TY  - THES
A1  - Bahlo, Angela
T1  - Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen und Untersuchungen zur Prionen-induzierten Neurodegeneration
T1  - Immunization strategies to prevent prion diseases and mechanisms of prion-induced neurodegeneration
N2  - Prionenerkrankungen oder Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind übertragbare Krankheiten, zu denen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, Scrapie bei Schafen und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern gehören. Der infektiöse Erreger (PrPSc) besteht dabei aus einer abnormalen Form des zellulären Prion-Proteins (PrPC) und unterscheidet sich von dieser nur in der Proteinstruktur. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung von aktiven Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen besteht in der fehlenden Reaktion des Immunsystems auf das ubiquitär exprimierte Selbst-Antigen PrPC, welche auf einer Immuntoleranz gegen das körpereigene Protein beruht. In dieser Arbeit wurde ein transgenes Mausmodell für aktive Immunisierungsexperimente verwendet. Diese transgenen Tiere exprimieren Hamster-PrPC (HaPrP) unter der Kontrolle des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors (NSE) ausschließlich im Nervensystem auf einem Prnpo/o-Hintergrund. Durch die Verwendung eines „artfremden“ Proteins (rekombinantes Maus-PrP) gegen endogenes Hamster-PrP als Vakzine sollte die Immunogenität des Proteins verstärkt werden. Zusätzlich wurde für die Immunisierungen ein Fusionsprotein aus Maus-PrP und einem T-Helferepitop des Tetanustoxins (P30) eingesetzt. Als Adjuvanz diente das bakterielle DNA-Motiv CpG-1826, welches die Fähigkeit besitzt T-und B-Lymphozyten direkt zu stimulieren und die Sekretion von Interleukinen zu induzieren. Die Immunisierungen erfolgten subkutan und wurden monatlich durchgeführt. Nach jedem Boost wurden die Blutseren auf Antikörper sowohl gegen Maus-PrP als auch gegen Hamster-PrP untersucht. Neben der Analyse der humoralen Immunantwort mittels ELISA, Westernblot und FACS, wurden die Seren der immunisierten Mäuse auf ihre Fähigkeit getestet, die Prionenreplikation in vitro zu inhibieren. Mit der gewählten Immunisierungsstrategie war es mit beiden Proteinen möglich, hohe Antikörperantworten sowohl gegen Maus- als auch gegen Hamster-Prion-Protein zu induzieren. In Zellkultur waren die Seren in der Lage, signifikant den PrPSc-Gehalt zu reduzieren. Die immunisierten Mäuse wurden mit Hamsterprionen infiziert, um den Einfluss der induzierten Antikörper auf den Verlauf der Krankheit zu untersuchen. Nach Immunisierung mit PrP-P30 zeigten die Mäuse gegenüber mit Ovalbumin-behandelten Kontrolltiere eine signifikant verlängerte Inkubationszeit von ca. 30%. Im Gegensatz dazu konnte nach Immunisierung mit PrP ohne das zusätzliche T-Helferepitop keine Verlängerung in den Inkubationszeiten beobachtet werden. Abschließend wurde die Immunantwort in den immunisierten Tieren auf zellulärer Ebene mittels Proliferationsanalyse von T-und B-Lymphozyten untersucht. Dafür wurden Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten der immunisierten NSEHa-Prnpo/o_Mäusen isoliert, ex vivo mit Maus-PrP bzw. Hamster-PrP stimuliert und auf die Proliferation von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Lymphozyten untersucht. Durch die Analyse wurde gezeigt, dass es nach Immunisierung mit rek.PrP oder PrP-P30 zu keiner spezifischen Proliferation von T-Lymphozyten kam. Die beobachtete humorale Immunantwort scheint also unabhängig von einer spezifischen T-Zell-Immunantwort zu wirken. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, durch die Wahl von geeigneten Immunisierungsstrategien, die Toleranz gegen das Selbstprotein PrP zu brechen. Sie stellen eine Grundlage für weitere Forschungsansätze dar, um prophylaktische Immunisierungen gegen Prionenerkrankungen in Zukunft zu realisieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Funktion der apoptotischen Faktoren BAX und BCL-2 in der Prionen-induzierten Neurodegeneration in vivo untersucht. Dazu wurde neuroektodermales Gewebe aus BAX-/- und BCL-2-/- -Embryonen in das Gehirn von PrP-Knockout-Mäusen (Prnpo/o) transplantiert. Diese PrPC-defizienten Tiere sind nicht mit Prionen infizierbar und können PrPSc nicht propagieren. Nach Langzeitinfektion mit Mausprionen wurden die Transplantate histochemisch auf Prionenpathologie untersucht. Die typischen neuropathologischen Veränderungen waren dabei strikt auf das PrPC-positive Transplantat begrenzt. Zusätzlich wurden die Transplantate auf apoptotische Veränderungen untersucht und dabei TUNEL-Färbungen und aktivierte-Caspase-3 Färbungen durchgeführt. Es zeigten sich hierbei hinsichtlich Ausprägung und Stärke der Pathologie keine Unterschiede zwischen den BAX-bzw. BCL-2-Knockout Transplantaten und wildtypischen Transplantaten. Daraus konnte gefolgert werden, dass in diesem Modell weder BAX noch BCL-2 eine signifikante Rolle bei der Prionenpathogenese spielen. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag für das bessere Verständnis der durch Prionen-induzierten Neurodegeneration und sind für die Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien hilfreich.
