TY - THES A1 - Lehmann [geb. Hofmann], Anna T1 - Entwicklung potenzieller Inhibitoren der Hitzeschockkomponenten HSF1 und HSP70 am Modell des Multiplen Myeloms T1 - Development of potential inhibitors of the heat shock components HSF1 and HSP70 on the model of the multiple myeloma N2 - Krebs gehört zu einem der zentralen Leiden der 21. Jahrhunderts und ist in den einkommensstarken Ländern die zweithäufigste Todesursache. Die Erkrankung Multiples Myleom (MM) gehört mit 1.3 % aller Krebserkrankungen zwar zu den seltenen Formen, verläuft jedoch meist tödlich und zeichnet sich durch eine unkontrollierte Entartung der monoklonaler Plasmazellen im Knochenmark aus. Da maligne Zellen dauerhaft internen und externen Stressfaktoren ausgesetzt sind und auf die Hitzeschutzantwort angewiesen sind, stellen die Komponenten des Hitzeschocksystems wie z.B. Chaperone HSP70 und HSP90 bzw. der Hitzeschockfaktor HSF1 ein attraktives therapeutisches Ziel dar. Nachweislich führt die Inhibition des Chaperons HSP90 zur HSF1-vermittelten Hochregulation des Proteins HSP70, sodass die Hitzeschutzantwort der zytotoxischen Aktivität der Inhibitoren entgegenwirkt und die Therapieerfolgschancen mindert. Die vorliegende Doktorarbeit, die im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216 (CRU216) ausgearbeitet wurde, befasste sich einerseits mit der Erweiterung der bereits vorhandenen Substanzbibliotheken sowohl zur Inhibition des Proteins HSP70 als auch des Transkriptionsfaktors HSF1. Hierdurch sollten detailliertere Struktur-Wirkungs-Bezeugungen evaluiert werden. Weiterhin wurden die kooperierenden Arbeitsgruppen des Forschungsprojektes durch die Entwicklung und Herstellung von Substanzen unterstützt, um mit Hilfe vielseitiger Methoden die exakten Wirkmechanismen beider Verbindungsklassen zu verstehen und aufzuklären. Die bereits bestehende Substanzbibliothek der 3,4-Dihydroisochinolin-1(2H)-on-Derivate aus der vorangehenden Arbeit wurde erfolgreich um neue Carbonsäure- ((±) 6a-j) und Carbonsäureamidverbindungen ((±) 7b-e) erweitert. Durch die Substitution phenolischer Seitengruppen der Isoquinolinone gelang es, Säurederivate herzustellen, die eine höhere Zytotoxizität auf den INA-6-Zellen als die Leitstruktur AH073t aufwiesen. Dabei handelt es sich um die monobromierte Verbindung (±) 6c (EC50 = 0.17 µM) oder das Derivat mit einem kurzem Bromoethoxylinker (±) 6j (EC50 = 0.18 µM). Parallel hierzu wurde festgestellt, dass die Substitution aromatischer Seitengruppen durch aliphatische Reste ((±) 6h-i) zum kompletten Aktivitätsverlust führte. Durch dir fortführende Umsetzung zu den Amiden gelang die Herstellung des Derivates (±) 7c (EC50 = 0.47 µM), welches eine ähnliche Aktivität im Vergleich zu der Struktur AH122t ((±) 7a) zeigte. Weiterhin wurde Verbindung (±) 7d identifiziert, die eine sechsfach höhere Zytotoxizität von 34.8 nM im Vergleich zu der Leitstruktur (±) 7a (EC50 = 200 nM) aufwies. Die Trennung der trans-Enantiomere der Leitstruktur AH073t wurde erfolgreich mit Hilfe einer chiralen chromatographischen Methode durchgeführt und die Absolutkonfiguration mit Hilfe der Circulardichroismus-Spektroskopie (Arbeitskreis Bringmann) bestimmt. Durch die biologische Untersuchung an den MM-INA-6-Zellen (Arbeitskreis Chatterjee) wurde die enantiospezifische Aktivität des 3R,4R-Enantiomers bestätigt, wohingegen das 3S,4S-Isomer hingegen nicht aktiv war. Die angestrebte Amidierung zu enantiomerenreinen Substanzen führte gegen die Erwartung zu einem Diastereomerengemisch, da aufgrund des aciden Protons am Kohlenstoff C-4 die Carbonsäuren im Laufe der Synthese epimerisierten. Um die Epimerisierung an der aciden Position zu vermeiden, wurden neuartige Isochinolinoncarbonsäure-Derivate hergestellt, die erstmalig an dem Kohlenstoff C 4 substituiert wurden. Mit Hilfe einer Schutzgruppentechnik wurden in drei Syntheseschritten erfolgreich drei neue Derivate, nämlich eine fluorierte ((±) 11), methylierte ((±) 15) und ethylierte Verbindung ((±) 16), erhalten. Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der fluorierten und ethylierten Spezies gelang durch die Röntgenstrukturanalyse der Einkristalle (Arbeitskreis Braunschweig). Dabei wurde festgestellt, dass die Alkylierungsreaktion stereospezifisch verliefen und ausschließlich cis-Derivate erhalten wurden. Die biologische Untersuchung dieser Substanzen bestätigte die Konfiguration, da alle drei Verbindungen keine Aktivität auf MM-INA-6-Zellen zeigten (EC50 >100 µM). Weiterhin wurde mit Hilfe einer UV-metrischen Messung die Sättigungskonzentration der neuen Derivate untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass die Substitution am Kohlenstoff C-4 zur Senkung der Löslichkeit geführt hat. Anhand der Proteinkristallstruktur des bHSC70 (C.Grimm) wurde ein TMAO-Molekül in der Nähe der der Interface-Oberfläche identifiziert. Basierend auf diesem