TY  - THES
A1  - Merle, Christian
T1  - Bedeutung von DNA- Polymorphismen für die Entstehung primärer Gonarthrose in einem arthroskopisch definierten Patientenkollektiv
T1  - Impact of DNA- Polymorphisms on Primary Knee Osteoarthritis in an Arthroscopically Defined Patient Cohort
N2  - Die primäre Gonarthrose ist ein komplexer, multifaktoriell bedingter Krankheitsprozess mit genetischer Komponente und gilt aufgrund ihrer epidemiologischen und sozioökonomischen Bedeutung als Volkskrankheit. Die Gene bzw. Proteine der Wnt- Familie spielen eine wichtige Rolle in der komplexen Regulation der Morphogenese, der Zelldifferenzierung , -proliferation und der Homöostase von Knochen und Knorpel. LRP 1 und LRP 5 fungieren als Co-rezeptoren des Wnt- Signalweges. In der vorliegenden Untersuchung wurden der A217V Polymorphismus des LRP 1 Gens und der A1330V Polymorphismus des LRP 5 Gens auf eine signifikante Assoziation mit dem Auftreten primärer Gonarthrose in einem arthroskopisch definierten Patientenkollektiv untersucht. Ziel der Studie war es, klar definierte Kollektive mit möglichst extremen Zuständen gegenüberzustellen und eine hochspezifische und hochsensitive Diagnostik zu verwenden. Junge, bereits in frühen Jahren an Gonarthrose erkrankte Patienten (<45 Jahre, Gruppe 1, n= 100) wurden älteren Patienten (>55 Jahre, Gruppe 3, n= 103), die nicht an Gonarthrose erkrankt waren, gegenübergestellt. Als weitere Gruppe dienten Patienten, welche eine endoprothetische Versorgung bei fortgeschrittener Gonarthrose erhielten (>55 Jahre, Gruppe 2, n= 86). Die Diagnose der primären Gonarthrose wurde anhand anamnestischer Daten sowie arthroskopischer bzw. direkt visuell erhobender Befunde im Rahmen der Arthrotomie bei Prothesenimplantation gestellt. Der Arthroseausschluss (Gruppe 3) erfolgte ebenfalls arthroskopisch. Methodisch wurden der WOMAC- Score, die Restriktions- Fragment- Längen- Polymorphismus (RFLP) Analyse sowie die Gensequenzierung angewendet. Die Allelverteilung der untersuchten Polymorphismen von LRP 1 und LRP 5 konnte zwischen den beiden gegenübergestellten Gruppen 1 und 3 keinen signifikanten Unterschied aufweisen. Für den LRP 5 A1330V Polymorphismus ergab sich ein signifikanter Unterschied (p< 0,05) zwischen den Gruppen 2 und 3. Dies kann als Hinweis auf eine mögliche arthrosefördernde oder auch protektive Funktion dieses Polymorphismus gewertet werden. Im Vergleich der Extremkollektive (Gruppe 1 vs. Gruppe 3) deutet sich lediglich ein Trend an (p= 0,067), so dass eine Assoziation des A1330V Polymorphismus des LRP 5 Gens mit primärer Gonarthrose erst durch weitere Untersuchungen mit höherer Fallzahl eindeutig bestätigt bzw. widerlegt werden kann.
N2  - Primary osteoarthritis of the knee is a complex, multifactorial process with a genetic component and has a high epidemiologic and sociooeconomic impact. Genes and proteins of the Wnt- family play a key role in the complex regulation of bone and catilage development and homeostasis. LRP 1 and LRP 5 act as co- receptors of Wnt signaling. The aim of this study was to investigate a potential association of the A217V SNP of the LRP 1 gene and the A1330V SNP of the LRP 5 gene with primary knee osteoarthritis in an arthroscopically defined patient cohort. SNP allels of young patients with severe knee OA (<45 years, group 1, n= 100) were compared to those of patients without knee OA (>55 years, group 3, n= 103) and to those of patients who received a total knee replacement (>55 years, group 2, n= 86). Primary OA was diagnosed on the basis of anamnestic data, arthroscopy or open joint exploration during total knee replacement. OA was ruled out by arthroscopy for patients in group 3. Methods included WOMAC- Scores, restriction- fragment- length- polymorphism (RFLP) analysis and gene sequencing. No differences in genotyp distribution were detected between group 1 and group 3 for LRP 1 and the LRP 5 SNPs. There was a statisically significant association (p< 0,05) of the LRP 5 A1330V SNP comparing group 2 and group 3 which may be interpreted as a potential protective or promoting function of this SNP in the OA process. Comparing the extreme groups 1 and 3 for the LRP 5 SNP, only a trend (p= 0,067) was observed, so that future research with higher patients numbers is recommended to clarify these results. The role of SNPs in the process of primary knee OA remains to be investigated.
