TY - THES A1 - Aumann, Ralf T1 - Vorkommen und Expression des opcA Gens in Meningokokkenstämmen von Erkrankten und asymptomatischen Trägern T1 - Prevalence and expression of the opcA gene in meningococci from invasive and carrier strains N2 - Das Opc-Protein ist ein Außenmembranprotein von Meningokokken, das über extrazelluläre Matrixproteine mit Integrinen der Wirtszelle interagiert. Opc ist in Menschen immunogen und induziert bakterizide Antikörper. Das Opc-Protein wurde daher als aussichtsreicher Impfstoff-Kandidat angesehen, da es außerdem relativ gut konserviert ist. Allerdings wird das Opc-Protein nicht von allen Meningokokkenstämmen exprimiert. Einerseits fehlt das opc-Gen in einigen klonalen Komplexen (z.B. ST-8, ST-11, ST-53), andererseits ist die Opc-Expression nicht konstitutiv wegen einer phasenvariablen Transkription, die auf einem Poly-Cytidin-Bereich im Promotor des opc-Gens beruht. In dieser Arbeit wurde die Präsenz des opc-Gens und die Opc-Expression in zwei großen Sammlungen deutscher Meningokokkenisolate von invasiven Erkrankungen (n=1141) und gesunden Trägern (n=792) untersucht. Das opc-Gen war bei 71% der invasiven und 77% der Trägerstämme nachweisbar. Der größte Teil der opc-Gen negativen Stämme gehörte zu den klonalen Komplexen ST-8, ST-11, ST-213, ST-231, ST-334 und ST-53. Der Anteil opc-positiver Stämme, die Opc in vitro exprimieren, war bei den invasiven Stämmen kleiner als bei den Trägerstämmen (13% vs. 29%, p<0,001, Chi-square-Test). Der größere Anteil Opc-exprimierender Trägerstämme ist u.a. am ehesten mit der Überrepräsentation von wenig pathogenen klonalen Komplexen (ST-23, ST-35, ST-198) mit einer hohen Opc-Expressionsrate zu erklären. 24 von den 176 invasiven Stämmen mit einer Anzahl von 11 - 14 Cs in der Promotor-Region, die die Opc-Expression begünstigt, zeigten weder im ELISA noch im Westernblot eine Opc-Expression. Bei 14 dieser 24 Stämme wurde als Ursache ein phasenvariabler, intragenischer Poly-Adenin-Bereich identifiziert, der zu einer Leserasterverschiebung führte. Die Vermutung mehrerer Autoren, dass die Opc-Expression mit dem klinischen Bild der Meningitis verknüpft ist, konnte mit der hier genutzten großen Stammsammlung nicht bestätigt werden. Invasive Stämme, die das Opc-Protein exprimierten, wurden genauso häufig von Patienten mit dem klinischen Bild der Meningitis isoliert wie Stämme, die das Opc-Protein nicht exprimierten (46% vs. 47%, Chi-square-Test: p<0,9). Allerdings gibt es eine starke Assoziation der Gegenwart des opc-Gens mit dem klinischen Merkmal Meningitis. Dieser Befund gibt Anlass zu der Hypothese, dass in vitro und in vivo Expression von Opc sich unterscheiden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das Opc-Protein nur in 19,8% aller Isolate (invasive und Trägerstämme zusammengenommen) exprimiert wurde. Es zeigte sich eine Tendenz zu häufigerer Opc-Expression in apathogenen Trägerisolaten. Das Vorhandensein des opc-Gens, nicht aber die in vitro Expression konnten mit dem klinischen Merkmal Meningitis assoziiert werden. Zusätzlich wurde ein weiterer Mechanismus der intragenischen Phasenvariation beschrieben. N2 - Presence of opc was associated with meningitis, mostly because ST-11/ST-8 cc meningococci with low meningitis rates were consistently opc negative. On the other hand, lack of opc did not exclude meningitis. Opc was expressed in only 13% of all invasive isolates. In vitro Opc expression was not associated with meningitis. Limitation: Definite conclusion about expression in vivo is not possible with cultured isolates. Evidence for intragenic opc phase-variation was provided. KW - Neisseria meningitidis KW - opc KW - Medizin KW - Mikrobiologie KW - Meningitis Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157278 ER - TY - THES A1 - Burgert, Anne T1 - Untersuchung von Sphingolipiden und anderen Membrankonjugaten mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie T1 - Analysis of sphingolipids and other membrane conjugates with super-resolution fluorescence microscopy N2 - Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) ermöglichen es Moleküle zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmoleküle auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochauflösende fluoreszenzbasierte Technik für biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zunächst potentielle Artefakt-auslösende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren. Eine mögliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger präzise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen führen oder zu falschen Rückschlüssen über die Verteilung von Molekülen. Eine Möglichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erhöhen, ist chemische Additive als Triplettlöscher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden können. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettlöscher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zunächst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60%, bei Atto655 veränderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erhöhten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht bestätigt werden. Hier hatte COT nur einen größeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60%). Eine Erklärung für diese Widersprüchlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, könnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den Übergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff. Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10%) der Intensität von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensität jedoch wieder um 40%. Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettlöscher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden. Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erhöhen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen. Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anfällig für die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgeführten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf mögliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Moleküle quantifiziert werden sollen. Dafür müssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgfältig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer höheren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgeführt werden, wäre es sinnvoll bei Veröffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen. Die Färbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molekülen mittels SMLM entstehen können. Häufig werden Antikörper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass möglichst kleine Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgeführt werden sollen. Anderenfalls leidet die Auflösung darunter, bzw. erhöht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molekülen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide gehören zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zelluläre Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig über die Verteilung der Ceramide und die Größe der CRPs bekannt. Sie wurden hier über IgG-Antikörper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und primären T-Zellen angefärbt und erstmals mit dSTORM hochaufgelöst, um sie dann zu quantifizieren. Unabhängig von der Zelllinie befanden sich 50% aller Ceramidmoleküle in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antikörper-Färbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Größe der CRPs. Dies könnte zu einer Veränderung der Löslichkeit von Membrankomponenten führen, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern könnte. Die Anhäufung der Ceramide in den CRPs könnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolekülen erleichtern und dadurch möglicherweise die Reaktivität von Rezeptoren verändern. Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure-Kettenlänge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende Möglichkeit darstellen, zelluläre Reaktionen zu verfolgen. Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis auslösen können. Es wurde mittels immunhistochemischen Färbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antikörper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgelöst wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen könnten. In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen auslösen, was zum Tod führen kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend für die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen Färbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, während das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor für A. fumigatus identifiziert werden. In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantikörper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr spät erkannt wird und die Behandlungsmöglichkeiten noch sehr eingeschränkt sind, führt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste Färbungen mit aufgereinigten Antikörper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgeführt und mit dSTORM hochaufgelöst werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Autoantikörper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antikörper an Neuronen hochaufgelöst werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antikörper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch dünner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley’s H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein für weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann. N2 - With single molecule localization microscopy (SMLM) quantification of molecules and the analysis of their distribution becomes possible. In this work various plasma membrane molecules of different eukaryotic and prokaryotic cells were imaged with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) or PALM (photoactivated localization microscopy) and quantified. To use these super-resolution fluorescence microscopy techniques and answer elaborate biological questions, potential sources of artifacts were identified and strategies to circumvent them developed. A possible source of artifacts is an insufficient number of photons emitted by fluorophores. If less photons are detected, determining the localization of one fluorophore is less precise. This can cause a wrong reconstruction of structures or might lead to false conclusions about the distribution of molecules. One possibility to increase the number of photons is to use chemical additives which quench the triplet state of fluorophores. They ensure that the fluorophores relax into the ground state allowing them to become excited again. Different additives, described in literature as triplet quenchers, were tested. The effects of these additives on the triplet state of different fluorophores (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) were analyzed with fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Cyclooctatetraene (COT) resulted in a decrease of triplet state yield of Al488, Al532 and Al647 by ~ 40-60%, yet the triplet state of Atto655 was unaffected. FCS measurements indicated that COT results in an increased number of emitted photons, but dSTORM measurements could not confirm this finding. Here, COT only revealed a positive effect on the intensity of Al647 (increase by ~ 60%). An explanation for this inconsistency with the FCS results might be the presence of the switching buffer in dSTORM measurements. The buffer is designed to cause a transition of the fluorophores to and stabilize the off-state by removing oxygen from the sample, counteracting the effect of COT. On addition of 5 mM potassium iodide (KI) only Al488 fluorophores showed a decreased triplet state rate (~ 80%) in FCS measurements. This finding was confirmed by dSTORM measurements with low concentrations (~ 0.5 mM) of KI which resulted in a slight intensity increase (~ 10%) of Al488. Higher KI concentration (5 mM) on the other hand showed a reversed effect, resulting in a drop in intensity by ~ 40%. Deuterium oxide (D2O) isn’t a triplet quencher but should minimize non-radiative processes. DSTORM measurements with Atto665 and Al647 revealed, that D2O does not affect the total number of emitted photons per fluorophore. Instead, D2O increased the amount of emitted photons per time. In a nutshell, these results show that dSTORM measurements with Al647 can be improved using COT, and measurements with Al488 by using very low concentrations of KI. If needed, D2O can speed up dSTORM acquisition time considerably, e.g. for life cell measurements. In addition to an insufficient number of collected photons, inappropriate photoswitching rates can induce artifacts in dSTORM measurements as well. This was shown using various biological reference structures. Especially the imaging of plasma membranes is prone to generate artifacts. Plasma membranes exhibit a lot of intrinsically three-dimensional structures with high local emitter densities. In these regions of higher fluorophore densities the likelihood of two close fluorophores emitting at the same time is increased. This in turn can result in large artificial clusters due to misinterpretation by the reconstruction software. Taken together, the performed experiments show how important it is to prove dSTORM images and minimize possibility image artifacts. Thus, raw