TY - THES A1 - Andres, Oliver T1 - Interaktion von Masernviren mit vaskulären Endothelzellen T1 - Interaction of measles virus with vascular endothelial cells N2 - Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind. N2 - Although an effective live vaccine is available, measles still represents a major infectious disease causing about 750,000 deaths a year, preferentially in children. Due to the measles virus (MV)-induced immunosuppression secondary bacterial infections as otitis or pneumonia are common complications. Neurological involvement can lead to the acute postinfectious measles encephalitis (APME), which usually ends up with severe cerebral damage, or to the lethal subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). In particular, immunosuppressed patients may acquire serious complications such as giant-cell pneumonia or measles inclusion body encephalitis (MIBE). However, the pathogenesis of complicated measles is poorly understood. Apart from epithelial cells, monocytes, macrophages and lymphocytes vascular endothelial cells (EC) are supposed to be important target cells for MV and involved in the pathogenesis of classic and complicated measles. Immunohistochemistry of pathologic sections has repeatedly revealed infected vascular EC in areas of extensive infection and inflammation. A systematic in-vitro analysis of the interaction of MV with human vascular EC has not been performed yet. This dissertation issues now a basic and systematic investigation of the interaction of attenuated and virulent MV strains with human vascular EC and aims to create a basis to define molecular mechanisms of MV pathogenesis. Natural conditions were approached by using primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and a human brain microvascular endothelial cell line (HBMEC) as cell culture models and attenuated and virulent MV strains as infectious agents. As a prerequisite for all experiments, both the primary cells and the cell line were examined for their growth features and their expression of EC specific marker molecules. The surface proteins membrane cofactor protein (MCP or CD46) and signaling lymphocytic activation molecule (SLAM or CD150) have previously been described as cellular receptors for MV. It has been proven here that HUVEC and HBMEC express CD46 constitutively, whereas SLAM was not detectable on various cellular levels. Neither the activation of EC with a range of cytokines and stimulants nor the contact of EC with inactivated MV induced the expression of SLAM, although an expression of toll-like receptor 2 (TLR2) by EC can be observed. Several studies on the infection of EC with MV displayed that the attenuated MV strain Edmonston (Edm) and, to a lower extent, the virulent MV strains WTFb, Wü4797 and Wü5679 are able to infect EC, accompanied by morphologic alte¬rations and cytopathic effects. Further experiments revealed efficient replication and spreading especially of Edm and Wü4797 in EC cultures. However, CD46 specific antibodies were able to reduce the capability of Edm to infect EC clearly, the replication of Wü4797, however, was not affected. Activation of EC by preincubation with a range of cytokines or stimulants had no significant effect on MV infection, interferon-α and -γ seemed to lower the extent of MV infection. The following analyses of differential receptor modulation by MV indicate that CD46 acts as a cellular receptor only for the attenuated strain Edm, but not for the virulent strains WTFb, Wü4797 or Wü5679. The results of this dissertation provide clear evidence of a CD46- and SLAM-independent infection of human vascular EC with virulent MV strains. In consequence, a further, yet unidentified cellular receptor on EC or a receptor-independent uptake and spreading mechanism of MV in EC cultures must be postulated. Finally, it is certain that EC are involved in the pathogenesis of MV-induced complications, whether directly or indirectly. KW - Masern KW - Endothel KW - Masernvirus KW - Infektion KW - Paramyxovirose KW - Slow-Virus-Infektion KW - Virusinfektion KW - Encephalitis KW - Rezeptor KW - Toll-like-Rezeptoren KW - SLAM KW - CD150 KW - CD46 KW - HUVEC KW - HBMEC KW - measles KW - HUVEC KW - HBMEC KW - SLAM KW - CD46 Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25650 ER - TY - THES A1 - Baumer, Yvonne T1 - Die Rolle und Mechanismen der GTPasen Rac 1 und Rho A in der Regulation der Endothelbarriere T1 - The role of Rho GTPases Rac 1 and Rho A in endothelial barrier function N2 - Endothelzellen kleiden als einschichtiger Zellverband das Innere der Blutgefäße aus und wirken als Barriere zwischen Blut und Interstitium. Entzündungen und Erkrankungen wie Lungenödem oder Arteriosklerose sind gekennzeichnet durch einen Zusammenbruch der Endothelbarriere. Erste Untersuchungen deuten auf eine bedeutende Rolle der GTPasen der Rho-Familie mit den Hauptvertretern Rho A, Rac 1 und Cdc42 als Regulatoren der Endothelbarriere hin. Bezüglich der Regulation der Endothelbarriereintegrität werden den GTPasen Rho A und Rac 1 meist antagonistische Funktionen zugeschrieben. In einem ersten Teil dieser Dissertation wurde daher die Funktion der Rho-GTPasen Rho A, Rac 1 und Cdc42 für die Endothelbarriere in verschiedenen Endothelien untersucht. Hierzu wurden drei mikrovaskuläre Endothelzelltypen verschiedenen Ursprungs sowie makrovaskuläre Endothelzellen der Pulmonalarterie mit GTPase-aktivierenden oder inaktivierenden bakteriellen Toxinen behandelt. Die Aktivierung von Rho A resultierte in allen Endothelzelltypen mit Ausnahme der mikrovaskulären myokardialen Endothelzellen in einem Zusammenbruch der Endothelbarriere. Die Aktivierung von Rac 1 und Cdc42 führte in allen Endothelzellarten zu einer Barrierestabilisierung. Darüber hinaus konnte in fast allen Endothelzelltypen durch pharmakologische Inhibition der Rho-Kinase eine Stabilisierung der Endothelbarriere induziert werden. Die Inaktivierung aller GTPasen sowie die alleinige Inaktivierung von Rac 1 führte zu einem kompletten Zusammenbruch der Endothelbarriere in vitro. Zudem ergaben in vivo-Experimente an perfundierten Rattenmesenterien eine gesteigerte Permeabilität nach Inaktivierung von Rho A, Rac 1 und Cdc42. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die cAMP-vermittelte Stabilisierung der Endothelbarriere genauer charakterisiert und dabei der Einfluss gesteigerter cAMP-Spiegel auf die Aktivität von Rho-GTPasen in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen untersucht. Hierbei wurde die cAMP-Konzentration zum einen durch den Einsatz einer Kombination aus dem Adenylatzyklase-Aktivator Forskolin und dem Phosphodiesterase 4-Inhibitor Rolipram und zum anderen durch das cAMP-Analogon 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP (O-Me-cAMP) gesteigert. O-Me-cAMP stellt hierbei einen selektiven Aktivator des cAMP nachgeschalteten Epac/Rap 1-Signalweges dar, wohingegen Forskolin/Rolipram durch die generelle cAMP-Steigerung zusätzlich die durch Proteinkinase A (PKA) vermittelten Signalwege stimuliert. Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstandes zeigten nach cAMP-Anstieg in beiden Fällen eine Barrierestabilisierung, die mit den Effekten einer Aktivierung von Rac 1 vergleichbar waren. Dies ging mit Veränderungen der Organisation und der Morphologie von Zell-Zell-Kontakten einher. Zusätzlich kam es nach cAMP-Steigerung zu einer gesteigerten Rac 1-Aktivierung ohne Beeinflussung der Rho A-Aktivität. Darüber hinaus zeigten Endothelzellen nach cAMP-Anstieg die Bildung eines corticalen Aktinrings und verminderte Stressfaserbildung, was typische Indizien einer Aktivierung von Rac 1 sind. Um die Rolle von Rac 1 näher zu untersuchen, wurden Rac 1-Inhibitionsstudien durchgeführt. Die pharmakologische Inhibition der Rac 1-Aktivität resultierte in einer verminderten Endothelbarriereintegrität. Für beide cAMP-steigernden Mediatoren kann nach Kombinationsstudien angenommen werden, dass die durch cAMP-Steigerung vermittelten barrierestabilisierenden Effekte durch Rac 1 vermittelt zu sein scheinen. Somit kann aus den Untersuchungen des zweiten Teils dieser Arbeit geschlussfolgert werden, dass cAMP eine gesteigerte Endothelbarrierefunktion sowohl über PKA- als auch über Epac/Rap 1-abhängige Rac 1-Aktivierung vermittelt. Um die Rolle der Rho-GTPasen und von cAMP während einer Barrieredestabilisierung zu untersuchen, wurde im dritten Teil Thrombin als barrieredestabilisierender physiologischer Mediator in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen genutzt. Thrombin-Gabe führte zu einem reversiblen Zusammenbruch der Endothelbarriere. Zu diesen Zeitpunkten kam es zu einer signifikanten Inhibition von Rac 1 und einer deutlichen Aktivierung von Rho A. Erst nach 15 min fielen die gesamtzellulären cAMP-Spiegel ab. Innerhalb von 60 min erholte sich die Endothelbarriere und Rac 1- bzw. Rho A-Aktivitäten sowie der cAMP-Spiegel erreichten wieder ihr Ausgangsniveau. Vorinkubation der Endothelzellen mit beiden cAMP-steigernden Mediatoren inhibierte den Thrombin-induzierten Barriere-zusammenbruch ebenso wie die Thrombin-vermittelten Veränderungen der Rac 1- und Rho A-Aktivitäten. Auch in diesem Zusammenhang durchgeführte Rac 1-Inhibitionsstudien deuten darauf hin, dass die Hemmung der Thrombineffekte durch cAMP-Steigerung u.a. durch Aktivierung von Rac 1 vermittelt wird. N2 - Endothelial cells build a monolayer coating the inner surface of blood vessels and thereby form a dynamic barrier between plasma and interstitial space. Impaired endothelial barrier function can result in vascular diseases such as edema, atherosclerosis and inflammation. Small GTPases of the Rho family such as Rho A, Rac 1 and Cdc42 are well known regulators of endothelial barrier integrity. It is generally believed that Rho A and Rac 1 regulate endothelial barrier functions in antagonistic manner. According to this concept, Rho A destabilizes barrier integrity whereas Rac 1 enhances endothelial barrier properties. In a first step we investigated the role of Rho A, Rac 1 and Cdc42 in endothelial barrier regulation in four different types of endothelial cells. Microvascular endothelial cells of different origin (myocardium, mesentery and dermis) and macrovascular endothelial cells from pulmonary artery were treated with bacterial toxins to specifically activate or inactivate Rho GTPases. Effects on endothelial barrier functions were revealed by immunfluorescence microscopy, measurement of transendothelial electrical resistance and FITC-dextran flux as well as by quantification of VE-cadherin-mediated adhesion using laser tweezers. Activation of Rho A resulted in break-down of endothelial barrier functions in all endothelial cell types except microvascular myocardial endothelial cells. Activation of Rac 1 and Cdc42 as well as pharmacological inhibition of Rho kinase stabilized endothelial barrier function in all endothelial cell types. Moreover, inactivation of all three GTPases as well as inactivation of Rac 1 alone resulted in endothelial barrier-breakdown in all endothelial cell types. From these data we conclude that Rac 1 is a highly important regulator required for maintenance of endothelial barrier function. In the second part of the study, we characterized the role of Rho GTPases in cAMP-mediated barrier stabilizing effects in microvascular endothelium. Therefore, we analyzed cAMP-induced effects on transendothelial electrical resistance, Rho GTPase activity and cell junction morphology in human dermal microvascular endothelial cells. To increase intracellular cAMP levels we used the cAMP-analogue 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP (O-Me-cAMP) or combined treatment with adenylat cyclase-stimulating agent forskolin together with phosphodiesterase 4 inhibitor rolipram. In this approach O-Me-cAMP is used to selectively activate the Epac/Rap 1 pathway whereas forskolin/rolipram-induced increase of cAMP triggers both protein kinase A (PKA)- and Epac/Rap 1-dependent mechanisms. Measurement of transendothelial electrical resistance revealed barrier stabilizing effects of both Epac/Rap 1 and PKA signaling pathways. Barrier stabilization was accompanied by changes in cell junction morphology and both O-Me-cAMP and forskolin/rolipram treatment strongly activated Rac 1 without affecting Rho A activity. Moreover, endothelial cells displayed changes in actin distribution and cortactin localization typical for activation of Rac 1. To investigate the role of Rac 1 activation in cAMP-mediated barrier stabilization we performed Rac 1 inhibition studies. Pharmacological inhibition of Rac 1 activity decreased transendothelial electrical resistance which was accompanied by formation of intercellular gaps. Under these conditions the efficacy of increased cAMP to stabilize endothelial barrier functions was reduced and O-Me-cAMP had no effect. This indicates that barrier-stabilizing effects of cAMP are at least in part mediated by Rac 1-dependent mechanisms which are induced via PKA and Epac/Rap 1 signaling. Next, to address the importance of cAMP and of Rac 1 under conditions of impaired endothelial barrier integrity we used the physiological permeability-increasing mediator thrombin. Thrombin induced a transient breakdown of endothelial barrier function accompanied by increased stress fiber and gap formation in human dermal microvascular endothelial cells. Rac 1 was significantly inactivated whereas Rho A was strongly activated 5 and 15 min after thrombin treatment. Additionally, cAMP levels were decreased. After 60 min Rac 1 and Rho A activity as well as cAMP levels reached baseline values and endothelial barrier function was restored. Increase of cAMP completely blocked endothelial barrier breakdown and largely prevented thrombin-mediated effects on Rac 1 and Rho A activity indicating that reduction of cAMP was the primary mechanism causing the thrombin response. When Rac 1 was inactivated in parallel, both O-Me-cAMP and forskolin/Rolipram were not effective to prevent thrombin-induced endothelial barrier breakdown. KW - Endothelbarriere Rho-GTPasen KW - Rac 1 KW - Rho A KW - Endothelbarriere KW - Rho-GTPasen KW - Rac 1 KW - Rho A KW - Endothel KW - endothelial barrier KW - Rho GTPases KW - Rho A KW - Rac 1 KW - thrombin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33471 ER - TY - THES A1 - Blecharz, Kinga Grażyna T1 - Molekulare Ziele der Glukokortikoidbehandlung unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen in einem in vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke T1 - Molecular targets of glucocorticoid-treatment under different pathophysiological conditions in an in vitro model of the blood brain barrier N2 - Die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist bei vielen Erkrankungen des humanen zentralen Nervensystems (ZNS) beeinträchtigt. Unter verschiedenen neuroinflammatorischen Bedingungen, wie bei zerebralen Ischämien, Traumata, Hirntumoren oder der Multiplen Sklerose (MS), kommt es zum Verlust der protektiven Schrankenfunktion. Zu den ersten Anzeichen des BHS-Zusammenbruchs zählt der Verlust der Zell-Zell-Adhäsion: der Adhärens- und Occludenskontakte. Therapeutische Maßnahmen dieser Krankheiten beinhalten Behandlungen mit Glukokortikoiden (GCs), wobei der Mechanismus und die Wirkungsweise dieser Substanzen bis heute nicht vollkommen aufgeklärt sind. In der zerebralen Hirnendothelzelllinie cEND [Forster C, Silwedel C, Golenhofen N, Burek M, Kietz S, Mankertz J & Drenckhahn D. (2005). Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J Physiol 565, 475-486] wurde eine Funktionsverbesserung der Endothelbarriere durch die Expressionerhöhung von Occludin nach GC-Behandlung bereits analysiert. Daraufhin wurden andere Kandidaten des apikalen Junktionssystems gesucht, die positiv auf GC-Gabe ansprechen. Der erste Teil der Arbeit präsentiert den positiven Einfluss der Dexamethason-Behandlung auf die Expression des Adhärenskontakt-Proteins VE- (Vascular-Endothelial) Cadherin in cEND-Zellen. Dabei wurde eine Reorganisation des Zytoskeletts, eine verstärkte Verankerung des VE-Cadherins an das Zytoskelett, sowie eine einhergehende Morphologieänderung der behandelten Zellen beobachtet. Untersuchungen der Transkriptionsaktivierung des VE-Cadherin-Promoters nach Dexamethason-Behandlung, wiesen auf einen indirekten Steroid-Effekt hin, der zu einer Erhöhung der VE-Cadherin-Proteinsynthese führte. Somit sind GCs wichtig für die Proteinsynthese und -organisation beider Kontaktproteinarten: der Adhärens- und Occludenskontakte in mikrovaskulären Hirnendothelzellen. Die Beeinträchtigung der BHS-Integrität mit Veränderungen der Occludenskontaktexpression zählt zu den frühen Ereignissen bei der Entstehung einer Inflammation des ZNS, wie beispielsweise bei der MS. Im zweiten Teil der Dissertation wurde die Herunterregulation von Occludenskontaktproteinen in der cEND-Zelllinie untersucht. Dabei wurden cEND-Zellen mit Seren von Patienten, die sich in zwei verschiedenen Stadien der MS befanden, behandelt: in der akuten Exazerbationsphase oder der Remissionsphase, und auf die Protein- und Genexpression mit und ohne Dexamethasons-Behandlung untersucht. Es konnte ein negativer Effekt auf den Barrierewiderstand und die Occludenskontaktexpression, sowie eine erhöhte MMP-9-Genexpression nach Krankheitssereninkubation gezeigt werden. Die Dexamethason-Behandlung ergab eine geringe, aber keine vollständige Rekonstitution der Barrierefunktion. Anhand dieser Studie konnte jedoch erstmals eine Erniedrigung der Protein- und mRNA-Synthese von Claudin-5 und Occludin in Remissionspatientenseren inkubierten cEND-Zellen demonstriert werden. Somit könnten diese Erkenntnisse zur Prädiagnose einer bevorstehenden Exazerbationsphase der MS eingesetzt werden. Eine Langzeit-GC-Behandlung führt zu zahlreichen Nebenwirkungen, u. a. zum Bluthochdruck, welcher aufgrund einer eingeschränkten Produktion des vasodilatativen Faktors Stickstoffmonoxid, NO, im myokardialen Endothel hervorgerufen wird. Veränderungen in der NO-Produktion, wie auch anderer Faktoren der NO-Signalkaskade in der myokardialen Endothelzelllinie MyEND unter Einfluss von Dexamethason standen im Zentrum des dritten Teils dieser Arbeit. Während keine Veränderungen in der Expression der endothelialen NO-Synthase, eNOS, nach GC-Behandlung gezeigt werden konnten, wurden repressive Einflüsse von Dexamethason auf die Enzymaktivität der eNOS in MyEND-Zellen untersucht. GC-Gabe führte zur einer herabgesetzten Synthese des essenziellen Co-Faktors der eNOS, des Tetrahydrobiopterins, BH4, sowie zu einer Herunterregulation der GTP-Cyclohydrolase-1 (GTPCH-1), des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms der BH4-Produktion. Im Gegensatz zu bisherigen Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, konnte in der vorliegenden Studie belegt werden, dass die Herunterregulation der GTPCH-1 mRNA-Level auf den Liganden-abhängigen proteasomalen Abbau des Glukokortikoid-Rezeptors (GR) zurückzuführen ist. Das 26S-Proteasom moduliert die GR-abhängige Genexpression durch Kontrolle des Umsatzes und des Recyclings des Rezeptors selbst, wodurch eine regulierte Hormonresponsivität gewährleistet wird. Die Aufhebung des Liganden-abhängigen Abbaus des GR-Proteins durch gezielte Proteasominhibition, sowie durch eine Überexpression des ubiquitinylierungsdefekten GR-Konstruktes, K426A-GR, in Dexamethason-behandelten MyEND-Zellen resultierte in einer Erhöhung der GTPCH-1-Expression, sowie einer gesteigerten eNOS-Aktivität. Die hier beschriebenen Ergebnisse erlauben einen innovativen Einblick in die Erkenntnisse zur GC-vemittelten Hypertonie. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass GC-Behandlungen von mikrovaskulären Hirnendothelzellen zu einer Stabilisierung der Endothelbarriere führen. Unter pathologischen Bedingungen, wie der MS, wird der protektive GC-Effekt durch andere Faktoren beeinträchtigt N2 - The integrity of the blood-brain barrier (BBB) is compromised in many disorders of the human central nervous system. A breakdown of the blood-brain barrier under conditions of neuroinflammation and cerebral ischemia, but also traumas, brain tumours and multiple Sclerosis (MS), leads to loss of the protective function of the barrier. In its breakdown one of the first observable changes is the loss of intercellular adhesion and concomitant an increase of permeability. Although therapeutic strategies for diseases with impaired BBB function include the treatment with glucocorticoids (GCs) but the mechanism explaining GC action still remains unclear. Recent studies showed the influence of GCs on the expression of the tight junction protein occludin in the brain capillary endothelial cell line cEND, contributing to improvement in endothelial barrier functions. In this study, we investigated GC effects on the expression of the adherens junction proteins VE- (vascular-endothelial) cadherin. It was possible to show a positive influence of dexamethasone administration on VE-cadherin protein levels as well as a rearrangement and the anchorage of VE-cadherin protein to the cytoskeleton. Investigation of transcriptional activation of the VE-cadherin promoter by dexamethasone, however, did not point to direct glucocorticoid-mediated VE-cadherin gene induction. But it rather suggested indirect steroid effects leading to increased VE-cadherin protein synthesis. We thus propose that glucocorticoid effects on VE-cadherin protein synthesis and organization are important for the formation of both adherens and tight junctions, and for improved barrier properties in microvascular brain endothelial cells. Abnormalities in the expression profile of tight junctions in cerebral endothelium constituting barrier functions occur early during neuroinflammation, as Multiple Sclerosis (MS). In the second part of this study, the disruption of tight junction proteins in the cEND cell line was analysed. cEND cells