TY - THES A1 - Bleuel, Gabriel T1 - Entwicklung und Validierung eines quantitativen Verfahrens zur Beurteilung der Viabilität von entsprechend der GMP-Richtlinien hergestellter Knorpelimplantate für das Knie T1 - Development and validation of a quantitative assay for a viability test of cultivated knee cartilage implants N2 - Due to the reversing age pyramid in Germany, more and more people are already suffering from joint cartilage damage. But not only age, but also accidents and sports injuries and being overweight can lead to irreversible cartilage defects. Although there are various treatment options, the previous methods cannot be considered a permanent cure. As part of the international research project BIO-CHIP, a promising treatment method with novel drugs was to be investigated. The patient's own cartilage cells from the nose serve as the starting material for the drug, a manufactured cartilage implant. These are isolated, multiplied and ultimately cultivated on a matrix to form a cartilage implant. In addition to toxicological and biological safety tests, an essential prerequisite for the approval of the implant is the assessment of the viability. This was previously carried out on the basis of histology from the pathology department. The aim of the present work was the development and validation of a standardized and objective viability test for the chondrocytes within the cartilage matrix. For this, the LDH was used as a marker for irreversibly damaged cells. The LDH concentration could be measured with the CyQuant LDH assay by measuring the absorption. It could be proven that LDH has the required stability and detectability in the medium. With the help of the lysis, of cultivated mini-cartilage implants, the maximum achievable LDH concentrations could be determined. A calibration curve was generated using these concentrations. This serves to assess the viability of future measured absorptions of the supernatant medium. The developed method does not require any invasive interventions on the implant and is characterized by its simple implementation, since only the protrusion has to be measured. The validation of the method certified a high level of robustness, linearity, accuracy and precision. N2 - Aufgrund der sich umkehrenden Alterspyramide in Deutschland leiden bereits jetzt immer mehr Menschen an Gelenkknorpelschäden. Doch nicht nur das Alter, sondern auch Unfälle und Sportverletzungen und Übergewicht können zu irreversiblen Knorpeldefekten führen. Obwohl es diverse Behandlungsmöglichkeiten gibt, können die bisherige Methoden nicht als dauerhafte Heilung betrachtet werden. Im Rahmen des internationalen Forschungsprojektes BIO-CHIP sollte eine vielsprechende Behandlungsmethode mit neuartigen Arzneimitteln untersucht werden. Als Ausgangsmaterial des Arzneimittels, ein hergestelltes Knorpelimplantat, dienen patienteneigene Knorpelzellen aus der Nase. Diese werden isoliert, vermehrt und letztlich auf einer Matrix zu einem Knorpelimplantat kultiviert. Wesentliche Voraussetzung für die Implantatfreigabe stellt neben toxikologischen und biologischen Unbedenklichkeitstests die Beurteilung der Viabilität dar. Diese wurde bisher anhand von Histologieschnitten von der Pathologie durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung eines standardisierten und objektiven Viabilitätstests für die Chondrozyten innerhalb der Knorpelmatrix. Hierfür wurde die LDH als Marker für irreversibel geschädigte Zellen verwendet. Die LDH Konzentration konnte mit dem CyQuant LDH-Assay durch die Messung der Absorption gemessen werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass LDH die erforderliche Stabilität und Nachweisbarkeit im Medium besitzt. Mithilfe der Lyse, analog zum Herstellungsprozess, gezüchteter Mini-Knorpelimplantate, konnten die maximal erreichbaren LDH Konzentrationen ermittelt werden. Mithilfe dieser Konzentrationen wurde eine Eichkurve generiert. Diese dient als Beurteilung der Viabilität zukünftig gemessener Absorptionen des Überstandmediums. Das entwickelte Verfahren erfordert keine invasiven Eingriffe am Implantat und zeichnet sich durch eine einfache Durchführung aus, da nur der Überstand gemessen werden muss. Die durchgeführte Validierung der Methode bescheinigte eine hohe Robustheit, Linearität, Genauigkeit und Präzision. KW - Hyaliner Knorpel KW - Lactatdehydrogenase KW - Kniegelenk KW - Zellkultur KW - Entwicklung KW - development KW - Validierung KW - LDH-assay KW - Knorpelimplantate KW - validation KW - cartilage Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242481 ER - TY - THES A1 - Dickhuth, Janike T1 - Steigerung der Proliferationsfähigkeit primärer humaner Keratinozyten aus oraler Mukosa im Zellkultursystem durch Anreicherung von humanen epidermalen Stammzellen T1 - Enhanced proliferation of oral mucosal keratinocytes by the use of enriched human epidermal stem cells in vitro N2 - Da Defekte im Bereich der oralen Schleimhaut infolge von Traumata, angeborenen sowie erworbenen Krankheiten die ungestörte Funktionsweise in Bezug auf Atmung, Nahrungsaufnahme und Sprache des Menschen empfindlich beeinträchtigen und ein adäquater, alle Funktionen wiederherstellender Wundverschluss mit dem limitierten Eigengewebe oft nicht möglich ist, bietet das Tissue Engineering durch die Entwicklung eines Hautäquivalents eine aussichtsreiche Alternative. Um eine ausreichende Menge an Zellen für die Herstellung eines autologen Transplantates in kurzer Zeit zur Verfügung zu stellen, sollte in der vorliegenden Arbeit eine Methode zur Steigerung der Proliferationsfähigkeit primärer humaner Keratinozyten aus oraler Mukosa im Zellkultursystem etabliert werden. Dazu mussten zunächst über die Explantation von