Ergebnis wurde eine Methode zur Herstellung eines TMAO-Isochinolinonhybrides entwickelt, welches sich an der Leitstruktur AH073t orientierte. Während der Synthesesequenz ist es zu der Decarboxylierung des angestrebten 3,4-Dihydroisochinolin-1(2H)-on-Derivates gekommen, wodurch das neue Derivat 17 erhalten wurde. Nachdem die Reaktionsbedinungen variiert und die gewünschte Verbindung nicht erhalten wurde, wurde 17 im darauffolgenden Syntheseschritt erfolgreich zum TMAO-Hybrid 18 umgesetzt. Der Szintillationsnähenachweis (SPA) ist eine etablierte Methode, um mit Hilfe von radioaktivmarkierten Liganden Bindungsstudien im Hochdurchsatzformat durchzuführen und hier die Bindungsposition der Isochinolinon-Derivate zu untersuchen. Die Substanz AH122t diente hierbei als Leitstruktur zur Entwicklung einer Methode zur Radioaktivmarkierung der potentiellen HSP70-Inhibitoren, sodass die aktivierte Stanylverbindung (±) 19 erhalten wurde. Diese Verbindung konnte in der Gegenwart von Chloramin T und des NaI-Salzes innerhalb von wenigen Sekunden zum Radioliganden (±) 7d* umgesetzt werden. Die Herstellung des Radioliganden wurde mittels einer entwickelten HPLC-Methode analysiert und validiert. Eine weitere Möglichkeit zur Evaluieren der potentiellen Bindungspartner der hergestellten Isochinolinon-Verbindungen bietet die Affinitätschromatographie gekoppelt mit der proteomischen Analyse mittels quantitativer Massenspektrometrie (Arbeitskreis Schlosser). Es gelang die Herstellung der Biotin-markierter Liganden (±) 23, der sich an der Leitstruktur AH073t orientierte, und (±) 25, der sich an AH081t orientierte. Die ersten Analysen mittels Affinitätschromatographie zeigten, dass mit dem Liganden (±) 23 überraschenderweise keine Proteine signifikant angereichert wurden, während mit dem Liganden (±) 25 zwar keine HSP70-Proteine angereichert, aber einige Komponenten der Hitzeschutzantwort wie die Phosphatidylinositol-Kinasen DNA-PK und ATM, und die Untereinheiten des Chaperons HSP90 identifiziert werden konnten. Die bereits bestehende Substanzbibliothek der -Acylaminocarboxamide wurde erfolgreich mit Hilfe der Ugi-Multikomponentenreaktion um die Derivate (±) 38c-g erweitert. Die Evaluierung der biologischen Aktivität erfolgte semiquantitativ mittels Westernblot und quantitativ mittels ELISA-Assay (Arbeitskreis Chatterjee), wobei die Beurteilung indirekt anhand des HSF1-vermittelten Regulationslevels des Chaperons HSP72 erfolgte. Hierbei wurden neue Verbindungen (±) 38c und (±) 38g mit dem ,-gesättigten Carbonylsystem identifiziert, die eine vergleichbare inhibitorische Aktivität wie die bereits bekannten ungesättigten Derivaten (±) 37l oder (±) 37m zeigten, was darauf hinweist, dass die inhibitorische Aktivität der  Acylaminocarboxamide nicht von der kovalenten Bindung des Michael-Systems verursacht wird. Um das Target der -Acylaminocarboxamide zu evaluieren, wurde auch hier die Durchführung der Affinitätschromatographie gekoppelt mit der Analyse mittels der quantitativer Massenspektrometrie angestrebt (Arbeitskreis Schlosser). In Anlehnung an die Synthesemethodik für die HSP70-Liganden wurden hierfür die Biotin-markierten Liganden (±) 42, (±) 44 und (±) 46 erfolgreich hergestellt, die sich durch die Position des Biotinlinkers unterscheiden. Die proteomische Untersuchung wurde erfolgreich mit den Liganden (±) 44 und (±) 46 durchgeführt und es wurden 68 Proteine signifikant angereichert. Viele dieser Proteine tragen die sogenannte Armadillo-Domäne, die eine wichtige Rolle in der Protein-Protein-Interaktion spielt und eine hochkonservierte Bindungstasche aufweist. Unter den angereicherten Proteinen befanden sich mitunter der MICOS-Komplex, der CCR4-NOT-Komplex und die Kinasen des Phosphatidylinositol-Signalwegs. Von den letzteren konnten explizit die Kinasen DNA-PK, ATM, ATR und mTOR identifiziert werden, die möglicherweise die HSF1-regulierte HSP70-Expression beeinflussen. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Position des Linkers die Bindung an zwei unterschiedliche Proteingruppen beeinflusst. Während der Ligand (±) 44 ausschließlich mit den Proteinen des CCR4-NOT-Komplexes interagierte, wurden für den Liganden (±) 46 die Komponenten des COG Komplexes identifiziert. N2 - Cancer is one of the emerging diseases of the current century and leads to every second death in the high-income countries. Multiple Myeloma (MM) is characterised by clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow. MM causes only about 1.3 % of all cancer cases but remains incurable due to resistance and huge relapse numbers. The heat shock response helps cells to deal with situation of stress and provides protection from cell death. Especially malignant cells must cope numerous internal and external stress factors and rely on proteins of the heat shock response as the chaperones HSP70/HSP90 but also the