were incubated with sera from patients, which were in two different states of MS: in the acute exacerbation or the remission phase of the disease, and protein levels and gene expression of claudin-5, occludin and VE-cadherin with and without dexamethasone treatment were investigated. There arised a downregulation of claudin-5 and occludin on protein and mRNA levels and an accompanying upregulation of MMP-9 activity revealed. A minor reconstitution of barrier functions related to dexamethasone treatment could be shown. However, no reconstitution could be detected to the control level. Especially, observations in downregulation of claudin-5 and occludin in cEND cells incubated with sera from patients in remission phase of MS could not be demonstrated before. Thus, this finding is proposed to be a new useful prediagnostic tool for an early detection of upcoming exacerbation phase. One of the numerous side effects of GC therapy is hypertension arising from reduced release of the endothelium-derived vasodilator nitric oxide, NO, being in the centre of the third part of this study. While effects of dexamethasone on endothelial NO synthase, eNOS, expression itself could not be demonstrated, repressive effects of dexamethasone on eNOS enzyme activity were shown in the myocardial endothelial cell line MyEND. Following GC-treatment we observed decreased levels of the essential cofactor of eNOS, tetrahydrobiopterin, BH4. We also determined a downregulation of GTP cyclohydrolase-1, GTPCH-1, the key enzyme of BH4 synthesis. In contrast to recent data from other groups, we postulate that this downregulation of GTPCH-1 mRNA levels is not a direct downregulation effect of GC action. But it is rather a consequence of the ligand-dependent proteasomal degradation of the GC receptor, GR. The 26S-proteasome modulates GR-dependent gene transcription by regulation of its turnover and the recycling of receptor/transcriptional DNA complexes, thereby ensuring continued regulation of hormone responsivity. In this work, the inhibition of proteasome-mediated proteolysis of GR by using inhibitors of the 26S-proteasome, or overexpression of a point-mutated, ubiquitination-defective GR construct, K426A-GR, which attenuates endothelial GC responsivity, was demonstrated. The abrogation of ligand-dependent degradation of GR protein resulted in increased levels of GTPCH-1 hence expression, leading to an increased eNOS-activity. These results provide a new insight into the research of GC-induced hypertension. Taken together, these data demonstrate, that GC treatment in microvascular brain endothelial cells leads to barrier stabilisation, but under conditions of MS there are many other factors like cytokines and chemokines, which abrogate this positive action. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Endothel KW - Tight junction KW - Dexamethason KW - Zellskelett KW - Proteasom KW - Hypertonie KW - Glukokortikoide KW - Endothelzelllinie KW - Adherens-Junction KW - blood brain barrier KW - brain endothelial cell line KW - tight junction KW - adherens junction KW - multiple sclerosis KW - proteasome Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57256 ER - TY - THES A1 - Daigeler, Adrien T1 - Die Bedeutung von Rho-Proteinen für Migration, Zellkontaktbildung und Aktinfilamentdifferenzierung in Endothelzellen T1 - Rho-proteins regulate migration, cell adhesion and stressfibers in endothelial cells N2 - Das Endothel verfügt im wesentlichen über drei dynamische Funktionseinheiten zur Migration und Zellkontaktbildung: Ein intrazelluläres Gerüst, bestehend einerseits aus den sogenannten Stressfasern, welche die Zelle durchziehen und vornehmlich an Zell-Zell-Kontakten und Zell-Matrix-Kontakten anhaften und so der Zelle Stabilität geben, und andererseits aus kontraktilen Aktin-Myosinbündeln, welche die Zelle befähigen, sich fortzubewegen oder ihre Form zu ändern, beispielsweise Ausläufer zu bilden. Zell-Zell-Kontakte, die es den Zellen ermöglichen, fest aneinander zu haften und sich so einerseits gegenseitig zu stützen und andererseits eine regulierbare Barriere zwischen intravasalem Raum und Interstitium zu bilden. Zell-Matrix-Kontakte, welche die Zelle fest mit dem Untergrund verankern und ein Unterspülen der Zelle verhindern. Besonders während der Migration der Endothelzelle unterliegen diese Systeme ständigem Auf- und Abbau. Diese Funktionseinheiten werden durch Rho-Proteine reguliert. Man unterscheidet drei wichtige Vertreter dieser Gruppe: Rac, CDC42 und RhoA. Es wurde die Prenylierung von Proteinen und damit auch die Prenylierung von Rho-Proteinen durch den HMG-CoA-Reduktase-Hemmer Lovastatin unterdrückt. In einer zweiten Versuchsserie wurden alle Rho-Proteine unselektiv durch Toxin-B, einem Toxin aus Clostridium difficile, und anschließend selektiv RhoA durch C3-Toxin aus Clostridium botulinum inaktiviert. Es wurden die Effekte auf Primärkulturen von Endothelzellen aus dem Truncus pulmonalis des Schweins, besonders im Hinblick auf Migration, Stressfasersystem, Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte, mit Hilfe immuncytochemischer Methoden beobachtet. Es konnte gezeigt werden, daß die Rho-Proteine wesentlich für die Bildung von Zellausläufern, wie zum Beispiel Lamellopodien, und die Migration in Endothelzellen sind. Zudem konnte belegt werden, daß Aufbau und Aufrechterhaltung des Aktinfilamentsystems und des kontraktilen Apparates der Endothelzellen im wesentlichen über das geranylierte RhoA reguliert werden. Die Effekte der unselektiven Rho-Protein-Hemmung unterschieden sich hier kaum von denen der selektiven RhoA-Hemmung. Auch die Unterdrückung der Geranyl-Prenylierung zeigte vergleichbare Ergebnisse. Die Aufrechterhaltung der Zell-Zell-Kontakte ist allerdings RhoA-unabhängig, da es trotz selektiver RhoA-Hemmung durch C3-Toxin nicht zur Auflösung der Zell-Zell-Kontakte kam. Diese werden vielmehr über Rac und/oder CDC42 gesteuert, denn erst durch die Blockierung aller Rho-Proteine durch Toxin-B kam es zur Lückenbildung zwischen den Zellen. Auch hier spielt die Geranylierung der Rho-Proteine eine wichtige Rolle, da die Geranylierungshemmung ähnliche Effekte wie die Hemmung durch Toxin-B zeigte. Die Ausbildung und Aufrechterhaltung der Fokalkontakte erfolgt im wesentlichen auch über die geranylierten Rho-Proteine, wobei RhoA hier die entscheidende Rolle zuzukommen scheint. Somit konnte in dieser Arbeit die entscheidende Rolle der Rho-Proteine und im speziellen die des RhoA-Proteins bei der Regulation wesentlicher Funktionseinheiten der Endothelzelle aufgezeigt werden. N2 - The effects of Lovastatin, Clostridium difficile toxin B and Clostridium botulinum toxin C3 on endothelial cells of porcine pulmonary trunk were analized. Lovastatin is a well known hydroxymethylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitor, that prevents isoprene synthesis and thereby lipid modification of Rho proteins carboxy terminus, which is essential for membrane association and activation. Toxin B, the causative agent of antibiotic associated pseudomembraneous colitis, inactivates the Rho proteins Rho, Rac and CDC 42 by glucolysation. C3 toxin, the causative agent of botulism, selectively inactivates Rho by adenosine diposhate ribosylation. Effects of these inhibitors on migration, stressfibres, adherens