Gewebeproben gesunder Patienten orale Schleimhautzellen gewonnen und die primären Keratinozyten von den mitwachsenden Fibroblasten isoliert werden. Dies wurde durch chemische und mechanische Separationsmethoden erreicht. Die Kultivierung der exprimierten Zellen erfolgte unter ständiger Beobachtung und physiologischen Bedingungen über einen Zeitraum von mehreren Wochen. Nach Konfluenz der zweiten Passage wurden die Zellen geerntet und für die Versuche vorbereitet. Die Steigerung der Proliferationsfähigkeit der Keratinozyten sollte durch die Anreicherung epidermaler Stammzellen erreicht werden, da diese insbesondere durch ihre Fähigkeit zur asymmetrischen Teilung die Grundlage für die Regeneration, Differenzierung und Homöostase des Gewebes bilden. Eine Möglichkeit zur Isolation von Zellen mit Stammzelleigenschaften stellt die Adhäsion an beschichteten Zellkulturgefäßen dar. Die Affinität des hauptsächlich in Stammzellen vorkommenden ß1­‐Integrin‐Rezeptors zu Bestandteilen der Basalmembran wie Kollagen­‐IV und Laminin sollte die Trennung hoch proliferativer Zellen von weniger teilungsaktiven Zellen leisten und das Protein indirekt als Marker für die Stammzellen fungieren. Über die Adhäsion der Keratinozyten an mit den Komponenten Kollagen‐IV und Laminin beschichteten Gefäßen ließen sich zwei Zellpopulationen (adhärente und nicht-adhärente Zellen) gewinnen. Unabhängig von der verwendeten Adhäsionskomponente zeigten die Fraktionen den charakteristischen Wachstumsverlauf (lag­‐Phase, log­‐ Phase, stationäre Phase und Absterbephase) in vitro kultivierter Zellen, allerdings konnte kein signifikanter Unterschied in Bezug auf die Vitalität und die Proliferationskinetik der Keratinozyten festgestellt werden. Eine nach der geleisteten Auftrennung der Keratinozyten zwischengeschaltete Analyse und Identifikation von Stammzellen mittels ß1­‐Integrin­‐Marker (z.B. durch einen Immunfluoreszenztest) könnte klären ob die adhärente Population überhaupt einen erhöhten Anteil an hoch proliferativen Keratinozyten beinhaltet oder ob die zahlreichen notwendigen, aber für die Zellen belastenden, Zwischenschritte der hier angewendeten indirekten Methode auslösend für die geringen Unterschiede sind. In Anlehnung an die von Stein et al. erarbeiteten guten Ergebnisse bezüglich der Proliferationskapazität oraler Keratinozyten nach Adhäsion an Kollagen­‐IV­‐beschichteten Zellkulturgefäßen wurde bei der vorliegenden Arbeit auf die aufwändige immunhistochemische Untersuchung verzichtet. Ein verstärktes Wachstum der adhärenten Population konnte nur bei vereinzelten Proben festgestellt werden; insgesamt konnte die prioritär gewünschte Steigerung der Proliferation primärer humaner Keratinozyten im Zellkultursystem zur raschen Bereitstellung von Zellen für die Entwicklung eines autologen Mundschleimhaut‐Transplantates nicht erreicht werden. Die drei angewandten Verfahren zur Erfassung der Quantität führten hinsichtlich der Wachstumssteigerung zu ähnlichen Ergebnissen. Da sie aber zum einen durch das Wegfallen der für die Zellzählung und den WST‐1‐Test notwendigen Zwischenschritte eine non­‐invasive (ohne mechanische Irritation und Interaktion mit Zusatzstoffen), d.h. für die Zellen schonende Methode darstellt und sich zum anderen die Ergebnisse der Real-Time-­Zellanalyse, im Gegensatz zur Endpunkt-­Messung, direkt auf die vorangegangenen Messungen beziehen, überzeugte die Auswertung mittels Impedanzmessung in Genauigkeit und Darstellung der Veränderung des Zellwachstums über die Zeit. N2 - PURPOSE The limited availability of autogenous oral mucosa in oral and maxillofacial surgery for intraoral grafting after trauma or tumor resection can be balanced by the use of tissue engineered oral mucosa. The aim of this study was to evaluate conditions that lead to a rapid proliferation of vital and highly proliferative oral keratinocytes for application in tissue engineering. MATERIAL AND METHODS Human oral keratinocytes were obtained from oral mucosal specimens and cultivated. According to their affinity to β1-integrin, epidermal stem cells population were isolated using collagen type IV and laminin coated dishes. Cell proliferation and cell viability were measured using the CASY cell counter, WST-1 assays, and real-time cell analysis (xCELLigence). RESULTS Measurements on cell proliferation (CASY cell counter) and cell viability (WST-1 assay) showed the characteristic proliferation stages of in-vitro cultivated cells. No statistically significant differences could be monitored. Real-time cell analysis as a more direct and precise technique revealed a steeper growth curve of adherent cells and therefore generally higher proliferation kinetics compared to cells derived from the supernate. DISCUSSION Data from real-time cell analysis showed an increased proliferation of adherent cells compared to those derived from the supernate. These results demonstrate the increase of the proliferation capacity by cultivation of keratinocytes derived by adhesion to ECM proteins. KW - Tissue Engineering KW - Keratinozyt KW - Basalmembran KW - Zellkultur KW - Tissue Engineering KW - Keratinozyt KW - Proliferationsfähigkeit KW - Kollagen KW - Laminin Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94084 ER - TY - THES A1 - Drexl, Hans Henning T1 - Der Einfluss von R-Roscovitine und Valproat auf das Wachstums- und präsynaptische Differenzierungsverhalten SMN-defizienter Motoneurone T1 - The Effects of R-Roscovitine and Valproic Acid on Axonal Growth and Presynaptic Differentiation of Smn-deficient Motoneurons N2 - Die spinale Muskelatrophie ist eine monogenetische Erkrankung, die bereits im Kindesalter aufgrund von Motoneurondegeneration zu Muskelatrophie führt und nicht selten