data movies need to be examined carefully and, if necessary, measurements must be repeated with adapted imaging conditions. Since dSTORM is increasingly used for quantification and cluster analysis it is recommended to publish raw data in the Supporting information of the manuscript. Another source of artifacts when imaging molecules with SMLM is the staining procedure. Usually antibodies are used to label biological structures for dSTORM. In the interest of resolution, small antibodies or just fragments of antibodies should be used, especially if cluster analysis is performed. Otherwise reduced resolution or an increase in cross-linking of molecules might occur. In the second part of this study plasma membrane ceramides were investigated. Sphingolipid ceramides regulate various cellular processes. Different stimuli initiate activation of sphingomyelinases (SMase) which synthesize ceramides at the plasma membrane. A rise in ceramide concentration leads to a condensation of them in ceramide-rich platforms (CRPs). So far, only little is known about the distribution and the size of CRPs. Here, plasma membrane ceramides of Jurkat-, U2OS-, HBME- and primary T-cells were stained with an IgG-antibody, imaged using dSTORM and their distribution quantitatively analyzed. Independent of the analyzed cell line, ~ 50% of all ceramides detected in the plasma membrane formed CRPs with a size of ~ 75 nm. On average one CRP consisted of ~ 20 ceramide molecules. Using a titration series the possibility of artificial cluster generation due to antibody staining was ruled out. Treatment of cells with Bacillus cereus sphingomyelinase (bSMase) increased the overall ceramide concentration in the plasma membrane, the number of ceramides in the CRPs as well as the quantity and the size of CRPs. This might result in a higher solubility of membrane components in CRPs which in turn could facilitate accumulation or compartmentation of certain proteins. Accumulation of ceramides in the CRPs could also enable local interaction with other molecules and possibly change the reactivity of some receptors. To investigate plasma membrane ceramides in living cells azido-modified ceramides and copper-free click chemistry were used for labeling. Imaging was performed using confocal laser-scanning microscopy (LSM) and structured illumination microscopy. It was shown that the length of fatty acid chains and the position of the azido group of ceramide analogues play a decisive role in the magnitude of the detected signal in the plasma membrane. These results demonstrate that azido-functionalized ceramides are live-cell compatible, making them an excellent tool to follow cellular reactions. In this study, ceramides were not only analyzed in eukaryotic cells but in bacteria as well. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) are gram-negative bacteria triggering sepsis or meningitis in humans. Using both immunolabeling with anti-ceramide IgG-antibodies and azido-modified ceramides, ceramides were detected for the first time in the membrane of N. meningitidis by dSTORM. Although sphingolipids were reported to exist in various bacterial membranes, studies about ceramides in N. meningitidis have not yet been published. The results obtained here suggest the presence of ceramides in N. meningitidis. The third part of this thesis addresses the interaction between NK cells and Aspergillus fumigatus. The mold can cause invasive aspergillosis in immunocompromised patients which can lead to death. Various studies have already shown that NK cells play a crucial role in the clearance of the fungal infection. Still, the exact mechanism remains unknown. As part of this work the NK cell marker CD56 was identified as a decisive receptor in recognition of the mold. Using LSM and dSTORM measurements in combination with immunocytochemical staining an active transport of the usually homogenous distributed CD56 receptors to the interaction site of NK cells and fungus was detected. Over time CD56 proteins accumulate at these interaction sites while the signal in the rest of the membrane continuously decreases. For the first time this study was able to identify CD56 as an important recognition receptor for A. fumigatus. In the last project binding of anti-N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptor encephalitis autoantibodies were investigated in neurons. Patients with this form of encephalitis generate autoantibodies against the NR1 subunit of their own postsynaptic NMDA receptors. Since NMDA receptor encephalitis is often diagnosed too late and treatment options are limited the disease often proves to be fatal. Anti-NMDA receptor encephalitis was described quite recently, explaining why the exact mechanism remains still unknown. For this study purified antibodies from anti-NMDA receptor encephalitis patients were used to stain NMDA receptor transfected HEK cells and hippocampal mouse neurons. These samples were subsequently imaged with dSTORM and analyzed. Measurements on HEK cells confirmed that the autoantibodies bind to the NR1 subunit. Using dSTORM, the binding sites of these antibodies at the neurons were imaged for the first time with super-resolution microscopy. The receptors are densely localized in synapses and more equally distributed at lower density in extrasynaptic regions. Based on Ripley’s H function synaptic clusters with a diameter of ~ 90 nm and ~ 500 localizations were determined while the extrasynaptic smaller clusters have a median diameter of ~ 70 nm and ~ 100 localizations per cluster. These first results form the basis for further investigations on the mechanism of anti-NMDA receptor encephalitis. KW - Ceramide KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Aspergillus fumigatus KW - NMDA KW - Neisseria meningitidis KW - Lokalisationsmikroskopie KW - dSTORM KW - Plasmamembran Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145725 ER - TY - THES A1 - Bösl, Maria T1 - Charakterisierung des Zwei-Partner-Sekretionssystems von Meningokokken T1 - Characterisation of the two-partner-secretion-system in meningococci N2 - Ein Proteintransportsystem genannt Zwei-Partner-Sekretionssystem ist bei gram-negativen Bakterien weit verbreitet. In B. pertussis ist es bereits ausführlich untersucht. Diese Arbeit widmet sich dem Zwei-Partner-Sekretionssystem in Meningokokken. N2 - Characterisation of a protein transoport system in meningococci. This system, called two-partner-secretion-system is allready well examined in B. pertussis. KW - Neisseria meningitidis KW - TPS-System KW - Proteintransport KW - two-partner-secretion-system Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28810 