junctions and focal adhesions were observed by immunocytochemical means and interpreted with regard to their dependency on Rho proteins. Results: Prenylation of Rho proteins is essential for maintainance as well as for rearrangement of the filamentous actin system and migration in porcine endothelial cells. Toxin B, that inhibits Rho, Rac and CDC42 prevented migration completely. Injection of C3-toxin TRITC-Phalloidin staining revealed a complete breakdown of filamentous actin in endothelial cells. Polymerization as well as maintainance of filamentous actin is dependent on prenylated Rho proteins, especially Rho. Treatment of endothelial cells with Lovastatin did not have an evident effect on distribution of Catenins. The prenylation of Rho proteins seems to be not essential for keeping mature adherens junctions intact. Treatment with toxin B induced a disruption of adherens junctions. Catenins and VE-Cadherin were arranged discontinuous between adjacent cells. Large gaps between resting and migrating cells developed. Selective inhibition of Rho by injection of C3 toxin did not cause a change in Catenin or VE-Cadherin distribution. Therefore we conclude that not Rho, but Rac or CDC42 are necessary to uphold continuity of cell contacts. Focal adhesions were reduced under Lovastatin treatment. Toxin B and C3-toxin prevented assembly and maintainance of focal adhesion contacts. Therefore we conclude that Rho plays the crucial role for focal adhesion regulation in endothelial cells. KW - Endothel KW - Rho KW - Rac KW - CDC42 KW - Migration KW - Stressfasern KW - Aktin KW - Zellkontakte KW - endotelium KW - Rho KW - Rac KW - CDC42 KW - migration KW - stress fibers KW - actin KW - contacts Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180716 ER - TY - THES A1 - Dziewior, Frank T1 - Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration in Gefäßendothelzellen unter rheologischer Beanspruchung T1 - Measurement of intracellular Ca2+-concentration in vessel endothelial cells subjected to rheological demand N2 - Die den Zellstoffwechsel und das Zytoskelett betreffenden Adaptationsvorgänge in Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung sind von besonderem klinischen Interesse, da Gefäßwandschäden eine entscheidende pathogenetische Relevanz bei der Entstehung vaskulärer Erkrankungen wie z.B. der Arteriosklerose zukommt. Der intrazelluläre Signalweg, über den die Zelle einen rheologischen Reiz in eine entsprechende Zellantwort umsetzt, ist bisher weitgehend ungeklärt geblieben, wobei eine Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration als Signalgeber diskutiert wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen Messplatz zu etablieren, der es gestattet, Veränderungen in der zytosolischen Calciumkonzentration in kultivierten Endothelzellen nach Applikation von Ca2+-erhöhenden Agonisten, Calciumionophoren sowie während rheologischer Beanspruchung in Echtzeit zu dokumentieren. Die Eignung des verwendeten rheologischen Systems für Scherstressexperimente konnte durch die Beobachtung der für Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung typischen zytoskelettalen Umbauvorgänge im Sinne einer Neuordnung der Aktinfilamente mit der Ausbildung von Stressfasern gezeigt werden. Erstmalig konnte dabei auch die Reaktion mikrovaskulärer Endothelzellen der MyEnd-Zelllinie der Maus auf Scherstressbeanspruchung gesehen werden. Bei diesen Zellen konnte eine Vermehrung des F-Aktin-Gehaltes beobachtet werden, im Gegensatz zu kultivierten Endothelzellen des Truncus pulmonalis des Hausschweins blieb aber eine signifikante Bildung von Stressfasern aus. Diese unterschiedliche Verhalten ist wahrscheinlich der andersartigen Zellmorphologie der MyEnd-Zellen zuzuschreiben. Es konnte in zwei verschiedenen Endothelzellsystemen gezeigt werden, daß Gefäßendothelzellen den Kontakt mit verschiedenen endogenen Stimuli bzw. Calciumionophoren mit einer zytosolischen Calciumerhöhung unterschiedlichen Ausmaßes beantworten. Bei einsetzendem oder sich verstärkenden Flüssigkeitsscherstress konnte von uns hingegen keine Calciumantwort beobachtet werden. An der Induktion zytoskelettaler Umbauvorgänge scheint Calcium als Botenstoff in den hier untersuchten Zellsystemen also nicht primär beteiligt zu sein N2 - The adjustment processes in endothelial cells under rheological demand induced by changes in cell metabolism are of particularly clinical interest, as vessel wall damage has a decisive influence on formation of vascular deseases as e.g. atherosclerosis. The intracellular signal pathway the cell uses to transmit a rheological stimulus into a corresponding cell answer has previously remaind unclarified. In this publication we were able to establish a measuring technique that allows to document changes in cytosolic free calcium in the presence of Ca2+-increasing agonist, calcium ionophores as well as during rheological demand. The suitability of the used rheological system could be proved by observation of the cytoskeleton reorganization processes, that are typical for endothelial cells under rheological demand. A reorientation of actin filaments and formation of shear stress fibers could be observed. For the first time we could see in this context the reaction of microvacular endothelial cells of the mice MyEnd-population on rheological demand. In these cells we could notice an increase of F-actin, but in contrast to cultivated pulmonary endothelial cells of the pig we could not observe a significant formation of shear stress fibers. This different behaviour is probably due to the different cell morphology of MyEnd cells. In two different endothelial cell systems could be shown that vessel endothelial cells answer on stimulation with varying endogeneous agonists and calcium ionophores with an elevation of cytosolic free calcium. No increase in cytosolic free calcium could be shown subsequently to starting or increasing rheological demand. In the investigated cell populations calcium seems not to be involved as a messenger for cytoskeletal reorganization. KW - Endothel KW - Calcium KW - Scherstress KW - Stressfasern KW - Aktin KW - Arteriosklerose KW - endothelium KW - calcium KW - shear stress KW - shear stress fibers KW - actin KW - atherosclerosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181128 ER - TY - THES A1 - Elfeber, Katrin T1 - Immunologischer Nachweis des Natrium-Glukose-Kotransporters SGLT1 im mikrovaskulären System des Gehirns, des Herzens und des Skelettmuskels T1 - Immunological evidence for the location of the sodium/glucose cotransporter SGLT1 in the microvascular system of brain, heart and sceletal muscle N2 - Glukose ist einer der Hauptenergielieferanten der Säugetierzellen. Aus diesem Grund wird die Glukoseaufnahme durch erleichterte Diffusion durch die GLUT (SLC2) Familie, sowie durch die Familie der sekundär aktiven Transporter SGLT (SLC5A) gesichert. In dieser Arbeit wurde ein polyklonaler Antikörper gegen SGLT1 aus Kaninchen hergestellt. Dieser Antikörper wurde für die Innunhistologie sowie für Western blots eingesetzt. Man sah eine Anfärbung von Bürstensaummembranen an Dünndarm- und Nierentubulusepithelzellen, aber in diesen Geweben nicht an Mikrogefäßen. Darüberhinaus konnten wir SGLT1 an der basolateralen Membran von Speicheldrüsenazini sehen, auch hier