TY  - THES
A1  - Jehle, Margot
T1  - Interaktionen der Replikationsproteine der Maus
T1  - Interactions of the replicationproteins from mouse
N2  - Zusammenfassung Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozeß, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der ORC-Komplex an Replikationsorigins in chromosomaler DNA, wodurch die Assemblierung des präreplikativen Komplexes an den Origins ausgelöst wird. Anschließend lagern sich CDC6- und RLF-B/CDT1-Protein an den ORC an, die beide schließlich für die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivität der CDC7/DBF4-Kinase wird der Origin lizensiert, nachdem der letzte Initiationsfaktor CDC45 die Assemblierung des pre-RC vervollständigt hat. Ein Ziel dieser Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Proteininteraktionen zwischen den verschiedenen Initiationsproteinen durch Two-Hybrid-Studien aufzuklären. Dazu wurden die cDNAs aller bisher in Mus musculus charakterisierten Initiationsproteine, wie ORC1-6, CDC6, MCM2-7, CDC7, DBF4, CDC45, der "polo like kinase" CDC5/PLK, des DNA-Einzelstrang-bindenden Replikationsproteins RPA mit seinen Untereinheiten RPA14, RPA32, RPA70 und schließlich des heterodimeren Proteins Ku mit den Untereinheiten Ku80 und Ku70 jeweils in zwei verschiedene Hefevektoren inseriert. Zum einen handelt es sich dabei um den Ködervektor pEG202 und andererseits um den Beutevektor pJG4-5 des Two-Hybrid-Systems. Dabei wurden alle möglichen Köder-/Beute-Proteinkonstellationen auf eine Aktivierung des Reportergens LacZ hin untersucht und so zahlreiche Protein-Proteininteraktionen identifiziert. Einige der hier beschriebenen Wechselwirkungen waren auch in anderen Spezies identifiziert worden und konnten somit für Maus bestätigt werden. Im Rahmen dieser Two-Hybrid-Untersuchungen wurden allerdings auch erstmals neue Protein-Proteininteraktionen nachgewiesen, wie beispielsweise CDC5/PLK mit MCM2 oder Ku80 mit ORC1, -2, -4 und -5. Sowohl von CDC5/PLK- als auch von Ku80-Protein wurde vermutet, daß sie im Zusammenhang mit der Initiation der DNA-Replikation stehen könnten. Die Two-Hybrid-Interaktionen hier vermittelten neue Indizien, die diese Vermutung untermauern. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden fünf CDC7-Deletionsmutanten konstruiert, um die Interaktionsdomänen des CDC7-Proteins mit anderen Proteinen im Rahmen des Two-Hybrid-Systems bestimmen zu können. Die Mutanten wurden dazu jeweils in den pEG202- und den pJG4-5-Hefevektor inseriert. Die Hefe-Studien wurden nur mit denjenigen Proteinen durchgeführt, mit denen das CDC7-Wildtyp-Protein im ersten Teil der Arbeit positive Interaktionen eingegangen war. Auffallend bei den Untersuchungen mit den Deletionsmutanten war, daß sie in der Köderposition mehr Interaktionen eingingen als in der Beuteposition. Nur die C1-, C2- und N2-Mutante gingen noch Wechselwirkungen mit einigen Initiatorproteinen ein, während weder die C2- noch die N1-Mutante dazu in der Lage waren. Als Resultat dieser CDC7-Interaktionsdomänenkartierung stellte sich das Kinase-Insert II als ein für die Mehrheit der Protein-Proteininteraktionen des CDC7-Proteins zentrales Element heraus. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war es, paradigmatisch einzelne Protein-Proteininteraktionen, die in den Two-Hybrid-Studien aufgefunden worden waren, mittels einer zweiten Methode zu analysieren. Zusätzlich sollte die Zellzyklusabhängigkeit einzelner Interaktionen der an der Initiation der DNA-Replikation beteiligten Proteine untersucht werden. Dazu wurden Immunpräzipitationsversuche mit synchronisierten FM3A-Mauszellen durchgeführt. Die in Suspensionskultur kultivierten Mauszellen wurden mit Mevastatin in früher G1-, mit Mimosin in G1/S-, mit Hydroxyharnstoff in der S- und mit Nocodazol in der Mitose arretiert. Ausgangsbasis für die weiteren IP-Experimente waren