TY - THES A1 - Jungbauer [geb. Ulzhöfer], Sandra Gabi T1 - Die Rolle präsynaptischer Proteine Aktiver Zonen bei konditionierten Lernprozessen T1 - The role of presynaptic active zone proteins in conditioned learning behaviour N2 - Synaptische Plastizität wird als Grundlage für Lern- und Gedächtnisprozesse in unserem Gehirn angesehen. Aktive Zonen (AZ) und ihre spezifischen Proteine modulieren diesen Prozess und bahnen essentielle Vorgänge der synaptischen Transmission. In dieser Arbeit wurden drei zentrale Proteine Aktiver Zonen - Bruchpilot, RIM (Rab3 interacting molecule) und Fife - untersucht und ihre Rolle bei konditionierten Lernprozessen in Drosophila melanogaster Larven geprüft. Hierzu wurde das etablierte Paradigma des larvalen appetitiven olfaktorischen Lernens genutzt, bei dem eine Gruppe von Larven lernt, einen Duft mit einem gustatorischen Verstärker zu koppeln. Durch die vielfältigen genetischen Manipulationsmöglichkeiten des Modellorganismus war es möglich, die Funktion der Proteine bei assoziativen Lernvorgängen selektiv zu betrachten. Bruchpilot wird für den funktionellen Aufbau Aktiver Zonen in Drosophila benötigt und ist wichtig für die Akkumulation von Calcium-Kanälen in der Nähe von AZ. Durch gentechnische Veränderungen dieses Proteins ließ sich jedoch keine Beeinträchtigung im olfaktorischen Lernverhalten von Drosophila Larven beobachten. RIM fungiert durch seine Interaktionsdomänen als Bindeglied zwischen verschiedensten Effektoren und hat Einfluss auf synaptische Plastizität. Es wurde gezeigt, dass eine Punktmutation in der C2A-Domäne von RIM beim Menschen gleichzeitig zur Retinadegeneration und zu einem gesteigert verbalen IQ (Intelligenzquotient) führt. Eine durch die hohe Homologie vergleichbare Mutation im Drosophila-Genom resultierte nicht in einem veränderten Phänotyp im olfaktorischen Lernen. Fife ist ein Protein, das für eine funktionsfähige Architektur von AZ und damit u.a. für den reibungslosen Vesikelverkehr zuständig ist. Es zeigte sich, dass dieses Protein auch synaptische Plastizität und Lernvorgänge beeinflusst. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind ein Beitrag, um die Zusammenhänge der synaptischen Plastizität und die Funktion Aktiver Zonen Proteine besser begreifen zu können. Hervorzuheben dabei ist, dass die Bruchpilot- und RIM-Mutanten-Larven keinen veränderten Phänotyp, bzw. bei Fife nur teilweise einen eingeschränkten Phänotyp im olfaktorischen larvalen Lernen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen zeigten. Gleichwohl man früher schon signifikante strukturelle Veränderungen an Aktiven Zonen dieser Mutanten an der neuromuskulären Endplatte und auch Effekte auf das Verhalten in adulten Drosophila gefunden hat. Es wird entscheidend sein, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion Aktiver Zonen Proteine weiter zu konkretisieren. N2 - Synaptic plasticity is considered to be the basis for learning and memory in our brain. Active zones (AZ) and its proteins orchestrate this process and are crucial to synaptic transmission. This work focused on three essential AZ proteins - Bruchpilot, RIM (Rab3 interacting molecule) and Fife- and their role in conditioned learning behaviour in Drosophila melanogaster larvae. To do so the well-established appetitive olfactory learning paradigm was used, in which a group of larvae is trained to learn that a specific odour is linked to a gustatory reinforcer. Due to the various genetic possibilities of Drosophila larvae it was possible to specifically study the function of each protein in associative learning behaviour. Bruchpilot is important for AZ structure in Drosophila and the accumulation of calcium channels in close proximity to active zones. Genetic manipulation of this protein did not impair olfactory learning in Drosophila larvae. Through its various interaction domains RIM connects with different molecular effectors and modulates synaptic plasticity. In Humans a point mutation in the C2A-domain of the protein leads to cone rod dystrophy and an elevated verbal IQ at the same time. A similar mutation in the Drosophila genome, thanks to the high genetic homologies, did not result in an altered phenotype. Fife is responsible for normal AZ architecture and also for efficient vesicle trafficking. It was shown that this protein modulates synaptic plasticity and learning processes. The results of this work contribute to a better understanding of synaptic plasticity and the function of active zone proteins. I would like to point out that Bruchpilot and RIM mutants did not show modified phenotypes in appetitive olfactory learning whereas Fife mutants were partially impaired in the tested paradigm compared to control groups. Although in previous works those mutants were found to cause structural changes at active zones in neuromuscular junctions and to affect learning behaviour in Drosophila adults. In future studies it will be crucial to determine the particular task and to specify the structure to function relationship of each AZ protein. KW - Plastizität KW - Aktive Zone KW - Konditioniertes Lernen KW - Drosophila melanogaster KW - Proteine Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169090 ER - TY - THES A1 - Pauli, Martin T1 - Bildgebung Aktiver Zonen : Lichtmikroskopische Methoden zur Darstellung präsynaptischer AktiverZonen in lebendem und fixiertem Gewebe T1 - Imaging active zones : Approaches for visualizing active zones with light microscopy in living and fixed