TY - THES A1 - Arndt, Petra T1 - Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere T1 - Cloning and functional characterization of organic cation transporters from rat kidney N2 - Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden. N2 - Organic cation transport in the renal tubule is an important physiological function for the maintenance of body fluid homeostasis and detoxification of harmful organic cations. In general, transport of organic cations in brush-border membranes is mediated by the H+/organic cation antiporter, whereas transport of organic cations in basolateral membranes is stimulated by the inside-negative membrane potential. By the expression cloning method, the organic cation transporter rOCT1, which is expressed in rat liver and kidney, was isolated. In 1996 another organic cation transporter from rat kidney, rOCT2, was isolated by homology cloning. rOCT2 was deduced to be a glycoprotein comprised of 593 amino acid residues with 12 putative transmembrane domains. To analyse the functional characteristics of rOCT2 in comparison with rOCT1 we utilized the Xenopus expression system. During this dissertation a pharmacological profile was made for rOCT2. The apparent substrate spectrum of rOCT2 was similar to that of rOCT1. Affinities of rOCT2 against several compounds were directly compared with those of rOCT1. We found differences in Km- and IC50-values for distinct substrates but also a lot of similarities between both transporters. Anions like p-aminohippuric acid were identified as a new group of inhibitors for rOCT1- and rOCT2-mediated transport. The potential difference is the driving force of transport mediated by rOCT1 and rOCT2. We showed the potential-dependent changes of Km-values of choline induced inward currents. Further when extracellular Na+ ions were replaced with K+ ions, the uptake of MPP and choline by rOCT2 was decreased. The bidirectional transport of MPP was shown and trans-sitmulation experiments for MPP influx and efflux were performed to study asymmetry of the transporter. The mechanism of interaction of several substrates with rOCT1 and rOCT2 were investigated and we found competitive and non-competitive inhibition of TEA uptake. KW - Ratte KW - Niere KW - Kation KW - Stofftransport KW - Molekularbiologie KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximaler Tubulus KW - Niere KW - Sekretion KW - Xenopus laevis KW - Oozyte KW - Transport KW - Inhibition KW - Homologieklonierung KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximal tubule KW - kidney KW - secretion KW - Xenopus laevis KW - oocyte KW - transport KW - inhibition KW - homology cloning Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-793 ER - TY - THES A1 - Gareiß, Martin T1 - Molekulare Charakterisierung und entwicklungsspezifische Expression der Kernmembranproteine Emerin und MAN1 im Tiermodell Xenopus laevis T1 - Molecular characterization and developmental expression of the nuclear membrane proteins ,emerin’ and ,MAN1’ in the model system Xenopus laevis N2 - Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären. N2 - Mutations in the human emerin gene EMD cause a rare form of an inheritated muscle dysfunction of striated muscle, named Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD1; OMIM 310300). The clinical phenotype of this genetic perturbance is manifested in 2nd-3rd decade by contraction of the cervical, elbow and Achilles tendons, by progressive muscle wasting and disturbance of the conduction system and cardiomyopathy, often leading to sudden death. Extensive investigations were made on the functions of this ubiquitous nuclear membrane protein, but the disease causing mechanisms remain obscure leading to the late onset of this tissue specific disease. To allure insights of the pathological function(s) of emerin this work examines the spatio-temporal transcription and expression patterns of emerin during development of the vertebrate model Xenopus laevis. Sequence analysis of EST-databases identified two emerin genes in the pseudo-tetraploid organism Xenopus laevis, Xemerin1 and Xemerin2, respectively. In comparison to the human and murine orthologues Xenopus emerins exhibit both similarities and differences. Structural analyses revealed an N-terminal conserved LEM-domain in the C-terminus and a unique hydrophobic transmembrane domain in the carboxy tail. Unlike the extended mammalian emerin (Homo sapiens 254 residues, Mus musculus 259 residues) neither a nucleus localization signal nor a serinerich region could be detected. However, comparison of the putative phosphorylation sites showed three equivalent sites as for the human emerin. Synthesis of specific monoclonal antibodies and recombinant fusion proteins elucidate the subcellular and tissue-specific localization of Xemerins. Similar to mammalian emerins immunofluorescence microscopy and immunoblotting showed clearly that both Xemerin1 and Xemerin2 are integral nuclear membrane proteins expressing ubiquitously in differentiated cells. Intriguingly, in oocytes Xemerin was undetectable by immunofluorescence and immunoblotting, respectively. Two-dimensional gel electrophoresis NEPHGE proved that our self-made monoclonal antibody 59/7 recognized both Xemerins highlighting two different molecular masses and isoelectric points. Interestingly, Xemerin2 exhibits an increased isoelectric point in 5-days old larvae than in adult somatic culture cells. Immunoblotting of embryonic proteins derived from different developmental stages showed that Xemerin1 and -2 are expressed in stage 43 (Nieuwkoop and Faber, 1975) during Xenopus embryogenesis for the first time. In this context, it is noteworthy that Xenopus A-type lamins – in contrast to previous reports – are already detectable in stage 28. Unexpectedly, RT-PCR analyses proved activity of the Xemerin genes during entire embryogenesis in all stages examined yet. Northern-blotting and sequence analyses of the Xemerin mRNA revealed exceeding untranslated regions with snRNP binding motives. Two independent techniques (band-quantification and quantitative real-time-PCR) bared a significantly increased activity of the Xemerin-genes upon stage 30. Outstanding interest provided the awareness, that exactly at this moment the activity of XMAN1, another inner nuclear membrane protein, was significantly down regulated. Whole mount in situ hybridizations exhibited stressed Xemerin expression in neuro-ectodermal tadpole tissues, as simultaneously reported for XMAN1 (also known as SANE) by to other groups (Osada et al., 2003; Raju et al., 2003). Congruent expression patterns of Xemerin proteins were provided by indirect immunofluorescence of embryonic thin-sections. These results corroborate the theory that XMAN1 and Xemerin could have overlapping functions. At first, recombinant fusion proteins showed an identical subcellular distribution of XMAN1 in comparison with Xemerin. Hence, in vitro binding assays proved direct interaction between Xemerins and XMAN1 as well as with Xenopus A-type lamins. Unfortunately, there is no functional XMAN1 antibody available up to now. Thus, it remains unclear if XMAN1 has overlapping functions with Xemerins during embryogenesis in vivo. Nevertheless, by characterizing Xenopus emerin this work displayed fundamental features for further studies. This opus definitely showed that the model system Xenopus laevis is competitive to the mammalian model ‘mouse’ elucidating the disease causing mechanisms of Emery-Dreifuss muscular dystrophy. KW - Glatter Krallenfrosch KW - Emerin KW - Oozyte KW - Xenopus laevis KW - Emerin KW - MAN1 KW - Oozyte KW - Embryonalentwicklung KW - Xenopus laevis KW - emerin KW - MAN1 KW - oocyte KW - early development Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19869 ER -