KW  - Kniegelenkarthrose
KW  - Molekulargenetik
KW  - Arthroskopie
KW  - Polymorphismus
KW  - LRP
KW  - SNP
KW  - Knee
KW  - Osteoarthritis
KW  - Genetics
KW  - SNP
KW  - Arthroscopy
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38784
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hemmrich, Ulrike
T1  - Beschreibung und Charakterisierung einer neuen Pathogenitätsinsel, integriert in das selC-Gen von "Locus of enterocyte effacement"-negativen, Shiga-Toxin-produzierenden Escherichia coli
T1  - Description and characterisation of a new pathogenicity island, integrated in selC of Locus of enterocyte effacement-negative Shiga Toxin-producing Escherichia coli
N2  - Shiga Toxin-produzierende Escherichia coli (STEC) verursachen Diarrhöen und hämorrhagische Colitis. Als lebensbedrohliche Komplikation können sie ein hämolytisch-urämisches Syndrom auslösen. Bisher identifizierte Virulenz-faktoren der STEC sind auf Bakteriophagen, Plasmiden und Pathogenitätsinseln kodiert. Bei der Mehrzahl der klinischen STEC-Isolate konnte die Pathogen-itätsinsel LEE (locus of enterocyte effacement) nachgewiesen werden. Der LEE ist stromabwärts des Gens für eine Selenocystein-tRNA (selC) ins Chromosom integriert. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von STEC, denen der LEE fehlt und die funktionelle Analyse von potentiellen Virulenz-assoziierten Genen. Dabei wurde eine Fokussierung auf Gene vorgenommen, die im Bereich der selC-Region vorkommen. Mittels PCR wurde zunächst überprüft, ob bei den LEE-negativen STEC-Stämmen Fremd-DNA in der selC-Region integriert ist. Hierzu wurden 35 LEE-negative STEC getestet. Bei 13 Stämmen konnte eine Insertion von Fremd-DNA gezeigt werden. Von einem dieser Stämme (E. coli 4797/97, Serovar O91:H-) wurde aus einer Genbank ein die selC-Region enthaltendes DNA-Fragment identifiziert. Ein 37,7 kb großes Fragment dieses Cosmids wurde vollständig sequenziert. Die Analyse der gesamten Sequenz ergab 30 offene Leserahmen mit Längen zwischen 95 und 4092 bp. Der G+C-Gehalt betrug 47,4%. An mehreren Stellen wurden Bereiche mit hoher Homologie zu verschiedenen Insertionssequenzen, inverted repeats und Integrasen gefunden. Drei Leserahmen hatten eine hohe Homologie zu bereits bekannten Genen. Hierbei handelt es sich um die iha- , btuB- und espP-Gene von E. coli. Das iha-Gen kodiert für ein Adhärenz-vermittelndes Protein, btuB für den Vitamin B12 Rezeptor und espP für eine Serinprotease. Bei den iha-Adhäsinen und Serinproteasen handelt es sich um potentielle Pathogenitätsfaktoren. Der sequenzierte Bereich hat somit die charakteristischen Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel: Die Präsenz von mehreren Pathogenitätsgenen und mobilen Elementen (Insertionselemente, Integrasen), die Lokalisation nahe an tRNA-Genen sowie ein veränderter G+C-Gehalt gegenüber dem Restgenom. Zur weiteren Charakterisierung des espI-Genprodukts wurde espI subkloniert. Bei der Untersuchung von Kulturüberständen zeigte sich, dass der Subklon DH5/pzh4 ein Protein von etwa 110 kDa sezernierte. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Serinprotease des Stammes 4797/97 als 140,8 kDa großes Vorläuferprotein synthetisiert und während des anschließenden Exportvorganges sowohl N-terminal als auch C-terminal prozessiert wird. Das C-terminale Ende wirkt als Translokator durch die äußere Membran, wo es nach Abspaltung des reifen EspI-Proteins verbleibt. Das reife Protein weist eine Größe von 110,5 kDa auf. Der hier gezeigte Transportmechanismus ist charakteristisch für sogenannte Autotransporter-Proteine. Trotz der hohen Sequenzhomologie zur IgA1-Protease von Neisseria gonorrhoeae, die als Prototyp der Autotransporter-Proteine gilt, konnte für EspI keine Proteaseaktivität gegenüber IgA gezeigt werden. EspI weist auch hohe Sequenzhomologie zu Exoproteinen von Shigella flexneri (SepA, Mucinase und SigA), EHEC (EspP) und vogelpathogenen E. coli (Tsh) auf, allerdings konnte keines der Substrate dieser Proteasen von EspI gespalten werden. Dagegen konnte eine proteolytische Aktivität gegenüber Schweine-Pepsin A und Apolipoprotein A1 nachgewiesen werden. Die putative Virulenz und räumliche Nähe der Gene espI, btuB und iha macht diese Region zum interessantesten Stück der im Rahmen dieser Arbeit identifizierten neuen Pathogenitätsinsel. Eine PCR-Untersuchung zur Verbreitung dieser Gene zeigte, dass diese Region bei LEE-negativen STEC weit verbreitet ist. Inwieweit diese Pathogenitätsinsel einen Einfluss auf die Virulenz von STEC hat, muss in weiteren Experimenten geklärt werden.