ER - TY - THES A1 - Danhof, Sophia T1 - Molekulare Untersuchung der Interaktion von Neutrophil Extracellular Traps mit dem humanen Pathogen Neisseria meningitidis T1 - Molecular investigation of the interaction of Neutrophil Extracellular Traps with the human pathogen Neisseria meningitidis N2 - Neisseria meningitidis ist ein wichtiger Erreger von Meningitis und Sepsis insbesondere bei jungen Menschen, gleichzeitig sind hohe Raten asymptomatischen Trägertums bekannt. Als die Virulenz begünstigende Faktoren wurden unter anderem die Kapsel, Pili, äußere Membranvesikel (OMV) und Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert, die es dem Erreger erleichtern, das menschliche Immunsystem zu überwinden. Dabei war bisher die Rolle von Neutrophil Extracellular Traps (NETs) als neu beschriebene Komponente der angeborenen Immunantwort nicht untersucht worden. NETs stellen spinnennetzartige DNA-Strukturen mit globulären Proteindomänen dar, die aus neutrophilen Granulozyten entstehen und als antimikrobiell gelten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von NETs auf Meningokokken zu charakterisieren und mögliche Resistenzmechanismen der Bakterien zu identifizieren. In den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass Meningokokken an NETs binden und durch diese in ihrer Proliferation gehemmt werden. Eine Lokalisation der Bakterien an die NETs konnte dargestellt werden, LPS und Pili wurden als wichtige Strukturen für die Vermittlung der NET-Bindung identifiziert. OMVs zeigten sich als protektiv gegenüber dem Einfluss der NETs, indem sie die Bindung der Erreger an die NETs blockierten. Wenig empfindlich zeigten sich die Bakterien gegenüber Histonen als den quantitativ bedeutsamsten NET-Proteinen. Meningokokken schützen sich gegenüber dem Einfluss der NETs durch Ausbildung von Kapsel und LPS mit intakter Phosphoethanolamin-Modifikation. Ebenso vermitteln zwei Cathelicidin-Resistenzgene den Bakterien einen Überlebensvorteil. Keine Rolle bei der NET-Resistenz spielten die untersuchten Effluxmechanismen. Neuere Untersuchungen von Lappann et al. indentifizierten Meningokokken und OMVs als potente NET-Induktoren. Damit könnten durch die relativ NET-resistenten Mikroorganismen andere Abwehrmechanismen der Neutrophilen konterkariert werden und eine Immunevasion begünstigt werden. Genauere Untersuchungen diesbezüglich stehen noch aus. N2 - Neisseria meningitidis is an important pathogenic agent of meningitis and sepsis especially in young adults, at the same time high rates of asymptomatic carriage are well-established. Known factors promoting virulence are, among others, the capsule, pili, outer membrane vesicles (OMV) and the lipopolysaccharide (LPS). In host defense against meningococcal disease, the role of Neutrophil Extracellular Traps (NETs), a recently described component of the innate immune response, had not yet been investigated. NETs are web like structures with globular protein domains that arise from neutrophil granulocytes and are considered being antimicrobial. The aim of the present study was to further investigate interactions between N. meningitidis and NETs and to identify possible resistance mechanisms of meningococci. In this thesis I could demonstrate that meningococci bind to NETs and are therewith being restricted in proliferation. A localization of bacteria to NETs was illustrated, and the mediating effect of LPS and pili on binding was identified. OMVs were shown to be protective against the properties of NETs by blocking the binding of pathogens to NETs. Bacteria were minor sensitive to histones which represent the quantitatively most significant group of proteins in NETs. Meningococci are protected against the effect of NETs by the formation of capsule and LPS when correctly modified with phosphoethanolamine. Two genes involved in cathelicidin resistance were shown to be beneficial on the survival of the bacteria. The investigated efflux mechanisms did not affect resistance to NETs though. Recent data by Lappann et al. identified the role of meningococci and OMVs as potent inducers of NET-formation. This might be a strategy of the NET-resilient microorganism to thwart neutrophil phagocytosis or degranulation and to facilitate immune escape, which is yet to be investigated. KW - Neisseria meningitidis KW - Meningokokken KW - Neutrophil Extracellular Traps KW - neutrophile Granulozyten KW - äußere Membranvesikel KW - antimikrobielle Peptide KW - meningococci KW - neutrophil granulocytes KW - outer membrane vesicles KW - antimicrobial peptides Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85231 ER - TY - THES A1 - Hauer [geb. Lein], Nina T1 - Genetische Variabilität und Expression der ADP-Ribosyltransferase NarE T1 - Genetic variability and expression of ADP-ribosyltransferase NarE N2 - Neisseria meningitidis ist Auslöser invasiver Infektionen, die Sepsis und Meningitis hervorrufen. Bakterielle ADP-Ribosyltransferasen wurden als Toxine zahlreicher Bakterien wie E.coli, V. cholerae und B. pertussis beschrieben, die postranslationale Modifikationen bei eukaryotischen Proteinen mit pathologischer Wirkung für den Menschen hervorrufen. Die ADP-Ribosyltransferase NarE von Neisserien ist auf der Basis von Sequenzhomologien identifiziert worden. Die enzymatische Aktivität des Proteins wurde bereits in Studien gezeigt. Ziel dieser Arbeit war, NarE aus epidemiologischem und populationsbiologischem Blickwinkel zu betrachten. Insgesamt wurden 576 Meningokokkenisolate (109 Isolate aus der Stammsammlung des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie Würzburg und 467 Isolate der Meningococcus Genome Library der Meningitis Research Foundation) auf das Vorhandensein von narE sowie auf Sequenzvariationen untersucht. Das Ergebnis zeigte den Besitz des Gens bei insgesamt 247 Stämmen. Bis auf zwei Punktmutationen waren alle untersuchten narE-Sequenzen identisch. Die narE-positiven Isolate konnten neun klonalen Komplexen zugeordnet werden. Zusätzlich wurde veranschaulicht, dass das Gen in Komplexen vorkommt, die verwandtschaftlich nicht eng miteinander verbunden sind. Mittels Western Blot konnte bei allen narE-positiven Meningokokken die Proteinexpression bestätigt werden, wobei ein signifikanter Unterschied zwischen Stämmen des cc32 und cc41/44 festzustellen war. Auf Transkriptionsebene konnte mittels qRT-PCR kein Unterschied zwischen diesen Komplexen ermittelt werden, so dass der Expressionsunterschied auf einem posttranskriptionellen Mechanismus beruhen muss. Neisseria gonorrhoeae ist ebenfalls im Besitz des Gens wie von Masignani et al. (2003) am Beispiel