transcriptions factor HSF1. To date, it was already demonstrated that the pharmacological inhibition of the protein HSP90 leads to the HSF1-dependent upregulation of HSP70 causing resistance against agents. The current thesis, which was realised within the Clinical Research Unit 216 (CRU216), proposed the enlargement of the established substance libraries of both targets HSF70 and HSF1 to intense the investigation of the structure-activity relationships. Furthermore, the collaborating research groups within the CRU216 were supported by development of numerous compounds and realisation of diverse analytical methods for research of the interaction of new compounds and the potential targets HSP70 and HSF1. The substance library of 3,4-dihydroisoquinolin-1(2H)-one derivatives, which was established in the previous work, was successfully expanded with new carboxylic acid derivatives (±) 6a-j and amide derivatives (±) 7b-e. The substitution of the phenolic moieties enabled the synthesis of agents with higher activity towards INA-6-cell as the lead compound AH073t (Chatterjee group). The brominated derivative (±) 6c and the derivative with a short bromoethoxy linker (±) 6j showed similar EC50 values of 0.17 µM and 0.18 µM, respectively. Concurrently, the replacement of the aromatic residues with aliphatic moieties ((±) 6h-i) led to complete abrogation of the biological activity. In conclusion, the aromatic molecule residues are essential for the interaction of the inhibitors to the potential target. Among the new amide derivatives, the compound (±) 7c showed similar inhibitory activity as the lead compound AH122t ((±) 7a) from the previous work. Furthermore, it was possible to identify the derivative (±) 7d with the EC50 value of 34.8 nM which was six times more active than the lead compound A122t (EC50 = 200 nM). The enantiomers of the racemic lead compound AH073t were successfully separated by means of a chiral chromatographical method. The configuration of the enantiomers was determined by circular dichroism spectroscopy (Bringmann group). The investigation of the biological activity on INA-6-cells determined that the 3R,4R-isomer is the eutomer whereas the 3S,4S-enantiomer did not show any inhibitory activity (Chatterjee group). Unfortunately, the following amide synthesis led to the epimerisation due to the acidic proton at the carbon C-4 so that the isolation of enantiomeric pure amide compounds could not be achieved. As next, the acidic position of the 3,4-dihydroisoquinolinones was substituted to prevent the epimerisation. It was possible to establish three novel derivatives (±) 11 (fluorinated), (±) 15 (methylated) and (±) 16 (ethylated) in three synthesis steps. The analysis of the steric configuration of the compound (±) 11 and (±) 16 was achieved by X-ray crystallography. Additionally, the alkylation reactions were found to be stereospecific leading to formation of pure cis isomers. The investigation of the biological activity on INA-6-cells confirmed these results as all three compounds were not active (EC50 >100 µM). Furthermore, the saturation concentration of the novel substances was analysed UV-metric and it was observed that the substitution on the carbon C-4 led to decreased solubility. The protein crystal structure of the bovine HSC70 (C.Grimm) showed that a TMAO molecule was bound next to the identified interface domain. Based on this result, a method for synthesis of a TMAO-isoquinolinone hybrid was developed. During the synthesis, unexpected decarboxylation of the planed isoquinolinone carboxylic acid occurred so that the novel compound 17 was isolated. As changed reaction conditions did not lead to the formation of the desired product, 17 was successfully oxidised to the TMAO-derivative 18. Scintillation proximity assay (SPA) is a radioisotopic assay technique that allows fast performance of binding studies and could support the evaluation of the binding target of the 3,4 dihydroisoquinolinones. A synthesis method for a radiolabelled ligand was successfully developed using the iodised analogue of the lead compound AH122t. The synthesis of the activated trialkylstannane (±) 19 was accomplished, which was radiolabelled within seconds by the reaction with Chloramine T and NaI to obtain the radioligand (±) 7d*. The formation of the radioligand was controlled by a developed HPLC method. A further method for the identification of the drug target is affinity chromatography in combination with quantitative mass spectrometry (Schlosser group). A synthesis route was developed and two affinity ligands (±) 23 and (±) 25, which differ by the position of the Biotinlinker, were obtained. The initial experiments indicated that surprisingly no proteins were captured by means of the ligand (±) 23. The ligand (±) 25 enabled the capturing and identification of some significantly