TY - THES A1 - Kuhnen, Sebastian T1 - Charakterisierung von sFRP4 als phosphatsensitives Phosphatonin in mesenchymalen Stammzellen T1 - Characterisation of sFRP4 as Phosphate-sensitive Phosphatonin in Mesenchymal Stem Cells N2 - Phosphat stellt einen essenziellen Bestandteil der Knochenhartsubstanz dar und ist zudem erforderlich, um mesenchymale Stammzellen osteogen zu differenzieren. Bei der Aufklärung molekularer Pathomechanismen von Störungen der Phosphathomöostase wurden in den vergangenen zehn Jahre mehrere Botenstoffe identifiziert, die spezifische Wirkungen auf den systemischen Phosphathaushalt haben. Die als „Phosphatonine“ bezeichneten Substanzen FGF23 (Fibroblastenwachstumsfaktor 23), sFRP4 (secreted frizzled related protein 4), FGF7 (Fibroblastenwachstumsfaktor 7) und MEPE (matrix extracellular phosphoglycoprotein) induzieren eine negative Phosphatbilanz, indem sie an der Niere phosphaturisch wirken. Ziel dieser Arbeit war es, eventuell vorhandene Interaktionen zwischen knochenbildenden Zellen, Phosphat und den inzwischen bekannten Substanzen mit Wirkung auf den Phosphathaushalt zu charakterisieren. Dazu wurden immortalisierte Zelllinien mesenchymaler Stammzellen (hMSC-TERT) und fetaler Osteoblasten (hFOB) konzentrations- und zeitabhängig mit Phosphat stimuliert (von 1,25 mM bis 20 mM, von 0 bis 48 h). Die quantitative real-time-PCR zur relativen mRNA-Quantifizierung wurde dabei in der Arbeitsgruppe als Methode etabliert, um den Einfluss dieser erhöhten Phosphatspiegel im Nährmedium auf die Expression von Genen des Phosphatstoffwechsels und Markern der osteogenen Differenzierung zu analysieren. Untersucht wurden Col1 (Kollagen 1), OC (Osteokalzin), AP (Alkalische Phosphatase) und OP (Osteopontin) als Differenzierungsmarker, Pit-1 (Natrium-Phosphattransporter), sFRP4, MEPE und FGF23 als Schlüsselsubstanzen im Phosphatstoffwechsel sowie Aktin und EF1a als Housekeeping-Gene. Die real-time-PCR wurde mit der SYBR® Green-Methode durchgeführt, die Effizienzbestimmung erfolgte mit LinRegPCR, die Auswertung mit REST© und REST 2005, jeweils für die ermittelte Effizienz und die als optimal angenommene Effizienz (E=2). Zunächst konnte die Expression des Natrium-Phosphattransporters Pit-1 in den Zellen hMSC-TERT und hFOB nachgewiesen werden. Bei beiden Zelllinien zeigte sich, dass die Expression von sFRP4 mit steigender Phosphatkonzentration bzw. steigender Stimulationsdauer nach unten reguliert wird. Beim Vergleich aller stimulierten Proben mit den unstimulierten Kontrollen fiel das Expressionsverhältnis bei hMSC-TERT ungefähr auf die Hälfte des Ausgangswertes (0,52; p<0,05), bei hFOB reduzierte es sich auf zwei Drittel (0,67; p<0,05). Es ist somit anzunehmen, dass Phosphat in der Lage ist, die Genexpression von sFRP4 in hMSC-TERT und hFOB nach unten zu regulieren. Für Pit-1 ergab sich bei hMSC-TERT der Hinweis auf eine gesteigerte mRNA-Expression unter Phosphateinwirkung, für hFOB-Zellen konnte diese Beobachtung nicht gemacht werden. Beide Zelllinien zeigten unter Phosphat-Stimulation und maximaler Einwirkzeit von 48 h kein einheitliches Expressionsmuster, das auf eine beginnende Differenzierung hinweisen würde. Der in dieser Arbeit gefundene Hinweis auf eine Phosphatsensitivität von sFRP4 in mesenchymalen Stammzellen und Osteoblasten lässt somit die Vermutung einer physiologischen Beteiligung von sFRP4 an der Phosphatregulation zu. Es bleibt zu klären, inwieweit andere Phosphatonine an solchen Signalachsen beteiligt sind. Spekuliert werden kann, dass sFRP4 auch als Antagonist des Wnt-Signalweges bei Differenzierungsvorgängen eine größere Rolle spielt als bisher angenommen. Des Weiteren sollte in der vorliegenden Arbeit ein Genexpressionssystem (Tet-On™ Konstrukt) in mesenchymalen adulten Stammzellen (hMSC-TERT) etabliert werden, mit dem im Endzustand die Expression beliebiger Gene Tetracyclin-abhängig induziert werden kann. Diese Arbeiten konnten bis zur ersten Transfektion erfolgreich durchgeführt werden: Für einen Referenz-Vektor zeigte sich eine ausgeprägte Induzierbarkeit durch Doxycyclin. Als erstes Gen sollte sFRP4 überexprimiert werden, das dafür zunächst isoliert, sequenziert und