weniger Isolate beschrieben. In dieser Arbeit konnte für alle 29 getesteten Gonokokken die Insertion von vier Basenpaaren bestätigt werden, die zu einer Verschiebung im Leseraster führt, so dass NarE nicht exprimiert wird. Auch ein Neisseria sicca Stamm beinhaltet und exprimiert das narE-Gen. N2 - Bacterial ADP-ribosyltransferases have been described as toxins of numerous bacteria such as E. coli, V. cholerae and B. pertussis that cause posttranslational modifications of eukaryotic proteins with pathological effects in humans. The ADP-ribosyltransferase NarE from Neisseria has been identified on the basis of sequence homologies. The enzymatic activity of the protein has already been shown in studies. The aim of this work was to look at NarE from an epidemiological and population biological point of view. A total of 576 meningococcal isolates were investigated for the presence of narE and for sequence variations. The result showed the possession of the gene in a total of 247 strains. With the exception of two point mutations, all investigated narE sequences were identical. The narE-positive isolates could be assigned to nine clonal complexes. In addition, it was demonstrated that the gene occurs in complexes that are not closely related. Western blot confirmed protein expression in all narE-positive meningococci with a significant difference between cc32 and cc41/44 strains. At the transcriptional level, qRT-PCR could not detect any difference between these complexes, so that the expression difference must be based on a post-transcriptional mechanism. Neisseria gonorrhoeae is also in possession of the gene as described by Masignani et al. (2003) using the example of a few isolates. In this work, the insertion of four base pairs was confirmed for all 29 gonococci tested, which leads to a shift in the reading frame so that NarE is not expressed. A Neisseria sicca strain also contains and expresses the narE gene. KW - Neisseria meningitidis KW - ADP-Ribosyltransferasen KW - NarE KW - Virulenzfaktor KW - Meningokokken Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187803 ER - TY - THES A1 - Heinen, Florian T1 - Einfluss von Neisseria meningitidis auf Tight-Junctions in humanen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (HBMEC) T1 - Influence of Neisseria meningitidis on tight junction proteins of human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) N2 - Neisseria meningitidis ist mit jahrlich etwa 700.000 Erkrankungsfallen weltweit und einer Mortalitat von circa 7% einer der häufigsten Ausloser der bakteriellen Hirnhautentzündung. Der entscheidende Schritt zur Auslosung einer Meningitis ist die Uberwindung der Blut-Hirn-Schranke. Diese im menschlichen Korper einmalig dichte Barriere wird maßgeblich durch Tight-Junctions spezialisierter Endothelzellen der Hirnkapillaren aufrecht erhalten. Ob N. Meningitidis diese Barriere auf einem parazellulären oder transzellulärem Weg uberwindet, ist nicht vollstandig geklart. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von N. meningitidis auf die Tight-Junction Proteine Occludin und ZO-1 unter Nutzung des HBMEC Zellkulurmodelles untersucht. Neben einer verminderten Genexpression von Occludin zeigte sich dabei eine Abspaltung eines 50 kDa Fragmentes von Occludin. Gleichzeitig konnte eine Umverteilung von Occludin von den Zellgrenzen in das Zytoplasma beobachtet werden. ZO-1 hingegen wurde weder in seiner Exprimierung, noch in seiner intrazellularen Verteilung beeinflusst. Mittels eines in dieser Arbeit etablierten Assays zur Bestimmung der Permeabilitat eines HBMEC-Monolayer als vereinfachtes in-vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke konnte bestatigt werden, dass durch die Beeinflussung von Tight-Junction Proteinen die parazellulare Permeabilitat steigt. In weiteren Analysen konnten diese Prozesse auf eine gesteigerte Aktivitat von Matrixmetalloproteinase 8 zurückgefuhrt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuen Mechanismus auf, durch den N. meningitidis im Stande ist, die-Hinr-Schranke auf einem parazellulärem Weg zu überwinden. N2 - Neisseria meningitidis is a leading cause of bacterial meningitis with about 700.000 cases per year and a mortality of approximately 7%. A crucial step in the pathogenesis of meningococcal meningitis is the crossing of the blood-brain barrier (BBB). This barrier mainly consists of tight junctions of the microvascular endothelial cells. It remains unclear whether N. meningitidis passes the BBB by a paracellular or transcellular route. In this work the influence of N. meningitidis on the tight junction proteins occludin and ZO-1 was investigated by using the HBMEC cell-culture model. Using QRT-PCR a reduced expression of occludin was seen, western-blot analyses showed a cleavage of occludin into a fragment of 50 kDA. Immonulourescence further showed a complete dissociation of occludin from the cell membrane, whereas ZO-1 was not influenced. By establishing a permeability-assay an increased permeability of the HBMEC monolayer after infection with N. meningitidis was demonstrated. Further work showed, that these effects are dependent of an increased activity of matrix metalloproteinase-8. These results reveal a new mechanism that could enable N. meningitidis to cross the BBB by a paracellular route. KW - Neisseria meningitidis KW - Tight junction KW - Occludin KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Neisseria meningitidis KW - Tight junction KW - Occludin KW - Blood-Brain Barrier Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71631 ER - TY - THES A1 - Herrmann, Johannes Bernd T1 - Rolle des Komplement C5a-Rezeptors 1 in der Pathophysiologie der Meningokokken-Sepsis T1 - Role of complement C5a-Receptor 1 in Pathophysiology of Meningococcal Sepsis N2 - Das bekapselte, Gram-negative, diplokokkenförmige Bakterium Neisseria meningitidis (Nme) ist ein asymptomatischer Kommensale des oberen Nasenrachenraums im Men-schen. Gerade bei Kindern ist es dem humanspezifischen Pathogen in seltenen Fällen möglich, in den Blutstrom einzuwandern und lebensbedrohliche Krankheitsbilder wie Meningoenzephalitis und Sepsis auszulösen, welche als „Invasive Meningokokkener-krankung“ (IMD) zusammengefasst werden. Jährlich ereignen sich weltweit bis zu 1,2 Mio Fälle von IMD, welche aufgrund des fulminanten Verlaufs und der hohen Letalität gefürchtet sind. In der Bekämpfung der Nme-Sepsis ist das humane Komplementsystem von entscheidender Bedeutung. Vor diesem Hintergrund ist die protektive Rolle des lytischen (Membranangriffskomplex MAK) und opsonisierenden Arms (Opsonine iC3b und C1q) der Komplementkaskade gut