N2  - Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) cause diarrhea and hemorrhagic colitis. As life-threatening disease they can trigger a hemolytic-uremic syndrome. Virulence factors of STEC identified so far are encoded on bacterio-phages, plasmids and pathogenicity islands. The majority of clinical STEC-isolates could be proven to harbour the pathogenicity island LEE (locus of enterocyte effacement). LEE is integrated in the chromosome downstream of the gene encoding a selenocystein-tRNA (selC). Target of this work was the characterisation of STEC lacking LEE and the functional analysis of potential virulence-associated genes. The focus was put on genes found in the selC-region. Using PCR analysis it was checked whether LEE-negative STEC-strains have integrated foreign DNA. Of 35 LEE-negative STEC 13 strains could be shown to have an insertion of foreign DNA. From one of these strains (E.coli 4797/97, serogroup O91:H-) a DNA-fragment was detected from a cosmid library that harboured the selC region. The sequence of a 37,7 kb long fragment of this cosmid was fully analysed. 30 open reading frames (ORF) between 95 and 4092 bp length were identified. The G+C-content was 47,4 %. In different parts the sequence shows a high homology to diverse insertion sequences, inverted repeats and integrase genes. Three ORF had high homology to already known genes, which are the iha- btuB- and espP-genes of E.coli. The iha-gene is encoding an adherence-conferring protein, btuB the receptor for vitamin B12 and espP a serine protease. Iha-adhesines and serine proteases are potential pathogenicity factors. Thus the sequenced area shows the character-istic attributes of a pathogenicity island: The presence of different pathogenicity genes and mobile elements (insertion elements, integrases), the localisation next to a tRNA-gene and a G+C-content different from that of the whole genome.We termed the espP-homologue espI for "extracellular serine protease encoded on an island". For further characterisation of its product, espI was subcloned. In the analysis of culture supernatants its size was about 110 kDa. In following experiments it could be proven that the serine protease of the strain 4797/97 is synthesised as a 140,8 kDa protein and cleaved on the N- and C-terminal part while its export through the cell membrane. The C-terminal part functions as a locater through the outer membrane, where it remains after the cleavage of the mature EspI-protein. The size of this mature protein is 110,5 kDa. The transport mechanism found here is characteristic for so called autotransporter-proteins. Despite the high sequence-homology to the IgA1-protease of Neisseria gonorrhoae, which is taken as prototype of autotransporter proteins, a proteolytic activity of EspI towards IgA could not be shown. There are also high sequence-homologies to exoproteins of Shigella flexneri (SepA, mucinase and SigA), EHEC (EspP) and avian pathogenic E.coli (Tsh). Nevertheless none of the substrates of these proteases could be cleaved by EspI. In contrast a pretolytic activity against swine pepsine A1 and apolipoprotein A1 could be shown.The putative virulence and the close location of the genes espI, btuB and iha make this region the most interesting part of the new pathogenicity island identified in this work. A PCR-analysis about the spreading of these genes showed, that this region is widespread amongst LEE-negative STEC. The influence of this pathogenicity island on the virulence of STEC has to be clarified in further experiments.