enriched heat shock response proteins as the PI3-kinases DNA-PK and ATM, and the subunits of the heat shock protein HSP90. However, HSP70 could not be determined as a target of (±) 25. The established library of the -acyl aminocarboxamides from the previous work was successfully enlarged by usage of the Ugi four component reaction and the derivatives (±) 38c g were obtained. The semi-quantitative Western blot analysis and quantitative ELISA-analysis were used as complementary readouts for the HSF1-dependent upregulation of HSP72 in the MM-INA-6 cell model (Chatterjee group). The ,-saturated carbonyl compounds (±) 38c and (±) 38g showed similar inhibitory activity as known derivatives with ,-unsaturated carbonyl moiety, e.g. (±) 37l or (±) 37m indicating that the Michael system and the related covalent binding to the target are unlikely. For the identification of the target of the -acyl aminocarboxamides affinity capturing experiment connected to quantitative mass spectrometry was performed (Schlosser group). The established synthesis method for preparation of biotinylated ligands was successfully applied to obtain three ligands (±) 42, (±) 44 and (±) 46. The derivatives (±) 42 und (±) 44 differ by a phenolic hydroxyl group and are linked at the same position to Biotin. The ligand (±) 46 was immobilised at a different molecule moiety to evaluate the binding effects to the target. The proteomic investigation with the ligands (±) 44 and (±) 46 allowed the identification of 68 significantly enriched proteins. Several captured proteins contain the so-called armadillo domain which is important for protein-protein interactions and exposes a highly conserved binding pocket. The significantly enriched proteins of both ligands were the MICOS-complex, the CCR4-NOT-complex and the kinases of the phosphatidylinositol-3-kinases signalling pathway, especially the kinases DNA-PK, ATM, ATR and mTOR. Further investigation of (±) 44 and (±) 46 revealed that the position of the linker affected the capturing results. While the ligand (±) 44 exclusively captured the proteins of the CCR4-NOT-complex, the proteins of the COG-complex only bound by the compound (±) 46. KW - Plasmozytom KW - Hitzeschocktranskriptionsfaktor KW - Hitzeschock-Proteine KW - Isochinolinderivate KW - Ugi-Reaktion KW - multiple muyloma KW - inhibition KW - heat shock response Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153477 ER - TY - THES A1 - Schaaf, Lisa T1 - Der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe T1 - The role of drug transporters in the pulmunary absorbtion of inhaled drugs N2 - Arzneistofftransporter ermöglichen endogenen und exogenen Molekülen die Überwindung von Zellmembranen und tragen dadurch zur Aufnahme, Verteilung und Elimination von Arzneistoffen bei. Inhalativ applizierte Wirkstoffe, wie Vertreter aus der Gruppe der Beta-2-Sympathomimetika oder Anticholinergika, zählen zu den Substraten wichtiger, pulmonal exprimierter Arzneistofftransporter. Trotz intensivierter Forschung auf dem Gebiet der Transporter-Expression ist diese im humanen Lungengewebe bisher wenig untersucht und deren pharmakokinetische Auswirkungen auf pulmonal verabreichte Arzneistoffe sind kaum bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe untersucht und Erkenntnisse über deren Expressions-Profil im humanen Lungengewebe gewonnen werden. Pharmakokinetische Parameter des inhalativen Anticholinergikums Ipratropiumbromid wurden an einem ex vivo Modell der humanen Lunge untersucht. Nach vorheriger Applikation des kompetitiven OCTN1/2-Inhibitors L-Carnitin wurde keine signifikante Reduktion der absorbierten Wirkstoffmenge detektiert. Damit zeigten sich die beiden organischen Kationen/Carnitin-Transporter OCTN1 und OCTN2, anders als bisher vermutet, nicht als primär an der Absorption von Ipratropiumbromid beteiligte Transporter. Infolgedessen wurde die Beteiligung weiterer Transporter hypothetisiert. Erstmals wurden die am humanen Lungen-Perfusions-Modell gewonnenen pharmakokinetischen Daten zur pulmonalen Absorption in direkter Beziehung zur mRNA- und Protein-Expression von Arzneistofftransportern in den jeweiligen individuellen Gewebeproben betrachtet. Die pulmonale Genexpression des Multidrug Resistance-Related Protein MRP5 wies eine signifikante negative Korrelation mit der Area under the curve (AUC0 – 60 min) von Ipratropiumbromid auf (r = -0,699; p < 0,05), was die Beteiligung von MRP5 an den Umverteilungsprozessen von Ipratropiumbromid in der humanen Lunge nahelegte. Auf Protein-Ebene wurde eine positive Korrelation zwischen der Expression des organischen Kationentransporters OCT3 und der AUC0 – 60 min von Ipratropiumbromid ermittelt (r = 0,7499,p < 0,05), woraus sich eine potentielle Beteiligung von OCT3 an der Aufnahme von Ipratropiumbromid aus dem luminalen Lungenbereich ableiten ließ. Zur