TY - THES A1 - Hettwer, Anette T1 - Entwicklung und Charakterisierung einer löslichen und funktionalen BMP-2-Variante T1 - Development and characterization of a soluble BMP-2-variant N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind potente Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren, die strukturell der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) - Superfamilie zugeordnet werden. Sie spielen eine Schlüsselrolle in einer Vielzahl an zellulären Prozessen ab den frühen Stadien der Embryogenese. Dadurch sind BMPs nicht nur für die korrekte Festlegung der embryonalen Körperachse verantwortlich, sondern regulieren als multifunktionale Mediatoren neben der Morphogenese auch Proliferation, Differenzierung und Apoptose unterschiedlicher Zelltypen. Bone Morphogenetic Proteins sind somit für die Aufrechthaltung der Homöostase im adulten Körper mitverantwortlich. Ihre Funktionalität vermitteln die BMPs über eine Signalkaskade, indem sie als dimeres Protein spezifische transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren von Typ I und Typ II in einem heteromeren Komplex assemblieren. Die intrazelluläre Signalweiterleitung verläuft über verschiedene Signalkaskaden (Smad-Proteine oder MAPKs), wodurch final im Zellkern Änderungen auf der Ebene der Gentranskription ausgelöst werden. Laut der namensgebenden Eigenschaft fungieren einige Wachstumsfaktoren als aktive Induktoren der Knochenbiosynthese. Ihre Anwesenheit ist essentiell für die vielen zellulären Prozesse, die während einer Frakturheilung auftreten, wobei eine Knochenneubildung ebenso stark abhängig ist vom Zusammenspiel verschiedener Stimulatoren und Inhibitoren, die die BMPs in ihrer Aktivität regulieren. Bedingt durch ihr großes Potential fanden die erstmals durch Marshal Urist 1965 aus Knochenmaterial isolierten BMP-Proteine ihren Einsatz in der regenerativen Medizin. Kommerziell erhältlich und bereits seit vielen Jahren in der klinischen Anwendung befindet sich derzeit das rhBMP-2 und rhBMP-7. Diese beiden Wachstumsfaktoren werden u.a. verwendet, um die Heilungsprozesse von langwierigen Schienbeinfrakturen zu verbessern, aber auch bei degenerativen Wirbelsäulenerkrankungen und in der Kieferchirurgie. Jedoch führt die schlechte Löslichkeit des BMPs aufgrund der ausgeprägten Aggregationstendenz zu gravierenden Problemen, nicht nur während der biotechnologischen Herstellung, sondern auch bei der klinischen Anwendung. Der Schwerpunkt des Optimierungsbedarfs der BMP-2 Herstellung im Rahmen dieser Doktorarbeit lag daher auf der Etablierung eines prokaryotischen Expressionssystems für die lösliche Produktion von BMP-2. Dafür wurde zunächst der Fokus auf die ungünstigen Löslichkeitseigenschaften des Wachstumsfaktors gelegt. Um die hohe Aggregationsneigung des BMP-2 während der Produktion in Escherichia coli zu minimieren, wurden anhand einer Algorithmus-basierten Analyse BMP-2-Varianten entworfen, in denen Aminosäuren mit stark hydrophoben Eigenschaften gegen solche mit hydrophilem Charakter ausgetauscht wurden. Hierdurch konnten die zur Aggregation neigenden Bereiche des BMP-2 weitestgehend eliminiert werden. Es wurden für die bezüglich ihrer Löslichkeit optimierten Proteinvarianten unterschiedliche Expressionsstrategien etabliert, wodurch dimere BMP-2-Muteine in angepassten chromatographischen Profilen mit einem Aufreinigungsschritt und ohne jegliche Renaturierungsmaßnahmen gewonnen wurden. Allerdings verbleiben hierbei Restmengen an bakteriellen Kontaminationen, die vorwiegend aus endogenen ribosomalen E. coli-Proteinen stammen und nicht vollständig entfernt werden konnten. Während der umfassenden in vitro Charakterisierung der BMP-2-Varianten konnte durch massenspektroskopische Analysen die Gesamtmasse beider Zielproteine bestätigt werden, wobei sequenzspezifische Fragmente eine eindeutige Identifikation der eingebrachten Mutationen ermöglichten. CD-spektroskopische Analysen erweitert um Auswertealgorithmen konnten die wesentlichen Wt-BMP-2-typischen Sekundärstrukturelemente identifizieren. Die neu generierten BMP-2-Varianten zeigen in der dynamischen Lichtstreuungsanalyse stark verminderte Aggregationstendenz im Vergleich zum Wildtyp-BMP-2. Dessen Aggregationsverhalten wurde durch die kombinierte Analytik seiner mikrofluidischen Diffusion und der dynamischen Lichtstreuung zum ersten Mal über den Konzentrationsbereich von 0.5 µM bis 100 mM genau charakterisiert. Erste zellbiologische Versuche verliefen ohne Erfolg, wodurch die biologische Aktivität der BMP-Varianten nicht abschließend geklärt werden konnte. Die simple Methode zur Expression und Aufreinigung der hydrophilisierte BMP-2-Muteine aus dieser Dissertation kann leicht in einen größeren Produktionsmaßstab überführt werden. BMP 2 kann dadurch schneller und kostengünstiger hergestellt werden. Final bleibt es jedoch erforderlich, die biologische Aktivität der neuen löslichen BMP-2-Varianten vollständig zu charakterisieren, um deren ganzes Funktionsspektrum zu entdecken. Der Fokus weiterer Forschung sollte zudem auf die verbleibende Oligomerisierungstendenz und die bestehende Kontamination mit Fremdproteinen gelegt werden, da diese beiden Faktoren letztendlich die Ausbeute an dimeren BMP-2 Varianten aus diesem System derzeit minimieren. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are potent differentiation and growth factors that are structurally assigned to the transforming growth factor-β (TGF-β)-superfamily. They play key roles in a variety of cellular processes from the early stages of embryogenesis. Thereby, BMPs are not only responsible for the correct definition of the embryonic body axis, but also regulate proliferation, differentiation and apoptosis of different cell types as multifunctional mediators in addition to morphogenesis. Bone morphogenetic proteins are therefore jointly responsible for maintaining homeostasis in the adult body. The BMPs mediate their functionality via a signaling cascade by assembling specific transmembrane serine/threonine kinase receptors of type I and type II as a dimeric protein in a heteromeric complex. Intracellular signaling occurs via various signaling cascades (Smad proteins or MAPKs), which ultimately trigger changes in the cell nucleus at the level of gene transcription. According to the eponymous property, some growth factors act as active inducers of bone biosynthesis. Their presence is essential for many cellular processes that occur during fracture healing, while new bone formation is also heavily dependent on the interaction of various stimulators and inhibitors that regulate the activity of BMP’s. Due to their great potential, BMP proteins, which were first isolated from bone material by Marshal Urist in 1965, were used in regenerative medicine. The rhBMP-2 and rhBMP-7 are currently commercially available and have been in clinical use for many years. Among others, these two growth factors are used to improve the healing processes of lengthy tibia fractures, but also in degenerative spinal diseases and in jaw surgery. Due to the pronounced tendency to aggregate, the decreased solubility of BMP’s leads to serious problems, not only during biotechnological production but also in clinical use. The main focus of the need for optimization of BMP-2 production in the context of this doctoral thesis was the establishment of a prokaryotic expression system for the soluble production of BMP-2. For this purpose, the focus was initially placed on unfavorable solubility properties of the growth factor. In order to minimize the high aggregation tendency of BMP-2 during production in E. coli, BMP-2 variants were designed using an algorithm-based analysis, in which amino acids with strongly hydrophobic properties were exchanged for those with hydrophilic properties. Thereby, the areas of BMP-2 that tend to aggregate could mostly be eliminated. Different expression strategies were established for the protein variants optimized with regard to their solubility, whereby dimeric BMP-2 muteins were obtained in adapted chromatographic profiles with one purification step and without any renaturation measures. However, residual amounts of bacterial contamination remain, which originate mainly from endogenous ribosomal E. coli proteins and could not be completely removed. During the comprehensive in vitro characterization of the BMP-2 variants, the total mass of both target proteins could be confirmed by mass spectroscopic analysis, where sequence-specific fragments enabled unambiguous identification of the introduced mutations. CD spectroscopic analyzes extended by evaluation algorithms were able to identify the basic wt-BMP-2 typical secondary structure elements. In dynamic light scattering analysis, the newly generated BMP-2 variants show a greatly reduced aggregation tendency compared to wildtype-BMP-2. Its aggregation behavior was characterized for the first time over the concentration range from 0.5 µM to 100 mM by the combined analysis of its microfluidic diffusion sizing and dynamic light scattering. Initial cell biological experiments were not successful, whereby the biological activity of the BMP variants could not be conclusively clarified. The simple method for expression and purification of the hydrophilized BMP-2 muteins from this dissertation can easily be scaled up. However, it remains necessary to fully characterize the biological activity of the new soluble BMP-2 variants in order to discover their full range of functions. Further research should also focus on the remaining oligomerization tendency and the existing contamination with foreign proteins, as these two factors ultimately minimize the yield of dimeric BMP-2 variants from this system at present. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - BMP-2 Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326800 ER - TY - THES A1 - Henninger, Markus T1 - Funktion der zentralen metabolischen Kinase SnRK1 und von ihr abhängiger Transkriptionsfaktoren bei der Mobilisierung von Speicherstoffen während der \(Arabidopsis\) Keimlingsentwicklung T1 - Function of the central metabolic kinase SnRK1 and on it dependent transcription factors in the mobilization of storage compunds during \(Arabidopsis\) seedling development N2 - Pflanzen müssen sich während der Samenkeimung und Keimlingsentwicklung über eingelagerte Speicherstoffe heterotroph versorgen, bis sie, nach Etablierung ihres Photosyntheseapparats, einen autotrophen Lebensstil führen können. Diese Arbeit geht von der Hypothese aus, dass der evolutionär konservierten zentral-metabolischen Kinase Snf1-RELATED PROTEIN KINASE 1 (SnRK1) eine besondere Rolle bei der Mobilisierung von Speicherstoffen während der Keimlingsentwicklung zukommt. Während die Bedeutung von SnRK1 als zentraler Regulator katabolischer Prozesse unter Energiemangel- und Stresssituationen bereits gezeigt wurde, war die Funktion von SnRK1 im Zusammenhang mit der Samenkeimung weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass SnRK1 in Arabidopsis die Mobilisierung und Degradation von Speicherstoffen, insbesondere von Triacylglyceride (TAGs), Samenspeicherproteinen und Aminosäuren, steuert. Sowohl Studien zur Lokalisation von SnRK1:GFP-Fusionsproteinen als auch Kinaseaktivitätsassays unterstützen eine mögliche Funktion von SnRK1 während der Keimlingsentwicklung. Eine induzierbare snrk1-knockdown Mutante zeigt neben einem eingeschränkten Wurzel- und Hypokotylwachstum auch keine Ausbildung eines Photosyntheseapparats, was die zentrale Rolle der SnRK1 in diesem frühen Entwicklungsstadium untermauert. Durch Fütterungsexperimente mit Glukose konnte der Phänotyp einer snrk1 -Mutante in Keimlingen gerettet werden. Dies zeigt, dass der metabolische Block durch externe Gabe von Kohlenhydraten umgangen werden kann. Die zentrale Funktion von SnRK1 ist folgich der Abbau von Speicherstoffen und keine allgemeine Deregulation des pflanzlichen Stoffwechsels. Durch massenspektrometrische Untersuchungen von Keimlingen des Wildtyps und der snrk1-Mutante konnte gezeigt werden, dass TAGs in der Mutante in der spä- ten Keimlingsentwicklung ab Tag 4 langsamer abgebaut werden als im Wildtyp. Ebenso werden Samenspeicherproteine in der Mutante langsamer