TY - THES A1 - Hauck, Fabian T1 - Regulation des Blimp1-Promotors durch die Transkriptionsfaktoren C/EBP-Beta und NFATc1 in T-Lymphozyten T1 - Regulation of the Blimp1-promoter by the transcription factors C/EBPβ and NFATc1 in T-lymphocytes N2 - Das murine Blimp1 (B lymphocyte-induced maturation protein) und sein humanes Homolog PRDI-BF1 (positive regulatory domain I binding factor 1) sind als terminale Differenzierungsfaktoren der myeloischen Reihe und der B-Lymphozyten (BCs) beschrieben worden. Über direkte sequenzspezifische Promotorbindung und epigenetische Modifikationen greifen sie größtenteils reprimierend in die Expression einer Vielzahl von Genen ein und werden dabei funktionell mit einer niedrigen Proliferationsrate und einem hohen Grad an Zelldifferenzierung und Apoptose in Zusammenhang gebracht. Im Zuge dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Blimp1 auch in der zweiten lymphatischen Zellreihe, also in den T-Lymphozyten (TCs) und hier insbesondere in den Subtypen der T-Helfer-2-Zellen (CD4+ TH2), der CD4+ T-Gedächtniszellen (CD4+ TMem) und der regulatorischen TCs (CD4+ CD25+ TReg) exprimiert wird. Die gefundene Blimp1-Expression ist nicht konstitutiv. Vielmehr wird das Blimp1-Gen über T-Zellrezeptorsignale – über die Proteinkinase C (PKC) und den Anstieg freier intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen – verstärkend über den Interleukin-6-Rezeptor-pathway, und über die Aktivität des Transkriptionsfaktors C/EBPβ (CCAAT/enhancer-binding protein) allein induziert. Die Transaktivierung des TATA-boxlosen Blimp1-Promotors (ca. 1 kb) durch C/EBPβ wird stärker über dessen proximale Hälfte vermittelt, an der jedoch keine direkte Bindung des Transkriptionsfaktors nachzuweisen ist, und scheint somit indirekt zu sein. Im Gegensatz dazu bindet das C/EBPβ-Protein im schwächer transaktivierenden distalen Blimp1-Promotorbereich direkt an eine kombinierte, der P1/Pu-bB-des IL-4-Promotors ähnliche NFAT/C/EBP-Bindungssequenz. Die C/EBP-Bindungsstelle liegt hierbei in direkter Nachbarschaft zum NFAT-(nuclear factor of activated T cells) Bindungsmotiv. Auch NFATc1 bindet direkt, entwickelt aber kein transaktivierendes Potential sondern reprimiert vielmehr die durch C/EBPβ-vermittelte Transaktivierung. N2 - Murine Blimp1 (B lymphocyte-induced maturation protein) and its human homolog PRDI-BF1 (positive regulatory domain I binding factor 1) have been described as terminal differentiation factors in the myeloid lineage and in B-lymphocytes (BCs). They mainly act as direct repressors of a variety of genes by sequence-specific promoter-binding and epigenetic modifications and are functionally associated with low proliferation rate and high degree of differentiation and apoptosis. This work shows that Blimp1 is expressed as well in the second lymphoid lineage, namely in T-lymphocytes (TCs), and especially in the subsets of T-helper 2 cells (CD4+ TH2), memory T-cells (CD4+ TMem) and regulatory T-cells (CD4+ CD25+ TReg). Expression of Blimp1 is not constitutive but inducible through the T-cell receptor (TCR) – via protein kinase C (PKC) and a consecutive increase in intracellular concentration of free Ca2+ – and sustainable through the interleukin-6 (IL-6) receptor. The Blimp1-gen is as well induced by the activation of the transcription factor C/EBPβ (CCAAT/enhancer-binding protein) alone. Although C/EBPβ-mediated transactivation of the TATA-boxless Blimp1-promoter (~1kb) is linked more intensively to its proximal half, no direct binding of the transcription factor has been detected and transactivation therefore seems to be indirectly. However, C/EBPβ-protein is binding to a combined NFAT/C/EBP-binding sequence that is related to the P1/Pu-bB of the IL-4 promoter and located in the transcriptionally weaker distal half of the Blimp1-promoter. This C/EBP-binding site is located in direct vicinity to a NFAT (nuclear factor of activated T cells)-binding-motif. As well NFATc1 is binding directly, but instead of acting as an independent transactivator it represses C/EBPβ-mediated transactivation. KW - Blimp1 KW - PRDI-BF1 KW - C/EBP-Beta KW - NFATc1 KW - T-Lymphozyten KW - Blimp1 KW - PRDI-BF1 KW - C/EBP-Beta KW - NFATc1 KW - T-lymphocytes Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16092 ER - TY - THES A1 - Hock, Matthias T1 - Analyse der NFATc1-Genexpression durch eGFP-BAC-Reportermäuse T1 - Analysis of NFATc1 gene expression using eGFP-BAC reporter mice N2 - In Lymphozyten wird nach Antigenaktivierung die