acidic and rich in cysteine (SPARC, 3.78 ± 0.12), A disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with trombospondin type 1 (Adamts-1, 3.51 ± 0.81) and Tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP2, 2.23 ± 0.98), whereas this up-regulation was abolished in mice that were treatd by integrin alpha v inhibitor via mini pumps. We conclude that signaling downstream of integrin alpha v is mediated by the MAPK, FAK and c-Src pathways leading to an up-regulation of extracelluar matrix components necessary for the compensatory response of the heart under a condition of pressure overload. KW - Antigen KW - integrin alpha v KW - cardiac hypertrophy KW - signal transduction KW - ECM KW - gene expression KW - integrin alpha v KW - cardiac hypertrophy KW - signal transduction KW - ECM KW - gene expression Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21339 ER - TY - THES A1 - Joner, Michael T1 - Integrinaktivierung und Formation des "fokalen Adhäsionskomplexes" im Hypertrophieprozess adulter Mäuseherzen T1 - activation of integrins and formation of the focal adhesion complex in the process of hypertrophy of adult mice hearts N2 - Chronische Drucküberlastung des adulten Herzens führt zu Umbauvorgängen in der Extrazellulärmatrix und zur Hypertrophie der Herzmuskelzellen. Dabei kommt es zur Aktivierung von Integrinrezeptoren und der dadurch induzierten Entstehung des sogenannten fokalen Adhäsionskomplexes im Zytoskelett der Herzmuskelzelle. Dies konnte kürzlich im Modell der rechtsventrikulären Drucküberlastung an der Katze gezeigt werden. (Laser M et al., J. Biol. Chem, 2000). Um zu testen, ob die Integrinaktivierunng und der Umbau des Zytoskeletts im Hypertrophieprozess des linken Ventrikels eine Rolle spielen, wurden ausgewachsene Mäuse (30g Körpergewicht) nach Konstriktion der transversalen Aorta analysiert und mit scheinoperierten Mäusen verglichen. Morphologisch zeigte sich bei den drucküberlasteten Tieren eine signifikante Herzhypertrophie bezogen auf Körpergewicht und Tibialänge innerhalb eines Monats. Keine Unterschiede fanden sich bei der hämodynamischen Charakterisierung für die in vivo gemessene Herzfrequenz, während der systolische Druck und der enddiastolische Druck signifikant erhöht waren. Zur Western Blot-Analyse wurden jeweils eine Detergens-lösliche sowie eine unlösliche Fraktion (Zytoskelett) der Herzen präpariert. Dabei zeigten sich im Zytoskelett verschiedene tyrosinphosphorylierte Proteine bei 160, 125, 75 und 60 kD, beginnend drei Tage nach Drucküberlastung. Zwei dieser Banden konnten wir als Zytoskelett-assoziierte Tyrosinkinasen, „focal adhesion kinase“(Fak) und c-Src, identifizieren, welche beide zum sogenannten Integrin-abhängigen fokalen Adhäsionskomplex gehören. Weitere Analysen zeigten Phosphorylierungen von Fak bei Tyr-397 und Tyr-925, c-Src bei Tyr-418. Dies lässt darauf schließen, dass beide Kinasen aktiviert sind. Aus diesen Daten wird deutlich, dass eine Aktivierung von Integrinrezeptoren und die Formation des fokalen Adhäsionskomplexes auch im Hypertrophieprozess des linken Ventrikels eine Rolle spielen. Um den Einfluss der Integrin-vermittelten Signalwege auf die Entwicklung der Hypertrophie und deren Signaltransduktion weiter zu testen, wurde eine konditionale „knock-out“-Mauslinie (Cre/loxP-System mit MLC-2v-Promotor) etabliert. Bei diesen Mäusen ist das beta.1-Integrin-Gen selektiv im Myokard ausgeschaltet. Die Ergebnisse aus Phänotypisierung und Charakterisierung dieser Mauslinie im Hypertrophieprozess stehen noch aus. N2 - chronic pressure overload of the adult heart is accompanied by reorganisation of the extracellular matrix and hypertrophy of the heart muscle cell. This is due to an activation of integrin receptors and the formation of the focal adhesion complex in the cytoskeletal fraction of the heart muscle cell. This was recently shown in a model of left ventricular pressure overloading in cats(Laser M et al., J. Biol. Chem, 2000). In order to test the hypothesis that the activation of integrins and the reorganisation of the cytoskeleton is also due to the process of hypertrophy in the left ventricle, we compared adult mice (30g of weight) after aortic banding with sham operated mice. We found a significant hypertrophy of the heart related to weight and length of the tibia within one month. We saw no difference between the in vivo messured heart rate of these mice, but in contrast we found a significant difference between the systolic and the diastolic heart pressure. For the western blot analyses we used a soluble and an insoluble fraction of the hearts. There were several phophorylated proteins at 160, 125, 75 und 60 kD after three days of aortic banding. Two of these were identified as „focal adhesion kinase“(Fak) und c-Src. These two kinases are part of the integrin-dependent focal adhesion complex. Further analyses showed phosphorylisations of Fak at Tyr-397 and Tyr-925, c-Src at Tyr-418. This is due to the activation of these kinases. Within these data we showed that there is an activation of integrins in the process of hypertrophy of the mouse left ventricle and that this is accompanied by the formation of the focal adhesion complex in this model. In order to test the influence of the integrin signaling in the mouse heart we arranged a conditional beta.1-integrin knock-out mouse (Cre/loxP-system with MLC-2v-promotor). These mice lack the beta.1-integrin only in the heart. The results of hemodynamic characterisation need to be done. KW - Integrine KW - fokaler Adhäsionskomplex KW - Signaltransduktion KW - knock-out KW - Integrininhibitor