einen tödlichen Verlauf nimmt. Ursache der Erkrankung ist ein Mangel an SMN-Protein. Der hierfür verantwortliche Verlust des SMN1-Gens kann durch das SMN2-Gen aufgrund eines gestörten Spleißprozesses am Exon 7 nicht kompensiert werden. Neben Aufgaben in der RNA-Prozessierung wird das SMN-Protein für den axonalen Transport von Ribonucleinpartikeln in Motoneuronen benötigt, was bei der SMA zu pathologischem Wachstum, Differenzierung und Funktion der Motoraxone führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden kultivierte Motoneurone aus einem Mausmodell für die SMA Typ I (Genotyp Smn-/-;SMN2) mit zwei unterschiedlichen Substanzen behandelt und deren Wirkungen auf das präsynaptische Differenzierungsverhalten der Motoneurone verglichen: R-Roscovitine, ein Agonist/Modulator spannungsabhängiger N-Typ- und P/Q-Typ-Kalziumkanäle, welcher zudem eine CDK-inhibierende Wirkung besitzt, sowie Valproat, ein HDAC-Inhibitor, der eine stimulierende Wirkung auf die SMN-Transkription hat. Es zeigte sich, dass R-Roscovitine in der Lage ist, das pathologische Wachstums- und präsynaptische Differenzierungsverhalten der Smn-defizienten Motoneurone zu normalisieren, ohne hierbei Einfluss auf die erniedrigte Menge an Smn-Protein zu nehmen. Die Behandlung mit Valproat beeinflusst hingegen weder die Menge an Smn-Protein, noch die pathologische Differenzierung der Wachstumskegel Smn-defizienter Motoneurone. Erklären lassen sich diese Effekte in erster Linie durch den Agonismus an spannungsabhängigen Kalziumkanälen durch R-Roscovitine. Durch vermehrten Kalziumeinstrom kommt es zur Normalisierung von Struktur und Funktion der Wachstumskegel. Ein CDK-vermittelter Effekt scheint unwahrscheinlich. Obgleich die genauen Vorgänge noch nicht verstanden sind, zeigen diese Ergebnisse, dass sich Smn-defiziente Motoneurone normal entwickeln können, wenn die hierfür erforderlichen kalziumabhängigen präsynaptischen Differenzierungssignale korrekt ausgelöst werden. Bei weiterer Erforschung sind Therapeutika denkbar, die in Zukunft die überwiegend genetisch orientierten Therapieansätze zur Hochregulation der SMN-Expression bei SMA-Patienten über einen von der Genetik unabhängigen Wirkmechanismus unterstützen können. N2 - Spinal muscular atrophy (SMA) is a monogenetic disease mostly of children and young adults. The affected show motoneuron degeneration, paralysis and muscular atrophy and the disease is frequently leading to death. SMA is caused by the loss of the SMN1 (survival motoneuron1) gene and thereby deficiency of the SMN protein. A second SMN gene in humans (SMN2) contains a mutation in Exon 7, why most of its transcripts are alternatively spliced and therefore truncated. Thus, the SMN2 gene is not able to compensate a SMN1 loss. The SMN protein is necessary for the assembly of snRNP particles, which are essential for RNA processing. In motoneurons, the SMN protein is additionally important for the axonal transport of mRNA. Therefore, cultured motoneurons from Smn-deficient mouse embryos show alterations in axonal growth as well as in size, differentiation and function of their growth cones. Especially low density of ß-actin and N-type (Cav2.2) voltage-gated calcium channels (VGCCs) and thereby reduced frequency of spontaneous Ca2+ transients have been described. These transients normally work as signals for differentiation on the growth cones. This work demonstrates that application of R-Roscovitine, an inhibitor of Cyclin dependent kinases (CDKs) 2 and 5 as well as a modifier/opener of VGCCs (N-type and P/Q-type), enhances VGCC accumulation and levels of ß-actin protein in growth cones and ameliorates defects of growth cone size and axon elongation in Smn-deficient motoneurons. These compensatory effects are primarily mediated by the enhanced VGCC clustering and hereby resuscitation of the presynaptic excitability; the low level of SMN protein in these cells is not risen by R-Roscovitine. Valproic acid, a well-known anti-epileptic drug and inhibitor of the histon-deacetylase (HDAC), has been shown to rise the level of SMN protein in different cell types by unspecific upregulation of transcription. Here, treatment of Smn-deficient cultured motoneurons with Valproate had no effects neither on the level of SMN protein nor on the VGCC accumulation in growth cones. In contrast to R-Roscovitine, Valproate inhibits VGCCs. These results underline the importancy of Ca2+ homeostasis for proper motoneuron differentiation and function. These mechanisms may offer an alternative approach for SMA treatment besides the existing gene-based strategy. KW - Spinale Muskelatrophie KW - R-Roscovitine KW - Valproat KW - SMA KW - Motoneuron KW - Zellkultur Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171696 ER - TY - THES A1 - Fach, Cornelia T1 - Selektive Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung eines hypermutablen Bereiches des Fanconi-Anämie-A (FANCA)-Gens aus Fibroblasten-Kulturen unterschiedlicher Passagen und Genotypen T1 - Selective amplification, cloning and sequencing of a hypermutable region of the Fanconi anemia A (FANCA) gene from fibroblast cultures of different passages and types of genes N2 - Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase. N2 - Fanconi anemia belongs to the chromosome breakage syndromes and is characterised by a spontaneous chromosomal instability. This instability is also a cause of frequent back mutations. Such are increased in gene sections of high sequence variability. In particular this applies to the Exon 10 of the FANCA gene. This section of the gene was picked out, because this is described as hypermutable range in the literature. In this work it should be investigated if sequences of the Exon 10 show