Untermauerung dieser Hypothese wurden Untersuchungen mit stabil transfizierten HEK293-Zellen durchgeführt. Sowohl der organische Kationentransporter OCT1 als auch OCT3 trugen dabei signifikant zu einer erhöhten zellulären Aufnahme der beiden Tritium-markierten Bronchodilatatoren Ipratropiumbromid und Salbutamol bei. Damit wurde für OCT3 zum ersten Mal eine Beteiligung an der zellulären Aufnahme dieser beiden Arzneistoffe nachgewiesen. Im Kontext der Gendermedizin sind geschlechtsspezifische Unterschiede in der Transporter-Expression von großem Interesse. Inwiefern die drei Sexualsteroidhormone Estradiol, Progesteron und Testosteron einen regulatorischen Effekt auf die mRNA-Expression von Membrantransportern haben, wurde erstmals durch in vitro Inkubationsversuche in physiologischen Hormonkonzentrationen mit der humanen Bronchialepithelzelllinie Calu-3 geprüft. Mittels intensiv optimierter und sorgfältig validierter RT-qPCR-Analytik konnten vor allem nach Inkubation mit weiblichen Sexualhormonen verglichen zu keiner Hormon-Zugabe statistisch signifikante Expressions-Unterschiede detektiert werden: Nach Behandlung mit Estradiol zeigten der Oligopeptid-Transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) und OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) eine geringere Genexpression, das Multidrug Resistance-Related Protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) sowie OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) waren nach Zugabe von Estradiol kombiniert mit Progesteron höher exprimiert als ohne Hormon-Zusatz. Da Estradiol überdies als Inhibitor des OCT1- und OCT3-vermittelten Transports gilt, wurde die Auswirkung des Hormons, unter anderem in physiologischer Konzentration, auf die Aufnahme von Tritium-markierten Ipratropiumbromid in stabil transfizierte HEK293-Zellen untersucht, wobei tatsächlich eine reduzierte zelluläre Ipratropiumbromid-Aufnahme beobachtet wurde. Somit könnte auch in vivo eine geschlechtsspezifische Inhibition der beiden Transporter stattfinden, wodurch deren Substrate einer geschlechtsspezifisch variierenden Pharmakokinetik unterliegen könnten. Darüber hinaus wurde in rund 80 humanen Lungengewebsproben die Genexpression von Arzneistofftransportern hinsichtlich geschlechts- und altersspezifischer Unterschiede überprüft. In unter 50-jährigen Männern war das Multidrug-Resistance Protein MDR1 signifikant höher exprimiert verglichen zu Männern von 50 - 60 Jahren. OCT1 war in Patienten von 50 - 60 Jahren signifikant geringer exprimiert als in über 60-Jährigen. Daneben lieferte die Analyse aller Gewebeproben das Genexpressions-Profil von Arzneistofftransportern im humanen Lungengewebe, wobei OCT3 das höchste und OCT2 das geringste mRNA-Expressions-Niveau unter den untersuchten Transportern aufwies. Eine wesentliche Beteiligung von OCT3 an Transportvorgängen im humanen Lungengewebe erschien damit wahrscheinlich. Resümierend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Einflusses von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalativ verabreichter Arzneistoffe geleistet werden. Dabei konnte OCT3 erstmals als maßgeblich an der zellulären Aufnahme von Ipratropiumbromid beteiligter Transporter in der humanen Lunge identifiziert werden, womit einerseits die Beteiligung von Arzneistofftransportern an pharmakokinetischen Prozessen in vivo und andererseits die Bedeutung von Arzneistofftransportern für die inhalative Arzneimitteltherapie deutlich wurde. N2 - Drug transporters facilitate the transport of endogenous and exogenous compounds across cell membranes. Therefore they contribute to the absorption, distribution and elimination of drugs. Pulmonary administered drugs, such as members of the drug class of betamimetics or anticholinergics, are known substrates of relevant pulmonary expressed drug transporters. Despite intensified research in the field of transporter expression few data are available about their expression in the human lung and the pharmacokinetic implications on pulmonary administered drugs. The aim of this thesis was to investigate the impact of drug transporters on the absorption of inhaled drugs and to gain insights into their expression profiles in human lung tissue. Pharmacokinetic properties of the inhaled anticholinergic ipratropium bromide were explored using an ex vivo model of the human lung. After preceding application of the competitive OCTN1/2-inhibitor L-carnitine no significant decrease of the amount of absorbed active ingredient was detected. This contradicted previous assumptions regarding the contribution of the organic cation/carnitine transporters OCTN1 and OCTN2 to the absorption of ipratropium bromide. Consequently the involvement of additional transporters was hypothesized. For the first time pharmacokinetic data of the pulmonary absorption obtained by employing the human lung