TY - THES A1 - Wäldchen, Felix T1 - 3D Single Molecule Imaging In Whole Cells Enabled By Lattice Light-Sheet Illumination T1 - 3D Einzelmolekülbildgebung in ganzen Zellen ermöglicht durch Gitterlichtblattbeleuchtung N2 - Single molecule localization microscopy has seen a remarkable growth since its first experimental implementations about a decade ago. Despite its technical challenges, it is already widely used in medicine and biology and is valued as a unique tool to gain molecular information with high specificity. However, common illumination techniques do not allow the use of single molecule sensitive super-resolution microscopy techniques such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) for whole cell imaging. In addition, they can potentially alter the quantitative information. In this thesis, I combine dSTORM imaging in three dimensions with lattice lightsheet illumination to gain quantitative molecular information from cells unperturbed by the illumination and cover slip effects. Lattice light-sheet illumination uses optical lattices for beam shaping to restrict the illumination to the detectable volume. I describe the theoretical background needed for both techniques and detail the experimental realization of the system as well as the software that I developed to efficiently evaluate the data. Eventually, I will present key datasets that demonstrate the capabilities of the developed microscope system with and without dSTORM. My main goal here was to use these techniques for imaging the neural cell adhesion molecule (NCAM, also known as CD56) in whole cells. NCAM is a plasma membrane receptor known to play a key role in biological processes such as memory and learning. Combining dSTORM and lattice light-sheet illumination enables the collection of quantitative data of the distribution of molecules across the whole plasma membrane, and shows an accumulation of NCAM at cell-cell interfaces. The low phototoxicity of lattice light-sheet illumination further allows for tracking individual NCAM dimers in living cells, showing a significant dependence of its mobility on the actin skeleton of the cell. N2 - Die Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie hat seit der ersten experimentellen Umsetzung vor etwa 10 Jahren einen bemerkenswerten Aufschwung erfahren. Trotz des hohen technischen Anspruchs findet sie bereits weite Verbreitung in der Biologie und Medizin und wird als einzigartiges Werkzeug geschätzt, um molekulare Information mit hoher Spezifität zu erlangen. Dennoch erschweren die gebräuchlichen Beleuchtungsmethoden die Anwendung von Methoden der Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie wie dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) auf das Volumen ganzer Zellen, denn hier kann die Beleuchtung selbst die quantitativen Daten beeinflussen. In dieser Arbeit kombiniere ich dreidimensionale dSTORM-Bildgebung mit Gitterlichtblattbeleuchtung (engl. lattice light-sheet illumination) um quantitative, molekulare Information ohne durch die Beleuchtung verursachte Störungen zu gewinnen. Die Gitterlichtblattbeleuchtung nutzt optische Gitter zur Strahlformung, um das beleuchtete Volumen auf das detektierbare Volumen zu beschränken. Ich stelle den nötigen, theoretischen Hintergrund für beide Methoden dar und beschreibe die experimentelle Umsetzung sowie die von mir zur effizienten Datenauswertung entwickelte Software. Schließlich präsentiere ich verschiedene Datensätze, die die Fähigkeiten des Systems mit und ohne dSTORM demonstrieren. Mein Hauptziel war hierbei, beide Methoden zu nutzen, um das neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM, engl. neural cell adhesion molecule) in ganzen Zellen abzubilden. NCAM (auch bekannt als CD56) ist ein Rezeptor auf der Plasmembran, der für seine Schlüsselrolle im Zusammenhang mit biologischen Prozessen wie Lernen und Gedächtnis bekannt ist. Die Kombination von dSTORM und Gitterlichtblattbeleuchtung ermöglicht das sammeln quantitativer Daten der Verteilung über die komplette Plasmamembran, wobei sich eine Akkumulation an Zell-Zell Kontaktflächen zeigt. Die niedrige Photoschädigung der Gitterlichtblattbeleuchtung ermöglicht weiterhin das Verfolgen von einzelnen NCAM-Dimeren in lebenden Zellen. Dort zeigt sich eine signifikante Abhängigkeit ihrer Mobilität vom Aktinskelett der Zelle. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Optik KW - Light-Sheet KW - Lattice Light-Sheet KW - dSTORM KW - Single Molecule Imaging KW - Localization Microscopy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207111 ER - TY - THES A1 - Proppert, Sven Martin T1 - Design, implementation and characterization of a microscope capable of three-dimensional two color super-resolution fluorescence imaging T1 - Design, Implementierung und Charakterisierung eines Mikroskops für dreidimensionale zwei Farben superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung N2 - This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging. N2 - In dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-Lokalisationsmikroskopie häufig auftreten. Weiterhin wird der Einfluss dieser Aberrationen auf die erreichbare Präzision und Exaktheit des Lokalisationsprozesses behandelt. Mit dem Wissen aus diesen Überlegungen wurden Experimente entworfen und durchgeführt um die getroffenen Schlussfolgerungen zu validieren und zu demonstrieren, dass das vorgeschlagene Mikroskop dazu in der Lage ist, biologische Strukturen in den drei räumlichen Dimensionen aufzulösen. Weiterhin wird gezeigt, dass beinahe aberrationsfreie Mikroskopie großer Volumina prinzipiell möglich ist. Während der Arbeit an dieser Promotion wurde eine neue Methode zur Gewinnung der axialen Koordinaten eingeführt. Diese auf kubischen B-splines basierende Interpolationsmethode stellte sich als anderen Routinen überlegen in der Kalibration eines Mikroskops und der anschließenden Auswertung von Messungen heraus. Deshalb wird dieses Verfahren in der vorliegenden Arbeit verwendet und erklärt. Da diese Doktorarbeit auch den Anspruch hat, zukünftigen Studenten den Einstieg in die hochauflösende 3D Mikroskopie zu erleichtern, werden abschließend detaillierte Protokolle für spezifische Aspekte der zwei Farben 3D Lokalisationsmikroskopie zur Verfügung gestellt. KW - Dimension 3 KW - aberration KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - single molecule microscopy KW - 3D KW - super-resolution KW - Mikroskopie KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Aberration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107905 ER -