aus den FM3A-Zellen präparierte Kernextrakte. Folgende Antikörper wurden zur Inkubation mit Kernextrakten verwendet: gegen ORC1-, ORC2-, ORC3-, ORC5-, ORC6-, CDC6-, MCM2-, MCM7- und DBF4 gerichtete Antikörper. Mit allen genannten Antikörpern konnten Immunpräzipitationen zwischen einzelnen ORC-Untereinheiten, CDC6- und ORC-Proteinen, einzelnen MCM-Untereinheiten und ORC2- bzw. CDC6-Protein und zwischen der regulatorischen Untereinheit der DDK-Kinase DBF4 und einigen ORC-Untereinheiten nachgewiesen werden. Ein großer Teil der IPs trat in zellzyklusunabhängiger Weise auf, während ein kleinerer Anteil Zellzyklusabhängigkeit zeigte, wie beispielsweise die CDC6-ORC2-Wechselwirkung, die nur von der frühen bis zur späten G1-Phase beobachtet werden konnte. Im vierten und letzten Abschnitt dieser Arbeit ging es um die Identifizierung eines Maus-EST-Klones für das CDT1-Gen. Das CDT1-Protein ist essentieller Bestandteil der Initiation der DNA-Replikation und sorgt gemeinsam mit dem CDC6-Protein für die Rekrutierung des MCM-Komplexes an den Origin, wodurch der präreplikative Komplex für die anstehende Initiation der DNA-Replikation lizensiert wird. Der vollständige Maus-EST-Klon wurde mittels einer Sonde durch radioaktive Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek von 9 Tage alten Mausembryonen identifiziert und charakterisiert. Die vollständige Sequenz von MmCDT1 ergab einen offenen Leserahmen von 1673bp und kodiert für ein Protein mit 557 Aminosäuren und einer Molmasse von 61.5 kDa.
N2  - Summary The initiation of DNA replication is a highly conserved process which is subdivided into three steps. The first step is the binding of the origin recognition complex to the replication origins in chromosomal DNA which triggers off the assembly of the prereplicative complex at the origins. Subsequently the CDC6 and the RLF-B/CDT1 proteins bind to ORC which are both responsible for the recruitment of the heterohexameric MCM complex to the prereplicative complex (pre-RC). The CDC7/DBF4 kinase licenses the origin after completion of the pre-RC by binding of the CDC45 protein. One task of this work was to dissolve the complex network of protein-protein interactions between the different initiator proteins with the method of the two-hybrid-system. Therefore the cDNAs encoding all described initiator proteins of Mus musculus, ORC1-6, CDC6, MCM2-7, CDC7, DBF4, CDC45, the "polo like kinase" CDC5/PLK, the single-stranded replication protein RPA with its subunits RPA14, RPA32 and RPA70 as well as the heterodimeric Ku protein with the Ku70 and the Ku80 subunits were inserted into the two-hybrid vectors pEG202 and pJG4-5. All possible bait/prey protein combinations were tested for the activation of the LacZ reporter gene. Numerous protein-interactions were detected which have been described already in other species and were confirmed here for the mouse system. There were also new protein-protein interactions observed, for example the interaction between the CDC5/PLK protein and the MCM2 protein or between the Ku80 subunit and the ORC1, 2, 4 and 5 proteins. Both the CDC5/PLK and the Ku80 protein are thought to be involved in the initiation of DNA replication. The demonstrated protein interactions provide evidence for this hypothesis. In the second part of this work five deletion mutants of the CDC7 protein were constructed to determine the interaction domains relevant for protein interactions with other proteins in the two-hybrid system. The mutants were inserted into the vectors pEG202 and pJG4-5. Only those proteins were tested for interaction with the CDC7 deletion mutants which have already shown interactions with the wild-type CDC7 protein. Proteins in the bait position showed much more interactions as proteins in the prey position. Protein interactions were observed with the C1, C2 and the N2 mutants