kloniert wurde und nun für den Einsatz in diesem Genexpressionssystem zur Verfügung steht. Die Aufklärung der Regulationsmechanismen und auch der Wirkungsweise von Phosphat wird ein wichtiges Ziel zukünftiger Forschung sein und eventuell neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von krankhaften Abweichungen der Phosphathomöostase eröffnen. N2 - Phosphate is an exceptionally important component of bone mineral and is necessary for the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. In the last decade, several substances have been identified by the analysis of pathological mechanisms that underlie disorders in phosphate homeostasis. These substances, the so-called “phosphatonins”, seem to have a specific function in the regulation of phosphate metabolism. Phosphatonins, such as FGF23 (fibroblast growth factor 23), sFRP4 (secreted frizzled related protein 4), FGF7 (fibroblast growth factor 7) and MEPE (matrix extracellular phosphoglycoprotein) are able to induce a state of negative phosphate balance by reducing renal phosphate reabsorption. The aim of this study was to elucidate possible interactions between bone forming cells, phosphate, and the known signal molecules of phosphate homeostasis. To this end, immortalized experimental cell lines of mesenchymal stem cells (hMSC-TERT) and fetal osteoblasts (hFOB) were stimulated in a dose- and time-dependent manner with augmented levels of phosphate (1.25 mM to 20 mM, 0 to 48 h). In order to detect the influence of increased phosphate levels on the expression of genes, which are markers of osteogenic differentiation and components of phosphate homeostasis, the method of quantitative real-time PCR was established in the workgroup. Col1 (collagen 1), OC (osteocalcin), AP (alkaline phosphatase) and OP (osteopontin) were analyzed as markers of differentiation; Pit-1 (sodium-phosphate transporter), sFRP4, MEPE and FGF23 as key-players in phosphate homeostasis; while Aktin and EF1a were used as housekeeping-genes. Real-time PCR was proceeded following the SYBR® Green method; the PCR efficiency was evaluated with LinRegPCR; finally the expression-ratios were calculated by REST© and REST 2005 - once using the evaluated efficiency and once using the optimal efficiency (E=2). It was shown that Pit-1 is expressed in hMSC-TERT and hFOB cells. For both cell lines it was obvious that the expression of sFRP4 is down-regulated by increasing phosphate concentrations or increasing duration of phosphate stimulation. Comparing all stimulated samples with all unstimulated controls, the expression ratio of sFRP4 decreased at half the initial value (0.52; p<0.05) in hMSC-TERT, and decreased at two-thirds of the initial value (0.67; p<0.05) in hFOB. This seems to be a strong indication that phosphate is able to down-regulate the expression of sFRP4 in hMSC-TERT and hFOB. Concerning Pit-1, one could suppose that the mRNA-expression was increased in hMSC-TERT cells following the stimulation with phosphate. In hFOB cells, this observation could not be made. Within both cell lines, no gene-expression pattern could be found that indicates the beginning of a differentiation process. The observed phosphate-sensitivity of sFRP4 in mesenchymal stem cells and osteoblasts permits us to assume that sFRP4 is involved in the physiological regulation of phosphate metabolism. Whether other phosphatonins are involved in such signaling-axis remains to be elucidated. By acting as a Wnt-antagonist, it can be assumed that sFRP4 plays a more important role in differentiation than previously known. Furthermore, the aim of this work was to establish a gene-expression-system (Tet-On™-system) in adult mesenchymal stem cells, by which it is possible to induce the expression of a target-gene in a tetracycline-dependent manner. The first transfection was accomplished successfully; the expression of a test-reference-vector was induced notedly by doxycycline. sFRP4 was projected as first gene being overexpressed by the Tet-On™-system. For this aim, sFRP4 was isolated, sequenced and cloned and is now ready to use in this manner. Revealing the mechanisms of regulation and the biological