dokumentiert. Dagegen ist der Beitrag des in-flammatorischen Arms (Anaphylatoxine C3a und C5a) in der Nme-Sepsis bisher unklar. Aus diesem Grunde wurde mit dieser Arbeit die Rolle des inflammatorischen Arms an-hand des Komplement C5a-Rezeptors 1 (C5aR1) in der Pathophysiologie der Nme-Sepsis am Mausmodell untersucht. Nach Etablierung des murinen, intraperitonealen In-fektionsmodells konnte ein schädlicher Effekt des C5aR1 in der Nme-Sepsis beobachtet werden. Aus der Abwesenheit des C5aR1 resultierte eine höhere Überlebensrate, ein besserer klinischer Zustand, eine niedrigere Bakteriämie und niedrigere Konzentrationen der pro-inflammatorischen Mediatoren IL-6, CXCL-1 und TNF-α. Im Hinblick auf den zellulären Pathomechanismus sprechen Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass der C5aR1 primär eine gesteigerte Freisetzung inflammatorischer Mediatoren durch verschiedene Zellpopulationen triggert (Zytokinsturm), wodurch sekundär Zellparalyse, steigende Bakteriämie und höhere Letalität bedingt sind. Durch Depletionsversuche und Immun-fluoreszenzfärbungen konnte, unabhängig vom C5aR1, eine allgemein protektive Rolle von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen in der Nme-Sepsis beo-bachtet werden. Darüber hinaus präsentierte sich der zyklische C5aR1-Antagonist PMX205 als erfolgsversprechende Therapieoption, um Parameter einer murinen Nme-Sepsis zu verbessern. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Wirksamkeit dieser Substanz in der humanen Nme-Sepsis zu erforschen. Zudem könnte das murine, intrape-ritoneale Infektionsmodell zur Klärung der Rolle des C5aR2 in der Nme-Sepsis genutzt werden. N2 - The encapsulated, Gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is an asymp-tomatic commensal in the human upper respiratory tract. In rare cases and especially in children, this human-specific pathogen is able to invade into the blood stream and cause life-threatening disorders like meningoencephalitis and septicemia, which are subsumed as „invasive meningococcal disease“ (IMD). The estimated number of cases is about 1.2 mio per year worldwide. IMD is greatly feared because of its fulminant progression and its high lethality. It is very well known, that the human complement system holds an essential role to fight meningococcal sepsis. In this context, the protective effects of the lytic (membrane attack complex MAC) and opsonizing branches (opsonines iC3b and C1q) are well established. On the contrary, very little is known about the contribution of the inflammatory branch (anaphylatoxines C3a and C5a) in meningococcal sepsis. Therefore, this work focused on the role of the C5a-Receptor 1 (C5aR1) in pathophysi-ology of meningococcal sepsis in a murine model. After having established the para-mount role of complement in murine intraperitoneal infection model, we could observe a detrimental effect of C5aR1 in Meningococcal sepsis. The absence of C5aR1 resulted in a higher overall survival, ameliorated clinical status, lower bacteremia and lower levels of the proinflammatory mediators IL-6, CXCL-1, TNF-α. Particularly with regard to results about the cellular pathomechanism, the C5aR1 seems to cause an increased re-lease of proinflammatory mediators (cytokine storm) exerted by various cell populations. As a consequence, cellular paralysis, increasing bacterial burden and higher lethality rate seems to occur. In reference to depletion experiments and immunofluorescence stain-ings, we could observe protective overall effects of neutrophils and mono-cytes/macrophages, uncorrelated to C5aR1 presence. Ultimately, the cyclic C5aR1-antagonist PMX205 appeared to be a promising option to improve parameters in murine meningococcal sepsis. Further experiments are required to examine the potential of this compound in human meningococcal sepsis. Moreover, the murine, intraperitoneal infec-tion model could be used to clarify the role of C5aR2 in meningococcal sepsis. KW - Komplement C5a KW - Neisseria meningitidis KW - Meningokokken-Sepsis KW - Komplement C5a Rezeptor 1 KW - C5aR1-Antagonist Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184533 ER - TY - THES A1 - Hessler, Frank T1 - Verbreitung von Meningokokken bei gesunden Trägern in Bayern : unter besonderer Berücksichtigung des hypervirulenten ET-15-Klons T1 - Spreading of meningococci among healthy carriers in Bavaria with special consideration of the hypervirulent ET-15-clone N2 - Neisseria meningitidis (Meningokokken) stellen einen häufigen Erreger von bakterieller Meningitis und generalisierter Sepsis bei Kleinkindern und Jugendlichen dar. Diese Bakterienspezies ist sehr kompetent für horizontalen DNA-Austausch durch Transformation, was zur einer sehr heterogenen Populationsstruktur führt. Innerhalb der Population gibt es wenige klonale Linien, die für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich sind, aber bei gesunden Trägern relativ selten gefunden werden. In den Achtziger Jahren trat ein hypervirulenter Klon in Kanada auf und war dort für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich. Dieser Klon wird als Elektrophoretischen Typ 15 (ET-15) bezeichnet und führt zu besonders schweren Erkrankungsverläufen, und einer hohen Letalität. In den Neunziger Jahren breitete sich dieser Klon in der Tschechischen Republik aus und trat 1998 im bayerischen Landkreis Rottal/Inn bei einem Ausbruch in Erscheinung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verbreitung von ET-15-Meningokokken unter 8000 Kindergartenkindern, Schülern und Bundeswehrsoldaten in elf Landkreisen und kreisfreien Städten sowie in sechs Bundeswehrkasernen untersucht. Die allgemeine Trägerrate an Meningokokken betrug 10,3%. Bei vier Probanden aus zwei Orten wurden ET-15-Meningokoken isoliert, was einer Trägerrate von 0,05% entspricht. Im Landkreis Rottal/ Inn wurden keine ET-15-Meningokokken gefunden. Während des Beobachtungszeitraumes ereigneten sich in Bayern vier Erkrankungsfälle durch diesen Bakterienklon. Der anschließende Vergleich der chromosomalen DNA mittels Pulsfeldgelelektrophorese nach SpeI-Verdau legte nahe, dass es sich bei den Trägerstämmen nicht um vier identische Klone handelte. Ebenso war kein gemeinsames Bandenmuster zwischen den vier Trägerisolaten und den vier Erkrankungsstämmen zu erkennen. Parallel dazu wurden die Träger- und Erkrankungsstämme mit identischen Referenzstämmen aus der Tschechischen Republik und aus Rottal/Inn verglichen, wobei sich auch hier kein gemeinsames DNA-Muster zeigte. Bei den Träger- als auch bei den Erkrankungsisolaten aus dem Untersuchungszeitraum in Bayern handelt es sich um neue Varianten des ET-15-Klones, die in Folge klonaler