degradiert, wodurch die Verfügbarkeit von freien Aminosäuren in geringer ist. Entgegen der allgemeinen Annahme konnte gezeigt werden, dass während der Keimlingsentwicklung zumindest in Arabidopsis, einer ölhaltigen Pflanze, zunächst Kohlenhydrate in Form von Saccharose abgebaut werden, bevor die Degradation von TAGs und Aminosäuren beginnt. Diese Abbauprodukte können dann der Glukoneogenese zugeführt werden um daraus Glukose herzustellen. Mittels Transkriptom-Analysen konnten zentrale SnRK1-abhängige Gene in der Speicherstoffmobilisierung von TAG, beispielsweise PEROXISOMAL NAD-MALATE DEHYDROGENASE 2 (PMDH2) und ACYL-CoA-OXIDASE 4 (ACX4), und Aminosäuren identifiziert werden. Somit wurde ein Mechanismus der SnRK1-abhängigen Genregulation während der Samenkeimung in Arabidopsis gefunden. Bei der Degradation von Aminosäuren wird die cytosolische PYRUVATE ORTHOPHOSPHATE DIKINASE (cyPPDK), ein Schlüsselenzym beim Abbau bestimmter Aminosäuren und bei der Glukoneogenese, SnRK1-abhängig transkriptionell reguliert. Durch Koregulation konnte der Transkriptionsfaktor bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63) gefunden werden, dessen Transkription ebenfalls SnRK1-abhängig reguliert wird. Außerdem konnte die Transkription von cyPPDK in bzip63-Mutanten nur noch sehr schwach induziert werden. In Protoplasten konnte der cyPPDK-Promotor durch Aktivierungsexperimente mit bZIP63 und SnRK1α1 induziert werden. Durch Mutationskartierung und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)PCR konnte mehrfach eine direkte Bindung von bZIP63 an den cyPPDK-Promotor nachgewiesen werden. Zusammenfassend ergibt sich ein mechanistisches Arbeitsmodell, in dem bZIP63 durch SnRK1 phosphoryliert wird und durch Bindung an regulatorische G-Box cis-Elemente im cyPPDK- Promotor dessen Transkription anschaltet. Infolgedessen werden Aminosäuren abgebaut und wird über die Glukoneogenese Glukose aufgebaut. Dieser Mechanismus ist essentiell für die Übergangsphase zwischen heterotropher und autotropher Lebensweise, und trägt dazu bei, die im Samen vorhandenen Ressourcen dem Keimling zum idealen Zeitpunkt zugänglich zu machen. Darüber hinaus werden Gene im Abbau von verzweigtkettigen Aminosäuren ebenfalls durch bZIP63 reguliert. Dabei wird dem Keimling Energie in Form von Adenosin-Triphosphat (ATP) zur Verfügung gestellt. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Mobilisierung von Speicherstoffen auch während der Keimlingsentwicklung direkt von SnRK1 abhängig ist. Die umfangreichen Datensätze der RNA-Seq-Analysen bieten zudem die Möglichkeit, weitere SnRK1-abhängige Gene der Speichermobilisierung zu identifizieren und somit einem besseren Verständnis der Keimlingsentwicklung beizutragen. Aufgrund der zentralen Bedeutung der SnRK1-Kinase in diesem entscheidenden Entwicklungsschritt ist davon auszugehen, dass diese Erkenntnisse mittelfristig auch für bessere Keimungsraten und somit bessere Erträge in der Landwirtschaft genutzt werden können. N2 - During seed germination and seedling establishment, seedlings must live heterotrophically on the resources stored in the seed. Only after establishing a fully functional photosynthetic apparatus, the young plant can change to an autotrophic lifestyle - one of the key features of plant life and metabolism. This work is based on the hypothesis that the evolutionarily conserved central metabolic kinase Snf1-RELATED PROTEIN KINASE 1 (SnRK1) plays a crucial role in the mobilization of storage compounds during seedling establishment. Whereas the importance of SnRK1 as a central regulator of catabolic processes during energy deprication and stress situations has already been demonstrated, so far, the function of SnRK1 in connection with seed germination had remained largely unresolved. Here, we shown for the first time that SnRK1 in Arabidopsis controls the degradation of storage resources, especially triacylglycerides (TAG), seed storage proteins and amino acids. Studies on the localization of SnRK1:GFP fusion proteins and as well as kinase activity assays support a possible function of SnRK1 during seedling establishment. An inducible snrk1-knockdown mutant is strongly impaired in root and hypocotyl growth and the plant do not develop a photosynthetic apparatus. Feeding experiments with glucose rescued the snrk1-mutant phenotype, showing that the metabolic block can be bypassed by external administration of carbohydrates. Thus, the central function of SnRK1 is concluded to be the degradation of the storage resources and rather than a general deregulation of the plant metabolism. Mass spectrometric investigations have shown that TAG degradation and seed storage proteins breakdown are partially impaired in the mutant. Thus, the availability of free amino acids in snrk1 mutant seedlings is lower in comparison to wildtype. It could be shown that - despite the fact that Arabidopsis is an oil-seed plant - carbohydrates, especially sucrose, are the primary resource compound for the seedling before the degradation of TAGs and amino acids is initiated. These degradation products can then be used in gluconeogenesis to produce glucose. Transcriptome analyses have identified key SnRK1-dependent genes, that play a key role in the storage resource catabolism, for example ACYL-CoA-OXIDASE 4 (ACX4) and PMDH2 in TAG breakdown. As an example of an enzyme involved in amino acid catabolism, cyPPDK was further investigated in the course of this study. During the degradation of amino acids, cyPPDK, a key enzyme in the degradation of certain amino acids and gluconeogenesis, is transcriptionally regulated in a SnRK1-dependent manner. Furthermore, it was discoverd that the SnRK1-dependent transcription factor bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63) is involved in the regulation of amino acid breakdown: In qRT-PCR experiments, bzip63-mutants showed no induction of cyPPDK, and co-regulation studies showed that cyPPDK and bZIP63 are subject to the same SnRK1-dependet regulation pattern during early seedling development. Finally, by mutation mapping and chromatin immunoprecipitation (ChIP)PCR, a direct binding of bZIP63 to the promoter could be demonstrated. Based on these results, a mechanistic working model was established, proposing bZIP63 to be phosphorylated by SnRK1 to then activate transcription of the cyPPDK promoter via binding to regulatory G-box cis elements. As a consequence, amino acids are degraded and the metabolites are used to produce glucose via gluconeogenesis. This additional source of energy enables the seedling to make the transition from heterotrophy to autotrophy. Additionally, the degradation of branched-chain amino acids is also regulated by bZIP63. Thereby, ATP is generated to fuel the seedlings energy demands. In summary, this study shows that SnRK1 plays an essential role in the mobilization of storage compounds in seedlings during the transition from heterotrophic to autotrophic life by supplying the seedling with the much-needed additional energy gained from the breakdown of TAGs and amino acids. Mining the extensive RNA-Seq data sets provided by this study will allow the identification of further SnRK1-dependent genes to further unravel this crucial signaling network. Due to the crucial role that these proteins play in early seedling development, these findings will enable future research to increase seedling vigor and finally crop yield. KW - SnRK1 KW - seedling establishment KW - transcription factor KW - Arabidopsis KW - Keimlingsentwicklung KW - bZIP KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214305 ER - TY - THES A1 - Schäbler, Stefan T1 - Charakterisierung des circadianen Drosophila Metaboloms unter Zuhilfenahme massenspektrometrischer Methoden T1 - Characterization of the circadian Drosophila metabolome by applying mass-spectrometry-based approaches N2 - Die Fähigkeit sich an die Rotation der Erde und den daraus resultierenden Tag- und Nacht-Rhythmus anzupassen, basiert auf einer komplexen Regulation verschiedener physiologischer Prozesse. Auf molekularer Ebene liegt diesen Prozessen eine Orchestration von Uhr-Genen zugrunde – auch als innere Uhr bezeichnet – die einen aktivierenden bzw. reprimierenden Einfluss auf die Expression einer Vielzahl weiterer Gene hat. Ausgehend von dieser Regulation lassen sich auf unterschiedlichsten Ebenen tageszeitabhängige, wiederkehrende Rhythmen beobachten. Während diese wiederkehrenden Rhythmen auf einigen Ebenen bereits gut erforscht und beschrieben sind, gibt es weitere Ebenen wie den Metabolismus, über die das Wissen bisher noch begrenzt ist. So handelt es sich bei Drosophila beispielsweise um den Organismus, dessen innere Uhr auf molekularer Ebene wahrscheinlich mit am besten charakterisiert ist. Dennoch ist bisher nur wenig über Stoffklassen bekannt, deren Metabolismus durch die innere Uhr kontrolliert wird. Zwar konnte bereits gezeigt werden, dass sich eine gestörte innere Uhr auf die Anlage der Energiespeicher auswirkt, inwiefern dies allerdings einen Einfluss auf dem intermediären Stoffwechsel hat, blieb bisher weitgehend unerforscht. Auch die Frage, welche Metaboliten wiederkehrende, tageszeitabhängige Rhythmen aufweisen, wurde bisher nur für eine begrenzte Anzahl Metaboliten untersucht. Bei der hier durchgeführten Arbeit wurden deshalb zunächst die globalen Metabolit-Profile von Fliegen mit einer auf molekularer Ebene gestörten inneren Uhr (per01) mit Fliegen, die über eine funktionale Uhr verfügen (CantonS), zu zwei Zeitpunkten verglichen. Um die Anzahl der zeitgleich untersuchten Gewebe und somit die Komplexität der Probe zu reduzieren, wurden hierfür die Köpfe von den Körpern der Fliegen getrennt und separat analysiert. Beide Körperteile wurden sowohl auf kleine hydrophile als auch auf hydrophobe Metaboliten hin mittels UPLC-ESI-qTOF-MS untersucht. Die anschließend durchgeführte, statistische Analyse brachte hervor, dass sich Unterschiede zwischen den beiden Fliegenlinien besonders in den Spiegeln der essentiellen Aminosäuren, den Kynureninen, den Pterinaten sowie den Spiegeln der Glycero(phospho)lipiden und Fettsäureester zeigten. Bei den Lipiden zeigte sich, dass die Auswirkungen weniger ausgeprägt für die Anlage der Speicher- und Strukturlipide als für die Intermediate des Lipidabbaus, die Diacylglycerole (DAGs) sowie die Acylcarnitine (ACs), waren. Um zu bestätigen, dass die inneren Uhr tatsächlich einen regulatorischen Einfluss auf die ausgemachten Stoffwechselwege hat, wurden anschließend die Spiegel aller Mitglieder darauf hin untersucht, ob diese wiederkehrende, tageszeitabhängige Schwankungen aufweisen. Hierfür wurden Proben alle zwei Stunden über drei aufeinanderfolgende Tage genommen und analysiert, bevor mittels JTK_CYCLE eine statistische Analyse der Daten durchgeführt und die Metaboliten herausgefiltert wurden, die ein rhythmisches Verhalten bei einer Periodenlänge von 24h zeigten. Hierbei bestätigte sich, dass besonders die Mitglieder des intermediären Lipidmetablismus hiervon betroffen waren. So konnten zwar auch für einige Aminosäuren robuste Rhythmen ausgemacht werden, besonders ausgeprägt waren diese jedoch erneut bei den DAGs und den ACs. Die abschließende Untersuchung letzterer unter Freilaufbedingungen (DD) sowie in per01 brachte hervor, dass die ausgemachten Rhythmen unter diesen Bedingungen entweder nicht mehr detektiert werden konnten oder deutlich abgeschwächt vorlagen. Lediglich zwei kurzkettige ACs zeigten auch unter DD-Bedingungen statistisch signifikante Rhythmen in ihren Spiegeln. Dies spricht dafür, dass neben der Regulation durch die innere Uhr weitere Faktoren, wie beispielsweise das Licht, eine entscheidende Rolle zu spielen scheinen. N2 - The ability to adapt to the rotation of the earth and to the resulting day and night rhythm is based on a complex regulation of various endogenous processes. At the molecular level, these processes are based on an orchestration of clock genes - also known as the endogenous clock – which have an activating or repressing influence on the expression of diverse clock-controlled genes. Based on this regulation, recurring rhythms depending on the time of day can be observed at various levels, ranging from gene expression to behavior. While