somatic instability. For this fibroblasts of a patient and appropriate controls in the cell culture were serially divided and aged. Because of the cell aging it could be shown that the growth rate was reduced. The cells, which were treated with MMC, stopped growth after 1-2 cell passages. The segment of the FANCA sequence was amplified from isolated DNA of the cells and cloned in the PCR TOPO TA. The received clones were made sequences. The sequence analyses resulted as the most frequent substitution a T to C exchange or revers complementary an exchange from A to G. This is interpreted as artifact. A supposed cause is the relatively high error rate of the Taq polymerase. For the amplification of the segment of the FANCA gene a polymerase should be used, which has a higher accuracy than the Taq polymerase, e.g. the Pfu polymerase. KW - Fanconi Anämie A KW - Zellkultur KW - PCR KW - Mutation KW - Hypermutabilität KW - Fanconi anemia A KW - cell culture KW - PCR KW - mutation KW - hypermutable Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10464 ER - TY - THES A1 - Faltin, Manuela T1 - Proliferation und Differenzierung der Zellkultursysteme hFOB 1.19 und C3H10T1/2 - BMP-2 unter dem Einfluss von nichtsteroidaler Antiphlogistika und einzeitiger Radiatio T1 - Proliferation und differentiation of the cellsystems hFOB 1.19 and C3H10T1/2 - BMP-2 under the treatment with NSAR and Radiatio N2 - Die Auswahl der Zellkulturmodelle hFOB 1.19 und C3H10T1/2 – BMP-2 erfolgte basierend auf den Hypothesen zur Entstehung heterotoper Ossifikationen. So kann die humane fetale Osteoblastenzell-Linie hFOB 1.19 in diesem Zusammenhang als determined osteoblastic progenitor cell und die murine mesenchymale Zell-Linie C3H10T1/2–BMP-2 als inducable osteoblastic progenitor cell angesehen werden. Die Zell-Linie hFOB 1.19 bietet aufgrund ihres humanen Ursprungs und der reproduzierbaren Expression osteogener Marker wie Alkalische Phosphatase, Prokollagen I und Osteocalcin die Möglichkeit, den humanen in vivo Osteogeneseprozess in vitro im Zellkultursystem zu imitieren. In der vorliegenden Studie gelingt es, im Rahmen der NSAR-Versuche die Schlüsselrolle des PGE2 sowohl im Knochenmetabolismus als auch bei der Entstehung heterotoper Ossifikationen, sowie dessen Mediatorfunktion in der Regulation osteoblastenspezifischer Differenzierungsparameter im Zellkulturmodell zu demonstrieren, obgleich der Nachweis der kalzifizierungsinhibierenden Wirkung Nichtsteroidaler Antiphlogistika, wie auch in der einschlägigen Literatur, am Zellkultursystem weiterhin aussteht. Unter Berücksichtigung aller gewonnenen Daten kann in dieser Studie dokumentiert werden, dass die murine mesenchymale Progenitorzelle C3H10T1/2 unter BMP-2-Transfizierung und der Zugabe von Ascorbat und -Glycerophosphat zu osteoblastärer Differenzierung induziert wird, osteogene Eigenschaften entwickelt und im Längsschnitt der Studie deutliche Mineralisationstendenz aufweist. N2 - xxx KW - Heterotope Ossifikationen KW - NSAR KW - Radiation KW - Zellkultur KW - Heterotopic ossifikation KW - NSAR KW - Radiatio KW - Cellculture Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7854 ER - TY - THES A1 - Gegg, Tanja Susanne T1 - In Vitro Toxizität der Nanopartikel Graphen und Siliciumdioxid für die Medikamentenapplikation T1 - In vitro toxicity of the nanoparticles Graphene and Silicon dioxide for drug targeting N2 - Graphen und Siliciumdioxid Nanopartikel sind als Trägersubstanz für Medikamente beim Drug Targeting von Interesse. Diese Arbeit ist eine toxikologische Untersuchung der Nanopartikel Graphen und Siliciumdioxid im Zellmodell. Dabei wurden Graphen Nanopartikel mit einer Dicke von 6 bis 8 nm und einer Breite von 15 µm verwendet. Die verwendeten Siliciumdioxid Nanopartikel waren kugelförmig und porös mit einer Partikel-Größe von 5 bis 20 nm. Die dosisabhängige Toxizität (Konzentrationen 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml und 1 mg/ml, Inkubation über 24 Stunden) gegenüber 5 verschiedenen Zelllinien (cerebEND, Caco-2, Hep G2, HEK-293, H441) wurde geprüft. Dabei kamen Zellviabilitätstests (CellTiter-Glo Assay, EZ4U-Test) zum Einsatz. Zudem wurde mit den Apoptose-Markern Bax und Caspase-3 auf Gen- und Proteinebene (Polymerasekettenreaktion und Western Blot) überprüft, ob eine Apoptose eingeleitet wurde. Zur Untersuchung der Zellviabilität wurde der CellTiter-Glo Assay verwendet. Für Graphen Nanopartikel zeigte sich ab einer Konzentration von 1 mg/ml bei den Zelllinien HEK-293 und H441 ein statistisch signifikanter Abfall der Zellviabilität. CerebEND und Hep G2 Zellen reagierten auf Graphen Nanopartikel ab einer Konzentration von 1 mg/ml ebenfalls mit einem deutlichen Abfall der Zellviabilität, diese Ergebnisse waren jedoch nicht statistisch signifikant. Die Zelllinie Caco-2 zeigte sich von den Graphen Nanopartikeln unbeeindruckt, es kam zu keiner statistisch signifikanten Veränderung der Zellviabilität. Siliciumdioxid Nanopartikel bewirkten ab einer Konzentration von 1 mg/ml einen statistisch signifikanten Abfall der Zellviabilität bei den Zelllinien cerebEND, HEK-293 und H441. HepG2 Zellen zeigten bei 1 mg/ml Siliciumdioxid einen deutlichen aber statistisch nicht signifikanten Abfall der Zellviabilität. Die Zelllinie Caco-2 erwies sich auch bei Siliciumdioxid Nanopartikel als äußerst robust und zeigte keine statistisch signifikanten Veränderungen der Zellviabilität. Messungen der Zellviabilität auf Grundlage von Adsorptionsmessung, wie beim EZ4U-Test, hatten sich als ungeeignet erwiesen, da die Eigenfarbe der Nanopartikel Graphen und Siliciumdioxid mit dieser Messung interferierte. Zudem wurde geprüft, ob die bei einem Teil der Zelllinien eingetretene toxische Wirkung der