Expansion entstanden sein könnten. Die Inzidenz des ET-15-Trägertums in Bayern im Beobachtungszeitraum ist als niedrig einzuschätzen. N2 - Neisseria meningitidis (the meningococcus) is a widespread pathogen of bacterial meningitis and sepsis in toddlers and teenagers. The reason for the heterogeneous population structure is horizontal DNA exchange via transformation. Few clonal lineages, being unfrequently recovered from healthy carriers, cause most cases of disease. In the eighties a hypervirulent clone the electrophoretic type (ET-15 clone) appeared in Canada and was responsible for the majority of the cases. The clone is associated with a high fatality rate. In the nineties the clone expanded in the Czech Republic; in 1998 it caused a serious outbreak of meningococcal disease in the area of Rottal/Inn in Bavaria. The carriage rate of ET-15 meningococci was assessed among 8000 children of kinder gardens, pupils and soldiers of the Federal Armed Forces in eleven bavarian districts, cities and military camps, respectively. The general carriage rate of meningococci was 10,4%. In four subjects from two locations, ET-15 meningococci were recovered, which corresponded to a carriage rate of 0,05%. In the district of Rottal/Inn, no ET-15 carrier was detected. During the collection period four cases of meningococcal disease due to ET-15 meningococci occurred in Bavaria. Comparison of the four carrier strains by pulsed field gel electrophoresis showed that the four carriage strains and the four invasive strains differed from each other. The carrier strains and disease strains were compared with the reference strains from the Czech Republic and from Rottal/Inn. No identical restriction fragment pattern was found. The carrier strains and disease strains from the survey period in Bavaria, are suggested to be new variants of the ET-15 clone, which might have developed during clonal expansion in Bavaria. The overall incidence of ET-15 carriage in the observation period was low. KW - Neisseria meningitidis KW - ET-15-Meningokokken KW - Trägerrate KW - gesunde Träger KW - Pulsfeldgelelektrophorese KW - Neisseria meningitidis KW - ET-15-meningococci KW - carriage rate KW - healthy carriers KW - pulsed field gel electrophoresis Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14730 ER - TY - THES A1 - Hübner, Claudia T1 - Analyse des Transkriptionsprofils von Neisseria meningitidis während der Infektion von Epithel- und Endothelzellen unter Verwendung der Mikroarraytechnologie T1 - Transcriptome analysis of Neisseria meningitidis during the infection with epithelial and endothelial cells by using microarray technology N2 - Neisseria meningitidis, ein pathogenes Bakterium, das schwere Fälle von Sepsis und Meningitis verursacht, interagiert während der Infektion mit verschiedenen Oberflächen des Wirtes. Die schnellstmögliche Anpassung an die spezifischen Milieubedingungen im Wirtsorganismus ist daher ein essentieller Schritt in der Pathogenese. Durch Verwendung von DNA-Mikroarrays, die auf gespotteten Oligonukleotiden basieren, wurde das Transkriptionsprofil von N. meningitidis während der Infektion von Epithel- und Endothelzellen analysiert. Zur Analyse wurde die isogene kapseldefiziente siaD-Mutante des N. meningitidis Stammes MC58 verwendet. 72 Gene konnten nach Kontakt mit Epithelzellen und 48 Gene nach Kontakt mit Endothelzellen als differential reguliert identifiziert werden. Darunter auch eine große Anzahl von Virulenzgenen. Während ein Teil der detektierten Gene in beiden Systemen als differentiell reguliert galt, gab es doch eine Anzahl von ORF´s, die nur für ein Zellkulturmodell spezifisch reguliert waren (59 spezifische Gene für HEp-2 und 35 spezifische Gene für HBMEC). Für einige ausgewählte Gene wurde die im Mikroarray detektierte Regulierung durch Quantitative RT-PCR nochmals bestätigt. Die Funktion von den als induziert identifizierten Genen rfaF, hem und NMB1843 wurde im Anschluß durch die Konstruktion von Mutanten näher untersucht. Das rfaF-Gen, eine in der LPS Biosynthese involvierte Heptosyl-II-transferase, wurde in beiden Zellkultursystemen als differentiell reguliert identifiziert. Die Deletion des Gens führte speziell für den bekapselten Stamm MC58 zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasion nach Infektion von Epithelzellen. Untersuchungen des Infektionspotential für HBMEC Zellen ergaben keine signifikant veränderte Adhärenz und Invasion. Bei zusätzlicher Deletion von rfaF in einem opc negativen Stamm konnte eine Abnahme der bakteriellen Aufnahme im Zellkulturmodell HBMEC beobachtet werden. Dagegen zeigten die opc, rfaF negativen Mutanten nach Kontakt mit HEp-2 Zellen keine verminderte Invasion. Weiterhin führte die Deletion des rfaF-Gens zu einer verstärkten Sensibilität gegenüber humanen Serum. Diese Daten deuten daraufhin, dass die LPS-Struktur eine Rolle in der bakteriellen Zellinteraktion spielt, speziell wenn eine für die Adhäsion wichtige Komponente nicht mehr exprimiert wird. Der ORF NMB1843, der für einen Transkriptionsregulator aus der MarR-Familie kodiert, ebenso wie das Hämolysin Gen konnten nur nach Kontakt mit HBMEC Zellen als differentiell reguliert identifiziert werden. In Infektionsstudien zeigten die hem-Mutanten keine veränderte Adhärenz und Invasion. Weiterhin war die Zytotoxizität der Mutanten nicht eingeschränkt. Ob der ORF NMB1646 daher als Hämolysin fungiert bleibt zu klären. Durchgeführte Mikroarraystudien mit den NMB1843-Mutanten, führten zur Identifizierung einiger ORF´s, die möglicherweise unter der Kontrolle dieses Regulators stehen. Dazu gehören die Virulenz assoziierten Gene sodC, iga und nadA sowie das für ein Hämolysin kodierende Gen NMB1779. Die Untersuchung des Expressionsprofils mittels SDS-PAGE Analyse führte zur Identifizierung einer Proteinbande bei 210 kDa, die spezifisch für die NMB1843 negativen Stämme ist. Dieses Protein wurde als nadA identifiziert. NadA induziert im Tiermodell bakterizide Antikörper und gilt daher als möglicher Impfstoffkandidat. Die in dieser Arbeit vorgelegten Daten liefern neue Einblicke in die Pathogenitätsmechanismen von N. meningitidis und belegen die Bedeutung der transkriptionellen Genregulation in den einzelnen Stadien der Meningokokkeninfektion. N2 - Neisseria meningitidis is a major cause of septicemia and meningitis. During the course of infection, N. meningitidis encounters multiple environments within its host, which makes rapid adaptation to environmental changes a crucial factor for neisserial pathogenicity. As technology platform oligonucleotide-based DNA microarrays were employed to analyse the transcriptome profile of