whereas the C3 and the N1 mutants were not able to interact with any of the initiator proteins. The kinase-insert II was shown to be a central element for the majority of the protein-protein interaction of the CDC7 protein, possibly being responsible for most of the CDC7 interactions. Further task was the analysis of some paradigmatically chosen protein-protein interactions obtained in the two-hybrid studies with the help of a second experimental method, i.e. the immunoprecipitation technique. Additionally the cell cycle dependence some of the interactions involved in the initiation of DNA replication was examined. Immunoprecipitation experiments were performed with synchronized mouse FM3A cells which were arrested in early G1 phase by mevastatin, at the G1/S transition by mimosine, in S phase by hydroxyurea and in mitosis by nocodazol. Nuclear extracts made from the FM3A cells were used for the immunoprecipitations. The following antibodies were used for incubation with the nuclear extracts: antibodies raised against ORC1, ORC2, ORC3, ORC5, ORC6, CDC6, MCM2, MCM7 and DBF4, respectively. Immunoprecipitations were found among some of the ORC subunits, CDC6 and ORC proteins, some MCM subunits and ORC2 and CDC6 proteins, respectively, as well as among the regulatory subunit DBF4 of the DDK kinase and some of the ORC subunits could be demonstrated with all the above mentioned antibodies. Most of the immunoprecipitations were found to be cell cycle-independent, whereas only some of them were cell cycle-dependent. For example the CDC6-ORC2 interaction which was only observed from early G1 phase to the G1/S transition. The last part of this work was the identification of a mouse EST clone for the CDT1 gene. The CDT1 protein together with CDC6 is essential for loading MCM2-7 proteins into prereplicative complexes during replication licensing. Screening a cDNA library of 9 days old mouse embryos with a radioactive labeled probe resulted in the complete mouse EST clone of CDT1. The full length sequence of MmCDT1 revealed an open reading frame encoding a predicted protein of 557 amino acids with a molecular mass of 61.5 kDa.
KW  - Maus
KW  - Replikation
KW  - Regulation
KW  - Initiation der DNA Replikation
KW  - Initiationsproteine der Maus
KW  - Two-Hybrid-System
KW  - Protein-Protein-Interaktionen
KW  - Immunpräzipitationen
KW  - initiation of DNA-replication
KW  - initiation proteins of mouse
KW  - two-hybrid-system
KW  - protein-protein-interactions
KW  - immunprecipitations
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4068
ER  - 
TY  - THES
A1  - Riedl, Sabine
T1  - Untersuchungen zur Induktion und zum Transfer der Vancomycin-Resistenz vom VanA-Typ sowie zur Flavophospholipol-Resistenz in Enterococcus faecium
T1  - Investigations concerning the induction and the transfer of VanA-type glycopeptide resistance in Enterococcus faecium
N2  - Enterokokken gelten primär als opportunistische Erreger mit geringer Pathopotenz. Sie zeichnen sich allerdings durch ausgeprägte natürliche und erworbene Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika aus. Besorgniserregend ist hierbei insbesondere das Auftreten von Vancomycin-resistenten Enterokokken. Glycopeptidantibiotika, wie Vancomycin und Teicoplanin, werden als Reserveantibiotika gegen multiresistente gram-positive Erreger, wie zum Beispiel Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Stämme (MRSA) eingesetzt. Der VanA-Typ der Glycopeptidresistenz, welcher zuerst in Enterococcus faecium beschrieben wurde, ist die in Zentraleuropa vorherrschende Variante der Glycopeptidresistenz. Das Transposon Tn1546, das die vanA-Resistenzdeterminante kodiert, liegt häufig auf großen konjugativen Plasmiden vor und kann zwischen Enterokokken-Stämmen transferiert werden. In dieser Arbeit wurde der direkte Einfluss von Vancomycin und eines