these recurring rhythms have been well characterized on certain output levels, little is known, however, on other levels like their influence on metabolism. Drosophila for example, is an organism whose endogenous clock is probably best characterized at the molecular level. However, little is known about substance classes and metabolic pathways that are controlled by the endogenous clock. It has already been shown that an impaired endogenous clock affects energy storage, but how an impaired clock influences intermediary lipid metabolism remains still unknown. Additionally, little is known on metabolites or metabolite classes, that display recurring, time-dependent rhythms. So far this has only been studied for certain metabolites or metabolite classes. Therefore, we compared global metabolite profiles at two timepoints between flies with an impaired endogenous clock (per01) and WT flies, possessing a functional clock (CantonS). In order to reduce the number of different tissues studied at once and thus the complexity of the sample, fly heads were separated from fly bodies and analyzed separately. In both body parts levels of small hydrophilic and hydrophobic metabolites were studied using UPLC-ESI-qTOF-MS. The subsequent statistical analysis revealed differences between the two fly lines, associated with the metabolism of essential amino acids, kynurenines, pterinates, glycero(phospho)lipids and fatty acid esters. Closer inspection of the lipid classes being affected revealed, that the effects were less pronounced for the formation of storage- and structural- lipids, compared to the intermediates of lipid degradation, the diacylglycerols (DAGs) and acylcarnitines (ACs). In order to confirm that the endogenous clock has indeed a regulatory influence on these metabolic pathways, the levels of all members were studied in a time-course experiment to determine, whether they display recurring, time-of-day-dependent fluctuations. For this purpose, samples were taken every two hours for three consecutive days, with heads and bodies analyzed separately, before a statistical analysis was carried out using JTK_CYCLE. The results were then filtered for those metabolites that showed a rhythmic behavior with a period length of 24 hours. The results confirmed that members of the intermediary lipid metabolism were particularly affected. Although robust rhythms could be detected for some amino acids, multiple DAG and AC species showed even more pronounced rhythms. The subsequent analysis of the latter under freerunning conditions (DD) and in per01 showed that the identified rhythms either diminished completely under these conditions or were significantly weakened. Only two short-chain ACs showed statistically significant rhythms in their levels under DD conditions. This suggests that in addition to regulation by the internal clock, other factors, such as light, seem to play a crucial role. KW - Drosophila KW - Lipidomik KW - LC-MS KW - Biochemische Analyse KW - Tagesrhythmus KW - QTOF KW - metabolomics KW - circadian rhythms KW - Metabolomik Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251908 ER - TY - THES A1 - Kucka, Kirstin Michaela T1 - Charakterisierung eines neuen Tumor Nekrose Faktor (TNF) Rezeptor 2 (TNFR2) Agonisten: Der heteromere, membranständige Ligand Lymphotoxin α\(_2\)β T1 - Characterization of a novel tumor necrosis factor (TNF) receptor 2 (TNFR2) agonist: the heteromeric, membrane bound ligand lymphotoxin α\(_2\)β N2 - Seit mehr als zwei Jahrzehnten ist bekannt, dass nicht nur der Tumor Nekrose Faktor-α (=TNF-α) sondern auch Lymphotoxin-α (=LTα) in Form von Trimeren an TNFR1 und TNFR2 binden kann. Durch diese Fähigkeit an beide Rezeptoren zu binden, haben diese zwei Liganden eine essentielle Rolle in der Entwicklung und dem Verlauf von Autoimmunerkrankungen. Bereits mit Beginn der 1990er Jahren wurde gezeigt, dass LTα nicht nur in Form von Homotrimeren vorliegt, sondern auch mit dem verwandten TNF-Superfamilie Liganden Lymphotoxin β (=LTβ) Heterotrimere bilden kann. Hierbei lagern sich LTα und LTβ in Form von LTα2β und LTαβ2 zusammen. Die initialen Experimente mit diesen Heterotrimeren zeigten bereits Unterschiede von LTα2β und LTαβ2. Während LTα2β wie LTα an den TNFR1 bindet, kann LTαβ2 weder an TNFR1 noch TNFR2 binden und interagiert mit einem eigenen Rezeptor namens Lymphotoxin β Rezeptor (=LTβR). Da bereits zwei Liganden (TNF und LTα) für TNFR1 und TNFR2 bekannt waren, wurde LTα2β bis heute nicht weiter charakterisiert. LTαβ2 hingegen war lange Zeit der einzige bekannte Ligand für den LTβR, weshalb die LTαβ2-LTβR-Interaktion ausführlich untersucht wurde. Diese Arbeit fokusiert sich auf die Charakterisierung von LTα2β. Hierfür wurde die einzige bekannte Eigenschaft aus den 90er Jahren von LTα2β nämlich die Bindung an TNFR1 aufgegriffen und um die Rezeptoren TNFR2 und LTβR erweitert. Diese Arbeit zeigt, dass LTα2β nicht nur an den TNFR1, sondern auch an TNFR2 und schwach an LTβR bindet. Trotz der asymmetrischen Bindestellen kann membrangebundenes LTα2β TNFR1 und TNFR2 nicht nur binden, sondern ist auch in der Lage diese zu aktivieren. Diese Arbeit gibt erste Einblicke in die Komplexizität dieses Heterotrimers indem gezeigt wird, dass LTα2β sowohl in seiner löslichen als auch in seiner membrangebundenen Form den TNFR1 aktivieren kann, während der TNFR2 nur durch das membranständige LTα2β aktiviert wird. Aufgrund der aktivierenden Eigenschaften von membranständigem LTα2β und LTαβ2 auf die murine (=mu) Panc02-Zelllinie wird ein ersten Ausblick auf mögliche weitergehende Experimente in mausbasierten Modellen gegeben. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass mit membranständigem LTα2β ein neuer TNFR2 Agonist gefunden wurde. N2 - Since more than two decades it is known, that not only the Tumor Necrosis Factor-α (=TNF-α) but also lymphotoxin-a (=LTα) bind to TNFR1 and TNFR2. Because of their ability to interact with both of these two receptors, the two ligands play a crucial role in the development and persistence of autoimmune diseases. Already at the beginning of the 1990th, it has been shown that LTα forms homotrimers but is also able to form heterotrimers with the related TNF-Superfamily ligand lymphotoxin-β (=LTβ). Thereby, LTα and LTβ associate to form LTα2β and LTαβ2. Initial experiments already have shown differences between LTα2β and LTαβ2. While LTα2β can bind to TNFR1 like LTα, LTαβ2 can bind neither to TNFR1 nor to TNFR2 but interacts with its own receptor called LTβR. Due to the fact that already two ligands (LTα and TNF) for TNFR1 and TNFR2 were known, LTα2β was not further characterized. Since LTαβ2 was the only known ligand for the LTβR, this LTαβ2-LTβR interaction was further and intensively investigated. This work is focused on LTα2β and its characterization. For this purpose the initial and only finding reported for in the 1990th namely the binding to TNFR1 were taken up and expanded for the interaktion with TNFR2 and LTβR. The results of this work show that LTα2β can not only bind to TNFR1, but also to TNFR2 and weaker to LTβR. Despite its asymmetric binding sites, membrane bound LTα2β was shown not only to bind, but also to be able to activate TNFR1 and TNFR2. This work shows that LTα2β can activate the TNFR1 receptor in its soluble and membrane bound form while TNFR2 can only be activated by membrane bound LTα2β. Due to the activating properties of membrane bound LTα2β and LTαβ2 on murine (=mu) Panc02 cells a first outlook on further experiments in mouse based models will be given. These findings show, that membrane bound LTα2β is a new TNFR2 agonist. KW - Ligand KW - Agonist KW - Lymphotoxin KW - Ligand-Rezeptor-Interaktion KW - TNF Superfamilie KW - TNFR2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249824 ER - TY - THES A1 - Lange, Manuel T1 - Mutanten im RES-Oxylipin Signalweg von \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Mutants in RES-Oxylipin Signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Reaktive elektrophile Spezies-Oxylipine (RES-Oxylipine) finden sich in Pflanzen- und Tierzellen und zeichnen sich durch eine für sie typische Anordnung von Atomen aus: einer α,β ungesättigten Carbonyl Gruppe. In Pflanzenzellen gehören unter anderem 2-(E)-Hexenal und die Vorstufe der Jasmonsäure 12-Oxophytodiensäure (OPDA) zu den RES-Oxylipinen, in Tierzellen z.B. Prostaglandin A1 (PGA). RES-Oxylipine üben Signalfunktionen aus, wie dies in Pflanzenzellen funktioniert ist jedoch noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit ist dabei einen möglichen RES-Oxylipin Signalweg aufzuklären und die beteiligten Gene zu identifizieren. Es konnte aber gezeigt werden, dass die Expressionsrate von bestimmten Genen wie z.B. GST6 durch RES-Oxylipine spezifisch induziert wird. Zur Untersuchung des RES-Oxylipin Signalweges wurde der GST6 Promotor vor das Luciferase-Gen fusioniert, um so ein RES-Oxylipin spezifisches Reportersystem zu erhalten. Die Ethylmethansulfonat mutagenisierten Linien wurden auf geänderte Luciferase-Aktivität hin untersucht. Dabei wurden drei Mutanten isoliert, die in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Eine zeigte basal erhöhte Luciferase-Aktivität (constitutive overexpresser 3 = coe3) und die anderen beiden erniedrigte Luciferase-Aktivität nach PGA Gabe (non responsive 1 und 2 = nr1 und nr2). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phänotypen in allen 3 Mutanten rezessiv vererbt werden und die Mutanten nicht zueinander allel sind. Zudem war die veränderte Luciferase-Aktivität nicht durch geänderte Phytohormonspiegel oder durch Mutationen im GST6 Promotor erklärbar. Auf die Gabe von RES, wie Benzylisothiocyanat oder Sulforaphan, sowie auf endogene RES-Oxylipine, wie OPDA und Hexenal, reagierten die Mutanten auf ähnliche Weise, wie nach PGA Gabe. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass sich die drei Mutanten stark voneinander unterschieden. Das Transkriptom kontrollbehandelter coe3 Pflanzen unterschied sich stark von dem der GST6::LUC Pflanzen. Die Mutante war trockenstressresistenter zudem war sie sensibler gegenüber NaCl, was jedoch nicht von einer veränderten Reaktion auf Abscisinsäure herrührte. Des Weiteren war der Chlorophyllabbau bei dunkel inkubierten Blättern geringer. Bei der Lokalisierung der Mutation, die noch nicht abgeschlossen ist, konnten Chromosom 2 und 5 als die wahrscheinlichsten Kandidaten ermittelt werden. Weitere Analysen sind nötig um den Bereich weiter eingrenzen zu können. Die Mutante nr1, die sich durch verminderte Reaktion auf RES-Oxylipine auszeichnete, zeigte einen kleineren Wuchs und ein deutlich verzögertes Blühen. Außerdem wies die Mutante erhöhte Argininspiegel in ihren Blättern auf. Das Transkriptom unterschied sich sowohl bei kontrollbehandelten, als auch bei PGA behandelten nr1 Pflanzen massiv von denen der gleichbehandelten Kontrollen. Auch die nr1 schien trockenstressresistenter zu sein, sie war im Gegensatz zur coe3 aber robuster gegenüber höheren Konzentrationen an NaCl. Mit Hilfe eines „Next Generation Genome-Mappings“ war es möglich die Mutation am Ende von Chromosom 3 zu lokalisieren und auf fünf mögliche Gene einzugrenzen. Weitere Untersuchungen müssen nun klären, welches dieser Gene ursächlich für den Phänotyp der geänderten Luciferase-Aktivität ist. Die zweite Mutante mit einer reduzierten Reaktion auf RES-Oxylipine war die nr2. Überraschender Weise unterschied sich das Transkriptom kontrollbehandelter nr2 Pflanzen deutlich stärker von dem der gleichbehandelten GST6::LUC Pflanzen, als das nach PGA Gabe der Fall war. Sie reagierte nur mit sehr schwacher Luciferase-Aktivität auf Verwundung und war zudem deutlich sensibler gegenüber Trockenheit. Für eine zukünftige Lokalisation der ursächlichen Mutation wurden entsprechende Kreuzungen durchgeführt aus deren Samen jederzeit mit einer Selektionierung begonnen werden kann. Mit dieser Arbeit konnte ein erster großer Schritt in Richtung Identifikation der, für die geänderte Luciferase-Aktivität, verantwortlichen Mutation gemacht werden, sowie erste Reaktionen der Mutanten auf abiotische Stressfaktoren untersucht werden. Somit ist man der Entdeckung von Signaltransduktionsfaktoren, die