Nanopartikel ab einer Konzentration von 1 mg/ml durch Nekrose oder durch Apoptose zustande kam. Die Polymerasekettenreaktion zeigte mit einer einzigen Ausnahme keine statistisch signifikante Erhöhung der Genexpression für Bax und Caspase-3 und gab somit auch keine Hinweise auf die Einleitung einer Apoptose. Im Western Blot zeigte sich keine statistisch signifikante Erhöhung der Proteinexpression von Bax und Caspase-3. Zudem konnte im Western Blot auch keine aktivierte Caspase-3 nachgewiesen werden. Somit lagen auf Grundlage von Polymerasekettenreaktion und Western Blot keine Hinweise auf das Eintreten einer Apoptose vor. Die toxische Wirkung der Nanopartikel Graphen und Siliciumdioxid, die bei einem Teil der Zelllinien ab einer Konzentration von 1 mg/ml nachgewiesen werden konnte, beruhte demnach auf Nekrose. N2 - Graphene and silicon dioxide nanoparticles are of interest as drug carriers for controlled drug delivery systems. This thesis is an evaluation of the toxic properties of the nanoparticles Graphene and Silicon dioxide based on tests on cell culture. The Graphene nanoplatelets were 6 to 8 nm thick and 15 µm wide. The Silicon dioxide nanoparticles were spherical and porous with a particle size of 5 to 20 nm. The dose dependent toxicity (concentrations 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml und 1 mg/ml, incubation over 24 hours) was tested on 5 different cell lines (cerebEND, Caco-2, Hep G2, HEK-293, H441). I used cell viability test (CellTiter-Glo Assay, EZ4U-test). In addition, I used PCR (Polymerase chain reaction) and western blot to detect the apoptosis markers Bax and Caspase-3, to see if the nanoparticles cause an apoptosis or a necrosis. For investigating the cell viability, I used the CellTiter-Glo Assay. Graphene nanoplatelets showed from a concentration of 1 mg/ml for the cell lines HEK-293 und H441 a statistically significant decrease of cell viability. CerebEND and Hep G2 cells reacted on Graphene nanoplatelets from a concentration of 1 mg/ml with a clearly decrease in cell viability, but these results were not statistically significant. The cell line Coco-2 showed no decrease in cell viability after the incubation with Graphene nanoplatelets. Silicon dioxide nanoparticles showed from a concentration of 1 mg/ml a statistic significant decrease of cell viability in the cell lines cerebEND, HEK-293 and H441. The Hep G2 cells showed a decrease in cell viability as well, but the results were not statistically significant. The cell line Caco-2 showed no decrease in cell viability after the incubation with Silicon dioxide nanoparticles. Cell viability tests based on the messurement of adsorption like the EZ4U-test, proved not suitable for this setting, because the own color of the nanoparticles interfered with the measurement. In addition, I tested if the nanoparticles caused an apoptosis or a necrosis. The PCR showed with one exception no statistically significant increase in the gene expression of Bax and Caspase-3 and therefore no proof of apoptosis. The western blot showed no statistically significant increase in the protein expression of Bax and Caspase-3. And it detected no activated Caspase-3. There was based on PCR and western blot no sign for the cells to enter in apoptosis. The toxic properties of the nanoparticles Graphene and Silicon dioxide, that was shown in a part of the cell lines from a concentration of 1 mg/ml, was therefore based on necrosis. KW - Nanopartikel KW - Toxizität KW - Graphen KW - Siliciumdioxid KW - Drug Targeting KW - Targeted drug delivery KW - Zellkultur Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-330562 ER - TY - THES A1 - Giniunaite, Aiste Marija T1 - Effekte von Tumor Treating Fields (TTFields) auf die Blut-Hirn-Schranke in einem murinen (cerebEND) und humanen (HBMVEC) Zellkulturmodell T1 - Effects of tumour treating fields (TTFields) on the blood-brain barrier in a murine (cerebEND) and human (HBMVEC) cell culture model N2 - TTFields sind eine zugelassene Therapie für die Behandlung von Glioblastom IDH-Wildtyp. Es handelt sich dabei um elektrische Wechselfelder niedriger Intensität und mittlerer Frequenz, die therapeutisch aus zwei Richtungen durch ein tragbares, nicht-invasives Gerät appliziert werden. Sie verhindern die Spindelfaserbildung während der Mitose. Die Wirkung vieler effektiver Chemotherapeutika ist im ZNS durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) eingeschränkt. Die BHS wird nach TTFields Applikation bei 100 kHz in einem murinen cerebEND-Zell-Modell vorübergehend geöffnet. Dieser Effekt wurde in dieser Arbeit zunächst mit Hilfe von Immunfluoreszenzmikroskopie und dann durch einen fraktionierten Western-Blot bestätigt, dass der mutmaßliche Wirkungsmechanismus von TTFields in der Delokalisierung des tight junction Proteins Claudin-5 von der Membran in das Zytoplasma liegt. TEER-Messungen zeigten, dass sich die Integrität der BHS durch 100 kHz TTFields nach 72 h verringerte und 48 h - 72 h nach Ende der Behandlung wieder normalisierte, auch wenn statt eines Behandlungsendes auf 200 kHz TTFields umgeschaltet wurde. Der zweite Teil der Untersuchung bestand darin, ein BHS-Modell aus humanen HBMVEC Zellen zu etablieren, um die Auswirkungen von TTFields im humanen System verifizieren zu können. Zunächst konnten keine Effekte von TTFields unterschiedlicher Frequenz auf eine HBMVEC-Monokultur festgestellt werden. In einer Kokultur mit Perizyten gab es eine erhöhte Expression von Claudin-5, Occludin und PECAM-1. Allerdings zeigten die TEER-Messungen und ein Permeabilitätsassay keine Unterschiede zwischen den Mono- und Kokultur-Modellen der BHS auf. Durch eine transiente Öffnung der BHS könnte eine höhere Dosis von Therapeutika, die