Expression des Nfatc1-Gens durch Aktivierung des P1-Promoters stark induziert. Dagegen ist die, durch den Promoter P2 vermittelte Expression ebenso wie die der anderen NFAT Faktoren c2 und c3 konstitutiv. Die Akkumulation der dabei gebildeten Isoform NFATc1/αA ist sowohl für Effektorfunktionen wie die Zytokinproduktion sowie die Proliferation und das Überleben der aktivierten Zellen wichtig (Chuvpilo et al., 2002). Um die Expression des Nfatc1-Gens auf Einzelzellebene messen zu können, wurden BAC (bacterial artificial chromosom) transgene Mauslinien generiert, die einen 210kb großen Bereich des Nfatc1-Gens der Maus enthalten. In diesen Lokus wurde ein eGFP-Reportergen innerhalb des allen Isoformen gemeinsamen, dritten Exons integriert. In dieser Arbeit wird durch semiquantitative RT-PCR-Experimente von Gesamt-Milzzellen und TLymphozyten gezeigt, dass in den B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen die Expression der eGFP-cDNA analog zum endogenen Nfatc1-Lokus der Kontrolle der beiden Promotoren P1 und P2 unterliegt. In Western Blot Experimenten wird in diesen Zellen mittels eines NFATc1α-spezifischen Antikörpers eine induzierbare und CsA-sensitive α-GFP-Isoform - vergleichbar mit der endogenen NFATc1α-Isoform - nachgewiesen. Gleichzeitig zeigen NFATc1-Antikörper das konstitutiv exprimierte GFPβ-Protein. Die Korrelation der Expression von NFATc1 und GFP auf mRNA- und Proteinebene machen in B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen das GFP-Protein somit zu einem sensitiven und spezifischen Marker der NFATc1-Aktivität. In FACS-Analysen gibt der Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität bei Stimulation von Gesamt- Milzzellen bzw. T-Lymphozyten um bis auf das Dreifache die Induktion von NFATc1 wider. Unter dem Einfluss von CsA verbleibt die GFPFluoreszenzintensität auf dem Niveau unstimulierter Zellen. Die GFPFluoreszenz korreliert darüber hinaus bei Primärstimulation mit der Expression des IL-2-Gens, dessen Promotor mit 5 NFAT-Bindestellen den Prototyp eines NFATc1-Targets darstellt (Serfling et al., 1989). Die Analyse der Koexpression von NFATc1 und GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt in allen stimulierten, GFP-positiven CD4+-Lymphozyten die nukleäre Lokalisation von 75 NFATc1, vor allem von NFATc1α. Die Analyse des GFP-Phänotyps in alloreaktiven T-Zellen zeigt bei Abstoßungsreaktionen in vitro („Mixed Lymphocyte Reactions“) eine selektive Zunahme der Fluoreszenz dieser Zellen um bis auf das Vierfache, was die Rolle von NFATc1 für die Effektorfunktion aktivierter T-Lymphozyten verdeutlicht. GFP und das endogene NFATc1 werden bei Stimulation konventioneller T-Zellen (Tcons, CD4+CD25-FoxP3-) stark exprimiert, während natürliche regulatorische T-Zellen (nTregs, CD4+CD25+FoxP3+) konstant geringe NFATc1- und GFP-Konzentrationen zeigen. In induzierten regulatorischen T-Lymphozyten (iTregs) supprimiert TGF- β konzentrationsabhängig die GFP-Fluoreszenz bis auf das Niveau unstimulierter Lymphozyten. Während in nTregs die Suppression des Nfatc1- Gens im wesentlichen durch FoxP3 erfolgt (Torgerson et al., 2009), scheint dies in iTregs vor allem über den TGF-β Signalweg vermittelt zu werden. Die Analyse der GFP-Expression in den verschiedenen Stadien der TZellentwicklung zeigt weiterhin deutliche Unterschiede in der Aktivität des Nfatc1-Gens. Dies wird durch die starke Aktivität des BAC-Genlokus in CD4- CD8- DN Thymozyten, welche eine sechsfach höhere GFP-Expression aufweisen als CD4+CD8+ DP Zellen, deutlich. N2 - Activation of lymphocytes causes a high level of Nfatc1 due to P1-promoter induction, whereas the P2-promoter leads to an constitutive expression of NFATc2/c3. NFATc1/αA is essential for effector-function, proliferation and survival of activated cells (Chuvpilo et al., 2002). Here we show that the eGFP-cDNA integrated in a NFATc1-eGFP-BAC-construct is under control of both promoters (P1, P2) and correlates with the NFATc1-Expression on mRNA and protein-levels. In FACS-analysis there is an increase in eGFP-fluorescence intensity, which is highly CsA-sensitive. In natural and induced Tregs we observed a low level of eGFP-expression correlating with concentration of TGF-β. CD4-CD8- DN cells show the highest eGFP-Expression in thymocytes. KW - NFATc1 KW - Genexpression KW - eGFP KW - BAC-Konstrukt KW - NFATc1 KW - Genexpression KW - eGFP KW - BAC-Konstrukt KW - NFATc1 KW - gene expression KW - eGFP KW - BAC-construct Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80596 ER -