RES-Oxylipinabhängig reguliert werden, einen wichtigen Schritt näher gekommen. N2 - Reactive electrophilic species oxylipins (RES-oxylipins) can be found in plant and animal cells and contain an α,β unsaturated carbonyl group. In plant cells 2-(E)-hexenal and 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA), the precursor of jasmonic acid, belong to the RES-oxylipins, in animal cells prostaglandin A1 (PGA). RES-oxylipins play an important role in signal transduction but it is still unknown how this functions in plant cells. In previous publications, it could be shown, that RES-oxylipins induce the expression of certain genes like GST6 specifically. To further investigate the possibility of a RES-oxylipin pathway the GST6 promotor was fused to the luciferase gene to get a RES-oxylipin sensitive reporter system. The ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenized lines were screened for altered luciferase activity under basal conditions and after treatment with PGA. Three lines were selected for further investigation: one with a constitutive higher luciferase activity (constitutive overexpresser 3 = coe3) and two with a reduced luciferase activity after PGA treatment (non responsive 1 and 2 = nr1 and nr2). In this thesis, it could be shown, that the mutation, which is responsible for the altered luciferase activity, is recessive and not allelic to each other. Furthermore, neither altered phytohormone levels nor mutations in the GST6 promotor are responsible for the changes in the luciferase activity. The response of these mutants to RES, like benzyl isothiocyanate (BITC) or sulforaphane, or endogenous RES-oxylipins, like OPDA or hexenal, is comparable to the response to PGA treatment. Further investigations show huge differences between the mutants. Control treated coe3 plants had very different transcriptomes compared to the control line. The coe3 mutant was more resistant to drought stress but more susceptible to salt compared to the control. This was not due to a changed response to abscisic acid (ABA). Another observed phenotype was the reduced chlorophyll depletion in dark incubated leaves. The localization of the mutation could not be completed within this thesis but chromosome 2 and 5 could be identified as most likely positions. Further investigations on this topic are needed to complete the localization. The nr1 mutant showed a reduced growth and delayed flowering phenotype and higher arginine levels could be detected in the leaves. The transcriptome exhibited huge differences after both control treatment and PGA treatment compared to the GST6::LUC. In drought experiments, the nr1 was also more resistant but, compared to the coe3, also more robust against higher salt concentrations. By next generation genome mapping it was possible to locate the mutation, which was responsible for the changes in luciferase activity after PGA treatment, at the end of chromosome 3. So there are five genes left who might be responsible for the observed phenotypes. Further investigations have to show which one is the one causing the phenotype. The nr2, as the third mutant investigated in this thesis showed highest differences to the GST6::LUC line after control treatment. It only had weak luciferase activity after wounding and was more susceptible to drought then the control. For further mapping experiments of the mutation in the nr2 mutant, F2 lines were generated. These are now ready to use to set up a mapping population. With this thesis it was possible to provide a milestone in identification of the mutations responsible for the changes in luciferase activity and in investigation of different abiotic stress responses. Now we are one step closer to discover signal transduction factors which are regulated by RES-oxylipins. KW - Arabidopsis thaliana KW - RES-Oxylipine Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166085 ER - TY - THES A1 - Müller, Heike Milada T1 - Anpassung an Trocken- und Salzstress: Untersuchungen an Modellpflanzen und Extremophilen T1 - Adaptation to drought and salt stress: studies on model plants and extremophiles N2 - Die wahrscheinlich größten Probleme des 21. Jahrhunderts sind der Klimawandel und die Sicherstellung der Nahrungsmittelversorgung für eine steigende Zahl an Menschen. Durch die Zunahme von extremen Wetterbedingungen wie Trockenheit und Hitze wird der Anbau konventioneller, wenig toleranter Nutzpflanzen erschwert und die dadurch notwendige, steigende Bewässerung der Flächen führt darüber hinaus zu einer zusätzlichen Versalzung der Böden mit für Pflanzen toxischen Natrium- und Chlorid-Ionen. Kenntnisse über Anpassungsstrategien salztoleranter Pflanzen an Salzstress, aber auch detailliertes Wissen über die Steuerung der Transpiration und damit des Wasserverlusts von Pflanzen sind daher wichtig, um auch künftig ertragreiche Landwirtschaft betreiben zu können. In dieser Arbeit habe ich verschiedene Aspekte der pflanzlichen Stressphysiologie bearbeitet, die im Folgenden getrennt voneinander zusammengefasst werden. I. Funktionelle Unterschiede der PYR/PYL-Rezeptoren von Schließzellen Entscheidend für den Wasserstatus von Pflanzen ist die Kontrolle des Wasserverlusts durch Spaltöffnungen (Stomata), die von einem Paar Schließzellen gebildet werden. Externe Faktoren wie Licht, Luftfeuchtigkeit und CO2, sowie interne Faktoren wie das Phytohormon Abszisinsäure (ABA) regulieren über Signalkaskaden die Stomaweite und dadurch den Wasserverlust. Die zugrunde liegenden Signalkaskaden überlappen teilweise. Vor allem der Stomaschluss durch erhöhtes CO2 und ABA weisen viele Gemeinsamkeiten auf und die Identifizierung des Konvergenzpunktes beider Signale ist immer noch aktueller Gegenstand der Forschung. Von besonderem Interesse sind dabei die in Schließzellen exprimierten ABA-Rezeptoren der PYR/PYL-Familie. Denn obwohl bislang nicht nachgewiesen werden konnte, dass CO2 zu einem Anstieg des ABA-Gehalts von Schließzellen führt deuten einige Studien darauf hin, dass die ABA-Rezeptoren selbst am CO2-Signalweg beteiligt sind. Durch Untersuchungen der Stomareaktion von Arabidopsis ABA-Rezeptormutanten konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass die in Schließzellen exprimierten ABA-Rezeptoren der PYR/PYL-Familie funktionale Unterschiede aufweisen. Fünffach-Verlustmutanten der ABA-Rezeptoren PYR1, PYL2, 4, 5 und 8 (12458) waren in ihrem ABA-induzierten Stomaschluss beeinträchtigt und nur die Komplementation mit PYL2 und in geringerem Maße PYR1 konnte die ABA-Sensitivität wiederherstellen. Die Stomata von 12458-Verlustmutanten waren außerdem insensitiv gegenüber erhöhtem CO2, was auf eine Beteiligung der ABA-Rezeptoren am CO2-induzierten Stomaschluss hindeutet und diese Sensitivität konnte nur durch die Komplementation mit PYL4 oder PYL5, nicht aber mit PYL2 wiederhergestellt werden. Somit konnten in dieser Arbeit erstmals funktionelle Unterschiede der PYR/PYLs beim Stoma-Schluss nachgewiesen werden. Alle externen und internen Stomaschluss-Signale haben außerdem Einfluss auf die Genexpression der Schließzellen und führen zu individuellen expressionellen Adaptionen. In vorangegangenen Microarray Studien konnte gezeigt werden, dass jeder Stimulus auch die Expression eines distinkten Sets an ABA-Rezeptoren beeinflusst. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich außerdem zeigen, dass die Expression der ABA-Rezeptoren bereits auf kleine Änderungen der ABA-Konzentration der Schließzellen reagiert und dass diese sich außerdem in ihrer Sensitivität gegenüber ABA unterschieden. Geringe Änderungen der ABA-Konzentration von Schließzellen haben demnach Auswirkungen auf deren Rezeptor-zusammensetzung. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Rezeptoren die Expression unterschiedlicher nachgeschalteter Gene beeinflussen, was darauf hindeutet, dass Anpassungen des Rezeptorpools durch geringe Änderungen des ABA-Gehalts von Schließzellen schlussendlich auf genexpressioneller Ebene zur längerfristigen Adaption an externe Bedingungen führen und die Rezeptoren auch hier funktional verschieden sind. II. Stomatäre Besonderheiten der toleranten Dattelpalme (Phoenix dactylifera) Dattelpalmen kommen natürlicherweise an besonders trockenen und heißen Standorten vor, an denen es aufgrund der harschen Bedingungen nur sehr wenigen Pflanzen möglich ist überhaupt zu wachsen. Ein naheliegender Grund für die herausragende Toleranz dieser Art gegenüber wasserlimitierenden Bedingungen ist eine Anpassung der stomatären Regulation zu Gunsten des Wasserhaushalts. In dieser Arbeit konnte ich durch vergleichende Untersuchungen der lichtabhängigen Transpiration sowie dem ABA-induzierten Stomaschluss grundlegende Unterschiede in der Stomaphysiologie der Dattelpalmen und der eher sensitiven Modellpflanze Arabidopsis thaliana nachweisen. Blattgaswechselmessungen zeigten, dass Dattelpalmen in der Lage sind die Spaltöffnungen bei niedrigen Lichtintensitäten, bei denen Arabidopsis bereits deutlich geöffnete Stomata aufwies, geschlossen zu halten. Der bedeutendste Unterschied in der Stomaphysiologie von Dattelpalmen und Arabidopsis lag aber im ABA-induzierten Stomaschluss. Während über die Petiole verabreichtes ABA bei Arabidopsis innerhalb von 15 Minuten zu einem vollständigen Stomaschluss führte, konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass der ABA-induzierte Stomaschluss der Datteln nitratabhängig ist. ABA allein führte nur zu einem sehr langsamen Stomaschluss der innerhalb einer Stunde nicht vollständig abgeschlossen war. Nur in Gegenwart von Nitrat führte die ABA-Gabe in den Transpirationsstrom der Fiederblätter der Datteln zu einem schnellen und vollständigen Stomaschluss. In Arabidopsis wird der in Schließzellen vorkommende Anionenkanal AtSLAC1 durch eine über den ABA-Signalweg vermittelte Phosphorylierung aktiviert, was schlussendlich zur Aktivierung spannungsabhängiger Kationenkanäle und zum Ausstrom von Kalium aus den Schließzellen führt. Es konnte gezeigt werden, dass die Nitratabhängigkeit der ABA-Antwort der Schließzellen von Dattelpalmen auf Eigenschaften von PdSLAC1 zurückzuführen ist und dieser Kanal nur in Anwesenheit von extrazellulärem Nitrat aktivierbar ist. Mittlerweile konnte, unter anderem basierend auf diesen Ergebnissen, eine Tandem-Aminosäuresequenz identifiziert werden, die die SLAC-Homologe monokotyler Pflanzen wie der Dattelpalme von der dikotyler Pflanzen unterscheidet und zumindest teilweise für die nitratabhängige Aktivierung des Stomaschlusses vieler monokotyler verantwortlich ist. III. Die Salztoleranz von Phoenix dactylifera und Chenopodium quinoa Sowohl Dattelpalmen als auch C. quinoa weisen, verglichen mit den meisten anderen Pflanzen, eine hohe Toleranz gegenüber NaCl-haltigen Böden auf. In dieser Arbeit habe ich die Salztoleranz beider Arten untersucht, um so Strategien zu identifizieren, die diesen Pflanzen diese gesteigerte Toleranz ermöglichen. Dattelpalmen können natürlicherweise auf salzigen Böden wachsen. Makroskopisch weisen diese Pflanzen aber keine Anpassungen wie bspw. Salzdrüsen auf und bislang ist unklar wie Dattelpalmen mit dem NaCl aus dem Boden umgehen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass der Natriumgehalt der Fiederblätter der Datteln durch eine sechswöchige Bewässerung mit 600mM NaCl, was ungefähr der Konzentration von Meerwasser entspricht, nicht zunimmt. Demnach sind Datteln so genannte „Exkluder“, also Pflanzen, die eine übermäßige Natriumaufnahme in photosynthetisch aktives Gewebe vermeiden. Der Natriumgehalt der Wurzeln dagegen nahm unter Salzstress aber zu. Diese Zunahme war allerdings in unterschiedlichen Bereichen der Wurzeln verschieden stark. Flammenphotometrische Messungen ergaben einen vom Wurzelansatz ausgehenden graduellen Anstieg des Natriumgehalts, der an der Wurzelspitze am höchsten war. Darüber hinaus konnte eine Induktion von PdSOS1, einem putativen Na+/H+-Antiporter in diesen unteren, natriumhaltigen Bereichen nachgewiesen werden. Eine hohe SOS1-Aktivität gilt bereits in anderen toleranten Arten als Schlüsselmerkmal für deren Toleranz und die gesteigerte Expression von PdSOS1 deutet auf eine erhöhte Natrium-Exportrate aus der Wurzel zurück in den Boden in diesen unteren Bereichen