KW  - STEC
KW  - Pathogenität
KW  - Molekulargenetik
KW  - STEC
KW  - LPA
KW  - Protease
KW  - EspI
KW  - STEC
KW  - LPA
KW  - protease
KW  - EspI
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3678
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TY  - THES
A1  - Sobeck, Alexandra
T1  - Caretaker-Gen-Syndrome
T1  - Caretaker gene syndromes
N2  - Ataxia telangiectasia: Identifizierung und Charakterisierung nicht-konservativer Spleißmutationen und deren Auswirkungen im ATM-Gen. Ein hoher Anteil der bisher im ATM-Gen identifizierten Mutationen (>350, www.vmresearch.org/atm.htm) stellt Deletionen oder Insertionen direkt an den Exongrenzen dar; viele dieser Aberrationen wurden allerdings nur auf cDNA-Ebene detektiert. Sollte es sich hierbei in den meisten Fällen um Mutationen an den Spleiß-Konsensussequenzen handeln, läge der Anteil der Spleißmutationen im ATM-Gen beträchtlich höher (~35 Prozent) als in anderen betroffenen Genen (~15 Prozent). Um der Frage nachzugehen, ob im ATM-Primärtranskript aufgrund einer erhöhten Labilität gegenüber Spleißmutationen auch Veränderungen weniger konservierter Positionen innerhalb der Donor- oder Akzeptor-Spleißstellen zu aberrantem Spleißen führen, wurden 20 AT-Zellinien mittels „Protein Truncation Test“ nach Deletionen oder Insertionen an den Exongrenzen durchsucht. Die 7 neu identifizierten Spleißmutationen wurden anschließend unter Verwendung eines „Splice Scoring“- Systems näher charakterisiert, die Penetranz der jeweiligen Mutation durch semiquantitative PCR evaluiert und die Auswirkungen auf Proteinebene durch Western Blotting überprüft. Obwohl nur eine der 7 neu identifizierten Spleißmutationen eine schwächer konservierte Position der Spleißsequenzen betraf, konnten im Rahmen einer Kooperation mit der Medizinischen Hochschule Hannover (Arbeitsgruppe Dr. T. Dörk) weitere Spleißmutationen an den Intronpositionen +3, +5 und -6 identifiziert werden, die ebenfalls in völlig aberrantem Spleißen resultieren. Daten weiterer Arbeitsgruppen lassen vermuten, daß tatsächlich ~ 50 Prozent aller Spleißaberrationen im ATM-Gen auf Mutationen außerhalb der konservierten Dinukleotidbereiche (gt und ag) zurückführen sind. Nijmegen Breakage Syndrom (NBS): Suche nach Genen, die einen NBS-ähnlichen Phänotyp auslösen. Über 90 Prozent aller NBS-Patienten tragen Mutationen im NBS1-Gen, dessen Translationsprodukt im Komplex mit MRE11 und RAD50 eine zentrale Rolle in DNA-DSB-Reparatur und Zellzykluskontrolle spielt. Weitere Mutationen bei Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp wurden im Gen der DNA-Ligase IV identifiziert, die zusammen mit weiteren Angehörigen des NHEJ-Reparaturweges (XRCC4, DNA-PKcs, Ku70, Ku80) ebenfalls in DNA-DSB-Reparatur involviert ist. Zellen von Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp wurden daher durch direkte Sequenzierung und/oder Western Blotting auf Defekte in den oben genannten Genen/Proteinen untersucht. In einem parallel durchgeführten unabhängigen Mutationsscreening (Medizinische Hochschule Hannover, Arbeitsgruppe Dr. T. Dörk) wurden in Fibroblasten einer Patientin mit NBS-ähnlichem Phänotyp Mutationen im RAD50-Gen identifiziert. Die Auswirkungen der RAD50-Defizienz auf die zelluläre Lokalisation der beiden Komplexpartner NBS1 und MRE11 sowie deren Fähigkeit zur Focibildung nach DNA-Schädigung wurde im Rahmen dieser Arbeit durch Immunfluoreszenzstudien untersucht: während NBS1 vorwiegend nukleäre Lokalisation aufwies, war MRE11 zu etwa gleichen Anteilen zwischen Nukleus und Zytoplasma verteilt; beide Proteine waren nach Bestrahlung der Zellen nicht mehr zur Focibildung fähig. Da in MRE11-defizienten Zellen keine nukleäre NBS1-Lokalisation beobachtet wird, scheint der Kerntransport des NBS1 von funktionellem MRE11, nicht aber von RAD50 abhängig zu sein. Fanconi Anämie (FA): Untersuchung einer möglichen Verbindung zwischen den FA-Proteinen und der RAD51-Familie. FA-Zellen aller bisher bekannter Komplementationsgruppen zeichnen sich durch Hypersensitivität gegenüber DNA-„interstrand crosslinks“ (ICLs) aus, zu deren Behebung u.a. die homologe Rekombinationsreparatur (HRR) eingesetzt wird, bei der das RAD51(A)-Protein eine zentrale Rolle spielt. Aufgrund schwacher Homologien werden 5 weitere Proteine (RAD51B, C, D, XRCC2 und 3) der RAD51-Familie zugeordnet. Da