N2  - Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are a group of fatal neurodegenerative disorders that affect animals as well as humans (Prusiner, 1997). The most prominent are Creutzfeldt-Jacob disease (CJD) in humans, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle, scrapie in sheep and goats and chronic wasting disease (CWD) in cervids. These diseases are characterized by the conversion of the cellular prion protein (PrPC) into the abnormally folded isoform termed PrPSc, which accumulates and represents the major component of infectious prions (Aguzzi and Polymenidou, 2004). The development of an effective PrP vaccine has been hampered by immunotolerance to the ubiquitously expressed endogenous PrPC and the immunization with recombinant PrP led only to weak antibody-responses against the protein in wildtype mice. Here, we tried to circumvent this problem experimentally by generation of anti-PrP immunity in hamster transgenic mice. These mice (NSEHa-Prnpo/o) express Hamster-PrP under the control of the neuron-specific enolase Promotor (NSE) exclusively in the nervous system on a Prnpo/o background (Race et al., 1995). To further enhance the immunogenic feature of the mouse Prion-Protein, we fused a T-Helper epitope of the tetanus toxin (P30) to the C-terminal end of the protein (Panina-Bordignon et al., 1989). This epitope has been successfully in the development of several anti-tumour vaccines (Hertz et al., 2001; Steinaa et al., 2008). For the immunization the recombinant mouse Prion-Protein (PrP) as well as the fusion construct, called PrP-P30, was used. The bacterial DNA-Motif CpG-1826 was co-injected as an adjuvant, known as a direct stimulator of T-and B-cells and to have the ability to induce the secretion of interleukins (Krieg, 2002). The immunization was performed monthly and the sera were analysed after every boost for the presence of antibodies against Mouse- and Hamster-PrP. Beside the analysis of the humoral response via ELISA, Westernblot and FACS, the sera of the immunized mice were tested for their ability to inhibit prion replication in vitro. With the selected immunization strategy it was possible to induce a high antibody response both against Mouse-PrP as well as against Hamster-PrP. In the cell culture assay with prion-infected cells a significant decrease of the PrPSc level was observed. Furthermore the immunized animals were inoculated with Hamster prions to assess the efficiency of the induced antibodies to prolong the incubation time of the disease. With the introduction of the T-Helper epitope P30 it was possible to prolong the survival time of the treated animals about 30%, in comparison to the animals receiving only PrP without P30 or control animals, which were treated with Ovalbumin, respectively. A second group of transgenic mice was immunized to investigate the cellular immune response by proliferation assays. Towards this, lymphocytes of spleen and lymph nodes of the immunized animals were isolated and stimulated ex vivo with either mouse- or hamster-PrP. This analysis showed that the induced humoral immune response was independent of T-cells, because no specific proliferation of neither CD4- nor CD8-positive T-cells could be observed. In conclusion, the results clearly demonstrate that the possibility to break the self-tolerance against PrP by using appropriate vaccination strategies. It therefore might open a new avenue for the future development of prophylactic prion vaccines. In a second part of the work, the role of BAX and BCL-2 in prion-mediated neurodegeneration was characterized in vivo. BAX- and BCL-2- deficient neuroectodermal tissue was transplanted into the brain of Prnpo/o recipient mice. Mice devoid of PrPC (Prnpo/o) are resistant to prions and do not propagate the infectious agent (Bueler et al., 1993). After long-term infection with mouse scrapie prions, typical histopathological features of the disease, such as gliosis, spongiosis and PrPSc accumulation were examined with histochemical techniques in the engrafted brains and the pathological changes were restricted to the PrPC-expressing neurografts. Furthermore we perform TUNEL and active-Caspase 3 stainings for determination and detection of apoptotic changes in the neurografts. Regarding the strength and characteristics of prion pathology no differences were seen between BAX- and BCL-2-Knockout grafts in comparison to the wildtype tissue. In summary, these results demonstrate that neither BAX nor BCL-2, two major players of apoptosis, are necessary for prion-induced neurodegeneration. These results therefore contribute to a better understanding of the pathogenic mechanisms in prion diseases and are useful for the development of future therapeutical strategies.