konnten wir SGLT1 in den Kapillaren nicht sehen. Überraschenderweise konnte SGLT1 in der Blut-Hirn-Schranke nachgewiesen werden. Auch konnte man die Lokalisation von SGLT1 in den Kapillaren des Herzens und des Skelettmuskels zeigen. Die physiologische und pathophysiologische Bedeutung dieser Lokalisationen liegt noch im Unklaren. N2 - Glucose is one of the main energy sources of mammalian cells. Therefore glucose uptake is complicatedly regulated by facilated glucose uptake via transporters of the GLUT (SLC2) family and secondary active transporters of the SGLT (SLC5A) family. For this work, a polyclonal antibody against rat SGLT1 was raised in rabbits. This antibody was used in immunohistochemistry and western blots. Brush border membranes of small intestine and kidney epithelial cells were stained, but no microvessels in these tissues. Futhermore we could see SGLT1 in the basolateral membrane of the acini of salivary glands, here we could not dectect SGLT1 in capillary endothelial cells. Surprisingly we were able to detect SGLT in the blood-brain-barrier. We were also able to show the location of SGLT1 in the capillaries of heart and sceletal muscle. The physiologial and pathophysiological impact of this locations remains to be determined. KW - Glukose KW - Endothel KW - Gehirn KW - Herz KW - Muskel KW - glucose KW - endothelium KW - brain KW - heart KW - muscle Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19221 ER - TY - THES A1 - Finster, Saskia T1 - Ultrastrukturelle Endothelveränderungen bei unterschiedlich konservierten Venentransplantaten - Konsequenzen für die Praxis T1 - Ultrastructural investigations for reducing endothelial cell damage of vein grafts during CABG-operation and practical consequences N2 - Zusammenfassung Die Langzeitresultate von aortocoronaren Venenbypässen unter Verwendung von Vena saphena magna Interponaten hängen neben vielen anderen Faktoren maßgeblich von der Integrität des Gefäßendothels ab. Ein intaktes Endothel spielt für die Offenheit des Grafts eine entscheidende Rolle, da Endothelverletzungen die Entwicklung vorzeitiger thrombotischer Graftverschlüsse triggern und auch an den späten Graftverschlüssen durch Intimahyperplasie und Einsprossung glatter Muskelzellen beteiligt sind. So spielt die Vermeidung intraoperativer Endothelschädigungen der Venengrafts durch die Lagerungsmedien eine entscheidende Rolle. Diese Arbeit hatte zum Ziel, das Endothel von Venengrafts nach Inkubation mit verschiedenen Lagerungslösungen mit direkten Nachweismethoden wie Rasterelektronen- und Transelektronenmikroskopie zu untersuchen. Untersucht wurden sieben cm lange Venensegmente von sechs Patienten, die sich einer ACVB-Operation unterzogen. Die Präparation der Venen fand unter standardisierten Bedingungen statt. Anschließend erfolgte die Inkubation jeweils eines Drittels der entnommenen Segmente für 45 Minuten in einer der folgenden Lagerungsmedien, physiologische Kochsalzlösung, Medium 199 + 20mM HEPES + 5% bovines Serumalbumin und Medium 199 + 20mM HEPES + 20% humanes Serumalbumin. Die Auswertung des Endothelzellschadens erfolgte mittels raster- und transelektronenmikroskopischer Untersuchungen sowie histopathologischer Aufarbeitung. Venensegmente nach Lagerung in physiologischer Kochsalzlösung zeigen signifikante Schädigungen der Endothelzelloberfläche. Bereits nach 45-minütiger Lagerung findet sich in den rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen eine 56,5%ige Ablösung der Endothelzellschicht, transelektronenmikroskopisch kann man Zellschädigungen im Sinne von Zellhydrops und Karyolyse nachweisen. Dagegen findet man nach Lagerung in Medium 199 mit 20%igem Albuminanteil bei Betrachtung mit dem Rasterelektronenmikroskop deutlich geringere Zellschädigungen. Das Endothel von Venen nach Inkubation mit Nährmedium mit 5%igem Albuminanteil stellt sich nahezu intakt, ohne wesentliche Zerstörungen der Zelloberfläche dar. Unsere Arbeit konnte belegen, dass die Lagerungsmethode einen deutlichen Einfluss auf das Gefäßendothel ausübt. Um möglichst große Anteile intakten Endothels zu gewährleisten, bedarf es einer Modifizierung der bisherigen Handhabung der Venenlagerung während einer aortocoronaren Venenbypass-Operation. Eine Möglichkeit dazu könnte in der Lagerung in Zellkulturmedium mit einem 5%igen Albuminanteil gesehen werden. N2 - Summery BACKGROUND: In the present study the influence of different storage solutions on endothelial integrity or damage was investigated with direct methods particularly with transmission electron microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM) and immunohistochemistry. METHODS: Saphenous vein segments of 10 cm in length were taken surgically from 6 male CABG-patients (aged 60-70) under standardized conditions. Each vein segment was cut into rings, which were incubated at room temperature for 45 minutes in different storage solutions, particularly in 0.9% sodium chloride solution and in buffered solution (M 199) with 5% human serum albumin respectively. Then, the vein segments were fixed in 3.5% glutaraldehyde and prepared for scanning and transmission electron microscopy to evaluate the endothelial damage. In addition, immunohistochemical staining (CD34, PECAM and Factor VIII) was performed. RESULTS: When using 0.9% sodium chloride solution, the SEM-examination revealed that 55% of the cell population was destroyed. In comparison to these findings only 26% of the endothelial cell population was damaged when the venous segment was stored in buffered solution with 5% albumin (p<0.01). In immunohistochemistry (CD34, PECAM, Factor VIII) these findings were supported. CONCLUSIONS: This study demonstrates the importance of storage solutions in regard to endothelial integrity. For best preservation of endothelium it is necessary to modify conventional storage methods. So, storage in buffered solution with albumin has shown much better endothelial cell preservation compared with physiological saline which might reduce the obliteration rate of CABG in future. KW - Venenlagerung KW - aortokoronarer Venenbypass KW - Endothel KW - Lagerungsmedium KW - storage solution KW - endothelium KW - CABG-operation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16258 ER - TY - THES A1 - Firnschild, Andreas T1 - Verbesserung der Endothelfunktion bei herzinsuffizienten Ratten durch den HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin T1 - HMG-CoA inhibition with rosuvastatin improves endothelial function in rats with congestive heart failure N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkungen einer 10-wöchigen Therapie mit dem 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoenzymA-(HMG-CoA)-Reduktase-Inhibitor Rosuvasta-tin auf die endotheliale Funktion, die Stickstoffmonoxid (NO)-Bioverfügbarkeit und die Phosphorylierung des „vasodilator-stimulated phosphoprotein“ (VASP) in Thrombozy-ten im Rattenmodell der chronischen Herzinsuffizienz (CHF) nach Koronarligatur un-tersucht. Die Phenylephrin-induzierte Vasokonstriktion war in Gefäßringen von Versuchstieren mit CHF im Vergleich zu Tieren ohne Herzinsuffizienz deutlich verstärkt, was sich auf eine Reduktion der tonischen NO-Freisetzung in Aortenringen von CHF-Ratten zurück-führen ließ. Die Behandlung mit Rosuvastatin erhöhte die NO-Freisetzung und