hin, was schlussendlich den Ausschluss von Natrium vermitteln könnte. In sensitiven Arten führt Salzstress häufig zu einer Abnahme der Kaliumkonzentration des Gewebes. Interessanterweise war dies weder für das Blatt- noch das Wurzelgewebe der Dattelpalmen der Fall. Der Kaliumgehalt beider Gewebe blieb trotz der Bewässerung der Pflanzen mit Salzwasser konstant. Auf expressioneller Ebene konnte ich darüber hinaus zeigen, dass PdHAK5, ein putativer hochaffiner Kaliumtransporter, der unter Kontrollbedingungen überwiegend in den oberen Wurzelabschnitten exprimiert wurde, durch den Salzstress dort reprimiert wurde. PdKT, ebenfalls ein putatives Kalium-Transportprotein dagegen, wurde nicht durch die Salzbehandlung beeinflusst, was zusammengenommen darauf hindeutet, dass das Aufrechterhalten des Kaliumgehalts bei Salzstress durch die differentielle Regulation verschiedener Kaliumaufnahmesysteme gewährleistet wird. Der effiziente Ausschluss von Natrium zusammen mit dem hohen K+/Na+-Verhältnis könnten demnach Schlüsselmerkmale für die hohe Salztoleranz von Phoenix dactylifera darstellen. Quinoa ist, ähnlich wie die Dattelpalme, eine salztolerante Nutzpflanze. Im Gegensatz zu Dattelpalmen weist Quinoa allerdings besondere Strukturen auf der Epidermis auf, die so genannten epidermalen Blasenhaare (englisch: epidermal bladder cells, EBCs). Die Funktion dieser ballonartig vergrößerten Zellen als externe Salzspeicher wird seit längerem diskutiert. Flammenphotometrische Messungen des Natriumgehalts von Quinoa unter Salzstressbedingungen ergaben, dass Quinoa anders als Dattelpalmen, Natrium in die oberirdischen, photosynthetisch aktiven Organe aufnimmt. Auch die Zunahme des Natriumgehalts der EBCs konnte ich nachweisen. Junge Blätter haben eine hohe Dichte an intakten EBCs, was deren Funktion als externe Salzspeicher besonders zum Schutz dieser jungen Blätter nahelegt. mRNA-Sequenzierungen ergaben darüber hinaus, dass die EBCs bereits unter Kontrollbedingungen viele in grundlegende Stoffwechselprozesse involvierte Gene sowie membranständige Transportproteine differentiell exprimieren. Diese Unterschiede im Transkriptom der EBCs zum Blattgewebe zeigen, dass katabole Stoffwechselwege nur eine untergeordnete Rolle in den hochspezialisierten EBCs spielen und deren Stoffwechsel auf dem Import energiereicher Zucker und Aminosäuren basiert. Mittels qPCR-Messungen und RNA-Sequenzierungen konnte ich die gewebespezifische Expression verschiedener Transportproteine nachweisen, die eine gerichtete Aufnahme von Natrium in EBCs ermöglichen könnten. Besonders die differentielle Expression eines Natriumkanals der HKT1-Familie deutet auf dessen Beteiligung an der Natriumbeladung der EBCs hin. CqHKT1.2 wurde ausschließlich in EBCs exprimiert und die elektrophysiologische Charakterisierung dieses Transportproteins ergab eine spannungsabhängige Natriumleitfähigkeit. Dieser Natriumkanal kann demnach die Natriumaufnahme bei Membranspannungen nahe dem Ruhepotential in die EBCs vermitteln und die Deaktivierung des CqHKT1.2 bei depolarisierenden Membranspannungen kann darüber hinaus einen Efflux von Na+ aus den EBCs verhindern. Auch das Expressionsmuster eines putativen Na+/H+-Antiporters (CqSOS1) der nur sehr gering in EBCs aber deutlich höher in Blattgewebe exprimiert wurde, deutet auf eine indirekte Beteiligung dieses SOS1 an der Beladung der EBCs hin. Bereits charakterisierte SOS1-Proteine anderer Pflanzen zeigten unter physiologischen Bedingungen eine Natriumexport-Aktivität. CqSOS1 könnte demnach den Export von Natrium aus Mesophyll- und Epidermiszellen der Blätter in den Apoplasten vermitteln, welches dann über CqHKT1.2 in die EBCs aufgenommen wird. Trotz der Natriumaufnahme in die oberirdischen Teile und die EBCs führte die Salzbehandlung ähnlich wie bei den Datteln nicht zu einer Abnahme des bemerkenswert hohen Kaliumgehalts. Mittels qPCR-Untersuchungen konnte ich die Expression verschiedener HAK-Orthologe nachweisen, deren Aktivität die Aufrechterhaltung des Kaliumgehalts unter Salzstress vermitteln könnten. Frühere Studien konnten zeigen, dass Salzstress bei Quinoa wie bei vielen salztoleranten Arten zu einem Anstieg der Konzentration von kompatiblen gelösten Substanzen und besonders von Prolin führt. In dieser Arbeit konnte ich die hohe Expression eines Prolintransporters in EBCs nachweisen, was eher auf einen importbasierten Anstieg der Prolinkonzentration als auf die Synthese innerhalb der EBCs schließen lässt. Zusammengefasst ergaben der Anstieg des Natriumgehalts der EBCs in Verbindung mit den Ergebnissen der RNA-Sequenzierung und den ergänzenden qPCR Messungen, dass die EBCs von Quinoa bereits unter Kontrollbedingen für die Aufnahme von überschüssigen Ionen unter Salzstress spezialisierte Zellen sind, deren Spezialisierung auf dem Import von energiereichreichen Zucken und anderen Substanzen basiert. N2 - The greatest problem faced by the 21st century are climate change and maintaining the food security for an increasing number of people. The increase in extreme weather events, such as drought and heat, makes it difficult to cultivate conventional crops that are not stress tolerant. As a result, increasing irrigation of arable land leads to additional salinization of soils with plant-toxic sodium and chloride ions. Knowledge about the adaptation strategies of salt-tolerant plants to salt stress as well as detailed knowledge about the control of transpiration and thus of the water loss of these plants are therefore important in order to be able to guarantee productive agriculture in the future. In this work, I have worked on various aspects of plant stress physiology, which will be summarized separately below. I. Functional differences of guard cell PYR / PYL receptors A tight regulation of the transpirational water loss through stomata, which are formed by a pair of guard cells, is crucial for regulating the water status of plants. External factors such as light, humidity and CO2 as well as internal factors such as the phytohormone ABA regulate the stoma width and thus the loss of water via individual signal cascades. However, the underlying signaling cascades partly overlap. In particular, the cascades involved in stomatal closure due to increasing CO2 and ABA overlap and the identification of a convergence point of both signals is still the subject of ongoing research. In this context, the ABA receptors of the PYR/PYL family that are expressed in guard cells are of particular interest. Although it has not yet been demonstrated that CO2 leads to an increase in the ABA content of guard cells, some studies indicate that the ABA receptors themselves are involved in the CO2 signaling pathway By studying the stomatal response of Arabidopsis ABA receptor mutants, I demonstrated that the PYR / PYL family ABA receptors expressed in guard cells show functional differences. Pentuple knock out mutants of the ABA receptors PYR1, PYL2, 4, 5, and 8 (12458) showed impairment in ABA-induced stomatal closure, and only complementation with PYL2 and, to a lesser extent, PYR1 could restore ABA sensitivity. Additionally, the stomata of the 12458 knockout mutants were also insensitive to elevated CO2 and the sensitivity could only be restored be the complementation with the receptors PYL4 and PYL5 suggesting an involvement of the ABA receptors in the CO2-induced stomatal closure. Furthermore, all external and internal stimuli that lead to stomatal closure influence the gene expression of guard cells leading to individual adaptions on the gene expression level. Previous microarray studies have shown that each stimulus also affects the expression of a distinct set of ABA receptors. In this work, I showed that the expression of ABA receptors already responded to small changes in the ABA concentration of guard cells and that the receptor expression also differed in their sensitivity to ABA. Small changes in the ABA concentration of guard cells could therefore influence their receptor composition. In addition, I was able to show that the receptors affect the expression of different downstream genes, suggesting that adjustments of the receptor pool by small changes in the ABA content of guard cells ultimately lead to long-term adaptations to external conditions at the gene expression level. II. Specific features of the stomata of the extremely tolerant date palm (Phoenix dactylifera) Date palms naturally occur in particularly dry and hot locations, where due to the harsh conditions only very few plant species are able to grow at all. One possible reason for the outstanding tolerance of this species to water-limiting conditions is an adaptation of the stomatal regulation in favor of maintaining water balance. In this work, I was able to demonstrate fundamental differences in the stomatal physiology of date palm and the rather sensitive model plant Arabidopsis thaliana by comparative studies of light-dependent transpiration and ABA-induced stoma closure. Leaf gas exchange measurements showed that date palm can keep the stomata closed at low light intensities, where Arabidopsis already had clearly opened stomata. However, the most significant difference in the stomatal physiology between date palm and Arabidopsis was found in the ABA-induced stomatal closure. While ABA fed via the petiole resulted in complete stomatal closure within 15 minutes in Arabidopsis, I showed that ABA-induced stomatal closure is nitrate-dependent in date palm. ABA alone only resulted in a very slow stomatal closure that was not fully completed within one hour. Only in the presence of nitrate did the feeding of ABA into the transpiration stream of date palm pinates lead to a rapid and complete stomatal closure. In Arabidopsis, the guard cell-expressed anion channel AtSLAC1 is activated by ABA signaling-mediated phosphorylation, triggering voltage-dependent cation channels to open and ultimately channeling potassium out of the guard cells. It could be shown that the nitrate dependence of the ABA response of the date palm guard cells is due to properties of PdSLAC1 and that this channel can only be activated in the presence of extracellular nitrate. Based on these results, a tandem amino acid sequence has now been identified, that distinguishes the SLAC homologues of monocotyledonous plants (including date palm) from dicotyledonous plants (including Arabidopsis) and is at least partially responsible for the nitrate-dependent activation of the stoma conductance of many monocots. III. The strategies behind the salt tolerance of P. dactylifera and Chenopodium quinoa Both date palms and C. quinoa have a high tolerance to NaCl-containing soils compared to most other plant species. In this work, I studied the salt tolerance of both species to identify strategies that allow these plants to grow under salt stress conditions. Date palm naturally grows on saline soils along the coast of the Arabian Peninsula. However, they do not possess any macroscopic adaptations such as salt glands. So far it is unclear how date palms handle excessive NaCl from the soil. In this work, I was able to show that the sodium content of date palm pinates does not increase after a six-week irrigation with 600mM NaCl, which is roughly the concentration of seawater. Accordingly, date palm is a so-called "excluder", i.e. a plant that avoids excessive sodium uptake into photosynthetically-active tissue. The sodium content of roots, however, increased under salt stress. But this increase was different in different areas of the roots. Flame photometric measurements revealed a gradual increase in sodium content from upper to lower parts of the roots, which was highest at the root tip. In addition, induction of PdSOS1, a putative Na+/H+ antiporter in these lower sodium-containing regions has been demonstrated. High SOS1 activity is already considered to be a key feature of tolerance in other species, and increased expression of PdSOS1 indicates increased sodium export rates from the root back into the soil in these lower areas, which could ultimately mediate the exclusion of sodium. In sensitive plant species, salt stress often leads to a decrease in the potassium concentration of the tissue. Interestingly, this was not