weiteren Antibiotikums, Flavophospholipol (FPL), auf die Rate des konjugativen Transfers des vanA-Operons in E. faecium untersucht. Das Phosphoglycolipidantibiotikum FPL wird derzeit als Leistungsförderer in der Tiermast eingesetzt. Beide Antibiotika induzieren die Expression der Glycopeptidresistenz vom VanA-Typ. Es konnte gezeigt werden, dass Flavophospholipol in unterschiedlichen Konzentrationen die Häufigkeit des Transfers von konjugativen VanA-Plasmiden sowohl in klinischen E. faecium-Isolaten, als auch in E. faecium-Stämmen aus Tierfaeces signifikant hemmte. Vancomycin zeigte keinen signifikanten Effekt auf die Transferrate der VanA-Plasmide. Somit konnte nachgewiesen werden, dass in E. faecium kein funktionaler Zusammenhang zwischen der Induktion des vanA-Operons durch Vancomycin und FPL und der Transferfrequenz der konjugativen VanA-Plasmide unter dem Einfluss der beiden Antibiotika besteht. Weiterhin wurde die Induktion des vanA-Operons unter dem Einfluss verschiedener Antibiotika in einem E. faecium-Isolat näher untersucht. Hierbei wurde die Expression des 39 kDa VanA-Ligase Proteins direkt durch das Western Blot-Verfahren dargestellt. Eine Induktion der Expression des VanA-Ligase Proteins erfolgte durch Inhibitoren der späten Phase der Zellwandsynthese, wie Vancomycin, Flavophospholipol, Bacitracin und Tunicamycin. Außerdem konnte eine leichte Induktion des VanA-Ligase Proteins durch Fosfomycin, Cefalexin und Cefuroxim, Meropenem und Clindamycin nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass Cefuroxim und Clindamycin zwei Antibiotika, die in klinischen Studien eine Besiedelung mit VRE begünstigen, auch eine geringe Zunahme der VanA-Ligase Expression bewirken. Zudem wurde deutlich, dass durch den Einfluss von Hitzestress und osmotischem Stress keine Induktion der 39 kDa VanA-Ligase Bande erfolgt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung einer putativen Resistenz-determinante gegen Flavophospholipol. Die Eigenschaft der FPL-Resistenz konnte nicht durch in vitro-Filterkonjugation von FPL-resistenten auf FPL-sensitive E. faecium-Stämme übertragen werden. Zur molekularen Untersuchung der Resistenz gegen Flavophospholipol wurde ein resistenter E. faecium-Stamm durch das konjugative Transposon Tn916 mutagenisiert. In allen identifizierten FPL-sensitiven Mutanten war die Insertionstelle des Transposons und dessen Orientierung im Chromosom identisch und es deletierte ein 1,5 kb großer genomischer Bereich „downstream“ der Transposon-Insertionsstelle. Dieser Bereich umfasste das 3´-Endes des Gens für eine putative Threonyl-tRNA Synthetase und den Genlocus für einen putativen Transkriptionsregulator. Die Sequenzen in allen Mutanten begannen ca. 200 bp vor dem Startcodon eines Gens für ein putatives Penicillin-Bindeprotein (PBP). In Northern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Transkription des putativen PBP in der Mutante 64/3-1 schwächer war als im Wildtyp 64/3. Außerdem wurden durch 3H Penicillin-Markierung von PBP-Extrakten Unterschiede im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine im Wildtyp und in der Mutante deutlich. Während im Wildtyp fünf Penicillin-Bindeproteine zu erkennen waren, fehlten PBP2 und PBP3 in der Mutante 64/3-1. Die Größe von PBP3 entsprach hierbei der geschätzten Größe des putativen PBP von 79 kDa. In der Mutante 64/3-1 fand wahrscheinlich durch den Verlust eines putativen Regulators oder wichtiger regulatorischer Bereiche eine Veränderung im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine statt, welche zum FPL-sensitiven Phänotyp führte. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass Flavophospholipol in E. faecium an PBP2 und PBP3 bindet und es sich hierbei um bifunktionale „high molecular weight“ Penicillin-Bindeproteine mit Transglycosylase- und Transpeptidase-Untereinheit handeln muss.
