TY - THES A1 - Kapfhammer, Dagmar M. T1 - Vibrio cholerae Phage K139 T1 - Vibrio cholerae Phage K139 N2 - Bisher sind ca. 190 verschiedene Vibriophagen beschrieben, nur 10 davon stellen filamentöse Phagen dar, der Rest gehört zu den sogenannten Caudovirales, d.h. sie weisen ein kubisches Nukleokapsid mit einem mehr oder weniger langen Schwanz auf. Der letzteren Gruppe ist auch der Phage K139 zuzurechnen. K139 ist ein temperenter Phage, dessen Wirtsspektrum sich nach bisherigen Erkenntnissen auf V. cholerae Stämme der Serogruppen O1 und O139 beschränkt. Als Rezeptor dient ihm dabei das O1 Lipopolysaccharid (LPS), Morphologisch ist er der Familie der Myoviridae zuzurechnen, innerhalb des Klassifikations-Schemas der Vibriophagen den Kappa-Phagen. Diese Phagengruppe weist eine hohe Assoziation mit epidemischen O1 El Tor Stämmen auf, es gibt aber keine Hinweise auf eine Beteiligung an der Virulenz von V. cholerae. In dieser Arbeit wurde die vollständige K139 Genomsequenz ermittelt. Diese besteht aus 33.1 kb ds DNA, die Sequenzierung deutet auf eine terminale Redundanz hin. Zusammen mit dem bereits bekannten Sequenzabschnitt ergab sich eine Zahl von insgesamt 44 offenen Leserastern (ORFs). Sowohl auf Sequenzebene als auch hinsichtlich der Organisation des Genoms konnte eine Verwandtschaft von K139 zu den P2-Phagen gefunden werden. Insgesamt weisen 26 ORFs Homologie zu P2 Genprodukten auf. Für 14 ORFs war eine Funktionszuordnung basierend auf der Homologie zu bereits bekannten Proteinen möglich. Auch über die Analyse der Sequenzmotive wurde versucht, Hinweise auf eine mögliche Funktion der putativen Proteine zu erhalten. Zur Unterstützung der bioinformatischen Auswertung wurden weiterführende Untersuchungen angestellt. So wurden die Proteine des Phagenpartikels mittels 2D SDS-PAGE und MALDI-TOF analysiert. Auf diese Weise konnten vier putative Kapsid- und drei putative Schwanz-Proteine als Bestandteil des Phagenpartikels ermittelt werden. Weiterhin wurde durch Überexpression und Restriktionsanalysen Orf8 als Adenin-spezifische Methyltransferase identifiziert. Als Methylierungssequenz wurde die Basenabfolge 5´-GATC-3´ ermittelt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Funktionszuordnung putativer Genregulatoren. Dies wurde einmal für die Proteine Orf2 und CI durch Überexpression und Konstruktion von Deletionsmutanten und deren phänotypischer Bestimmung in Plaque-Assays untersucht. Dabei konnte Orf2 eine mögliche Schutzfunktion vor superinfizierenden Phagen zugeschrieben werden. Widersprüchlich sind dagegen die Ergebnisse für die Funktion von CI, das aufgrund seiner Homologie als Repressor der Lyse dienen sollte. Zum zweiten wurde in einem Promotor-Test System der Einfluß der Proteine CI, Orf2, 8, 11, 12 und 13 auf vier verschiedene putative Promotor-Bereiche von K139 untersucht. Weiterhin wurde durch Southern Blot Analysen die Verbreitung von K139 innerhalb verschiedener V. cholerae Isolate untersucht. Dabei wurden in 50% der O1 und O139 und in 7% der Nicht-O1/O139 Stämme ein positives Hybridisierungssignal gefunden. Dabei zeigten der O1 klassische Stamm sowie zwei Nicht-O1/O139 Stämme ein verändertes Restriktionsmuster. Nähere Untersuchungen der verschiedenen Phagentypen mittels Southern-Blot und PCR zeigten eine hohe Verwandtschaft, lediglich eine Region, die der K139 Genomregion zwischen dem rep und dem orf15 Gen entspricht, zeigte auffällige Unterschiede. Die Sequenzierung ergab eine auffallend mosaikartige Struktur mit homologen und nicht-homologen Sequenzabschnitten im Vergleich der Phagen untereinander. Schließlich wurde noch eine weitere Genregion sequenziert, orf35 bis orf36, in der wirtsspezifische Sequenzunterschiede vermutet wurden. Für die Sequenz von orf35, das für das putative Schwanzfaser Protein kodiert, konnte eine mosaikartige Struktur ermittelt werden, die durch die Anwesenheit von zwei konservierten (C1 und C2) und zwei variablen (V1 und V2) Regionen zustande kommt. Die Kombination der variablen Bereiche ergab drei verschiedene Schwanzfaser-Protein Typen. Überraschenderweise korrelieren diese Typen nicht mit der Serogruppe des Wirtes. So konnte der