KW  - Impfung
KW  - Apoptosis
KW  - Immuntoleranz
KW  - Prionen
KW  - Immunisierung
KW  - Neurografts
KW  - prions
KW  - immunization
KW  - tolerance
KW  - neurografts
KW  - apoptosis
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28443
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TY  - THES
A1  - Hoffmann, Tanja
T1  - Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen das Prion-Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation in Zellkultur
T1  - Generation and characterization of anti-PrP antibodies with inhibitory effect on prion replication in cell culture
N2  - Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten Isoform des zellulären Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infektiöse Isoform, die PrPSc genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc übernimmt. Die Konversion des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale von Prionenerkrankungen und bieten mögliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass Antikörper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen können und so die PrPSc-Akkumulation inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Generation neuer Anti-PrP-Antikörper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen können und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antikörpern für therapeutische und diagnostische Zwecke zu erweitern. Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antikörper mittels „Hybridom“-Technik hergestellt. Zwei der Antikörper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-Mäusen, die zuvor mit fibrillärem PrP immunisiert wurden. Bei fünf Antikörpern (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde für die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet. Alle Antikörper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc. Die bestimmten Aviditäten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante) waren mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar. Das Epitop des Antikörpers B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), während die Antikörper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globulären C-Terminus binden (Reste 158-176). Das Epitop der Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus bestimmt (Reste 142-157). Diese Antikörper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-152), einem Epitop, das bereits häufiger für inhibitorisch wirksame Antikörper bestimmt wurde. Drei der sieben Anti-PrP-Antikörper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antikörper 48-11-5 führte zu einer unvollständigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die Verlängerung des Applikationszeitraums nicht verstärken ließ. Dagegen inhibierten die Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollständig. Dieser Effekt wurde auf eine spezifische Interaktion der Antikörper mit PrP zurückgeführt, da ein zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch hätte verringern können, nicht beobachtet wurde. Bei der Analyse der Infektiosität von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antikörper 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosität der Zellen nicht reduzieren konnte. Die Behandlung mit dem Antikörper 103-8 reduzierte die Infektiosität der ScN2a-Zellen zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antikörper B2-43-133 die Infektiosität der ScN2a-Zellen vollständig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antikörper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke inhibitorische Wirkung dieses Antikörpers wird zusätzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert (0,31 nM) unterstützt, der mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar ist. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antikörpern der Antikörper B2-43-133 ein Kandidat für weiterführende Experimente mit therapeutischem Hintergrund ist. Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antikörper für die Inhibition nutzen, konnte nicht geklärt werden. Obwohl der Antikörper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfläche (Retention) verlängerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Moleküle der PrPSc-Konversion entzogen werden können, wurde dies für einen Referenzantikörper, welcher einen ähnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder dafür, dass die Verlängerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antikörper ist und ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder dafür, dass verschiedene Antikörper verschiedene Mechanismen nutzen können. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des Antikörpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht bestätigt werden, da eine stabile Komplexbildung des Antikörpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer Erhöhung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antikörper führte.