normalerweise die BHS nicht überwinden können, im ZNS erreicht werden. Damit könnten TTFields eine innovative Methode zur Behandlung von Hirntumoren und anderen Erkrankungen des ZNS darstellen. Die hier präsentierten Daten geben erste Hinweise in diese Richtung, müssen aber noch optimiert und verifiziert werden. N2 - TTFields are an approved therapy for the treatment of glioblastoma IDH-wildtype. They are low intensity, medium frequency alternating electric fields which are applied therapeutically from two directions by a portable, non-invasive device. TTFields prevent spindle fiber formation during mitosis by aligning the strongly polar tubulin subunits in the electrical fields. The achievement of effective chemotherapy of glioblastoma IDH-wildtype and other central nervous system (CNS) disorders is limited by the blood-brain barrier (BBB). Application of TTFields at 100 kHz at the mouse cell line cerebEND temporarily opens the BBB. This TTFields effect was observed in fluorescence microscopy. Fractionated Western-Blots revealed delocalisation of the TJ-Protein Claudin-5 from the membrane to the cytoplasm due to the application of TTFields. The integrity of the BBB has been shown in TEER measurements to be interrupted by 72 h TTFields application at 100 kHz. This effect was reversible and repeatable. In addition, if TTFields at 200 kHz were applied after BBB-opening at 100 kHz the cells recovered. The second part of this project was to establish a human cell culture BBB model (HBMVEC) to investigate TTFields effects on human cells. There were no effects of TTFields at different frequencies on HBMVEC cells detectable. HBMVEC cells had lower expression of Claudin-5, Occludin and PECAM-1 compared to their co-culture with pericytes. However, TEER measurements and permeability assays revealed no differences between such mono- and co-cultures. By overcoming the BBB a higher dose of the drugs could be achieved in a more controlled manner in the CNS. As a result, TTFields could be an innovative method for the treatment of brain tumours and other diseases of the CNS. The presented experiments provide a first rationale in this direction but require optimisation and verification. KW - Tumortherapiefelder KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Glioblastom KW - Zellkultur KW - cerebEND Zellkultur KW - HBMVEC Zellkultur KW - TTFields KW - blood-brain barrier KW - cerebEND KW - HBMVEC KW - Tumor Treating Fields Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310648 ER - TY - THES A1 - Goektas, Volkan T1 - Einfluss von CYR61 auf die chondrogene Differenzierung humaner Chondrozyten T1 - Influence of cyr61 on the chondrogenic differentiation of human chondrocytes N2 - Das CCN Protein CYR61 besitzt eine Reihe außergewöhnlicher biologischer Funktionen. Als ein Molekül der EZM dient es der Regulation zellulärer Aktivitäten wie Adhäsion, Wanderung und Proliferation. Diese Funktionen stehen im Einklang mit der Wirkung von Proteinen, die Zellwachstum und Differenzierung steuern. Die gewebespezifische und zeitlich begrenzte Expression von CYR61 in Mäuseembryonen lieferte bereits erste Hinweise über eine mögliche Beteiligung an der Entwicklung des Skelettsystems. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde das CYR61 Protein in nachfolgenden Arbeiten als ein neuer, die Chondrogenese regulierender, Faktor identifiziert. Welchen Einfluss dieses Proteins auf den Knorpelstoffwechsel unterschiedlicher humaner Chondrozytenzelllinien hat wurde Gegenstand neuer Untersuchungen. Dieses Interesse bildete die Grundlage zur Themenstellung der vorliegenden Arbeit. Die Wirkung von CYR61 auf die chondrogene Differenzierung sollte anhand zweier verschiedener Zelllinien (C-28/I2 und T/C-28a2) untersucht werden. Hierbei wurde das Expressionsverhalten von unterschiedlichen Chondrozytenmarkern unter der Wirkung von CYR61 untersucht. Die CYR61-abhängigen Effekte wurden durch RT-PCR nachgewiesen und die Ergebnisse unter serumhaltigen sowie serumreduzierten Versuchsbedingungen hierbei miteinander verglichen. N2 - The human cysteine rich protein 61 (cyr61)is a member of the CCN family of growth factor inducible immediate early genes. They play an important role in cellular processes such as adhesion, migration and proliferation. The influence of cyr61 on the chondrogenic differentiation of two different chondrocyte cell lines (C-28/I2 und T/C-28a2) was the aim of this work. The expression pattern of different collagens and proteoglycans was detected either in cyr61 stimulated cells and non-cyr61 stimulated cells for confluent and postconfluent cells. Differentiation markers were analyzed at the mRNA level by RT-PCR. To minimize seruminductive effects the experiments were also performed under serumreduced cellculture conditions. KW - Knorpelzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Proliferation KW - Polymerase-Kettenreaktion KW - Zellkultur KW - Stimulation KW - Kollagen KW - Decorine KW - Knorpelstoffwechsel KW - CYR61 KW - Aggrekan KW - Kollagen Typ II KW - CCN Protein Familie KW - Proteoglykane KW - cyr61 KW - aggrecan KW - collagen type II KW - CCN protein familiy KW - proteoglycan Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49298 ER - TY - THES A1 - Hausmann, Michael Franz Toni T1 - Untersuchungen zum Differenzierungspotential humaner Monozyten / Makrophagen in vitro T1 - A study: The Potential of human monocyte / macrophage-differentiation in vitro N2 - Unter dem Einfluss von M-CSF und GM-CSF entwickeln sich CD14-positive periphere humane Blutmonozyten zu CD68-positiven M-CSF- bzw. GM-CSF-Makrophagen. M-CSF-Makrophagen lassen sich mit INFg und LPS zu klassisch aktivierten M1-Makrophagen, oder mit IL-4 und IL-10 zu alternativ aktivierten M2-Makrophagen differenzieren. Durch GM-CSF werden aus Monozyten GM-CSF-Makrophagen induziert. Im Gegensatz zu M1-Makrophagen sind GM1-Makrophagen bisher noch wenig untersucht. Mit INFg und LPS werden GM-CSF-Makrophagen zu GM1-Makrophagen aktivert. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, wie groß die Übereinstimmung zwischen M-CSF- und M2-Makrophagen sowie zwischen GM-CSF- und M1-Makrophagen / GM1-Makrophagen ist. Im Gegensatz zu M-CSF- und GM-CSF stellt Laktat aber keinen Differenzierungsfaktor für Monozyten dar. Jedoch beeinflusst Laktat den Phänotyp von M2-Makrophagen und hemmt die Ausschüttung von IL-12 und NO durch M1- und GM1-Makrophagen. N2 - In the presence of M-CSF and GM-CSF CD14-positive human blood monocytes develop into CD68-pos M-CSF- or GM-CSF-macrophages. M-CSF-macrophages differentiate when incubated with INFg and LPS to classicly activated M1-marophages, when incubated with IL-4 and IL-10 zu alternativly activated M2-macrophages. Monocytes presented to GM-CSF eventually become GM-CSF-macrophages. There are only few examinations of GM-CSF-macrophages and classicly activated GM1-macrophages compared to M1-macrophages. In this study we focused on comparing the non-activated M-CSF-macrophages to alternativly activated M2-macrophages and non-activated GM-CSF-macrophages to classicly activated GM1-macrophages/M1-macrophages. Furthermore we point out that lactate is not a potential differentiation-signal für monocytes. But lactate does infact interfere with certain macrophage-phenotypes and the secretion of proinflammatory IL-12 and NO-molecules. KW - Differenzierung KW - Makrophage KW - Monozyt KW - Mensch KW - Zellkultur KW - differentiation KW - macrophage KW - monocyte KW - human KW - in-vitro Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77801 ER - TY - THES A1 - Hoppensack, Anke T1 - Entwicklung eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus T1 - Development of a human in vitro model of the renal proximal tubule N2 - Die Epithelzellen des renalen proximalen Tubulus resorbieren große Mengen an Wasser, Glucose und weiteren wertvollen Substanzen aus dem Primärharn, um deren Ausscheidung zu verhindern. Weiterhin sekretieren sie harnpflichtige Substanzen in den Primärharn und sind in der Lage, in die Zelle aufgenommene Substanzen enzymatisch umzusetzen. Diese Funktionen machen den renalen proximalen Tubulus zu einer wichtigen Einheit für die Nie-renfunktion. Sie führen aber auch zu einer hohen Empfindlichkeit gegenüber toxischen Effek-ten von Fremdstoffen. Daher ist ein In-vitro-Modell des renalen proximalen Tubulusepithels sowohl für die Erforschung physiologischer und pathologischer Mechanismen als auch zur Testung der Toxizität von Substanzen, insbesondere neuen Arzneimitteln, bedeutend. Ein weiteres Forschungsfeld, für das ein In-vitro-Gewebe von großem Nutzen wäre, ist die Ent-wicklung von bioartifiziellen Nierenersatzsystemen. Aufgrund Spezies-spezifischer Unterschiede, z.B. in der Expression von Transportproteinen und Enzymen, ist ein Modell mit humanen Zellen anzustreben. Bisher besteht jedoch ein Mangel an Modellen, die das renale proximale Tubulusepithel für die oben genannten An-wendungsbereiche adäquat abbilden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus unter Verwendung von humanen Nierenzellen (human kidney-derived cells, hKDCs), die Eigenschaften renaler Vorläuferzellen aufweisen. In Kombination mit die-sen Zellen wurden verschiedene Kultursubstrate getestet. Dabei zeigte sich, dass die Zellen sowohl in Zellkulturplatten als auch auf Kollagen-Typ-I-beschichteten Insertmembranen mehrschichtig wachsen, ohne die typische Morphologie renaler proximaler Tubuluszellen auszubilden. In einem dreidimensionalen Kollagen-Typ-I-Hydrogel bildeten die hKDCs hin-gegen tubuläre bzw. zystäre Strukturen mit einer kubischen bis hochprismatischen Morpho-logie. Da für die oben erwähnten Anwendungsbereiche jedoch eine planare Zellschicht benö-tigt wird, erfolgte die Testung weiterer biologischer Matrices. Diese waren die Small intestinal submucosa (SIS) und das Biological vascularized scaffold (BioVaSc). Beide ließen sich aus porcinem Dünndarm herstellen, wobei bei der SIS die Mucosa sowie das Mesenterium ent-fernt wurden. Bei der BioVaSc handelt es sich um ein Darmsegment mit erhaltenem Ge-fäßsystem, dass zur Perfusion genutzt wird. Nach ihrer Kultur auf der SIS wiesen die hKDCs das typische Wachstum und die charakteris-tische Morphologie des renalen proximalen Tubulusepithels auf. Dazu gehören die Kontakt-hemmung, die das einschichtige Wachstum ermöglicht, die kubisch bis hochprismatische Morphologie sowie die Bildung eines Bürstensaums an der apikalen Zellmembran. Anhand einer Kollagen-Typ-IV- und einer Alcianblau-Färbung ließ sich die Bildung einer Basalmemb-ran an der Grenze zur SIS nachweisen. Bürstensaum- und Basalmembranbildung zeigten die zelluläre Polarisierung. Weiterhin waren typische Markerproteine renaler proximaler Tu-buluszellen wie N-Cadherin und Aquaporin-1 immunhistochemisch, zum Teil deutlich stärker als bei den Ausgangszellen, nachweisbar. Dies belegt einen positiven Einfluss der extrazellu-lären Matrixkomponenten der SIS auf die Ausbildung von Charakteristika des renalen proxi-malen Tubulusepithels. Die Albuminaufnahme als spezifische Funktion war ebenfalls nach-weisbar. Die molekularen Veränderungen der hKDCs während der Kultivierung auf der SIS ließen sich weiterhin mittels Raman-Spektroskopie bestätigen. Aufgrund der starken Interak-tion zwischen Tubulusepithel und umgebenden Kapillarnetzwerk wurde weiterhin die Co-Kultur mit Endothelzellen etabliert. Für den Vergleich der hKDCs mit einer etablierten humanen Zelllinie renaler