effects of phosphate in organisms will remain one topic of further investigation and will perhaps offer new therapeutic strategies for the treatment of disorders in phosphate homeostasis. KW - Phosphat KW - sFRP4 KW - mesenchymale Stammzellen KW - quantitative real-time PCR KW - osteogene Differenzierung KW - phosphate KW - sFRP4 KW - mesenchymal stem cells KW - quantitative real-time PCR KW - osteogenic differentiation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22738 ER - TY - THES A1 - Melms, Hannah T1 - Charakterisierung und Analyse mesenchymaler Stammzellen dentalen Ursprungs mit Fokus auf die dentalen Aspekte der Hypophosphatasie - Etablierung eines in vitro Modells - T1 - Characterization and analysis of mesenchymal stem cells of dental origin with focus on the dental aspects of hypophosphatasia - Establishment of an in vitro model - N2 - Im seltenen Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP) treten aufgrund der Fehlfunktion der Gewebe-unspezifischen Alkalischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) skelettale und dentale Symptome in sehr variabler Ausprägung auf. Der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ist das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen ein erstes Anzeichen dieser Erkrankung. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Modell der HPP etabliert und der Fokus auf die dentalen Aspekte dieser Erkrankung gelegt. Hierzu wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Bereichen analysiert, die bei einer Erkrankung von dieser Mineralisierungsstörung betroffen sind. Es wurden dentale Stammzellen aus der Pulpa (dental pulp stem cells, DPSCs) und dem parodontalen Ligament (periodontal ligament stem cells, PDLSCs) isoliert und im Vergleich zu Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) charakterisiert. Um den Einfluss der Spendervariabilität zu reduzieren, wurden aus dem gesamten dentalen Probenmaterial nur vollständige Probenpaare aus DPSCs und PDLSCs von 5 Spendern für die vergleichenden Analysen verwendet. Die dentalen MSCs konnten somit paarweise direkt miteinander verglichen werden. DPSCs gelten seit ihrer Entdeckung von Gronthos et al. im Jahr 2000 als geeignete Quelle für die Stammzellgewinnung mit vielversprechenden Anwendungsmöglichkeiten im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen muskuloskelettalen Medizin. PDLSCs sind aufgrund der parodontalen Problematik der HPP von besonderem Interesse in dieser Arbeit. Die Isolation von Stammzellen aus Pulpa und PDL konnte mit dem Nachweis der sogenannten Minimalkriterien für MSCs bestätigt werden. In diesem durch Enzyminhibition mit Levamisol induzierten in vitro Modell der HPP wurde die TNAP-abhängige Genexpression, die Enzym-Aktivität und das osteogene Differenzierungspotenzial an diesen drei Mineralisierungs-assoziierten MSCs untersucht. Die erweiterte Genexpressionsanalyse in Kooperation mit der Core Unit Systemmedizin der Universität Würzburg mit einer RNA-Sequenzierung der PDLSCs ergab interessante Einblicke in die differentielle Genexpression nach der TNAP-Inhibition während der osteogenen Differenzierung und Ansatzpunkte für weitere Analysen. Die beobachteten Genregulationen waren nach dem derzeitigen Verständnis pathologischer Zusammenhänge nachvollziehbar und simulierten in vitro HPP-relevante Signalwege repräsentativ. Insbesondere die signifikante Genregulation von P2X7 und DMP1, sowie Zusammenhänge aus dem Wnt-Signalweg zeigen hinsichtlich der dentalen Aspekte der HPP neue Ansatzpunkte auf. Die erhöhte P2X7-Expression in diesem in vitro HPP-Modell scheint mit der Parodontitis-Problematik der HPP zu korrelieren und verdeutlicht unter anderem die multifaktorielle Ätiologie und Pathogenese der Parodontitis. Die Tatsache, dass die experimentellen Beobachtungen in Einklang mit dem klinischen Bild der HPP gebracht werden können, bestätigt die Relevanz des hier etablierten in vitro Modells. Zusammenfassend konnten anhand dieses in vitro Modells der HPP neue Aspekte aufgedeckt werden, die nicht nur im Hinblick auf die dentale Problematik der HPP aufschlussreich sind. N2 - In the rare clinical picture of hypophosphatasia (HPP) skeletal