perfusion model were correlated with the mRNA and protein expression of drug transporters in respective individual tissue samples. The pulmonary gene expression of the multidrug resistance–related protein MRP5 showed a significant negative correlation with the area under the curve (AUC0 – 60 min) of ipratropium bromide (r = -0,699; p < 0,05). This might indicate that MRP5 contributes to the redistribution processes of ipratropium bromide in the human lung. A positive correlation between the protein expression of the organic cation transporter OCT3 and the AUC0 – 60 min of ipratropium bromide was detected (r = 0,7499, p < 0,05) suggesting a potential involvement of OCT3 in the absorption of ipratropium bromide in the luminal lung area. Uptake assays using stably transfected HEK293 cells were performed to substantiate this hypothesis. Both organic cation transporters, OCT1 and OCT3, contributed significantly to an increased cellular uptake of the tritium labeled bronchodilators ipratropium bromide and salbutamol. Thus, the contribution of OCT3 to the cellular uptake of both pharmaceutical substances was demonstrated for the first time. Gender-specific differences of drug transporter expression are of major interest in the context of gender medicine. In vitro incubation studies with the human bronchial epithelial cell line Calu-3 for the first time elucidated whether physiological concentrations of the three sex steroid hormones estradiol, progesterone and testosterone exert a regulatory effect upon the mRNA expression of membrane transporters. By thoroughly optimized and carefully validated RT-qPCR analytics statistically significant differences in gene expression were detected primarily after incubation with female sex hormones compared to no hormone exposure: After incubation with estradiol the peptide transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) and OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) showed decreased expression whereas the multidrug resistance–related protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) as well as OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) were upregulated after addition of both estradiol and progesterone compared to no treatment. Since estradiol is also a known inhibitor of the transport mediated by OCT1 and OCT3 its impact on the uptake of tritium labeled ipratropium bromide was investigated in stably transfected HEK293 cells. Indeed, a reduced cellular uptake of ipratropium bromide was observed after incubation with estradiol, also at physiological concentrations. Therefore, a gender-specific inhibition of both transporters in vivo is conceivable and could result in gender-specific pharmacokinetic characteristics for substrates of these transporters. Moreover, the gene expression of drug transporters in approximate 80 lung tissue samples was examined regarding gender and age related differences. The multidrug resistance protein MDR1 was significantly higher expressed in men younger than 50 years compared to 50 - 60 year old men. OCT1 was significantly less expressed in 50 - 60 years old patients compared to patients older than 60 years. Furthermore, the gene expression profile of drug transporters in the human lung was analyzed. In all tissue samples OCT3 showed the highest mRNA expression level whereas OCT2 was least expressed amongst the investigated transporters. This suggested a substantial involvement of OCT3 in transport processes in human lung tissue. In conclusion, the present research contributed to the elucidation of the role of drug transporters in the pulmonary absorption of inhaled drugs. For the first time OCT3 was identified to be substantially involved in the cellular absorption of ipratropium bromide in human lungs. Hence, the data supported the involvement of drug transporters in pharmacokinetic processes in vivo and emphasized the importance of drug transporters for inhaled pharmacotherapy. KW - Lunge KW - ABC-Transporter KW - Organischer Kationentransporter KW - Pharmakokinetik KW - Genexpression KW - Arzneistofftransporter KW - Lungengewebe KW - Lungenperfusionsmodell KW - Ipratropiumbromid Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151534 ER - TY - THES A1 - Scherf-Clavel, Maike T1 - Anwendung der Trockenblutanalytik zur vereinfachten Überwachung der Nierenfunktion und zur Blutspiegelbestimmung von Metformin und Sitagliptin T1 - Application of dried-blood analytic for the simplified monitoring of the renal function and for the blood level determination of metformin and sitagliptin N2 - Die oralen Antidiabetika Metformin und Sitagliptin werden überwiegend renal eliminiert, weshalb während der Therapie regelmäßig die Nierenfunktion abgeschätzt werden sollte. Dies geschieht mithilfe von Serumkreatinin-basierten Formeln, zum Beispiel der Gleichung nach Cockcroft-Gault. Mit