normali-sierte die gesteigerte Kontraktionsantwort bei CHF-Tieren. Die durch Acetylcholin in-duzierte endothelabhängige Vasorelaxation war bei CHF signifikant beeinträchtigt und wurde durch die Behandlung mit Rosuvastatin ebenfalls deutlich verbessert. Da sich keine Unterschiede in der endothelunabhängigen Relaxation nach Gabe eines NO-Donors zwischen den Untersuchungsgruppen zeigten, ist die Reduktion der Acetylcho-lin-Antwort demnach eindeutig endothelial bedingt und lässt sich nicht auf eine vermin-derte NO-Sensitivität der Muskelzellen zurückführen. Diese endotheliale Dysfunktion scheinen Statine zumindest teilweise normalisieren zu können. Die Bildung von Super-oxidanionen in Aorten von CHF-Tieren war im Vergleich zu Tieren ohne Herzinsuffi-zienz signifikant gesteigert. Durch chronische Therapie mit Rosuvastatin konnte dies signifikant reduziert werden. Passend hierzu war die intraluminale NO-Bioverfügbarkeit, gemessen als basale VASP-Phosphorylierung an Ser239 in Thrombo-zyten, bei CHF-Tieren erniedrigt und wurde durch die Rosuvastatin-Behandlung nor-malisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass es durch chronische Therapie mit dem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin zu einer Steigerung der NO-Bioverfügbarkeit und damit zu einer Verbesserung der Endothelfunktion bei Ratten mit Herzinsuffizienz kommt. N2 - This study showed the effects of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibiton for ten weeks with rosuvastatin on endothelial function, NO bioavailability and platelet vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) phosphorylation in congestive heart failure (CHF) rats after coronary ligation. Phenylephrine-induced vasoconstriction was significantly increased in rats with CHF and partly normalized by treatment with rosuvastatin suggesting a reduction of tonic NO release in CHF aortic rings. Acetylcholine-induced endothelium-dependend vasorelaxation was impaired in CHF and significantly improved by rosuvastatin treatment. Since there was no significant difference between the groups in endothelial-independend relaxation induced by 2-(N,N-Diethylamino)-diazenolate-2-oxide (DEA-NONOate), the reduction in acetylcholine-induced response is caused by endothelial dysfunction and not by reduced NO-sensitivity of the muscle cells. This endothelial dysfunction seems to be at least partly normalized by statins. Aortic superoxide production was significantly increased in rats with CHF and normalized by rosuvastatin. Basal platelet VASP phosphorylation on Serin 239 was significantly reduced in CHF and normalized in rats treated with rosuvastatin. In this study HMG-CoA reductase inhibiton with rosuvastatin significantly improved NO bioavailability and endothelial function in rats with CHF. KW - Herzinsuffizienz KW - Endothel KW - Stickstoffmonoxid KW - Statine KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - congestive heart failure KW - endothelial dsyfunction KW - NO KW - statins KW - VASP Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26194 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Anke Katrin T1 - Ex vivo Expansion von endothelialen Vorläuferzellen T1 - Ex vivo expansion of endothelial progenitor cells N2 - EINFÜHRUNG: Endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) können in vivo aus dem Knochenmark in die periphere Blutzirkulation mobilisiert und gezielt zu ischämischem Gewebe oder Gefäßläsionen rekrutiert werden. Im Zielgewebe differenzieren EPCs in situ zu reifen Endothelzellen und tragen auf diese Weise zur Neovaskularisation und Endothelregeneration bei. Der therapeutische Einsatz von EPCs ist durch die geringe Zellzahl limitiert, die aus dem Blut eines Patienten gewonnen werden kann. Folglich ist ein Verfahren zur ex vivo Expansion von EPCs erforderlich. Das Cystein-reiche Protein 61 (CYR61) ist ein matrizelluläres Signalprotein der CCN-Familie, das in vitro in der Lage ist die Proliferation, Migration und Adhäsion von Endothelzellen zu steigern. In vivo ist CYR61 im Rahmen von Geweberegeneration und Neovaskularisation verstärkt exprimiert. Die Beteiligung von EPCs und CYR61 an der Blutgefäßbildung legt eine mögliche Interaktion dieser beiden angiogenetischen Faktoren nahe. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob CYR61 ein potenter Stimulator der ex vivo Expansion von EPCs ist, ohne dabei den Phänotyp der Zellen zu verändern. MATERIAL UND METHODEN: Das rekombinante CYR61-Protein wurde in Insektenzellen als Fusionsprotein mit der Fc-Domäne des humanen IgG exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Mononukleäre Zellen des peripheren venösen Blutes von adulten humanen Spendern wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert und anschließend mit einem für die Selektion von EPCs geeigneten Grundmedium in vitro kultiviert. Vom 2. Kulturtag an wurde das Grundmedium mit CYR61 supplementiert. Die Kontrollzellen wurden in reinem oder mit Fc-tag supplementiertem Grundmedium kultiviert. Das Wachstum und die Entwicklung der Zellen wurden über die gesamte Kulturdauer hinweg beobachtet und fotografiert. Die Zellproliferation wurde mittels Zellzählung quantifiziert. Zudem wurden die Zellen mittels FACS-Analyse und immunhistochemischer Färbung bezüglich der Expression charakteristischer Oberflächenmarker phänotypisch analysiert. ERGEBNISSE: Die in vitro Kultur von aus dem Blut isolierten EPCs unter CYR61-Supplementierung führte zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Zellproliferation, im Konzentrationsbereich von 0,05 bis 1,5µg/ml CYR61. Die Behandlung von EPCs mit 0,5µg/ml CYR61 führte zu einer durchschnittlich 4,1-fachen Zellzahlzunahme im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen. Die FACS-Analysen und immunhistochemischen Färbungen ergaben ein für EPCs charakteritisches Oberflächenmarkerexpressionsprofil der Zellen. Sowohl die mit CYR61 behandelten als auch die unbehandelten Kontrollzellen zeigten eine identische EPC-typische Markerexpression, wodurch gezeigt werden konnte, dass der Phänotyp der EPCs von der Behandlung mit CYR61 unbeeinflusst bleibt. SCHLUSSFOLGERUNG: Folglich ist CYR61 ein potenter Stimulator der ex vivo Expansion von aus dem peripheren humanen Blut isolierten EPCs. Dieses Ergebnis legt eine mögliche Verwendung von ex vivo unter CYR61 Behandlung expanierten EPCs zur Stimulation von Neovaskularisation und Endothelregeneration nahe. Derartige neue Zell-basierte therapeutische Strategien könnten dazu beitragen beispielsweise die Behandlung der ischämischen Herzkrankheit, die Knochenregeneration oder die Vaskularisierung von mittels Tissue Engineering hergestellten Gewebekonstrukten zu verbessern. N2 - BACKGROUND: Endothelial progenitor cells (EPCs) can in vivo be mobilized from the bone marrow into the peripheral blood, home to sites of ischemia or vascular injury and differentiate into endothelial cells in situ, resulting in an enhanced neovascularisation and reendothelialisation. The use of EPCs as a potential therapeutic agent is limited by the small number of EPCs that can be isolated from peripheral blood. Consequently an ex vivo expansion technique for EPCs is required. The cystein-rich protein 61 (CYR61) is a matricellular signal protein of the CCN family, that promotes endothelial cell proliferation, migration and