proximaler Tu-buluszellen wurde die HK-2-Zelllinie verwendet. Mit dieser Zelllinie ließen sich die Ergebnisse der hKDCs jedoch nicht reproduzieren, was auf die fehlende Sensitivität der transformierten Zelllinie auf die Substrateigenschaften zurückzuführen ist. In der dynamischen Kultur mit der BioVaSc als Matrix waren ein inhomogenes Wachstum sowie eine variierende Markerexpression zu beobachten. Die ließ sich vor allem auf den starken Einfluss der Aussaatdichte sowie die Festigkeit der Matrix zurückführen. Bei einer erfolgreichen Optimierung der Kultur kann dieses Modell jedoch für komplexere Studien in der pharmakologischen Entwicklung nützlich sein. Mit der Kombination aus hKDCs und SIS ist es gelungen, eine einzelne, durchgängige Zell-schicht zu generieren, die wichtige Charakteristika des renalen proximalen Tubulusepithels aufweist. Weitere Untersuchungen sind nun nötig, um die Funktionalität des Modells weiter-gehend zu charakterisieren (z.B. der Transport von Substanzen und Sensitivität gegenüber toxischen Substanzen). Anschließend kann es für die spezifischen Anwendungen weiterentwickelt werden. N2 - The epithelial cells of the renal proximal tubule resorb high amounts of water, glucose and other valuable substances from the primary urine to prevent their excretion. Furthermore, they secrete metabolic waste products into the primary urine and are able to enzymatically alter absorbed substances. These functions make the renal proximal tubule an important unit for kidney function, but also lead to a high sensitivity towards toxicity of xenobiotics. There-fore, an in vitro model of the renal proximal tubular epithelium is important not only for the investigation of physiological and pathological processes, but also for toxicity testing of sub-stances, in particular, new pharmaceuticals. A further research area, for which an in vitro tis-sue would be of great value, is the development of bioartificial kidney assist devices. Due to species-specific differences, e.g. regarding the expression of transport proteins and enzymes, a model with human cells should be aimed. Until recently, there has been a lack of models that adequately simulate the renal proximal tubular epithelium for the above men-tioned fields. Therefore, the aim of this work was to develop a human in vitro model of the renal proximal tubule using human kidney-derived cells (hKDCs), which exhibit renal progenitor cell charac-teristics. Different culture substrates were tested in combination with these cells. hKDCs in cell culture plates as well as on collagen type I-coated insert membranes grew in multilayers without developing the typical morphology of renal proximal tubular cells. In contrast, in a three-dimensional collagen type I hydrogel, hKDCs formed tubular and cystic structures with a cubic to high-prismatic morphology. However, since a planar cell layer is required for the above mentioned research fields, small intestinal submucosa (SIS) and the biological vascu-larized scaffold (BioVaSc) were tested, which are both made of porcine small intestine. For SIS production, the mucosa and the mesenterium were removed, whereas the BioVaSc is a segment of the small intestine with a preserved vascular system, which can be used for per-fusion. Following their culture on the SIS, hKDCs featured the typical growth and characteristic mor-phology of the renal proximal tubule epithelium. hKDCs were contact-inhibited, which allows monolayered growth; they had a cubic to high-prismatic morphology and developed a brush border at their apical cell membrane. By collagen type IV and alcian blue staining, the for-mation of a basement membrane at the cell-matrix border was detectable. Brush border and basement membrane formation showed cellular polarization. Furthermore, marker proteins of renal proximal tubular cells such as aquaporin-1 and N-cadherin were shown by immuno-histochemistry, which were partially stronger than before SIS culture. This demonstrates a positive influence of the extracellular matrix components of the SIS on the development of characteristics of the renal proximal tubular epithelium by hKDCs. Albumin uptake as a spe-cific function was likewise detectable. The molecular changes of hKDCs during their culture on the SIS were also identified by Raman spectroscopy. Due to the strong interaction of the tubule epithelium with the peritubular capillaries, the co-culture of hKDCs with endothelial was established as well. For comparison of hKDCs with a well-established human cell line of renal proximal tubular origin, the HK-2 cell line was used. With this cell line, the results of hKDCs were not repro-ducible, which can be explained by the lacking sensitivity of the transformed cell line towards the substrate properties. In the dynamic culture with the BioVaSc scaffold, an inhomogeneous growth and a varying marker expression were observed. This was ascribed to the strong influence of the cell seed-ing density and the low matrix stiffness. If successfully optimized, this culture model can be useful for more complex studies in the pharmacological development. In summary, with the combination of hKDCs and the SIS, a single, continuous cell layer could be generated that exhibits essential characteristics of the renal proximal tubular epithelium. More studies are required to further characterize the functionality of the model (e.g. transport of substances and sensitivity towards toxic substances). Subsequently, it can be further de-veloped for specific applications. KW - Niere KW - In vitro KW - Tissue Engineering KW - Gewebekultur KW - Zellkultur KW - Tissue Engineering KW - Kidney KW - in vitro Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-81562 ER -