N2  - The development of prion diseases is characterized by accumulation of an abnormal folded isoform of the cellular prion protein (PrPC). This infectious isoform, called PrPSc, emerges through interaction with PrPC adopting the conformation of PrPSc. Thus, conversion of PrPC to its pathogenic isoform and the resulting PrPSc accumulation are substantial hallmarks of prion diseases that provide possible therapeutical intervention points. Recent studies have shown that antibodies recognizing PrPC and/or PrPSc interfere with the conversion process in vitro and in vivo and inhibit PrPSc accumulation (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). This study was initiated to generate new anti-PrP antibodies that could efficiently inhibit the PrPSc conversion and thereby extend the repertoire of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic and diagnostic use. Altogether, seven antibodies could be established by hybridoma-technique: two mAbs from immunisation of Prnp0/0 mice with fibrillar PrP (B2-31-166 and B2-43-133) and the remainder (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) by using recombinant PrP as immunogen. All antibodies were able to detect recombinant PrP as well as native and denaturated PrPC and PrPSc. The avidities and similar dissociation constants were comparable to commercial reference antibodies. The epitope of mAb B2-31-166 was determined in the unstructured N-terminal domain (residues 96-110), whereas mAbs 7-12-5, 12-29 and 48-115 detected an epitope in the C-terminal globular domain (residues 158-176). The epitopes of mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 are located in the C-terminus (residues 142-157) as well and correspond to the -helix 1 of PrPC (residues 144-152). This region was already determined as a potential epitope for other inhibitory effective antibodies. Three antibodies (7-12-5, 12-29 and B2-31-166) did not inhibit PrPSc accumulation in prion-infected cells (ScN2a cells). MAb 48-11-5 only led to an incomplete reduction of the PrPSc content. This effect could not be strengthened through extending the treatment period. In contrast, mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 were able to completely inhibit the PrPSc accumulation in ScN2a cells. This effect was attributed to a specific interaction between antibodies and PrP as no cytotoxic effect was detectable that could lead to an unspecific reduction of the PrPSc content. Interestingly, analysis of the infectivity of antibody-treated ScN2a cells showed that mAb 110-10 was indeed able to inhibit PrPSc accumulation, although it did not affect the infectivity of ScN2a cells. MAb 103-8 reduced the infectivity level, but new PrPSc accumulation could be detected in ScN2a cells 30 days after the treatment had been finished. Only treatment with mAb B2-43-133 completely eliminated the infectivity of ScN2a cells and no PrPSc could be detected in ScN2a cells even 36 days after treatment. The strong inhibitory effect of this antibody is supported by a very low IC50 value (0,31 nM) which is also comparable with commercial anti-PrP antibodies. In summary, these results indicate that anti-PrP antibody B2-43-133 represents a good candidate for future immunotherapeutic approaches. Furthermore, it was impossible to clearly identify the underlying mechanisms of the antibodies for the inhibition of PrPSc accumulation. Although mAb B2-43-133 prolonged the retention of PrPC on the cell surface, whereby the bound PrPC molecules could hypothetical withdraw the PrPSc conversion, this could not be observed for commercial antibodies with similar inhibitory effect. These data imply that the prolongation of the PrP retention is only one feature of mAb B2-43-133. However, it is possible that different antibodies use different mechanisms to inhibit PrPSc conversion and that the retention is one of them. In addition, the inhibition of PrPSc accumulation is probably not mediated by the formation of an antibody-protein complex since the treatment of ScN2a cells with a stable complex consisting of B2-43-133 and recombinant PrP complex decreased the inhibitory effect compared to free antibody.