Knockout-Zellinien aller RAD51-Familienmitglieder ebenfalls hohe Sensitivität gegenüber ICLs aufweisen, wurde eine mögliche Verbindung zwischen den FA-Proteinen FANCA, C, G und der RAD51-Familie getestet. Unter Verwendung des "Yeast Two Hybrid" (Y2H)-Systems konnten zunächst mehrere Interaktionen zwischen FA- und RAD51-Proteinen detektiert werden. Zur Bestätigung einer funktionellen Verbindung wurden die FA- und RAD51-Proteine in humanen 293-Zellen überexprimiert. Aufgrund der focibildenden Eigenschaften des RAD51-Proteins wurden die FA-Proteine und die RAD51-Familie auf Focibildung nach DNA-Schädigung sowie etwaige Kolokalisationen getestet; mögliche physikalische Interaktionen wurden durch Koimmunpräzipitationsstudien überprüft. Die RAD51-Familie zeigten keinerlei Focibildung nach DNA-Schädigung während die FA-Proteine in einigen Experimenten eine Lokalisation in nukleäre Foci zeigten, die sich jedoch in Größe und Homogenität deutlich von denen klassischer DNA-Reparaturfoci unterschieden und nicht mit RAD51 kolokalisierten. Die häufige Beschränkung der FA-Foci auf Bereiche besonders dicht gepackten Chromatins kann möglicherweise als weiterer Hinweis auf die postulierte Rolle der FA-Proteine bei Chromatin Remodelling Mechanismen interpretiert werden. Bei Überexpression in HEK293-Zellen konnte keine der im Y2H-System identifizierten Interaktionen zwischen FA- und RAD51-Proteinen durch Koimmunpräzipitationen detektiert werden. Dennoch erscheinen seit der Identifizierung des FANCD2, das durch den FA-Komplex aktiviert wird und mit dem RAD51-Interaktor BRCA1 in nukleäre Foci kolokalisiert, weitere Untersuchungen einer Verknüpfung der FA-Proteine mit den Angehörigen des HRR-Weges durchaus sinnvoll.
N2  - Ataxia telangiectasia: Identification and characterization of mutations at non-conserved splice positions within the ATM gene. Since the identification of ATM, more than 350 different mutations have been identified (www.vmresearch.org/atm.htm) with an unusual frequency of exon skipping or deletions/insertions at the exon boundaries. Although in many studies only the observed aberrations in cDNA were reported, they presumably represent splice mutations. These findings suggest that the rate of splicing defects in the ATM gene may be substantially higher than that reported for other human genetic disorders. In order to investigate this phenomenon, we have asked the question whether the high frequency of splice mutations in the ATM gene might be caused by an increased liability of the ATM transcript towards mutations at less conserved positions within the splice site consensus sequences. Mutation screening of 20 AT cell lines using the protein truncation test revealed 10 different splice mutations, seven of which had not been reported previously. A splice scoring system was used to estimate the penetrance of each mutation. Potentially leaky splicing was evaluated by semiquantitative PCR. The implications of each mutation on the protein level were investigated by western blotting. One out of seven new splice mutations was positioned at a less conserved consensus site. Furthermore, in cooperation with the Medizinische Hochschule Hannover (group of Dr. T. Doerk), point mutations at intron positions +3, +5 and –6 were identified, each resulting in completely aberrant splicing. In addition, there is accumulating evidence from other studies that indeed ~50 per cent of splice mutations in the ATM gene are positioned outside the highly conserved donor or acceptor dinucleotides, gt or ag, respectively. Nijmegen breakage syndrome (NBS): Search for genetic defects resulting in an NBS- or NBS-like phenotype. More than 90 per cent of NBS patients carry mutations in the NBS1 gene. The NBS1 protein, in a complex with MRE11 and RAD50, is known to be involved in DNA DSB repair via NHEJ and cell cycle control. In cells from patients with an NBS-like phenotype, defects in another component of the NHEJ pathway, DNA ligase IV, have been identified very recently. Therefore, mutation screening in genes known to be involved in NHEJ (NBS1, MRE11, RAD50, DNA ligase IV, XRCC4, DNA-PKcs, Ku70, Ku80) was carried out in cell lines from NBS-like patients using direct sequencing and/or western blotting. In one of these cell lines, an independently performed screening at