N2  - Enterococci are primary opportunistic pathogens. Species of this genus are inherently resistant to many antimicrobial agents and readily acquire additional resistances, which is likely the reason why enterococci have become prominent nosocomial pathogens. Glycopeptides, such as vancomycin and teicoplanin are the antibiotics of last resort for the treatment of methicillin-resistant staphylococci (MRSA). In Central Europe, the VanA-type is the most frequent genotype of acquired glycopeptide resistance. The vanA gene cluster is located on transposons of the Tn1546 type, which are integrated into conjugative plasmids, and can therefore be transferred among enterococcal strains. In this study, the influence of vancomycin and flavophospholipol (FPL) on the conjugative transfer of vanA plasmids was determined in several Enterococcus faecium strains. FPL is a phosphoglycolipid antibiotic used as a growth promoter in animal husbandry. Both antibiotics have an inducing effect on the vanA operon. We showed that subinibitory concentrations of FPL inhibit the tranfer of vanA plasmids. This inhibitory effect is dose-dependend and was observed both in clinical and animal isolates of E. faecium. Vancomycin had no significant effect on the transfer rate of vanA plasmids. These results suggest that there is no functional link between the induction of vancomycin resistance of VanA-type and the frequency of transfer of conjugative vanA plasmids in E. faecium. Furthermore, the influence of some antibiotics on the VanA ligase protein expression was examined by Western-blotting analysis. Induction of the 39 kDa protein could be detected after addition of some cell-wall active agents such as vancomycin, flavophospholipol, bacitracin and tunicamycin. Fosfomycin, cefalexine and cefuroxime as well as meropenem and clindamycin had a weaker inducing effect on the VanA ligase protein expression. Heat- and osmotic stress had no effect on the expression of the VanA ligase. A further objective of this study was the identification of a putative Flavophospholipol resistance determinant. Transfer of the FPL resistance between E. faecium strains could not be detected in filter mating experiments. For the molecular analysis of the Flavophospholipol resistance an insertional mutagenesis was carried out in a FPLr E. faecium strain using the conjugative transposon Tn916. The chromosomal insertion sites of the transposon were identical in all identified mutants with a 1.5 kb sequence deletion downstream of Tn916. Sequence analysis of the deleted area revealed homolgy to the 3´-end of a putative threonyl-tRNA synthetase gene and the gene of a putative regulator. The sequences in all mutants began about 200 bp upstream of the startcodon of a putative penicillin-binding protein (PBP) gene. The transcription of this penicillin-binding protein was weaker in the transposonmutant 64/3-1 than in the wildtype 64/3 as could be shown by Northern hybridisation. Further, binding-studies using 3H penicillin showed differences in the expression pattern of the penicillin-binding proteins between wildtype and mutant 64/3-1. The wildtype contained five PBP, while PBP2 and PBP3 where not marked in mutant 64/3-1. The size of PBP3 corresponds with an estimated size of the putative penicillin-binding protein of 79 kDa. This results suggest that the change in the penicillin-binding protein expression pattern of FPLs mutant 64/3-1 may be caused by the loss of a putative regulator or an important regulatory sequence. The PBP studies also show that FPL binds to PBP2 and PBP3 in E. faecium and these are likely bifunctional high molecular weight penicillin-binding proteins with transglycosylase- and transpeptidase-modules.
KW  - Streptococcus faecium
KW  - Vancomycin
KW  - Flavomycin
KW  - Arzneimittelresistenz
KW  - Genregulation
KW  - Enterococcus faecium
KW  - VanA
KW  - Flavophospholipol
KW  - Regulation
KW  - Resistenz
KW  - Enterococcus faecium
KW  - VanA
KW  - flavophospholipol
KW  - regulation
KW  - resistance
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5633
ER  -