the case for date palm leaf or root tissue. The potassium content of both tissues remained constant despite irrigation of the plants with salt water. On the expression level, I also showed that PdHAK5, a putative high-affinity potassium transporter predominantly expressed in the upper root sections under control conditions, was repressed by the salt stress there. In contrast, PdKT, also a putative potassium transport protein, was not affected by the salt treatment, suggesting that maintenance of potassium content in salt stress is ensured by the differential regulation of various potassium uptake systems. The efficient exclusion of sodium together with the high K+/Na+ ratio could therefore be key features of the high salt tolerance of Phoenix dactylifera. Quinoa, like the date palm, is a salt-tolerant crop but in contrast to date palms quinoa has special structures on the epidermis, the so-called epidermal bladder cells (EBCs). The function of these balloon-like enlarged cells as external salt dumpers has been proposed. Flame photometric measurements of the sodium content of quinoa under salt stress conditions showed that quinoa, unlike date palm, absorbs sodium in the above-ground, photosynthetically active parts. I was also able to prove the increase in the sodium content of the EBCs. Young leaves are equipped with a high density of intact EBCs, suggesting their function as external salt stores, especially for the protection of these young leaves. In addition, mRNA sequencing revealed that the EBCs, already under control conditions, differentially express many genes involved in basic metabolic processes as well as membrane-bound transport proteins. These differences in the transcriptome of EBCs to leaf tissue show that catabolic pathways such as photosynthesis play only a minor role in the highly specialized EBCs and their metabolism is based on the import of high energy compounds such as sugars or amino acids. Using qPCR measurements and RNA sequencing, I was able to demonstrate the tissue-specific expression of various transport proteins, which could allow unidirectional uptake of sodium in EBCs. In particular, the differential expression of a sodium channel of the HKT1 family indicates its involvement in the sodium loading of the EBCs. CqHKT1.2 was expressed exclusively in EBCs and the electrophysiological characterization of this transport protein revealed a voltage-dependent sodium conductivity. Thus, this sodium channel can mediate sodium uptake into EBCs at normal membrane voltages, and deactivation of CqHKT1.2 at depolarized membrane voltages can prevent efflux of Na+ out of the EBCs. The expression pattern of a putative Na+/H+ antiporter (CqSOS1), which is expressed only very low in EBCs but significantly higher in leaf tissue, indicates an indirect involvement of this SOS1 in the loading of the EBCs. SOS1 proteins from other plant species that have already been characterized showed a sodium export activity under physiological conditions. Thus, CqSOS1 could mediate the export of sodium from mesophyll and epidermis cells of the leaves in the apoplasts, which is then absorbed into the EBCs via CqHKT1.2. Similar to the results of date palm, the sodium uptake into the above ground parts and the EBCs of quinoa during the salt treatment did not lead to a decrease in the remarkably high potassium content of quinoa. Using qPCR studies, I was able to demonstrate the expression of various HAK orthologues, the activity of which could mediate the maintenance of potassium levels under salt stress. Previous studies have shown that salt stress in quinoa, as in many tolerant species, leads to an increase in the concentration of compatible solutes and particularly proline. In this work, I was able to demonstrate the high expression of a proline transporter in EBCs, suggesting an import-based increase in proline concentration rather than synthesis within the EBCs. In summary, the increase in sodium in EBCs together with the RNA-Seq analyses and the complementary qPCR measurements revealed that the Quinoa EBCs under control conditions are already equipped for the uptake of excess ions under salt stress, with a metabolism that strongly depends on the import of high-energy compounds such as sugars and amino acids. KW - Botanik KW - Salzresistenz KW - Dürreresistenz KW - abiotische Stresstoleranz von Pflanzen KW - abiotic stress tolerance of plants Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179005 ER - TY - THES A1 - Voß, Lena Johanna T1 - Änderungen der Membranspannung und der Osmolarität als Auslöser für Calciumsignale in Pflanzen – Studien an Schließzellen von Nicotiana tabacum und Polypodium vulgare T1 - Induction of Calcium Signals by Changes in Membrane Potential and Osmolarity – Studies on Guard Cells of Nicotiana tabacum and Polypodium vulgare N2 - Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt. N2 - Stomata are small pores in the leaf surface that allow plants to adapt their water balance to changing environmental conditions. The turgor pressure of the guard cells determines the width of the stomatal aperture and is regulated by ion fluxes in or out of the guard cell. A network of different signal transduction pathways is necessary for the adaption of stomatal movements to ambient conditions. Many of these transduction pathways have been described in detail and many of their components have been identified. It is a well known fact that calcium acts as a second messenger in pathways regulating stomatal movements. However, the mechanisms that lead to transient elevations of the cytosolic calcium concentration are largely unknown. The molecular basis of the regulation of stomatal aperture in non-angiosperm species is also poorly understood. In order to gain new insights into these topics, mechanisms of calcium elevation and electrophysiological properties of guard cells were studied, focussing especially on the visualization of the cytosolic calcium concentration in guard cells. In the first part of this study, the application of hyperpolarizing voltage pulses by means of TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) was used to specifically trigger an increase in the cytosolic calcium concentration in individual guard cells in the angiosperm model plant Nicotiana tabacum. To visualize the dynamics of the cytosolic calcium concentration with high temporal and spatial resolution, a spinning disc system for confocal imaging was used simultaneously with the electrophysiological recordings. During the application of hyperpolarizing voltage pulses a transient increase in cytosolic volume was observed. This increase can be explained by an osmotically driven water flux caused by changes of the cytosolic ion concentration. These in turn are caused by the voltage-dependent activation of inward rectifying potassium channels in the guard cell plasma membrane and by the compensating current from the impaled microelectrode. Using the calcium-sensitive dye Fura-2, it could be shown that two mechanisms lead to the elevation of the cytosolic calcium concentration during the application of hyperpolarizing voltage pulses. The first mechanism is the activation of hyperpolarization-activated calcium permeable channels (HACCs) in the plasma membrane, which has already been described in 1998 by Grabov & Blatt. In addition to this mechanism of calcium release, a second previously unknown mechanism was discovered in which calcium is released into the cytosol from intracellular stores. This mechanism is related to the increase in cytosolic volume we described above and is probably caused by changes in membrane tension or osmolarity within the cell. These changes could lead to an activation of mechanosensitive calciumpermeable channels. The second part of this thesis deals with the molecular basis of the regulation of stomata in non-angiosperms. In guard cells of Polypodium vulgare voltage-dependent currents across the plasma membrane similar to those described in angiosperm model plants could be measured using TEVC. Furthermore, the application of hyperpolarizing voltage pulses induced increases in cytosolic calcium concentration in guard cells of Polypodium and Asplenium indicating the existence of voltage-dependent calcium permeable channels in the plasma membrane. The diffusion of iontophoretically injected fluorescent dyes into the neighboring guard cells in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris and Selaginella showed that in these species a symplastic connection between neighboring guard cells exists, which could not be observed in guard cells of angiosperms. Electron microscopic images of Polypodium glycyrrhiza guard cells showed that this connection is probably formed by plasmodesmata between adjacent guard cells. Analysis of the calcium dynamics in neighboring guard cells after hyperpolarizing voltage pulses revealed that calcium homeostasis seems to be regulated independently in both guard cells despite their symplastic connection. As part of the investigations on guard cells of ferns, a new method for the application of ABA was established, which allows the phytohormone to be charged iontophoretically into the apoplast with the aid of microelectrodes. In contrast to the guard cells of Nicotiana tabacum, which reacted with loss of turgor and subsequential stomatal closure to this method of ABA-application, no closure of the stomata could be induced in Polypodium vulgare in this way. However, since the ABA response of fern stomata is also dependent on other factors such as growth conditions (Hõrak et al., 2017), an ABA-responsiveness in this fern species can still not be completely excluded. The release of calcium from intracellular stores, as shown in this work, could play an important role for the regulation of stomatal aperture. To clarify this question, the identification of the channels involved in osmotically/mechanically induced calcium release from internal stores would be of great interest. Further studies on fern guard cells could clarify the physiological significance of ion channels known from angiosperms for the stomatal movements in early land plants, and thus contribute significantly to the understanding of the evolution of stomatal regulation. In addition, the question arises as to what role the symplastic connection of the neighboring guard cells through plasmodesmata plays for the function of stomata. KW - Schließzelle KW - Nicotiana tabacum KW - Polypodium vulgare KW - Calcium Imaging KW - Elektrophysiologie KW - Schließzellen KW - Farne KW - Abscisinsäure KW - Oregon Green-BAPTA KW - Fura-2 KW - Hyperpolarisierung KW - guard cells KW - ferns KW - abscisic acid KW - hyperpolarisation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219639 ER - TY - THES A1 - Reyer, Antonella T1 - Charakterisierung des Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii als nicht-invasives, optogenetisches Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen T1 - Characterisation of Channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii as a non-invasiv, optogenetic tool for the functional analysis of electical signals in plants N2 - Ebenso wie Tiere verfügen Pflanzen über die Fähigkeit elektrische Signale zu generieren. Dabei repräsentieren elektrische Signale – Membranpotentialänderungen an der Plasmamembran – die frühesten Antworten, welche an Pflanzenzellen im Zuge veränderter externer und intrinsischer Bedingungen beobachtet werden können. Stimuli wie Kälte, Hitze, Verwundung, Herbivorie und Pathogene, aber auch physiologische Prozesse, wie Wachstum und Bestäubung führen zur Änderung des Potentials der Plasmamembran pflanzlicher Zellen. Die meisten dieser Membranpotentialänderungen bestehen aus einer schnellen Depolarisation, gefolgt von einer Repolarisation des Membranpotentials, deren Kinetik, in Abhängigkeit des Stimulus hoch variabel sein kann. Das Wissen über die molekularen Grundlagen der Generierung und Weiterleitung elektrischer Signale in Pflanzen ist im Gegensatz zu Tieren nur wenig verstanden. Eine Ausnahme stellen ‚klassisch-erregbare‘ Pflanzen wie die Venusfliegenfalle oder die Mimose dar. In diesen Pflanzen führt ein Berührungsreiz zur Auslösung