and dental symptoms occur in very variable severity due to a dysfunction of the enzyme tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP). The premature loss of deciduous teeth is the main dental symptom and in many cases the first sign of this disease. In this thesis, an in vitro model for HPP was established and the research focus was put on the dental aspects of this disease. Mesenchymal stem cells (MSCs) from areas affected by this mineralization disorder were analyzed. Dental pulp stem cells (DPSCs) and periodontal ligament stem cells (PDLSCs) were isolated and characterized in comparison to bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). In order to reduce the influence of donor variability, only complete pairs of DPSCs and PDLSCs from five donors were used for comparative analysis. The mesenchymal stem cell character of the isolated cells from the dental pulp and the PDL was confirmed by the verification of the so-called minimal criteria for MSCs. In this in vitro model for HPP, which was induced by inhibition of TNAP enzyme with levamisole, the TNAP-dependent gene expression, the enzyme activity and the osteogenic differentiation potential of these three mineralization-associated MSCs were investigated. Additionally, an extended gene expression analysis was performed in cooperation with the Core Unit System Medicine of the University of Würzburg using the RNA sequencing technique. Analysis of RNAs isolated from PDLSCs provided interesting insights into the differential gene expression due to TNAP inhibition during osteogenic differentiation and consequently starting points for further analyses. The observed gene regulation was in line with the current understanding of pathological relationships and simulated HPP-relevant signaling pathways in vitro. In particular, the significant gene regulation of P2X7 and DMP1, as well as correlations from the Wnt signaling pathway, reveal new considerable approaches for the dental aspects of HPP. The increased P2X7 expression in this in vitro HPP model seems to correlate with the periodontal disease of HPP and illustrates, among other things, the multifactorial etiology and pathogenesis of periodontitis. The fact that the experimental observations can be reconciled with the clinical picture of HPP confirms the relevance of the in vitro model established here. In summary, this in vitro model for HPP has revealed a number of new interesting aspects - not only with regard to the dental problems of HPP. KW - Hypophosphatasie KW - Stammzellen KW - Hypophosphatasia KW - Mesenchymale Stammzellen KW - mesenchymal stem cells KW - dentale Stammzellen KW - dental stem cells KW - osteogene Differenzierung KW - osteogenic differentiation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189844 ER - TY - THES A1 - Reichert, Johannes Christian T1 - Osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Kollagen I Hydrogelen und Herstellung eines stammzellbasierten Polycaprolacton-Hydrogel Konstrukts für die Rekonstruktion segmentaler Knochendefekte T1 - Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in collagen type I hydrogels and fabrication of a stem cell based polycaprolactone-hydrogel construct for the reconstruction of segmetnal bone defects N2 - Segmentale Knochendefekte, stellen ein bedeutendes, klinisches Problem mit bisher limitierten, therapeutischen Möglichkeiten dar. Sie schränken nicht nur die Gesundheit und Lebensqualität des Betroffenen ein sondern bringen bei steigender Inzidenz und kostenintensiver Behandlung auch eine gewaltige sozioökonomische Problematik mit sich. Die bisher zur Verfügung stehenden, therapeutischen Mittel wie die Entnahme von autologer Spongiosa aus dem Beckenkamm bergen das Problem der Morbidität an der Entnahmestelle, von persistierender Schmerzsyndromen, von Hypersensitivität, Instabilität des Beckens und Infektionen. Zudem ist die Menge an Knochen, die gewonnen werden kann, limitiert. Allografts sind von einer bedeutend niedrigeren Zellularität, besitzen eine geringere Revaskularisierungsrate sowie eine höhere Resorptionsrate, führen zu einer niedrigeren Knochenformationsrate und gehen mit