TY - THES A1 - Hacker, Christian T1 - Beteiligung des Major Vault Proteins an der Kernporenkomplexbildung T1 - Involvement of the Major Vault Protein in nuclear pore complex formation N2 - In die Kernmembran von Eukaryoten sind Kernporenkomplexe eingelagert. Diese stellen die einzige Verbindung zwischen dem Nukleo- und Zytoplasma dar und vermitteln den gerichteten Transport von Proteinen und Ribonukleoproteinpartikeln über die Kernhülle. Durch vorangehende Versuche unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass es experimentell möglich ist, die Bildung einer kontinuierlichen Doppelmembran von der Insertion der Kernporenkomplexe zu trennen (Ewald et al., 1997). Dabei spielen verschiedene im Extrakt enthaltene Membranfraktionen eine Rolle. Erst kürzlich wurden in unserer Arbeitsgruppe zwei unterschiedliche Membranfraktionen aus Xenopus Extrakt isoliert, die aufgrund ihrer Dichte als 40% und 30% Membranfraktion benannt wurden. Massenspektrometrische Untersuchungen zeigten, dass sich in der 30% Membranfraktion, welche für die Kernporenkomplexbildung verantwortlich zu sein scheint, das Major Vault Protein (MVP) befindet. MVP ist Hauptbestandteil der Vault-Komplexe, großer tonnenförmiger Ribonukleoproteinpartikel, denen bislang eine Vielzahl von zellulären Funktionen zugeordnet wurden, die meisten davon jedoch noch stark debattiert. Vaults könnten womöglich eine Rolle als Transporter über die Kernporenkomplexe spielen und wurden schon mehrfach mit dem Aufbau einer multiplen Arzneimittelresistenz in Verbindung gebracht. Die Beteiligung von MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe ist eine neue zelluläre Funktion und sollte deshalb in dieser Arbeit näher untersucht werden. In dieser Arbeit wurden zunächst die 40% und 30% Membranfraktionen auf ihr unterschiedliches Verhalten bei der Bildung der Kernhülle separat und in Kombination genauer untersucht. Dabei zeigte sich, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und eine kontinuierliche Doppelmembran aufbaut. Die 30% Membranfraktion konnte alleine nicht an Chromatin binden, induzierte aber in der durch die 40% Membranfraktion gebildeten Doppelmembran den Aufbau von Kernporenkomplexen. Durch Immunfluoreszenzaufnahmen und ultrastrukturelle Untersuchungen wurde belegt, dass das an der 30% Membranfraktion assoziierte MVP für die Bildung von Kernporenkomplexen verantwortlich war. Ferner konnten wir zeigen, dass sowohl MVP als auch Vault-Partikel die de novo Insertion von Kernporenkomplexen in kontinuierliche Doppelmembranen induzieren konnten. Die molekularen Mechanismen der Kernporenkomplexbildung durch MVP wurden mit Hilfe von artifiziellen Lipidmembranen analysiert. Anhand von unilamellaren Liposomen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass MVP die Lipidstruktur beeinflussen und perforieren kann. Zudem löste MVP die Bildung von Poren in schwarzen Lipidmembranen aus und führte zur Messung von Strömen durch Einzelkanalmessungen über die entstandenen Poren. Um die bei dem Prozess der Kernporenkomplexbildung beteiligten Bindungspartner von MVP zu identifizieren, wurden mehrere Protein-Protein-Bindungsstudien durchgeführt. Unter den ermittelten MVP-Bindungspartnern ließen sich keine Nukleoporine mit dem Sequenzmotiv FXFG identifizieren, es ist jedoch nicht auszuschließen, dass MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe mit anderen Nukleoporinen interagiert. Da eine frühere Arbeit die Bedeutung von Mikrotubuli bei der Bildung der Kernporenkomplexe aufzeigte (Ewald et al., 2001), wurden in dieser Arbeit die Interaktionen der isolierten 40% und 30% Membranfraktionen und von MVP mit dem Mikrotubulinetzwerk näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass nur die 30% Membranfraktion mit Mikrotubuli interagierte und eine Inhibition der Mikrotubulipolymerisation durch Colchizin den Einbau von Kernporenkomplexen verhinderte. Im Gegensatz dazu interagierten die 40% Membranvesikel nicht mit Mikrotubuli und daher hat eine Colchizin-induzierte Inhibition der Mikrotubulipolymerisation keinen Effekt auf den Aufbau einer kontinuierlichen Doppelmembran. Durch immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass die Lokalisation von MVP an der Kernhülle ebenfalls Abhängig von Mikrotubuli ist. Um zu demonstrieren, dass die MVP-induzierte Kernporenkomplexbildung im zellfreien System abhängig vom Transport von MVP zur Kernhülle ist, wurde die Zugabe von MVP zu porenlosen Kernen nach einer Colchizin-Behandlung analysiert. Hierbei konnte belegt werden, dass MVP Mikrotubuli auch benötigt, um die Bildung von Kernporenkomplexen in der Kernmembran zu initiieren. Da Mikrotubulifilamente im zellfreien System mit ihren Plus-Enden gegen die Chromatinoberfläche gerichtet sind, sollten für den gerichteten Transport zum Chromatin Motorproteine der Kinesin-Familie eine Rolle spielen. Durch die Inhibition von Mklp2, einem mitotischen Kinesin, konnte der Aufbau der Kernporenkomplexe durch MVP in porenlosen Kernen blockiert werden. N2 - In eukaryotes, the nuclear envelope is normally interspersed with numerous nuclear pore complexes, which act as the only gateway between the nucleo- and cytoplasm. Nuclear pore complexes mediate