dem Ziel, zukünftig eine Möglichkeit für eine vereinfachte Kontrolle der Therapie mit Metformin und/oder Sitagliptin in Kapillarblutproben zu haben, wurde eine Methode zur Bestimmung der Konzentration von Kreatinin, Metformin und Sitagliptin aus Trockenblutproben (Dried Blood Spots, DBS) entwickelt. Als Träger zeigte Blotting Papier die besten Ergebnisse in Bezug auf die Handhabung und die Extraktionseffizienz. Aus einem einzelnen DBS gelang es, Metformin und Kreatinin mittels HPLC-UV und Sitagliptin mittels LC-MS/MS zu quantifizieren. Die flüssigchromatographischen Methoden wurden entsprechend der EMA- und FDA-Kriterien erfolgreich vollvalidiert. Die unteren Nachweisgrenzen (LLOQ) lagen bei 0,2 µg/mL für Metformin, 1,5 µg/mL für Kreatinin und 3 ng/mL für Sitagliptin. Da Referenzbereiche für Arzneistoffkonzentrationen in der Regel für Serum/Plasma angegeben werden, wurde das Verteilungsverhalten der beiden Antidiabetika zwischen Plasma (cP) und Blutzellen (cBZ) mittels in-vitro Inkubationsversuchen ermittelt. Für Metformin betrug der Verteilungskoeffizient cP/cBZ 4,65 ± 0,73, für Sitagliptin 5,58 ± 0,98. Damit lagen beide Arzneistoffe mehr als 4-fach höher im Plasma als in den Blutzellen vor. Erythrozyten waren zuvor schon als tiefes Kompartiment für Metformin beschrieben worden, für Sitagliptin waren dieses die ersten Daten die zeigten, dass der Arzneistoff ebenfalls eine relevante Verteilung in die Blutzellen zeigt. In Kooperation mit einer diabetologischen Schwerpunktpraxis wurde eine erste klinische Studie (Basisstudie) durchgeführt, die zum Ziel hatte, aus den DBS die Nierenfunktion abzuschätzen. In DBS von 70 Patienten wurden Metformin, und/oder Sitagliptin sowie Kreatinin quantifiziert. Mit Hilfe der von der Praxis übermittelten Serumkreatinin-konzentration konnte durch den Vergleich mit der Konzentration im Kapillarbut erstmalig ein Korrelationsfaktor bestimmt und verifiziert werden, um die Kapillarblut- in die Serumkonzentration des Kreatinins umzurechnen (F = cKapillarblut/cPlasma = 0,916 ± 0,088). So war es möglich, die Nierenfunktion über die Formel nach Cockcroft und Gault abzuschätzen. In der Basisstudie fiel auf, dass die Konzentration des Sitagliptins im Blut der Patienten signifikant mit steigendem Hämatokrit korrelierte (Pearson R = 0,396; p < 0,05). Die nähere Untersuchung dieser Beobachtung mittels in-vitro Verteilungsversuchen zeigte eine sehr stark inter-individuell schwankende Verteilung des Sitagliptins zwischen Plasma und den Blutzellen und eine vom Hämatokrit (Hct) linear abhängige Verteilung. In Blut mit einem höheren Hct fand sich mehr Arzneistoff in den Blutzellen als in Blut mit niedrigerem Hct, was die höheren Gesamtkonzentrationen an Sitagliptin im DBS erklärte. Dialyseversuche in-vitro bestätigten, dass die Eliminationszeit mit steigendem Hämatokrit des Blutes anstieg. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Blutzellen ein tiefes Kompartiment für Sitagliptin darstellen. Eine zweite klinische Studie (Feldstudie) wurde in Kooperation mit 14 öffentlichen Apotheken mit dem Ziel, repräsentative Konzentrationen für die Kapillarblutspiegel der beiden Medikamente unter Alltagsbedingungen zu ermitteln, durchgeführt. In DBS von 84 Patienten wurden wiederum Metformin, Sitagliptin und Kreatinin quantifiziert. Aus den Daten der beiden Studienpopulationen (n = 134) wurde für Metformin eine mittlere Konzentration von 2,22 ± 1,16 µg/mL und für Sitagliptin von 432,20 ± 268,79 ng/mL bestimmt. Mittels populationspharmakokinetischer Methoden konnten für beide Arzneistoffe zum ersten Mal Eliminationshalbwertszeiten (t1/2) aus Kapillarblut für Patienten mit einer Kreatininclearance größer und kleiner als 60 mL/min bestimmt werden. Erwartungsgemäß waren die t1/2 bei besserer Nierenfunktion kürzer, sowohl für Metformin (11,9 h versus 18,5 h) als auch für Sitagliptin (8,4 h versus 13,0 h). Für Sitagliptin waren dies erstmalige klinische Belege für eine ansteigende Eliminationszeit mit sinkender Nierenfunktion. Die gewonnenen Daten boten zudem Gelegenheit, den literaturbekannten ungünstigen Effekt einer kombinierten Einnahme von Diuretika, NSAIDs, ACE-Inhibitoren und/oder Angiotensinrezeptorantagonisten („target drugs“) auf die Nierenfunktion („triple whammy“) zu betrachten. Tatsächlich korrelierten die Anzahl der eingenommenen „target drugs“ und auch die Dosis der Diuretika mit einer sinkenden Kreatininclearance der Patienten. Mit vorliegender Arbeit wurden zum einen neue Erkenntnisse über die Pharmakokinetik des Sitagliptins gewonnen, zum anderen wurde die Grundlage geschaffen, um aus einem DBS die Blutspiegel von Metformin und Sitagliptin im Zusammenhang mit der Nierenfunktion zu betrachten. In Zukunft könnte diese Methode für ein Therapeutisches Drug Monitoring der beiden Arzneistoffe eingesetzt werden um dieses für Patienten aufgrund der minimalinvasiven