KW  - Monoklonaler Antikörper
KW  - Prionprotein
KW  - ScN2a Zellen
KW  - Immunisierung
KW  - Scrapie
KW  - Behandlung
KW  - monoclonal antibodies
KW  - prion protein
KW  - scrapie
KW  - treatment
KW  - ScN2a cells
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33998
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TY  - THES
A1  - Meyr, Marcus
T1  - Untersuchung rekombinanter Vakziniaviren MVA auf Eignung als Vektorimpfstoff gegen Infektionen mit dem Hepatitis-C-Virus
T1  - Evaluation of recombinant vaccinia virus MVA as an experimental vaccine against infections with the hepatitis c virus
N2  - Die Infektion mit dem Hepatitis C Virus (HCV) gilt als eine der Hauptursachen für chronische Hepatitiden und führt häufig zu Leberzirrhose und Leberkarzinom. Weltweit sind etwa 200 Millionen Menschen mit diesem Virus infiziert. Die aktuelle Behandlung der Hepatitis C mit Ribavirin und Interferon-alpha ist langwierig, beeinträchtigt durch Nebenwirkungen und führt nur bei einem Teil der Patienten zur Heilung. Aus diesem Grund ist die Entwicklung eines präventiv oder therapeutisch einsetzbaren Impfstoffes gegen HCV-Infektionen sehr wünschenswert. Das hoch attenuierte und in seiner Vermehrungsfähigkeit extrem eingeschränkte modifizierte Vakziniavirus Ankara (MVA) gehört zu den viel versprechendsten Kandidaten für die Entwicklung neuartiger rekombinanter Virusimpfstoffe. Im Rahmen dieser Arbeit sollten erste rekombinante MVA-HCV-Viren auf ihre Eignung als Impfstoffe untersucht werden. Als Zielantigene dienten wichtige virale Strukturproteine, darunter das unter den HCV-Genotypen hoch konservierte Nukleokapsidprotein Core, sowie das Nichtstrukturprotein NS3, welches als regulatorisches Virusprotein im HCV-Replikationszyklus eine wichtige Rolle spielt, untersucht werden. Hierfür wurden die rekombinanten MVA-Viren MVA-P7.5-HCV core (MVA-core) und MVA P7.5-HCV-1-830 (MVA-1-830) eingesetzt, welche für die HCV-Strukturproteine codierende Gensequenzen unter der Kontrolle des Vakziniavirus-spezifischen Promotors P7.5 exprimieren. Zusätzlich wurde ein weiteres rekombinantes Virus MVA-P7.5-HCV-NS3 (MVA-NS3) konstruiert, welches die Gensequenz für das HCV-Nichtstrukturprotein NS3 trägt. Alle Vektorviren erwiesen sich in in vitro Experimenten als genetisch stabil, erlaubten die Produktion der rekombinanten HCV-Antigene in infizierten Zielzellen und waren somit geeignet für in vivo Untersuchungen im Mausmodell. Da HCV-spezifischen CD8+-T-Zellantworten eine wichtige Rolle bei der Ausheilung einer Hepatitis C zugeschrieben wird, sollte insbesondere die Anregung dieser Immunantworten untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass bereits eine einmalige Immunisierung mit MVA-core, MVA-1-830 oder MVA-NS3 ausreichend ist, um HCV-spezifische CD8+-T-Zellantworten zu induzieren. Diese CD8+-T-Lymphozyten konnten ex vivo in Epitop-spezifischer Weise zur Interferon-gamma-Synthese stimuliert werden, ließen sich Antigen-spezifisch in vitro expandieren und waren in der Lage, HCV-spezifische Zielzellen zu erkennen und zu lysieren. Zudem konnte eine Steigerung der Immunantworten durch Mehrfachapplikation der MVA-Vakzinen erzielt werden. Im Folgenden gelang es, die HCV-spezifischen CD8+-T-Zellantworten durch kombinierte Applikation der MVA-Vakzinen mit anderen rekombinanten Virusimpfstoffen wie Semliki-Forest-Viren oder Adenoviren, sowie mit Plasmid-DNA weiter zu verstärken. Solche Impfstrategien sind viel versprechend, da sich die gemeinsame Komponente der eingesetzten, unterschiedlichen Vektorvakzinen auf die rekombinanten Antigene beschränkt und eine starke Immunreaktion auf diese Antigene angeregt wird. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass rekombinante MVA-Vektoren, die HCV-spezifische Antigene produzieren, dafür geeignet sind, um nach Impfapplikation HCV-spezifische zelluläre Immunantworten zu induzieren. Die im Tiermodell erarbeiteten, optimierten Immunisierungsstrategien liefern eine erste Grundlage für weitere Immunisierungsexperimente in Primatenmodellen und zur Planung erster klinischer Studien im Menschen.