the directed transport of proteins and ribonucleoproteinparticles through the nuclear envelope. Little is known about the assembly of these structures out of various subcomplexes. Interestingly, our group recently linked the Major Vault Protein (MVP) with the assembly of nuclear pore complexes. MVP is the main part of Vault-complexes, huge barrel-shaped ribonucleoproteinparticles with many cellular functions attached, many of them still in debate. Vaults possibly play a role as nuclear transporters and several works exist that connect them with the origin of multiple drug resistance. The involvement in the assembly of nuclear pore complexes depicts a novel cellular function of MVP and should therefore be analyzed in this project. Preceding work with the cell-free system based on Xenopus laevis egg extract showed that the building of a continuous double membrane could be separated from the insertion of nuclear pore complexes and could be assigned to different membrane fractions of the egg extract. (Ewald et al., 1997). Two different membrane fractions were isolated out of Xenopus egg extract and named 40% and 30% membrane fraction according to their density. Mass spectrometric analysis showed that the pore-inducing 30% membrane fraction contained MVP (Dissertation Friederike Vollmar). The first step in this project was the particularly examination of the different behaviour of the 40% and 30% membrane fraction during the formation of the nuclear envelope. Thereby, it could be demonstrated that the 40% membrane fraction binds to chromatin where it builds up a continuous double membrane. The 30% membrane fraction was not able to independently bind to chromatin, but induced the formation of nuclear pore complexes when added to the pore-free nuclei. Immunofluorescent and ultrastructural studies proved that the MVP-associated 30% membrane fraction is responsible in this process. MVP, as well as Vault-particles have the ability to induce the de novo insertion of nuclear pore complexes in continuous double membranes. Artificial lipid membranes were used to study the molecular mechanisms involving MVP during the process of nuclear pore complex assembly. By using unilamellar liposomes and electron microscopy it could be demonstrated that MVP affects and perforates the lipid structure. Furthermore, MVP induced the formation of pores in black lipid membranes and lead to the detection currents by single channel measurement. To identify MVP-binding partners that are involved in the process of nuclear pore complex formation, several protein-protein-interaction studies were performed. The studies showed that no nucleoporins with the sequence motive FXFG could be detected among the MVP-binding partners, but it cannot be ruled out that MVP interacts with other nucleoporins during the formation of nuclear pore complexes. As a previous study showed the importance of microtubules during the assembly of nuclear pore complexes (Ewald et al., 2001), this work analyzed the interactions of the isolated 40% and 30% membrane fraction and of MVP concerning the microtubule network. Thereby, it could be shown that only the 30% membrane fraction was able to interact with microtubules and the colchicines-induced inhibition of microtubule polymerisation prevented the insertion of nuclear pore complexes. In contrast, the 40% membrane vesicles did not interact with microtubules and the colchicine-induced inhibition of microtubule assembly had no effect on the constitution of a continuous double membrane. In the next step, immunofluorescence studies demonstrated that the nuclear localisation of MVP is also dependent on microtubules. To demonstrate that the MVP-induced formation of nuclear pore complexes also depends on the microtubule-driven transport of MVP towards the nuclear membrane, the addition of MVP to pore-free nuclei was monitored after colchicine treatment. Hereby, it could be shown that MVP also needed microtubules to initiate the assembly of nuclear pore complexes. As the plus-ends of microtubules are directed towards the chromatin surface in the cell-free system, the directed transport in the direction of chromatin should be mediated by motor proteins of the Kinesin family. The inhibition of Mklp2, a mitotic Kinesin, prevented the assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. The MVP-mediated de novo assembly of nuclear pore complex therefore is accomplished by the microtubule-transport of MVP via Mklp2. KW - Ribonucleoproteine KW - Kernhülle KW - Kernpore KW - Kernporenkomplex KW - Major Vault Protein KW - Vault KW - Kernhüllenbildung KW - Xenopus laevis KW - Nuclear pore complex KW - Major Vault Protein KW - Vault KW - Nuclear envelope assembly KW - Xenopus laevis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51279 ER - TY - THES A1 - Schäffler, Katrin M. T1 - Regulation der eukaryotischen Translation durch RNA-bindende Faktoren: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des La-verwandten Proteins 4B (LARP4B) T1 - Regulation of the eukaryotic translation by RNA-binding factors: structural and functional characterization of the La-related protein 4B (LARP4B) N2 - In Zellen liegen RNAs in Form