gleiche Schwanzfaser-Typ in drei verschiedenen Serogruppen gefunden werden. Als Grund hierfür wird die Fähigkeit von V. cholerae diskutiert, durch horizontalen Gentransfer ein neues LPS Biosynthese-Cluster zu erwerben und damit die Serogruppe zu wechseln. N2 - So far 183 different tailed and ten filamentous Vibrio phages were described. Phage K139 belongs to the Myoviridae family of tailed phages. It can be isolated from V. cholerae strains of the O1 and O139 serogroups. The receptor is known to be the O1 LPS. In the classification scheme of Vibriophages K139 can be assigned as a Kappa-phage based on its morphology. The Kappa group was shown to be widely distributed among epidemic V. cholerae strains, but no evidence could be provided so far showing whether or not it is contributing to V. cholerae pathogenicity. In this study the complete genome sequence of K139 was characterized. It consists of 33.1 kb linear ds DNA with terminal redundant ends of unknown length. Along with the already known sequence of the lysogenic/lytic control region the genome harbours 44 ORFs. Database analysis revealed that 26 of them are homolog to P2-like phages. The relationship to the P2-like phage group is also reflected by the genomic organization of K139, which resembles that of phage HP1. A possible function could be assigned to 14 ORFs based on homology to proteins of already known function. Determination of sequence motifs of the deduced gene products further helped to identify possible functions. In addition, the putative function of several ORFs assigned by bioinformatic analysis was supported by experimental data. For example, the proteins of the phage particles were analysed by MALDI-TOF. Four putative capsid and three putative tail proteins could be identified as part of the phage particle by this method. Moreover, Orf8 could be assigned a function as adenine-specific methyltransferase by overexpression and restriction analysis. The specific methylation sequence could be identified as 5´-GATC-3´. A further focus of this study was the identification of potential K139 gene regulators. Overexpression vectors and knock-out mutants of orf2 and cI were tested for their phenotype in plaque assays. Thereby Orf2 was found to be involved in protection against superinfecting K139 phages. The phenotypical data about the CI function is contradictory. Homology analysis suggested a function as lytic repressor, which was confirmed only by part of the plaque assays. A different approach of elucidating the function of putative repressors was done by the construction of a promoter-probe system, which allowed to test a possible influence of the proteins Orf2, CI, Orf8, 11, 12 and 13 on the putative K139 promoter sequences. Thereby Orf11 could be shown to activate transcription of its own promoter P11, whereas Orf13 activates the late promoter P17 of the morphogenesis cluster, which confirmed the function of Orf13 assigned by homology analysis. Furthermore the occurence of K139 related phage sequences was investigated by Southern Blot screening of V. cholerae isolates belonging to different serogroups. K139 could be detected in 50% of the O1 and O139 strains, but related sequences were also found in two non-O1/O139 strains. The different phage types were further characterized by Southern Blot and PCR analysis, which revealed an almost identical overall genome organization. Only one genomic region produced strikingly differing PCR products. Sequencing of this region revealed a mosaic-like pattern of homologous an non-homologous sequences. Finally the orf35 and orf36 regions of the phages were also sequenced, because the putative function of Orf35 as the receptor binding protein suggested host-specific differences. Indeed, two conserved (C1 and C2) and two variable (V1 and V2) regions were identified. Three different V1 and two different V2 regions could be detected within the K139 related phages. The combination of these variable regions defines three types of tail fiber proteins. Interestingly, the tail fiber types don´t correspond to the serogroup of the host in some of the cases. For example, the same