the Medizinische Hochschule Hannover (group of Dr. T. Doerk) revealed two mutant alleles of the RAD50 gene. In the present work, the cellular RAD50-deficient phenotype was characterized in response to induced DNA damage. In contrast to normal controls, the RAD50-deficient fibroblasts were not able to form IR-induced foci. Localization of NBS1 was still predominantly nuclear, whereas MRE11 was distributed equally between nucleus and cytoplasm. In contrast, MRE11-deficient cells do not show much nuclear localization for NBS1, suggesting that the nuclear localization of NBS1 depends on functional MRE11, but not on the presence of RAD50. Fanconi anemia (FA): Are the FA proteins linked to DNA DSB repair via the RAD51 family? FA cells of all complementation groups are hypersensitive towards DNA interstrand crosslinks (ICLs). Removal of ICLs includes the generation of a DNA DSB. Their repair is then presumably carried out by the homologous recombination (HRR) pathway, an essential component of which is the RAD51 protein. Due to weak homologies five other proteins have been assigned to the RAD51 family (RAD51B, C, D, XRCC2 and 3). Strikingly, knockout mutants of all RAD51 paralogs also show high sensitivity to ICL-inducing agents. In order to investigate a possible connection between the FA pathway and the RAD51 family, the yeast two-hybrid system was used to test for any interactions between the FA proteins FANCA, C, G and the RAD51 family members. Several interactions were detected. Further characterization was done by study of nuclear foci and immunoprecipitation. FA and RAD51 proteins were overexpressed in human 293 cells. Since RAD51 localizes into nuclear foci after DNA damage, FA proteins and RAD51 paralogs were tested for their ability to (co-) localize into nuclear foci after MMC-treatment. Whereas none of the RAD51 paralogs showed nuclear foci formation, in some experiments FA proteins moved into nuclear speckles following DNA damage. However, size and homogeneity of DNA damage-induced FA speckles was quite different from those formed by „classical“ DNA repair proteins; in addition, no colocalization was seen with foci containing RAD51. Notably, FA speckles were often restricted to sites of very tightly packed chromatin, again suggesting a role of the FA-proteins in chromatin remodelling mechanisms. To identify any physical interaction between FA proteins and the RAD51 family, coimmunoprecipitation studies (Co-IPs) were carried out, after overexpression in HEK293 cells. Whereas the reported interaction between FANCA and FANCG could repeatedly be shown, no Co-IP was detected for any combination of an FA protein with a member of the RAD51 family. However, since the identification of FANCD2, a connection between the FA pathway and RAD51 seems all the more plausible: following DNA damage FANCD2 colocalizes with BRCA1, which itself is closely associated with RAD51. Further studies will be necessary in order to unravel the way by which the FA proteins might interact with conserved DNA repair mechanisms like the HRR pathway.
KW  - Ataxia teleangiectatica
KW  - Fanconi-Anämie
KW  - Molekulargenetik
KW  - Caretaker-Gen-Syndrome
KW  - Ataxia telangiectasia (AT)
KW  - Nijmegen Breakage Syndrom (NBS)
KW  - Fanconi Anämie (FA)
KW  - Caretaker gene syndromes
KW  - Ataxia telangiectasia (AT)
KW  - Nijmegen breakage syndrome (NBS)
KW  - Fanconi anemia (FA)
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182385
ER  - 
TY  - THES
A1  - Funk, Natalja
T1  - Das Sap47-Gen aus Drosophila melanogaster : Gezielte Mutagenisierung und Suche nach Interaktionspartnern
T1  - The Sap47 gene of Drosophila melanogaster: mutagenesis and identification of interaction partners
N2  - SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie gehört. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner für das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt.
N2  - SAP47 (synapse-associated protein of 47 kDA) of Drosophila melanogaster belongs to a novel protein family of unknown function. Three techniques were used for Sap47 mutagenesis: "gene targeting" by homologous recombination, RNA interference (RNAi) and Jump-out mutagenesis. A standard yeast-two-hybrid system and the "CytoTrap" assay were used to identify interaction partners for the SAP47 protein.