adhesion in vitro and is shown to be over expressed in the context of tissue regeneration and neovascularisation in vivo. The involvement of EPCs and CYR61 in neovascularisation suggests possible interaction between these two angiogenic factors. This study explores the question whether CYR61 is a potent stimulator of ex vivo expansion of EPCs, without altering the cell phenotype. MATERIALS AND METHODS: The recombinant CYR61 protein was expressed in insect cells as a fusion protein with the IgG Fc-domain and purified via protein G sepharose. Mononuclear cells were isolated from peripheral venous blood of adult healthy human volunteers using density gradient centrifugation, followed by in vitro cultivation with a basic medium for selection of EPCs. From day 2 of cultivation onwards the basic medium was supplemented with CYR61. Control cells were cultured in basic medium alone or were treated with Fc-tag. Cell growth and development was monitored and photographed during the time of culture. Cell proliferation was quantified by cell counting. Phenotypic analysis of EPC based on cell surface marker expression was performed using FACS-analysis and immunhistochemical staining. To evaluate the influence of the treatment with CYR61 on the phenotype of EPCs, the marker expression of the treated an untreated cells was compared. RESULTS: Medium supplementation with CYR61 during in vitro culture of EPCs isolated from peripheral blood resulted in a dose-depend increase of cell proliferation in the concentration range between 0.05 and 1.5µg/ml CYR61. Treatment of EPCs with 0.5µg/ml CYR61 resulted in a 4.1-fold average EPC number increase compared to untreated control cells. FACS analysis and immunhistochemical staining revealed a characteristic EPC surface marker expression profile. Both CYR61 treated and untreated cells showed the same EPC marker expression, demonstrating that CYR61 treatment has no influence on EPC phenotype. CONCLUSION: In conclusion, CYR61 represents a potent stimulator of ex vivo expansion of EPCs isolated from peripheral human blood. This finding suggests a possible application of EPCs expanded ex vivo under CYR61 treatment to stimulate neovascularisation and endothelial regeneration. Such novel cell-based therapeutic strategies may help improve for instance treatment for ischemic heart disease, bone regeneration or vascularisation of tissue engineered constructs. KW - Vaskularisation KW - Angiogenese KW - Endothel KW - endotheliale Vorläuferzellen KW - CYR61 KW - Vaskulogenese KW - endothelial progenitor cells KW - CYR61 KW - vasculogenesis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64878 ER - TY - THES A1 - Höber, Sarah T1 - Korrektur der altersbedingten Reduktion von Zahl und Funktion endothelialer Progenitorzellen durch Wachstumshormonbehandlung : Rolle des Insulin-like growth factor-1 T1 - Age-dependent impairment of endothelial progenitor cells is corrected by growth hormone mediated increase of insulin-like growth factor-1 N2 - Im Alter reduziert sich die Anzahl und Funktion zirkulierender endothelialer Pro-genitorzellen (EPC). Gleichzeitig sinken die Spiegel des Insulin-like growth fac-tor-1 (IGF-1), und das Risiko, arteriosklerotische Läsionen auszubilden, steigt. Unsere Daten weisen auf einen direkten Zusammenhang zwischen Alter, IGF-1-Spiegeln sowie Zahl und Funktion zirkulierender EPC hin. IGF-1 stimuliert nicht nur die Angiogenese, sondern besitzt auch vasoprotektive Eigenschaften. In dieser Studie wurde die Anzahl und Funktion der EPC ge-sunder männlicher Probanden (n=16) vor und nach 10tägiger Behandlung mit humanem rekombinantem Wachstumshormon (0,4 mg s.c./Tag) untersucht. Als Kontrollgruppe dienten junge Studienteilnehmer (n=10). Sowohl ihre IGF-1-Spiegel (223,1±15,7 ng/ ml vs 126,0±7,2 ng/ml) als auch die Anzahl zirkulieren-der CD133+/VEGF-2+ EPC waren im Vergleich mit der älteren Teilnehmergrup-pe höher. Zusätzlich zeigten sich eine bessere EPC-Funktion und eine höhere Telomeraseaktivität. Die Behandlung mit Wachstumshormon erhöhte die IGF-1-Spiegel und die Anzahl der zirkulierenden EPC bei den älteren Probanden deut-lich. Auch zeigten sie eine erhöhte Fähigkeit, Kolonien zu bilden und eine ver-mehrte Migrationskapazität. Außerdem war der Einbau in gefäßähnliche Strukturen durch Wachstumshormon- behandlung verbessert und die Telomeraseakti-vität mit der jungen Kontrollgruppe vergleichbar. In vitro-Untersuchungen zeigten, daß Expression, Phosphorylierung und Aktivi-tät der endothelialen NO-Synthase (eNOS) in EPC von IGF-1 mittels des IGF-1-Rezeptors stimuliert werden. IGF-1 erhöht in vivo und in vitro die Funktion der EPC über den IGF-1-Rezeptor sowie den Phosphatidyl-Inositol-3- Kinase (PI3K)/Akt-Signalweg. Die durch Wachstumshormon vermittelte Erhöhung von IGF-1 könnte eine neue Therapiestrategie zur Verminderung vaskulärer Defekte bei Patienten mit ver-minderter Anzahl und Funktion von EPC darstellen. Weitere Untersuchungen sowie klinische Studien sollten durchgeführt werden. N2 - Aging is associated with an increased risk for atherosclerosis. A possible cause is low numbers and dysfunction of endothelial progenitor cells (EPC) which insufficiently repair damaged vascular walls. We hypothesized that decreased levels of IGF-1 during age contribute to dysfunctional EPC. We therefore measured the effect of growth hormone (GH), which increases endogenous insulin-like growth factor-1 (IGF-1) levels, on EPC in mice and human subjects. We compared EPC number and function in healthy middle-aged male volunteers (57.4 ± 1.4 years) before and after a ten day treatment with recombinant GH (0.4 mg/day) with that of younger and elderly male subjects (27.5 ± 0.9 and 74.1 ± 0.9 years). Middle-aged and elderly subjects had lower circulating CD133+/VEGFR-2+ EPC with impaired function and increased senescence. GH treatment in middle-aged subjects elevated IGF-1 levels (126.0±7.2ng/ml vs. 241.1±13.8ng/ml; p<0.0001), increased circulating EPC with improved colony forming and migratory capacity, enhanced incorporation into tube-like structures, and augmented endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression in EPC comparable to that of the younger group. EPC senescence was attenuated, whereas telomerase activity was increased after GH treatment. Treatment of aged mice with GH (7 days) or IGF-1 increased IGF-1 and EPC levels and improved EPC function, whereas a two day GH treatment did not alter IGF-1 or EPC levels. Ex vivo treatment of EPC from elderly individuals with IGF-1 improved function and attenuated cellular senescence. IGF-1 stimulated EPC differentiation, migratory capacity and the ability to incorporate into forming vascular networks in vitro via the IGF-1 receptor. IGF-1 increased telomerase activity, eNOS expression, phosphorylation and activity in EPC in a phosphoinositide-3-kinase/Akt dependent manner. Small interference RNA-mediated knockdown of eNOS in EPC abolished the IGF-1 effects. Growth hormone-mediated increase in IGF-1 reverses age-related EPC dysfunction and may be a novel therapeutic strategy against vascular disorders with impairment of EPC. KW - Arteriosklerose KW - Endothel KW - EPC KW - IGF-1 KW - Wachstumshormonbehandlung KW - eNOS KW - EPC KW - IGF-1 KW - eNOS Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29710 ER -