N2  - Infections with hepatitis C virus (HCV) are considered as one of the main causes for chronic hepatitis and often lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. About 200 million people worldwide are chronically infected with this virus. The current antiviral therapy relying on ribavirin and interferon-alpha is time consuming, often impaired by side effects and leads to resolution of the disease in only a part of the patients. For this reason, the development of a prophylactic or therapeutic vaccine against HCV infections is very desirable. The highly attenuated and replication deficient modified vaccinia virus Ankara (MVA) is one of the most promising candidates for development of new generation virus vaccines. Purpose of this work was to evaluate first recombinant MVA HCV viruses for their suitability as vaccines against hepatitis C. HCV structural proteins, amongst them the highly conserved core protein, as well as the non-structural protein NS3, which plays a key regulatory role in the HCV replication cycle, served as target antigens for MVA vaccine development. First, we investigated recombinant MVA viruses MVA-P7.5-HCV-core (MVA-core) and MVA-P7.5-HCV-1-830 (MVA-1-830), which express the coding gene sequences for HCV structural proteins under control of the vaccinia virus specific promoter P7.5. Second, we constructed and characterized a recombinant virus MVA-P7.5-HCV-NS3 (MVA-NS3) that carries the gene sequence for the HCV non-structural protein NS3. As demonstrated by in vitro experiments, all vector viruses were genetically stable, permitted the production of recombinant HCV antigens in infected target cells and were thus suitable for in vivo experiments using mouse models. Since HCV specific CD8+ T cell responses are considered important in hepatitis C virus clearance, special emphasis was given to the analysis of induction of this kind of immune response. When tested in first vaccination experiments, already a single immunization with MVA-core, MVA-1-830 or MVA-NS3 was sufficient to induce HCV specific CD8+ T cell responses. These CD8+ T lymphocytes could be stimulated ex vivo in an epitope specific manner, resulting in interferon-gamma production, could be further expanded in vitro and were able to recognize and lyse HCV specific target cells. Additionally, multiple applications of the MVA vaccines resulted in an increase of these cellular immune responses. In a final series of experiments, the possibility to further amplify HCV specific CD8+ T cell responses could be demonstrated by using combined applications of MVA with other experimental gene transfer vaccines based on Semliki Forest virus, adenovirus or plasmid DNA. Overall, the results of this work clearly suggest that recombinant MVA vectors delivering HCV specific antigens, are suitable candidate vaccines for induction of HCV specific cellular immune responses upon immunization. Importantly, the definition of optimized immunization strategies offers a rational basis for further immunization studies in primate models and for the conception of first clinical studies in humans.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Impfung
KW  - Hepatitis-C-Virus
KW  - Hepatitis
KW  - Vakzinia
KW  - MVA
KW  - Immunisierung
KW  - Impfung
KW  - hepatitis
KW  - vaccinia
KW  - mva
KW  - immunisation
KW  - vaccination
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11388
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TY  - THES
A1  - Nitschke, Cindy
T1  - Humorale und zelluläre Immunantwort gegen das Prion-Protein
T1  - Humoral and cellular immune response against prion protein
N2  - Das Prion-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Entwicklung einer Therapie für Prionenerkrankungen eine Induktion von Autoantikörpern gegen das Prion-Protein voraussetzt. In dieser Arbeit wurden aktive Immunisierungsstrategien gegen das zelluläre Prion-Protein beschrieben und die zellulären und humoralen Immunantworten sowie deren Einfluss auf die Entstehung einer Prionenerkrankung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Immunisierung mit rek. mPrP und Adjuvants eine Aktivierung und Proliferation von PrP-spezifischen T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen induziert wurde. Desweiteren konnten in PrP-defizienten Mäusen spezifische Antikörper gegen das Prion-Protein nachgewiesen werden, die in der Lage waren, die pathogene Form des PrPs (PrPSc) zu detektieren und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die Immunisierung mit rek. mPrP und CpG-1826 konnten in CD4+-T-Zellen erhöhte Zytokinspiegel von TNF und IFN induziert werden. Im Gegensatz dazu konnte keine T-Zell-Antwort und nur geringe Antikörperkonzentrationen nach Proteinimmunisierung in Wildtypmäusen nachgewiesen werden. Die induzierten Antikörper in Wildtypmäusen waren nicht in der Lage den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. In einem zweiten Ansatz wurde die Immunisierung mit zwei unterschiedlichen PrP-exprimierenden DNA-Vektoren durchgeführt. Hierfür wurden der pCG-PrP-Vektor, der das Maus-PrP exprimiert, und der pCG-PrP-P30-Vektor, der zusätzlich zum PrP für das P30-Th-Epitop des Tetanustoxins kodiert, verwendet. Dieses P30-Epitop wurde schon in früheren Arbeiten genutzt, um die Toleranz gegen körpereigene Proteine zu brechen. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die DNA-Immunisierung eine PrP-spezifische Antikörperantwort in Prnp0/0-Mäusen induziert werden konnte. In Wildtypmäusen wurden allerdings nur geringe Antikörpertiter nachgewiesen. Die Antikörper aus den Prnp0/0-Mäusen waren in der Lage PrPSc zu erkennen, und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die DNA-Immunisierung wurde eine PrP-spezifische Aktivierung und Proliferation von T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen erreicht, die nach Immunisierung mit pCG-PrP-P30 stärker war als nach Immunisierung mit pCG-PrP. Nach DNA-Vakzinierung konnte in Wildtypmäusen eine unspezifische Erhöhung der Zytokinantwort mit erhöhten TNF- und IFN-Spiegeln nachgewiesen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Kombination aus DNA- und Proteinimmunisierung durchgeführt, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die nach DNA-Immunisierung allein erreicht wurden. Die Inokulation der immunisierten Wildtypmäuse mit einem Maus-adaptierten Scrapiestamm (RML) zeigte keinen Schutz dieser Tiere vor einer Prionenerkrankung. Alle Mäuse aus der immunisierten und nicht immunisierten Gruppe erkrankten im gleichen Zeitraum an Scrapie, zeigten PrPSc Akkumulation im Gehirn und in der Milz und für Prionenerkrankungen typische histopathologische Veränderungen. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Immunisierungsstrategien entwickelt werden, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen und einen Schutz vor Prionenerkrankungen zu induzieren.