tissue N2 - Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Veränderungen präsynaptischer Aktiver Zonen als mögliches Korrelat synaptischer Plastizität zu detektieren. Damit soll die Hypothese getestet werden, dass strukturelle Plastizität Aktiver Zonen eine zentrale Rolle bei der Informationsverarbeitung im Gehirn und bei Lern- und Gedächtnisprozessen spielt. Dazu war es notwendig Methoden zu etablieren, die die strukturelle Analyse Aktiver Zonen und deren Veränderung in vitalem Gewebe ermöglichen. Um die Untersuchungen in einem Gewebe mit plastischen Eigenschaften durchzuführen, wurden Methoden zur Herstellung organotypischer hippocampaler Hirnschnittkulturen etabliert, da hippokampale Moosfasersynapsen ausgeprägte präsynaptische Plastizität aufweisen (Bliss und Collingridge, 1993). Durch Einzelzellelektroporation wurde es möglich, individuelle Neurone mit Transgenen zur Markierung der gesamten Zelle (DsRed) und synaptischer Substrukturen wie Aktive Zonen (z.B.: GFP-CAST, einem Fluorophor-markierten AZ-Protein) zu transfizieren. Mit konfokaler Bildgebung transfizierter Zellen konnten strukturierte Anreicherungen von GFP-CAST in Moosfaserboutons dargestellt werden. Konfokale Bildgebung von Doppelimmunfluoreszenzfärbungen zur detaillierten Analyse der Proteinlokalisation zeigte ein diffraktionsbedingtes Auflösungsdefizit, das auch durch die Anwendung von STED-Mikroskopie nicht zufriedenstellend gelöst werden konnte. Um eine präzise Karte synaptischer Proteine zu erstellen, wurde hochauflösende Mikroskopie (dSTORM) mit einer lateralen räumlichen Auflösung von 20 nm etabliert. Dabei erwiesen sich die ausgeprägte Plastizität, die hohe Dichte an Aktiven Zonen und die variable Gestalt der Boutons im hippokampalen Präparat als problematisch. Aus diesem Grund wurde die elektronenmikroskopisch gut charakterisierte neuromuskuläre Endplatte mit ihrer symmetrischen molekularen Struktur als Präparat für dSTORM verwendet. An der Endplatte konnte die molekulare Organisation der Aktiven-Zonen-Proteine Piccolo und Bassoon dargestellt werden. Zudem konnten erstmals die Mündungen postsynaptischer Falten lichtmikroskopisch aufgelöst werden. So gelang es Werkzeuge zu etablieren, die mit lichtmikroskopischen Methoden die Darstellung der Architektur Aktiver Zonen mit molekularer Auflösung ermöglichen. Die Herausforderung wird es sein, diese neue Dimension in funktionellem Kontext zu nutzen. Die experimentellen Grundlagen dazu wurden durch eine spezielle Badkammer und die Etablierung von Rollertubekulturen bereits gelegt. Dabei ermöglicht dSTORM die Adressierung quantitativer Fragestellungen bis hin zur Bestimmung der Molekülanzahl. N2 - The aim of this work was to visualize structural changes of presynaptic active zones (AZ) as a putative correlate of synaptic plasticity in the brain, thereby testing the hypothesis, that structural plasticity is a key player in information processing, learning and memory. Therefore it was necessary to establish methods that allowed the structural analysis of active zones and their changes in living tissue. To do these investigations in a tissue with plastic characteristics, organotypic hippocampal slice cultures have been established, due to distinct presynaptic plasticity of hippocampal mossy fibre boutons (Bliss and Collingridge, 1993). With single cell electroporation it became possible to mark transgenetically individual neurons (DsRed) and synaptic substructures like active zones (GFP-CAST, a fluorophor labelled AZ- Protein). By imaging transfected neuron using confocal light microscopy, discrete accumulations of GFP-CAST were found in mossy fibre boutons. Aiming to analyse protein localisation in detail, confocal imaging of double-immunofluorescence staining revealed a diffraction based lack of lateral resolution, that couldn’t be solved satisfactory by the application of STED microscopy. To generate a precise map of synaptic protein distribution, superresolution light microscopy (dSTORM) was established with a lateral resolution of 20 nm. Pronounced structural plasticity, high active zone density and complex structure of hippocampal mossy fibre boutons turned out to be a drawback of this preparation. Therefore mammalian neuromuscular endplates that are well characterised by electron microscopy and display a highly symmetrical shape were introduced as a preparation for dSTORM. At the endplate dSTORM revealed a differential distribution of active zone proteins Piccolo and Bassoon. Moreover, for the first time it was possible to resolve the aparture of postsynaptic folds by light microscopy. These results show that it was possible to establish tools based on superresolution light microscopy, that are capable of exploring active zone ultrastructure on a molecular level. It will be future tasks to use these novel techniques in a functional context. Based on experimental advances shown in this work like specialised recording chambers for slicecultures or the use of rollertube cultures, dSTORM will allow to address questions concerning synaptic function and plasticity, down to counting single molecules. KW - Hippokampus KW - organotypische Schnittkultur KW - Aktive Zone KW - synaptische Plastizität KW - dSTORM KW - Hippokampus KW - organotypische Schnittkultur KW - Aktive Zone KW - synaptische Plastizität KW - dSTORM KW - hippocampus KW - organotypic slice cultur KW - synaptic plasticity KW - active zone KW - dSTORM Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77630 ER -