tail fiber gene product could be detected in three different serogroups, whereas strains of the same serogroup contain three different tail fiber gene products. As a reason for this observation the possibility of serogroup conversion of the host strain by acquisition of a new LPS biosynthesis gene cluster via horizontal gene transfer is discussed. KW - Bakteriophage K139 KW - Molekulargenetik KW - Bakteriophage KW - Vibrio cholerae KW - bacteriophage KW - Vibrio cholerae Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3768 ER - TY - THES A1 - Langenhan, Ronny T1 - Identifizierung immunodominanter antigener Strukturen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) mit Hilfe einer Expressionsgenbank T1 - Identification immunodominant and antigenic structures of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with an expression library N2 - Infektionen durch MRSA können aufgrund der zunehmenden Therapieresistenz der Erreger ernsthafte Verläufe zeigen. Daher ist die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien ein Ziel der aktuellen Infektionsforschung. Ein vielversprechender Ansatz liegt in der Verwendung pathogenspezifischer, monoklonaler Antikörper gegen immunodominante Antigene der Erreger. Durch die Fortschritte in der Genomforschung der vergangenen Jahre ist nun die Analyse der Gesamtheit der Pathogenitätsfaktoren eines bakteriellen Erregers möglich. Durch eine funktionelle Genomanalyse mit Hilfe immunologischer Detektionssysteme können antigene Bakterienzellstrukturen identifiziert werden. Daraus abgeleitete Targetstrukturen sollen die Grundlage bilden für die Entwicklung spezifischer humaner Antikörper, die in alternativen Therapieansätzen zusätzlich zur antimikrobiellen Chemotherapie zukünftig an Bedeutung gewinnen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Expressionsgenbank eines MRSA-Stammes hergestellt und mittels Patientenseren nach immunodominanten Antigenen gesucht. Die aus einem Partialverdau der genomischen DNA gewonnenen Fragmente wurden in einen Expressionsvektor kloniert. Die so hergestellte Genbank des ausgewählten MRSA-Stammes A 134 umfasst ca. 10000 Klone. Ein vergleichendes Screening der Genbank erfolgte mit dem Serum eines Patienten mit einer MRSA-Sepsis und mit dem Serum einer negativen Kontrollperson. Die DNA-Inserts der immunoreaktiven Klone wurden sequenziert und durch Datenbankvergleiche identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass der gewählte Ansatz geeignet ist, um immunodominante Antigene, die während einer Sepsis exprimiert werden, zu identifizieren. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen putativen immunodominanten Antigenstrukturen umfassen ein Holin, die Amidase LytA, Faktoren des isd-Genclusters, der für die Cadmiumresistenz wichtige Transporter CadA, unbekannte Proteine der Staphylokokken-Pathogenitätsinsel SaPI3 und Protein A. Interessanterweise wurden durch den methodischen Ansatz vorwiegend Proteine auf mobilen genetischen Elementen identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass während einer S. aureus-Infektion nicht nur Gene für das Wachstum der Zellen und Virulenzfaktoren wie Toxine und Adhäsine, sondern auch mobile Elemente exprimiert werden. Die Bedeutung dieser Prozesse für das Infektionsgeschehen ist allerdings bislang unbekannt und zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit diese Elemente für die Pathogenese von Bedeutung sind. Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene müssen auch in zukünftigen Arbeiten durch Subklonierung weiter charakterisiert werden. Eine weitere interessante Beobachtung ist die Identifizierung eines Bakteriophagens, der in das isd-Gencluster inserierte, das für die Aufnahme von Eisen eine Bedeutung besitzt. Inwieweit durch die Insertion des Phagens die Eisenaufnahme in dem klinischen Isolat gestört wird, müssen zukünftige Studien zeigen. Die positive Reaktion des Patientenserums mit dem Protein A ist am wahrscheinlichsten auf die Antiköperbindung am FC-Fragment zurückzuführen. Es ist jedoch auch möglich, dass während der Infektion verstärkt Protein A gebildet wird, das durch die Bindung von Antikörpern