von Ribonukleoprotein-Komplexen (RNP) vor, wobei das Zusammenwirken von RNA und Proteinen die Funktionen der einzelnen RNPs definiert. RNA-bindenden Proteinen kommt demnach eine zentrale Bedeutung beim Verständnis des RNA-Metabolismus zu. Zu dieser Proteingruppe zählen auch die La-verwandten Proteine (engl. La-related proteins, LARPs), welche eine evolutionär konservierte Familie von Faktoren bilden und durch eine putative RNA-bindende Domäne, dem La Modul, charakterisiert sind. Bereits für zwei Vertreter dieser Proteinklasse (LARP3 und LARP7) konnte eine über das La Modul vermittelte spezifische Interaktion mit uridylreichen RNA-Sequenzen gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Vertreter der LARP-Familie, das sogenannte LARP4B, sowohl biochemisch als auch strukturell zu untersuchen und es somit einem zellulären Prozess zuzuordnen. Zellbiologische Studien zeigten zunächst, dass LARP4B unter normalen Wachstumsbedingungen eine homogene zytoplasmatische Verteilung aufweist. Unter Stressbedingungen akkumuliert LARP4B hingegen in diskreten subzellulären Domänen, den sogenannten Stress Granules (SGs). Obwohl SGs bislang noch wenig funktionell untersucht sind, wird davon ausgegangen, dass sie der reversiblen Speicherung von mRNA-gebundenen Translationsfaktoren dienen. Durch affinitätschromatographische Strategien ließen sich spezifische Interaktionspartner von LARP4B identifizieren. Als direkte Bindungspartner wurden das zytoplasmatische Poly (A) bindende Protein 1 (PABPC1) und der Rezeptor für aktivierte C Kinase 1 (RACK1) gefunden. Darüber hinaus zeigten Sedimentationsanalysen, dass LARP4B nahezu quantitativ mit Ribosomen und Polyribosomen assoziiert vorliegt. Diese Studie identifizierte daher LARP4B als ein Protein, das mit Schlüsselfaktoren der eukaryotischen Translation wechselwirkt. In Übereinstimmung mit diesen Befunden reduziert ein RNAi-induzierter Mangel des Proteins die Translationsrate drastisch, während die Überexpression von LARP4B in vivo zu einer Stimulation der Proteinbiosynthese führt. Da dieser stimulatorische Einfluss bei einer Vielzahl unterschiedlicher mRNA-Spezies detektiert werden konnte, kann LARP4B als genereller, positiver Translationsfaktor angesehen werden. Interessanterweise wurden in Studien, die zeitgleich für das verwandte LARP1 durchgeführt wurden, vergleichbare zelluläre Interaktionen wie für LARP4B beschrieben. Um zu klären, ob beide LARPs Orthologe darstellen und funktionelle Redundanz zeigen, wurde in der vorgelegten Arbeit ein Vergleich von LARP4B mit LARP1 durchgeführt. Unabhängige in vivo Studien und Sedimentationsanalysen zeigten deutlich, dass beide Proteine im mRNA-Metabolismus agieren, jedoch in diesem unterschiedliche Phasen der eukaryotischen Proteinbiosynthese beeinflussen. N2 - The cooperation of RNA with different classes of proteins in so called ribonucleoprotein complexes (RNPs) is essential for the function of these RNPs. Therefore, RNA-binding proteins play a crucial role to understand the complex mechanisms of RNA-metabolism. One family of such proteins comprise the La-related proteins (LARPs). These evolutionary conserved factors are characterized by a putative RNA-binding domain, named the La module. For two of these factors (LARP3 and LARP7) a specific interaction with RNA containing uridine-rich sequence elements mediated via their La module could be described. The present work describes the biochemical and structural characterization of LARP4B, a thus far uncharacterized member of the LARP family. Immunofluorescence analyses identified LARP4B as a cytosolic protein that accumulates upon arsenite treatment in cellular stress granules (SGs). While still not sufficiently determined, these domains are believed to serve as storage pools for stalled, mRNA-bound translation initiation complexes formed upon polyribosome disassembly. Biochemical experiments further uncovered an interaction of LARP4B with the Poly(A) binding protein cytosolic 1 (PABPC1) and the receptor for activated C Kinase 1 (RACK1). Moreover, under physiological conditions, LARP4B co-sediments almost quantitatively with polysomes in cellular extracts, suggesting a role in translation. In agreement with this notion, knockdown of LARP4B by RNA-interference impaired translation of cellular mRNAs whereas over-expression stimulated protein synthesis. As this stimulatory effect could be detected for a wide range of different mRNA-species, LARP4B hence represents a general stimulator of translation. Interestingly, parallel studies uncovered comparable cellular interactions for another LARP family member (LARP1). To test whether LARP4B and LARP1 represent orthologs possessing redundant function, these two factors have been compared in this work using several independent in vivo and in vitro studies. These data clearly showed that both proteins positively influence RNA-metabolism but influence different phases of protein biosynthesis. KW - Translation KW - Eukaryoten KW - Ribonucleoproteine KW - Regulation KW - LARP4B KW - La Protein KW - PABPC1 KW - RACK1 KW - translation KW - LARP4B KW - La protein KW - PABPC1 KW - RACK1 Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69809 ER -