eines charakteristischen Aktionspotentials, welches in der Folge zu einer, auf differentiellen Turgoränderungen basierenden, nastischen Bewegung führt. In allen anderen Pflanzen ist die Kinetik der Membranpotentialänderungen sehr variabel, abhängig vom Stimulus und dem physiologischen Zustand der Zellen und – mit Ausnahme der Reaktion auf einen Kältestimulus – lediglich nach langen Latenzzeiten wiederholbar. Dieser Umstand verhindert eine systematische Analyse der molekularen Basis elektrischer Signale in den meisten Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es daher, auf der Basis des Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welches bereits seit 2005 in der Neurobiologie genutzt wird, ein nicht-invasives Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen zu etablieren. ChR2 ist ein Blaulicht-aktivierter Kationenkanal, der für seine Funktion all trans-Retinal als Cofaktor benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten des ChR2, mit einem Schwerpunkt auf ChR2-C128T und vor allem ChR2-D156C, auch bekannt als ChR2-XXL eingesetzt. ChR2 konnte bereits durch M. Baumann im Rahmen ihrer Dissertation funktionell im transienten Expressionssystem Nicotiana benthamiana dargestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das System weiter ausgebaut und die besonders aussichtsreichen ChR2-Varianten nicht nur in N. benthamiana, sondern auch in stabilen Arabidopsis thaliana Linien funktionell charakterisiert. Dabei konnte mit dem ChR2-XXL ein geeignetes optogenetisches Werkzeug zur Untersuchung elektrischer Signale in Pflanzen identifiziert werden. ChR2-XXL bietet die Möglichkeit das Membranpotential durch kurze, 5 s Blaulichtpulse im Mittel um 95 mV zu depolarisieren und im Anschluss die Repolarisationsphase zu untersuchen. Blaulicht-induzierbare, ChR2-XXL-vermittelte Depolarisationen konnten, reproduzierbar und beliebig oft an den gleichen Zellen wiederholt ausgelöst werden. Dadurch ermöglicht ChR2-XXL die bisher nur unzureichend bekannten molekularen Komponenten der Repolarisation des Membranpotentials in Pflanzen zu erforschen. In tierischen Zellen generieren spannungsabhängige Natriumkanäle die Depolarisation, während spannungsabhängige Kaliumkanäle die Depolarisationskinetik bestimmen. Die im Vergleich zu tierischen Zellen veränderten Ionengradienten lassen vermuten, dass die pflanzliche Depolarisation im Wesentlichen durch Ca2+-abhängige Anionenkanäle vermittelt wird, die durch den Efflux von Cl- das Membranpotential depolarisieren. Für die Repolarisation wird zum einen die Beteiligung von auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen postuliert. Zum anderen wird auch eine Beteiligung der Plasmamembran (PM) H+-ATPasen vermutet, welche gleichzeitig einen essentiellen Beitrag zur Generierung des Ruhepotentials leisten. In der vorliegenden Arbeit wurde es durch den Einsatz von ChR2-XXL möglich, beide potentiellen Komponenten der Repolarisationsphase, Kaliumkanäle und PM H+-ATPasen, erstmals durch eine nicht-invasive, Anionen-unabhängige Methode der Depolarisation zu untersuchen. Durch den Einsatz von Mutanten und Kaliumkanalinhibitoren konnte ein möglicher Beitrag des auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanals Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (AtGORK) an der Repolarisationsphase in Arabidopsis Mesophyllzellen nahezu ausgeschlossen werden. Der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK öffnet erst bei Membranpotentialen positiv vom Gleichgewichtspotential für Kaliumionen (EK (-118 mV)). Da die ChR2-induzierbaren Depolarisationen ebenso wie viele natürliche Stimuli, diesen Wert kaum erreichen oder nur geringfügig überschreiten, leistet der GORK einen geringfügigen Beitrag bei der Repolarisation. Dies ließ vermuten, dass die Repolarisation von EK bis zum Ruhepotential bei ca. -180 mV dagegen möglicherweise durch die PM H+-ATPasen bewerkstelligt wird. Die Wirkung des PM H+-ATPase Inhibitors Natriumorthovanadat, sowie des PM H+-ATPase Aktivators Fusicoccin auf die Repolarisationsphase konnten diese Hypothese unterstützen. Die Hemmung der PM H+-ATPasen verlangsamte die Repolarisationskinetik während eine Aktivierung der PM H+-ATPasen diese beschleunigte. So wurde es erstmals möglich den genauen Einfluss der PM H+-ATPasen auf Wiederherstellung des Membranpotentials während der Repolarisation in Mesophyllzellen zu studieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Kaliumkanalblockers Ba2+ die Repolarisation ebenfalls beschleunigt werden konnte. In Übereinstimmung mit dem ‚Pump-and-Leak‘-Modell (Alberts et al. 2002) deutet dies darauf hin, dass schwach einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle, wie der ARABIDOPSIS K+ TRANSPORTER 2 (AKT2) dem PM H+-ATPasen Protonengradienten entgegenwirken und somit das Ruhepotential aus der Summe der bewegten Ladungen von Pumpen und Kaliumkanälen bestimmt wird. Das mögliche Potenzial optogenetischer, Rhodopsin-basierter Werkzeuge für die molekulare Analyse elektrischer Signale, insbesondere unter Einsatz der breiten Palette lichtgesteuerter Pumpen und Kanäle, ihrer spektralen Diversität und ihrer Einkreuzung in ausgewählte Arabidopsis Mutanten wird diskutiert. N2 - Like animals, plants have the ability to generate electrical signals – membrane potential changes on the plasma membrane. Electrical signals represent the earliest answers that can be observed in plant cells in the course of changing external and internal conditions. Stimuli such as cold, heat, wounding, herbivory and pathogens, as well as physiological processes such as growth and pollination, lead to changes in the potential of the plasma membrane of plant cells. Most of these membrane potential changes consist of rapid depolarization, followed by repolarization of the membrane potential, the kinetics of which can be highly variable depending on the stimulus. In contrast to animals, knowledge about the molecular basis of the generation and transmission of electrical signals in plants is poorly understood. Exceptions include "classically excitable plants" such as the Venus fly trap or mimosa, in which a touch stimulus leads to the triggering of a characteristic action potential, which subsequently leads to an elastic movement based on differential turgor changes. In all other plants, the kinetics of membrane potential changes are highly variable, depending on the stimulus and the physiological state of the cells and – with the exception of the reaction to a cold stimulus – can only be repeated after long latency periods. This prevents a systematic analysis of the molecular basis of electrical signals in most plants. The aim of this work was therefore to establish a non-invasive tool for the functional analysis of electrical signals in plants based on the channelrhodopsin-2 ChR2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, which has been used in neurobiology since 2005. ChR2 is a blue light-activated cation channel that needed all-trans retinal as a cofactor in order to function. In this work, different variants of the ChR2, with a focus on C128T and especially D156C, also known as ChR2-XXL, were used. ChR2 could already be functionally represented by M. Baumann in the context of her dissertation in the transient expression system Nicotiana benthamiana. In the present work, the system was expanded and particularly promising ChR2 variants were characterized not only in N. benthamiana, but also in stable Arabidopsis thaliana lines. The ChR2-XXL identified a suitable optogenetic tool for examining electrical signals in plants. ChR2-XXL offers the possibility to depolarize the membrane potential by short, 5 s blue light pulses on average by 95 mV and then to investigate the repolarization phase. Blue light-inducible, ChR2-XXL-mediated depolarizations could be triggered reproducibly and repeatedly on the same cells as often as desired. ChR2-XXL enables research into the previously inadequate molecular components of the repolarization of the membrane potential in plants. In animal cells, voltage-dependent sodium channels generate depolarization, while voltage-dependent potassium channels determine the depolarization kinetics. The ion gradients changed compared to animal cells suggest that plant depolarization is essentially due to Ca2+-dependent anion channels, which depolarize the membrane potential through the efflux of Cl-. For repolarization, the involvement of outward rectifying potassium channels is postulated. On the other hand, participation of PM H+-ATPases is also suspected, which at the same time make an essential contribution to the generation of the resting potential. In the present work, the use of ChR2-XXL made it possible for the first time to investigate both potential components of the repolarization phase, potassium channels and PM H+-ATPases, using a non-invasive, anion-independent method of depolarization. Through the use of mutants and potassium channel inhibitors, a possible contribution of the outward rectifying potassium channel Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (GORK) to the repolarization phase in Arabidopsis mesophyll cells could almost be excluded. The outward-rectifying potassium channel GORK only opens at membrane potentials more positive than the equilibrium potential for potassium ions (EK (-118 mV)). Since the ChR2-inducible depolarizations, like many natural stimuli, hardly reach this value or only exceed it slightly, GORK makes a minor contribution to repolarization. This suggested that the repolarization from EK to the resting potential at approximately -180 mV, on the other hand, may be accomplished by PM H+-ATPases. The effects of the PM H+-ATPase inhibitor sodium orthovanadate and the PM H+-ATPase activator fusicoccin on the repolarization phase supported this hypothesis. The repolarization kinetics were slowed by inhibition of the PM H+-ATPases and accelerated by their activation. This made it possible for the first time to study the exact influence of the PM H+-ATPases on restoring the membrane potential during repolarization in mesophyll cells. It was also observed that repolarization could be accelerated in the presence of the potassium channel blocker Ba2+. In accordance with the 'pump-and-leak' model, this indicates that weakly inwardly-rectifying potassium channels, such as the Arabidopsis K+ Transporter 2 (AKT2) counteract the PM H+-ATPase-generated proton gradient and thus the resting potential from the sum of the moving charges of pumps and potassium channels is determined. The potential of optogenetic, rhodopsin-based tools for the molecular analysis of electrical signals, in particular using the wide range of light-controlled pumps and channels, their spectral diversity and their intersection with selected Arabidopsis mutants is discussed. KW - pflanzliche Elektrophysiologie KW - Channelrhodopsin-2 KW - elektrische Signale KW - Arabidopsis thaliana KW - Optogenetik Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218671 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Julian T1 - Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie beleuchtet den Oligomerisierungsstatus pflanzlicher Membranproteine T1 - Super-resolution microscopy elucidates the stoichiometry of plant membrane proteins N2 - SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt. Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden. Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert. In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann. Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert. Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert. Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind. Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu. N2 - Anion channels of the slow anion channel family (SLAC/SLAH) are general master switches of plant stress responses. In addition a subgroup of channels load the vascular tissue in roots with nitrate and chloride. The activity of the main nitrate and chloride loading anion channel, SLAH3, is controlled by heteromerization with the electro-physiologically silent subunits SLAH1 and SLAH4 or alternatively by cytosolic acidification. Although the crystal structure of a bacterial homologue (HiTehA) of plant SLAC/SLAH anion channels is already known and suggests a trimeric structure, the stoichiometry and the multimerization level of the plant anion channel counterparts are still undiscovered. Fluorescence microscopy encompasses numerous well-established application methods like confocal laser scanning microscopy (CLSM), high resolution techniques like structured illumination microscopy (SIM) and super resolution microscopy represented by single molecule localization microscopy (e.g. dSTORM and PALM) or recently upcoming methods like expansion microscopy (ExM). These different application methods open new fields of insight into the biological organization of proteins, even down to the molecular level. In comparison to faunal studies, very little floral enquiries have been conducted, especially in the super resolution-sector. Single-molecule localization microscopy enables individual molecules to be quantified in the native environment and therefore allows conclusions regarding protein stoichiometry. As protein stoichiometry often involves cellular function of the corresponding protein, we used PALM applications and single molecule counting strategies to analyze the stoichiometric distribution of anion channel complexes. Moreover, in this study, expression patterns of the SLAC/SLAH proteins were investigated and different microscopic applications on plant specific issues could be improved and established. Referring to microscopic applications, we confirmed the polar orientation of PIN proteins via SIM and succeeded in resolving the clustered distribution in the plasma membrane at the cellular pole. Besides we were also able to measure cellwall dimensions of root cross sections from Arabidopsis thaliana seedlings and therefore succeeded in concluding the root architecture, designating the various cell types within the root, comparing them with cellwall thickness and evaluating resolution limits of the SIM microscope. Due to these reasons, this specimen can be recommended as a model structure for resolution analyses, control measurements regarding tissue-intactness after image processing for super-resolution images, or further questions. We turned out to establish two different protocols for ExM-studies in plants. One is based on enzymatic digestion and the other one on denaturation. We were able to label, expand and image whole At-seedlings, root- and leaf segments and thereby improved the resolution 2 3 fold. In this regard we managed to comprehensively depict the intact structure of leaves and roots with impressive penetration depth and extremely low background. We also examined our data and identified tissue-specific changes, discuss problems and possible limits of ExM in plants. The major part of this work was the investigation of SLAC/SLAH proteins. The expression of SLAH2 in roots is mainly located in endodermal and pericycle cells which was observed in various At-SLAH2-YFP mutants. Thus, strengthening the hypothesis, that SLAH2 has a major role in loading the vascular tissue with nitrate. The heterogeneous expression levels of SLAH2 in the meristematic-, elongation- and differentiation zone and moreover the upregulation in areas of lateral root formation also suggests that SLAH2 has an effect on plant growth by regulating nitrate levels. SLAH4 is located in the plasma membrane and FRET FLIM measurements showed a high affinity to SLAH3, validating the two homologues as interaction partners. For PALM-stoichiometry analyses, the plant anion channels were expressed in mammalian COS7-cells, in order to avoid endogenous falsification of the stoichiometries, as well as impractical reasons of PALM imaging in plant tissue. Hence, checking the electrophysiological functionality of mEOS2-SLAC/SLAH constructs via patch-clamp measurements. dSTORM-measurements were used to verify expression levels, correct membrane-association and the distribution of the SLAC/SLAHs in COS7 cells. We determined the multimerization level of SLAC/SLAHs upon cytosolic acidification and monitor stoichiometric changes upon heteromerization of SLAH3 with SLAH1 and SLAH4. On the basis of our data the following valuable new insights into the regulation mechanisms of plant anion channels were revealed: under control conditions, SLAC1, SLAH2 and SLAH3 are mainly depicted as dimers. Upon cytosolic acidification with NaOAc the stoichiometries of SLAC1 and SLAH2 remained unchanged, whereas the amount of dimeric SLAH3 is significantly reduced and shifts to a mainly monomeric distribution. It could also be assessed that SLAH3 interacts with SLAH1 or SLAH4, thereby forming a heterodimer, which is barely separable by acidification. In contrast, for SLAH1 and SLAH4 no affinity was observed. Moreover, the stoichiometries of different SLAH3-mutants indicated a crucial role of the amino acids histidin His330 and His454 in the pH-sensitive regulation of SLAH3. Hence, super-resolution micrsocopy, especially PALM allows the quantification of polymerization- and heteromerization-levels of proteins like the SLAC/SLAH anion-channels on the molecular level and therefore enabling physiological conclusions. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Membranproteine KW - Oligomerisation KW - Superresolution microscopy KW - SLAC/SLAH KW - PALM stoichiometry Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211762 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Nadine T1 - Eine vergleichende biophysikalische Analyse von Hitze- und Trockentoleranzstrategien der Wüstenpflanze Phoenix dactylifera und Nutzpflanzen der gemäßigten Klimazonen T1 - A comparative biophysical analysis of heat and drought tolerance strategies of the desert plant Phoenix dactylifera and crops of temperate climates N2 - Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht. Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht. Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat. Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren. Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen. Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein. N2 - Low water availability and heat stress present major barriers to achievíng high biomass and full yield potential in crops. Global climate change is accompanied by a subtle increase in the severity of these abiotic stresses. Thus, the adaptation of crop species to the changing climate is required in order to sustain agricultural productivity in the future. Currently, our knowledge of plant strategies for abiotic stress tolerance as well as genomic and transcriptional information is limited to a few model angiosperms, providing a starting point for the understanding of responses to drought and/or heat stress, within and across species. In the framework of my PhD thesis, we followed a different strategy to learn about abiotic stress tolerance: we studied the survival strategy of the extremophilic desert plant Phoenix dactylifera (date palm) in comparison to the crop Hordeum vulgare (barley) and the model plant Arabidopsis thaliana, both from temperate zones. Date palms grow and produce fruits even under extreme drought and heat conditions in the deserts of the Arabian Peninsula. Neither the molecular biology and physiology of guard cells nor the heat protection of transport protein mediated sugar and ion transport processes have been studied so far in this non-succulent desert plant, Phoenix dactylifera. To understand the stomatal response to the water stress phytohormone ABA (abscisic acid), we cloned the major components for guard cell fast abscisic acid signaling and analysed the anion channel opening mechanism of the date palm side by side with barley and Arabidopsis in Xenopus oocytes. Both monocot plant species (barley and date palm) possess stomatal complexes consisting of guard cells and subsidiary cells. This distinguishes monocot species from dicots, which usually exhibit stomatal complexes formed by a pair of guard cells only. Interestingly, date palm and barley stomata closed in response to the drought stress hormone ABA only in the presence of extracellular nitrate. Heterologously expressed Phoenix SLAC1-type anion channel PdSLAC1 is activated by the ABA kinase PdOST1 and this activation is inhibited by the coexpression of PP2C phosphatase ABI1 – thus like its counterparts from barley and Arabidopsis, PdSLAC1 is controlled by an ABA-dependent phosphorylation/dephosphorylation network. However, PdOST1 did activate the desert plant anion channel PdSLAC1 only in the presence of extracellular nitrate – an electrical property that PdSLAC1 shares with the barley SLAC1 but distinguishes both monocot SLAC1 channels from AtSLAC1. Given that, in the presence of nitrate, ABA enhanced and accelerated stomatal closure, our findings indicate that the guard cell osmotic motor driving stomatal closure in date palm and barley uses nitrate as the signal to open the major anion channel SLAC1. This initiates guard cell depolarization and finally stomatal closure to prevent plant wilting under drought stress conditions. To understand the monocot-specific SLAC1 nitrate dependency, we performed a 3D-model- based site-directed mutagenesis study including chimeric channels between monocot and dicot SLAC1 anion channels. Our structure-function research identified two residues on transmembrane domain 3 (TMD3) that play an essential role in nitrate-dependent gating of monocot SLAC1-type anion channels. Phylogenetic analysis finally revealed that during evolution the monocot specific nitrate-dependent gating was established after the split between monocots and dicots. Thus, the success of monocot species may in part rely on the integration of drought signals (ABA) and the nitrogen nutrition status of the plant via nitrate-sensitive gating of SLAC1 anion channels. Since the Arabidopsis ABA-signaling pathway has been extensively studied, the discovery of the monocot-specific nitrate dependent motif on TMD3 could now serve as a set screw to improve the breeding programs of dicot agricultural crops. Desert plants not only suffer from drought but also from extreme heat stress. We could show that heat-stressed date palms produce and emit high amounts of the volatile hydrocarbon compound isoprene (2-Methyl-1,3-Butadien). The temporary release of isoprene allows the plant to perform photosynthesis even under extreme temperatures. However, it is not known whether and how isoprene also protects transport processes across biological membranes in periods of heat. To study the influence of isoprene on transmembrane transport, we identified and cloned the date palm proton-coupled sucrose transporter 1 (PdSUT1) and compared its electrical properties with ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. Interestingly, the electrical behavior, the kinetic properties and the temperature dependence of both carriers were similar. However, the response to isoprene application massively altered the affinity of ZmSUT1 to its substrate sucrose while the affinity of the date palm transporter was only weakly affected. The intercalation of isoprene with the fatty acid chains of biological membranes is believed to decrease the membrane fluidity under heat stress. This and the insensitivity of PdSUT1 towards isoprene may indicate that the desert plant sucrose transporter PdSUT1 transports sucrose with high affinity even at high temperatures. Future studies must now clarify whether the volatile hydrocarbon isoprene has a direct influence on the carrier itself or isoprene integrates into the membrane and thus indirectly influences the properties of transport proteins. Regardless of the mode of action of isoprene, it remains to be noted that PdSUT1 is less sensitive to isoprene than its orthologue from maize. This may be an adaptation of the sucrose carrier to the extreme heat periods and the accompanying isoprene emission from date palms. KW - Dattelpalme KW - Gerste KW - Elektrophysiologie KW - Hitzestress KW - Schließzelle KW - Anionenkanal KW - Zuckertransporter KW - SLAC1 KW - SUT1 KW - Signaltransduktion KW - ZmSUT1 KW - Phoenix dactylifera KW - Hordeum vulgare KW - Zea mays Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186491 ER -