am Fc-Teil eine immunsuppressive Wirkung durch die Neutralisierung opsonisierender und Toxin-inaktivierender Antikörper besitzt. Durch die Sequenzierung und Datenbankanalyse der positiven Klone konnte ein erster Überblick über immunodominante Antigene von S. aureus erhalten werden. Da auf den Insertelementen meist mehrere putative Antigene kodiert sind, müssen in zukünftigen Arbeiten die identifizierten Insertelemente subkloniert und damit weiter charakterisiert werden. Dadurch sollte es möglich sein, die immunogenen Strukturen zu erkennen und diese für die Entwicklung monoklonaler Antikörper zu nutzen. N2 - Infections caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are increasingly difficult to threat due to the presence of multiple antibiotic resistance traits. Therfore, the developemet of alternative strategies are urgently demanded to combat severe staphylococcal infections. Immunotherapy has become a promising approach using specific, monoclonal antibodies against defined immunodominant structures (antigens) of the bacterium. The recent progress of genome-based research of bacterial pathogens allows now the global analysis of factors involved in pathogenicity. The identification of such virulence-associated factors might result in the development of specific antibodies against bacterial pathogens which may administered supplementary to antibiotics increasing the success of of a therapy. In this study an expression library of an MRSA strain was constructed. For this purpose, genomic DNA of a MRSA strain was digested with Sau3A and DNA fragments of 3 to 10 kb were ligated into the expression vector ZAP-express. The gene library encompasses approximately 10,000 clones. To detect specific antigenic structures the expression library was screened by using human sera of MRSA septiceamic patients and sera of asymptomatically colonized individuals. Clones which specifically reacted with the patients sera were further analyzed by DNA-sequencing and BLAST analysis. Several staphylococcal antigenic and immunodominant structures were identified including a putative holin and a gene with strong homology to the amidase lytA. Both proteins may phage-derived as they show significant similarity to a range of phage proteins. In addition, genes of the isd-locus reacted with the immunsera. These genes encode proteins which are important for transport of iron into the cell. Furthermore, a cadmium resistance factor (cadA), unknown proteins localized on Staphylococcus aureus pathogenicity island 3 (SaPI3) and protein A showed a positive reaction with the immune sera. Interestingly, almost all proteins identified are associated with mobile genetic elements. The results of the study suggests that proteins encoded on mobile genetic elements are indeed expressed during infection which in turn are recognized by the immune system resulting in the production of specific antibodies. To what extend these antibodies contribute to a successful defence of staphylococcal cells is currently not known and subject of ongoing studies. Moreover, the antigenic and immunodominant structures identified in this study have to subcloned to characterize their immunoreactive potential. The positive reaction of the patient serum with protein A is probably caused by the antibody-binding capacity of the protein to the FC-fragment of antibodies. An alternative theoretical opportunity could be that an acute S. aureus infection causes a massive production of protein A that subsequently consume antibodies due to binding of the FC-Fragment. The sum of these events may cause a dramatic immunsuppressive effect. In conclusion, several putative immunodominant structures have been identified being the basis for further studies to assess whether or not these structures may serve as targets of an antibody-based therapy of infections caused by S. aureus. KW - MRSA KW - monoklonale Antikörper KW - Expressionsgenbank KW - Pathogenitätsinsel KW - Bakteriophagen KW - MRSA KW - monoclonal antibodies KW - expression library KW - pathogenicity island KW - bacteriophage Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13719 ER -