N2  - The prion protein (PrPC) plays a pivotal role in transmissible spongiform encephalopathies (TSE). Recent studies have shown that strategies aimed to elicit antibodies against PrP should be considered as a promising therapeutic approach for prion diseases. In this study active immunisation strategies against PrPC were described, humoral and cellular immune responses as well as the influence of the onset of the prion disease were analyzed. Here we demonstrate that immunisation with recombinant murine prion-protein (mPrP) results in activation and proliferation of PrP-specific T cells and induction of PrP-specific antibodies in PrP-deficient mice (Prnp0/0). These antibodies are able to detect and reduce PrPSc levels in cell culture. Immunisation with rek. mPrP and CpG-1826 results in increased levels of TNF and IFNin Prnp0/0 mice. In contrast no T cell response and only low antibody titers against PrP were found in individual wild-type mice. The low level of antibodies in wildtype mice were not able to reduce the PrPSc level in cell culture. In a second approach, we investigated a new immunisation strategy against PrPC with two vaccine DNA vectors (pCG-PrP and pCG-PrP-P30). The pCG-PrP vector system contains murine PrP sequence, whereas the pCG-PrP-P30 vector also contains an immune stimulatory peptide of the tetanus toxin, which has been shown to break tolerance against self proteins. Results indicate that this improved vaccine evokes a sustained antibody response in Prnp0/0 mice, but only low antibody titers were found in wild-type mice. The antibodies from Prnp0/0 mice were able to detect PrPSc and to reduce PrPSc levels in cell culture. DNA immunisation induced activation and proliferation of PrP-specific T cells in Prnp0/0-mice which was even stronger after immunisation with pCG-PrP-P30 than after pCG-PrP treatment. DNA vaccination induced an unspecific T cell response with increased levels of IFN and TNF in wild-type mice. Furthermore we combined DNA and protein immunisation to break tolerance against PrP. The results obtained were similar then those after DNA vaccination alone. Inoculation of the immunised wildtype mice with mouse adapted scrapie prions showed that these animals were not protected against the development of the prion disease. All mice in the vaccinated and control groups succumbed to scrapie with similar incubation times, deposition of PrPSc in brain and spleen and typical histopathological changes in the brain. Nevertheless based on these findings additional strategies of immunisiation should be envisaged to develop immunotherapeutic approaches to break tolerance against PrP and to protect against the prion disease.