der Gefahr einer Abstoßungsreaktion einher. Zukünftig könnte das Tissue Engineering als interdisziplinäres Forschungskonzept hier eine entscheidende Rolle spielen. Insbesondere MSZ wird ein großes therapeutisches Potential für die Rekonstruktion von Knochengewebe zugeschrieben. Die vorliegende Studie beschäftigte sich einerseits mit der Frage, ob unter dem Einfluss entsprechender Wachstumsfaktoren humane MSZ aus dem Knochenmark in Kollagen I Hydrogelen zu einer osteogenen Differenzierung und der Produktion mineralisierter, extrazellulärer Matrix angeregt werden können. Zum andern wurde untersucht, ob es möglich ist, ein Konstrukt aus MSZ, einem Kollagen Gel und einem geeigneten Scaffold herzustellen, das sich zur Rekonstruktion segmentaler Knochendefekte eignet. Zunächst wurden MSZ aus dem Knochenmark isoliert und in Monolayerkulturen osteogen differenziert. Die histochemischen Untersuchungen zeigten, dass in osteogenem Differenzierungsmedium kultivierte MSZ in der primären Zellkultur vermehrt mineralisierte Matrix bildeten und ALP exprimierten. In den RT-PCR Analysen konnte eine deutliche Mehrexpression später osteogener Markergene wie Osteokalzin nachgewiesen werden. MSZ, die leicht zu isolieren und zu 53 kultivieren sind, eignen sich demnach gut als Zellen zur Herstellung eines Konstruktes für die Rekonstruktion von segmentalen Knochendefekten. Eingebracht in Kollagen I Hydrogele zeigten die Zellen unter dem Einfluss verschiedener osteogener Differenzierungsbedingungen unterschiedliche Genexpressionsmuster. Nach 42 Tagen Kultur in SZM (Kontrollgruppe) konnte sowohl die Expression osteogener Markergene als auch eine chondrogene Differenzierung nachgewiesen werden. Es konnte eine deutliche Mehrexpression von AGN, Col II und SOX-9, gleichfalls der osteogenen Marker ALP und Cbfa1 gezeigt werden. Ein entsprechendes Bild hatte auch die histologische Aufarbeitung ergeben. Dies könnte auf die Eigenschaften des Kollagen Hydrogels zurückzuführen sein, dem aufgrund seiner Zusammensetzung und biologisch-induktiven Merkmale eine chondrogene Induktion, sogar ohne Wachstumsfaktoren, zugeschrieben wird. In der mit BMP- 2 differenzierten Gruppe zeigte sich eine deutliche Zunahme der Expression der chondrogenen Markergene, wie Col II und SOX-9. Auch die osteogenen Marker wie ALP, Cbfa1 und OC waren etwas stärker exprimiert. Den Ergebnissen nach zu schließen begünstigte BMP-2 bei der Kultivierung von MSZ in Kollagen I Hydrogelen in vitro eine eher chondrogene Differenzierung. Zumindest in Kombination mit Kollagen I Hydrogelen scheint daher BMP-2 als osteogener Wachstumsfaktor bei der Herstellung stammzellbasierter Konstrukte für den Knochenersatz weniger geeignet. Nach Kultur in osteogenem Medium konnte gegenüber der SZM Gruppe eine deutliche Mehrexpression aller getesteten, osteogenen Marker, insbesondere auch von Cbfa1 und OC, nachgewiesen werden. Allerdings zeigte sich auch bei den chondrogenen Markergenen wie Col II eine geringe Zunahme der Genexpression. Das osteogene Medium induzierte demnach MSZ in Kollagen I Gelen vorwiegend eine osteogene Differenzierung. Entsprechend konnte in den histologischen Untersuchungen die Bildung einer mineralisierten, extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit in vitro aus einem Kollagen I Gel, MSZ und einem PCL-Scaffold ein Konstrukt hergestellt werden, das die Regeneration segmentaler Knochendefekte positiv beeinflussen könnte. Es zeigte sich ein gutes Bonding an der Grenzfläche zwischen Kollagen Gel und 54 PCL-Scaffold. Das Kollagen Gel hatte die makroporösen und mikroporösen Freiräume des Scaffolds komplett ausgefüllt, wodurch eine homogene Verteilung der MSZ innerhalb des Scaffolds erreicht werden konnte. N2 - Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in collagen type I hydrogels and fabrication of a stem cell base polycaprolactone-hydrogel construct for the reconstruction of segmetnal bone defects KW - Osteogene Differenzierung KW - mesenchymale Stammzelle KW - Polycaprolacton KW - Knochendefekt KW - osteogenic differentiation KW - stem cell KW - polycaprolactone KW - bone defect Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23274 ER -