Blutabnahme wesentlich angenehmer zu gestalten. N2 - Patients´ kidney function should frequently be monitored under therapy with the oral antidiabetics metformin and sitagliptin due to their renal elimination. The creatinine clearance or the glomerular filtration rate can be estimated using serum creatinine-based equations such as the Cockcroft-Gault equation. Aiming at simplifying drug monitoring a method was developed to quantify creatinine, metformin and sitagliptin in dried blood spots (DBS). For sample collection blotting paper showed the best results regarding handling and extraction efficiency. A single DBS was used to quantify creatinine and metformin with HPLC-UV and sitagliptin with LC-MS/MS. Both chromatographic methods were subjected to a full validation following the current FDA and EMA guidelines. The lower limits of quantification (LLOQ) were 0.2 µg/mL for metformin, 1.5 µg/mL for creatinine and 3 ng/mL for sitagliptin. Since reference intervals for drug concentrations are typically reported for plasma/serum, in-vitro experiments were performed to investigate the distribution of the drugs between plasma (cP) and blood cells (cBC). For metformin the mean ratio of plasma to blood cell concentration cP/cBC was 4.65 ± 0.73, for sitagliptin 5.58 ± 0.98. Thus, both drugs were present at more than four times higher concentrations in plasma compared to blood cells. The erythrocytes had been identified as deep compartment of metformin before, but for sitagliptin these were the first data showing a drug distributing into blood cells. In collaboration with a physician specialized in diabetology a first clinical study (basic study) was performed to estimate the kidney function using DBS. In blood spots of 70 patients metformin, creatinine and sitagliptin were quantified. For the first time a correlation factor (F = ccapillary blood/cplasma = 0.916 ± 0.088) was determined and verified to translate capillary blood concentrations of creatinine into plasma concentrations. Thereby, the Cockcroft-Gault equation could be used to estimate the kidney function. In capillary blood samples of patients participating in the basic study the concentration of sitagliptin statistically significantly correlated with increasing hematocrit values (Pearson R = 0.396; p < 0,05). In-vitro experiments revealed a strong inter-individual variability of sitagliptin distribution between blood cells and plasma and also a distribution depending on the hematocrit (hct). With a higher hematocrit a bigger amount of the drug resided within the cells compared to blood with a lower hematocrit. In in-vitro dialysis experiments an increasing elimination time from venous blood was demonstrated with rising hct. Based on these results blood cells were identified as deep compartment for sitagliptin. A second clinical study (field study) was performed in cooperation with 14 community pharmacies to determine representative capillary blood concentrations under real-life conditions. In DBS of 84 patients metformin and/or sitagliptin and creatinine were quantified. In the cohort of both studies (n = 134) mean concentrations of 2.22 ± 1.16 µg/mL for metformin and 432.20 ± 268.79 ng/mL for sitagliptin were detected. Population pharmacokinetic methods were applied to calculate elimination half-lives (t1/2) from capillary blood for patients with creatinine clearances higher and lower than 60 mL/min. As expected, t1/2 were shorter in patients with a better renal function, both for metformin (11.9 h vs. 18.5 h) and for sitagliptin (8.4 h vs. 13. 0 h). For the first time an increasing elimination time with decreasing renal function was demonstrated for sitagliptin. The collected data provided the opportunity to examine the influence of drugs with known unfavorable impact on kidney function. The effect of the combined therapy with diuretics, NSAIDs, ACE-inhibitors and angiotensin receptor antagonists (“target drugs”) on the renal function has been termed “triple whammy”. Indeed, in the present study both the number of the target drugs as well as the dose of the diuretics correlated with a decreasing creatinine clearance. With the herein presented work new insights into the pharmacokinetics of sitagliptin were gained. Additionally, a basis was created to use a single dried-blood-spot for appraisal of the blood levels of metformin and sitagliptin in relation to the kidney function. This method might facilitate an easier and more pleasant future therapeutic drug monitoring of the compounds due to minimal invasive blood collection. KW - Pharmakotherapie KW - Diabetes mellitus KW - Metformin KW - Sitagliptin KW - Trockenblutanalytik KW - Kreatinin KW - Orale Antidiabetika KW - Nierenfunktion KW - Blutspiegel KW - Instrumentelle Analytik KW - Pharmakokinetik Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146930 ER -