KW  - Prion
KW  - Humorale Immunität
KW  - Zelluläre Immunität
KW  - Prion-Protein
KW  - Immunisierung
KW  - Antikörper
KW  - prion protein
KW  - immunisation
KW  - antibodies
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18409
ER  - 
TY  - THES
A1  - Piger, Veronika
T1  - Einfluss immunologischer Mechanismen bei der Implantation von Embryonen und deren therapeutischer Nutzen im Rahmen des IVF-Programms
T1  - The influency of immunological mechanisms for the implantation of embryos and the therapeutical effect for the ivf programm
N2  - Trotz des hohen Standards in der IVF-Behandlung gibt es bestimmte Patientinnen bzw. Paare, bei denen es nach der Durchführung von drei oder mehr optimalen Behandlungszyklen mit einem Transfer von mehr als sechs Embryonen insgesamt, nicht zum Eintritt einer Schwangerschaft kommt, vermutlich liegen hierfür die Probleme in der Implantationsphase. Dies hieße, daß ein Embryo entweder gar nicht erst implantiert wird oder, daß er kurz nach der Implantation wieder abstirbt. Hieraus ergäbe sich eine Ähnlichkeit zum klinischen Abortgeschehen. Heute weiß man, daß dem klinischen Abortgeschehen in 60 bis 70 Prozent Chromosomenstörungen zu Grunde liegen, in den übrigen Fällen wird hauptsächlich eine immunologische Ursache angenommen. Somit könnte auch die Ursache wiederholter frustraner IVF-Behandlungen im immunologischen Bereich zu suchen sein. In unserer Untersuchung wurden 100 sterile Paare untersucht, die von 1987 bis 1995 das IVF-Programm durchliefen. Das Kollektiv umfaßt Patientinnen zwischen 22 und 42 Jahren, mit folgenden gynäkologischen Diagnosen: Normalbefund, idiopathische, tubare und ovarielle Sterilität. Bei den Partnern wurden die folgenden Befunde erhoben: Normozoospermie, Oligo-Astheno-Teratozoospermie und isolierte, aber sehr ausgeprägte Asthenozoospermie. Bei beiden Partnern wurden die HLA-Antigene bestimmt, sowie zytotoxische Antikörper im Serum der Frau gesucht. Anschließend wurden der Patientin intrakutan Lymphozyten ihres Partners in den Unterarm injiziert. Bei zu großer Übereinstimmung im HLA-System wurden Lymphozyten eines Fremdspenders verwendet, der in den wichtigsten Blutgruppenmerkmalen mit der Patientin übereinstimmmte. Nach 4 Wochen wurde im Serum der Patientin nach sog. "schützenden Antikörpern" gesucht. Je nach Testergebnis wurde ein ausreichender Schutz angenommen oder eine Auffrischung empfohlen. Es wurde eine kumulative Schwangerschaftsrate von 53 Prozent erzielt. In über 70 Prozent trat diese bereits im ersten Zyklus nach Immunisierung ein. Folgende Schwangerschaftsverläufe konnten beobachtet werden: je ein Drittel Geburt, intakte Schwangerschaft (>12. SSW), Abort bzw. EUG. Die Immunisierungstherapie, wie von uns durchgeführt, scheint eher unspezifisch zu sein und auch zeitlich begrenzt. Der genaue Wirkmechanismus bleibt noch zu klären. Die vorherrschenden Erklärungsmodelle in der Literatur für das immunologische Abortgeschehen sind die Folgenden: Ausbildung zytotoxischer Antikörper, Fehlen Blockierender Faktoren, erhöhtes HLA-Sharing der Partner.
N2  - Though we have attended a high standard of ivf-treatments there are still patients who fail to become pregnant even after three or more cycles with a transfer of 6 or more embryos altogether. It is most probable that the main reasons herefore are during the implantation. That would mean that an embryo fails to be implanted or that he is aborted short afterwhile. It is known that the main reason for an abortion is an aberration of chromosomes in 60 to 80 per cent it is suggested that there are immunological reasons for the remaining 20 to 40 per cent. So it is likely that there are also immunological problemes responsible for recurrent ivf-failure. 100 patients from the age of 22 to 42 years who passed the ivf-programm from 1987 to 1995 were examened. Both partners were tested for the hla-antigens and it was looked for cytotoxic antibodies in the blood of the women. Lymphocytes of the husbands were injected in the forearm of the women for the immunological treatment. It was suggested to use lymphocytes of another donor if the hla-antigens of the partners were to much alike. Four weeks later "protective antibodies" were searched in the blood of the women. We could attend a pregnancy rate of 53 per cent, in about 70 per cent there was a pregnancy already in the first cycle after the immunization. About a third of the 53 patients gave birth to a healthy baby, another third was still pregnant, the other women aborted or had an extra-uterine pregnancy. The mechanisms of an immunological abortion are not yet detected but there are mainly the following reasons suggested: the developement of cytotoxic antibodies, the lack of blocking factors or a sharing of hla-antigens of the partners. The immunotherapy we carried out has to be considered as rather nonspecific and the way of its efficiency has still to be detected.
KW  - IVF
KW  - Sterilität
KW  - Immunisierung
KW  - Blockierende Faktoren
KW  - HLA-Antigene
KW  - zytotoxische Antikörper
KW  - ivf-failure
KW  - sterility
KW  - immunotherapy
KW  - blocking factors
KW  - hla-sharing
KW  - cytotoxic antibodies
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181788
ER  -