KW - integrins KW - focal adhesion complex KW - knock-out KW - signal transduction KW - integrin inhibitor Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9990 ER - TY - THES A1 - Nething, Katja T1 - Beteiligung der Plasmamembran Ca2+-ATPase an Wachstumsregulation und Signaltransduktion im Überexpressionsmodell und im Myokard transgener Ratten T1 - Role of the plasma membrane calcium ATPase in growth regulation and signal transduction in the myocardium of transgenic rats N2 - Einleitung: Die Plasmamembran Ca2+-ATPase (PMCA) ist ein ubiquitär in eukaryonten Zellen vorkommendes Enzym, das Kalziumionen aus der Zelle transportiert. In Myokardzellen ist ihre Funktion trotz eingehender biochemischer Charakterisierung unklar. Die frühere Hypothese einer Zuständigkeit für die Feinabstimmung der [Ca2+]iz wurde in neuerer Zeit ergänzt durch die vermutete Rolle der PMCA in der Regulation von Zellparametern wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Unterstützt wird dies durch die Lokalisation der ATPase in Caveolae, spezifischen Membraninvaginationen, in denen wichtige Zentren der zellulären Signalverarbeitung gesehen werden. Ziel: Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion der Plasmamembran Ca2+-ATPase, insbesondere eine mögliche Beteiligung des Enzyms an der Übermittlung zellulärer Signale im Rahmen von Apoptose und Wachstum, weiter aufgeklärt werden. Methoden: Die Experimente zur Apoptose in dUTP-nick-end-labeling (TUNEL)-Technik wurden zum einen an einer Myoblastenlinie, zum anderen an transgenen Ratten mit hPMCA 4CI-Überexpression durchgeführt. Die Proteinsyntheseraten neonataler Kardiomyozyten wildtypischer bzw. überexprimierender Tiere mittels 3H-Leucin-Inkorporation in Ruhe und unter Stimulation mit hypertrophieinduzierenden Substanzen wurden verglichen. Ergänzend zu diesen funktionellen Versuchen fanden Immunfluoreszenzanalysen an neonatalen Kardiomyozyten der hPMCA 4CI-überexprimierenden Rattenlinie 1142 statt. Ergebnisse: In der L6-Myoblastenlinie beeinflußte die Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase die Apoptose nicht, ebenso in ruhenden neonatalen Kardiomyozyten. Phenylephrin und Isoproterenol steigerten die Syntheseaktivität in den überexprimierenden Herzmuskelzellen signifikant gegenüber Wildtypkontrollen. NOS-Inhibition mit L-NAME induzierte in den neonatalen Kardiomyozyten Hypertrophie. Die Kombination von L-NAME und Isoproterenol ergab in beiden Zellgruppen gegenüber dem Einzelstimulus verdoppelte Proteinsyntheseraten, wobei die Myozyten der Linie 1142 signifikant stärker ansprachen. Zusammenfassung: Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase moduliert myozytäres Wachstum, wobei ein Einfluß auf den b-adrenergen und NO Signalweg vorliegt. Die mittels Immunfluoreszenz nachgewiesene Lokalisation der PMCA in Caveolae läßt eine Interaktion des Enzyms mit anderen Signaltransduktionsmolekülen in diesen Subkompartimenten vermuten. N2 - Introduction: The plasma membrane calcium ATPase (PMCA) is a calcium-extruding enzyme controlling calcium homeostasis in all eucaryontic cells. Especially in excitable cells like cardiomyocytes its exact function still remains unclear. The former hypothesis of a role in fine tuning of outward calcium currents has to be questioned. Several recent studies indicate that the sarcolemmal Ca2+-pump might play a role in regulating myocardial growth and/or differentiation, possibly through modulation of caveolar signal transduction. Objective: To test whether the PMCA might be involved in cellular processes other than beat-to-beat regulation of contraction/relaxation cycle, especially in growth regulation, apoptosis and signal transduction. Methods: Analysis of apoptosis was performed on L6-myoblasts with stable PMCA-overexpression and neonatal cardiomyocytes from transgenic rats, using the TUNEL-technique according to the manufacturer’s protocol. Growth experiments include several different approaches, comparing unstimulated versus stimulated cardiomyocytes. Stimuli used are catecholamines and L-NAME, an inhibitor of NO synthase. Protein synthesis rate of the cells was assessed via 3H leucine incorporation, serving as a measure for hypertrophy. In addition to these experiments, immunostaining and confocal laser microscopy were performed on the primary cell culture of cardiac myocytes. Results: Overexpression of PMCA did not exert significant effects on apoptosis nor in L6 myoblasts neither in cardiomyocytes. Growth experiments revealed significant higher protein synthesis rates in cardiomyocytes from transgenic rats under catecholamine stimulation with phenylephrine and isoproterenol. L-NAME induces hypertrophy in neonatal cardiomyocytes, combination of isoproterenol and L-NAME produces protein synthesis rates twice as high, predominantly in transgenic cells. Immunostaining showed colocalization of PMCA with caveolin 3, which locates the transgenic enzyme to caveolae. Conclusion: Overexpression of plasma membrane calcium ATPase modulates myocyte growth, with effect on beta-adrenergic and NO pathway. In view of these results and recent findings about caveolae, one could hypothesize that the PMCA exerts its effects by interacting with other signal transduction molecules in these highly specific subcellular compartments. KW - Plasmamembran Ca2+-ATPase KW - Überexpression KW - Signaltransduktion KW - kardiale Hypertrophie KW - transgene Ratten KW - Plasma membrane Ca2+-ATPase KW - overexpression KW - signal transduction KW - cardiomyocyte growth KW - transgenic rat Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7498 ER -