KW  - Taufliege
KW  - Molekulargenetik
KW  - Sap47
KW  - Synapse
KW  - RNA interference
KW  - Gezeilte Mutagenese
KW  - Sap47
KW  - synapse
KW  - RNA interference
KW  - gene targeting
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7667
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kraft, Christian
T1  - Die Rolle von Mutation und Rekombination in der Mikroevolution von Helicobacter pylori
T1  - The role of mutation and recombination in the microevolution of Helicobacter pylori
N2  - Helicobacter pylori ist ein pathogenes Bakterium, das verantwortlich gemacht wird für verschiedene Erkrankungen des Magens und Duodenums, wie beispielsweise chronische Gastritis, peptische Ulzera und maligne Lymphome. Das Bakterium zeichnet sich durch eine hohe Rekombinationsrate aus und besitzt ein hohes Maß an genetischer Allelvielfalt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rekombinationsrate und die Länge der rekombinerten DNA-Importe anhand von sequentiellen Isolaten, die zu definierten Zeitpunkten aus dem selben Patienten isoliert wurden, untersucht. Es wurden zehn Gene, darunter sieben 'housekeeping' Gene und drei virulenzassoziierte Gene, amplifiziert und sequenziert. Die Ergebnisse zeigten eine bis dahin noch nicht für Bakterien beschriebene Fragmentlänge der DNA-Importe von durchschnittlich lediglich 417 Basenpaaren. Die Rekombinationsrate war außergewöhnlich hoch. DNA-Microarray-Analysen konnten zeigen, dass es trotz dieser hohen Rekombinationsrate nur wenige Veränderungen in der genomischen Genausstattung gab. Jedoch hing das Auftreten von Rekombinationsereignissen direkt mit Veränderungen der Genausstattung zusammen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein neues in vitro-Transformationsmodell entwickelt, das die in vivo ermittelten Resultate nachvollziehen sollte. Das Modell konnte sowohl die in vivo gefundene Rekombinationsrate als auch den Import von kurzen DNA-Fragmenten bestätigen, die zu einem Allelmosaik zwischen DNA-Rezipient und Donor führten. Auffällig war eine stark verminderte Transformierbarkeit mit Donor-DNA aus asiatischen H. pylori-Stämmen. Um eine mögliche Beteiligung des Nukleotid-Excisions-Reparatur (NER) Mechanismus an der Rekombination zu ermitteln, wurden zwei Gene des Mechanismus ausgeschaltet. Die Ergebnisse der NER--Mutanten (uvrA-, uvrD-) zeigten eine starke Verminderung der Transformierbarkeit. Diese Verminderung hatte jedoch keinen Einfluss auf die Länge der rekombinierten DNA-Importe. Das Ausschalten des uvrA-Gens führte zudem zu einer erhöhten Sensibilität gegenüber UV-Licht. Der NER-Mechanismus ist bei H. pylori in einer noch nicht aufgeklärten Weise an der Rekombination beteiligt. In einem Rhesusaffen-Tiermodell wurde die initiale Besiedlung mit H. pylori untersucht. Die Tiere stellen einen natürlichen Wirt dar und zeigen ähnliche Krankheitssymptome wie menschliche Patienten. Die Rhesusaffen wurden experimentell mit zwei klinischen H. pylori-Isolaten infiziert. Die Reisolation zu bestimmten Zeitpunkten zeigte, dass sich nur einer der beiden Stämme im Affenmagen etablieren konnte und der zweite Stamm verdrängt worden war. In einem zweiten Versuchsansatz wurden die persistent infizierten Affen mit vier weiteren H. pylori-Stämmen infiziert, um eine transiente Koinfektion zu simulieren. Diese Stämme verdrängten jedoch den bereits etablierten Stamm, und es konnte keine in vivo-Rekombination festgestellt werden. Dennoch ist dieses Modell das Erste, in dem eine persistierende experimentelle H. pylori-Infektion in Rhesusaffen über einen Zeitraum von mehr als vier Jahren nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf den beim Menschen meist unentdeckten Anfang der H. pylori-Infektion. Die Untersuchungen an weiteren Spezies des Genus Helicobacter zeigten, dass die beschriebene Spezies Heelicobacter nemestrinae keine eigene Spezies darstellt, sondern der Spezies H. pylori zugeordnet werden konnte. Den damit nächsten 'Verwandten' stellt die Spezies H. acinonychis dar, deren Stämme sich untereinander wesentlich weniger stark unterscheiden als H. pylori-Stämme. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Daten zum Verständnis der Evolution und Mikroevolution innerhalb eines Wirtes von H. pylori, die zu besseren Strategien in der Bekämpfung dieses pathogenen Bakteriums führen können.