N. meningitidis during two key steps of meningococcal infection: the interaction with epithelial and endothelial cells. The isogenic capsule deficient siaD mutant of the N. meningitidis strain MC58 was used for this study. Seventy-two genes were differentially regulated after contact with epithelial cells, and 48 genes were differentially regulated after contact with endothelial cells, including a considerable proportion of well-known virulence genes. While several genes were in concordance between bacteria adherent to both cell types, there were a considerable number of open reading frames that were differentially regulated in only one system (59 genes specific for HEp-2 and 35 genes specific for HBMEC). Quantitative RT-PCR analyses confirmed the microarray observed regulation for several selected ORF´s. Subsequently, the function of the upregulated genes rfaF, hem and NMB1843 was investigated by construction of mutants. The rfaF gene, encoding a heptosyl-2-transferase involved in LPS biosynthesis, were detected as being differentially regulated in both cell systems. Disruption of the rfaF gene in meningococcal strain MC58 resulted in a significantly increased adhesion and invasion to epithelial cells in particular for the capsulated mutant. Investigations of the infection potential for HBMEC cells did not result in a significant change in adherence and invasion pattern. The additional deletion of the rfaF gene in an opc negative strain leads to a significantly decrease in the bacterial uptake for HBMEC cells. Compared to HBMEC, opc, rfaF mutants showed no differences in internalisation after contact with HEp-2 cells. Moreover rfaF deficient meningococci demonstrated enhanced sensitivity to normal human serum (NHS). These data provide evidence that the LPS structure plays a role in the bacterial cell interaction, particularly if an important adhaesive structure is absent. The ORF NMB1843, which encodes a transcriptional regulator of the MarR family, as well the hemolysin gene, were detected as being upregulated only after contact with endothelial cells. Using infection assays, no changes were detected in the adherence and invasion pattern for hem mutants. Furthermore the cytotoxic potential of the mutants was not different from the parental strains. Therefore it remains to be clarified whether the ORF NMB1646 actually act as a hemolysin. Microarray studies for the NMB1843 mutants showed some ORF´s, which possibly are under control of this regulator, for example the virulence genes sodC, iga and nadA as well as the hemolysin coding gene NMB1779. The analysis of the expression profile by SDS-PAGE led to the identification of a 210 kDa protein, which is specific for the NMB1843 negative strains. This unknown protein was identified as nadA. NadA evokes a strong antibactericidal antibody response in laboratory animals. For this reason NadA is regarded as a good vaccine candidate. The data represented in this study provide new insight into the pathogenicity mechanisms of N. meningitidis and could demonstrate the importance of gene regulation on the trancriptional level during different stages of meningococcal infection. KW - Neisseria meningitidis KW - Infektion KW - Endothel KW - Epithel KW - Transkription KW - Neisseria meningitidis KW - Adhärenz und Invasion KW - Epithel und Endothelzellen KW - Transkriptionsprofil KW - Neisseria meningitidis KW - adhesion and invasion KW - epithelial and endothelial cells KW - Transcriptome Analysis Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13535 ER - TY - THES A1 - Kaiser, Lena Franziska T1 - Wirkmechanismus von Sphingolipiden und Sphingosin gegen mikrobielle Erreger T1 - Mechanism of the bactericidal effect of sphingolipids and sphingosine against microbial pathogens N2 - Die zunehmende Antibiotikaresistenz vieler Krankheitserreger ist ein weltweites Problem, welches zu einem klinischen Bedarf an neuen antimikrobiellen Substanzen führt. Sphingolipide einschließlich Ceramide stellen eine vielfältige Gruppe strukturverwandter Lipide dar und bestehen aus einem Sphingosin-Grundgerüst, welches mit einer Fettsäure verbunden ist. Sowohl das Sphingosin-Grundgerüst allein als auch Sphingolipide zeigen eine antibakterielle Wirkung gegenüber einer Vielzahl pathogener Mikroorganismen. Die Intensität der Hemmung hängt von der Sphingolipidstruktur und dem Mikroorganismus ab. Neuere Studien konnten zeigen, dass Sphingosin, Ceramide und Ceramid-Analoga in N. meningitidis aufgenommen werden und eine bakteriostatische oder bakterizide Wirkung zeigen. Jedoch ist die antibakterielle Wirkungsweise noch nicht genau bekannt. Um mehr über den Wirkmechanismus zu erfahren haben wir die ultrastrukturellen Veränderungen von N. meningitidis nach Inkubation mit azido-funktionalisierten Sphingolipiden mit elektronenmikroskopischen Verfahren (transmissionselektronenmikroskopische und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen) untersucht. Mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) konnten wir die azido-funktionalisierten Sphingolipide nach Aufnahme in N. meningitidis lokalisieren. Zum Anfärben der funktionalisierten Sphingolipide wurde die kupferfreie Azid-Alkin-Cyccloaddition verwendet. N2 - The increasing antibiotic resistance of many pathogens is a worldwide problem that leads to a clinical need of new anti-microbial compounds. Sphingolipids, including ceramides, represent a diverse group of structurally related lipids and are composed of a sphingosine backbone coupled to a fatty acid. Solely the sphingosine backbone as well as the sphingolipids show antibacterial activity against a wide range of pathogenic microorganisms. The rate of inhibition depends on the sphingolipid structure and the microbial strain. Recent studies revealed the uptake of sphingosine, ceramides and ceramide analogues by N. meningitidis and a bacteriostatic or bactericidal effect. However, the mechanism of the bactericidal effect is still unknown. To elucidate the antibacterial mechanism, we studied the ultrastructural changes after incubation of N. meningitidis with azido-modified sphingolipids by using electron microscopy techniques (transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). Due to correlative light-electron microscopy (CLEM) we were able to localize the azido-modified sphingolipids after incorporation in N. meningitidis. Copper-free azide-alkyne cycloaddition was used to stain the azido-modified sphingolipids. KW - Neisseria meningitidis KW - Sphingolipide KW - Sphingosin KW - Antimikrobieller Wirkstoff KW - Mikroskopie KW - sphingolipids Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218970 ER -