N2  - The human pathogen Helicobacter pylori colonizes the gastrointestinal tract and causes a long-term infection leading to several diseases such as gastritis, peptic ulcers and cancer. H. pylori is the most genetically diverse bacterial species known. Population genetic analysis has shown that the diversity is largely due to recombination between different H. pylori strains during mixed infection. To analyse the recombination rate in vivo, sequential isolates, taken from the same patient at different timepoints, were used. Fragments of seven housekeeping genes, the two flagellin genes and the vacuolating cytotoxin gene vacA, were sequenced and pairwisely compared to detect genetic changes that had occurred during chronic colonization. The recombination rate was unexpectedly high and the size of the imported DNA-fragments had an average of only 417 basepairs. DNA-imports of this extraordinarily short length were never found before in other bacterial species so far. A Microarray analysis showed a high stability of the genetic content in the paired isolates. The very few differences in this genetic content were mainly driven by recombination events. A new developed in vitro transformation model was able to measure the recombination frequency and the length of the imported DNA. The model confirmed the unusually high recombination frequency and the very short imported DNA fragments found in vivo in the sequential isolates. Interestingly, by using Asian strains as DNA donor, the recombination frequency was much lower compared to European and African strains. To answer the question whether the nucleotide-excision-repair (NER) mechanism was involved in the recombination process, knock out mutants of two key genes of the mechanism were used (uvrA-, uvrD-). The NER mutants showed a notable decrease in their transformation ability, but the length of the imported fragments was not affected. The NER mechanism seems to be involved in the recombination process, but it is still unknown in how far and in which way. A rhesus monkey model was developed to establish an experimentally persistent H. pylori infection and to investigate the initial infection steps. Macaques are natural hosts of H. pylori and develop similar disease. Two clinical isolates were chosen for infection, but only one strain survived in the stomach of the macaques. The second strain was outcompeted by the first one. In a second trial the macaques were infected with four new strains of H. pylori to simulate a transient co-colonisation. Only two of the new strains survived and the formerly established strain was outcompeted by the two new strains. No recombination events could be detected. Nevertheless, this is the first time that rhesus monkeys were experimentally persistently infected for more than four years with H. pylori. In this model the first steps of an new H. pylori infection can be investigated, which is not possible in humans. Investigations of other members of the genus Helicobacter showed, that the species Helicobacter nemestrinae was not an independent species, but represented a strain of H. pylori. The closest related species then was represented by Helicobacter acinonychis. Genetic analyses revealed a much more clonal genome between different H. acinonychis strains compared to H. pylori.
KW  - Helicobacter pylori
KW  - Evolution
KW  - Molekulargenetik
KW  - Helicobacter
KW  - Evolution
KW  - Helicobacter
KW  - evolution
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9757
ER  - 
TY  - THES
A1  - Cho, Seung-Hak
T1  - Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus
T1  - Epidemiological and molecular investigations of the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus
N2  - Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehören zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig darüber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die Fähigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hängt von der genetischen Ausstattung der Stämme mit dem für die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon häufiger in klinischen als in kommensalen Stämmen vorkommt. Der überwiegende Teil dieser ica-positiven Stämme bildete phänotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stämme, unabhängig von ihrer Herkunft, das vollständige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stämme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stämme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stämmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant häufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stämmen nachweisbar, während es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytären Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stämme wiesen überdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phänotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante führte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollständige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollständig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen überein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo während einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phänotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stämmen zu größeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilität unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausübt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veränderten SigB-Expression in Zusammenhang steht.
N2  - Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis belong to the most frequent causes of nosocomial infections in immunocompromised patients. These bacteria form an essential part of the healthy skin flora of human beings. Little is known, whether there are differences in the genetic equipment between clinical and commensal isolates and which factors contribute to the setup of staphylococci in the hospital environment. The results of the presented work show that the ability to form biofilms is an essential feature of pathogenic staphylococci. The expression of this virulence factor is highly variable and depends on the presence of the ica operon which is responsible for biofilm formation, specific environmental factors and the influence of insertion sequences. In an epidemiological investigation, it was shown that the ica operon in S. epidermidis is more often present in clinical strains than in commensal ones. The predominant part of these ica-positive strains formed phenotypically a biofilm. In contrast, all examined S. aureus contained, independent of their origin, the complete ica gene clusters, while, however, none of these strains formed a biofilm under laboratory conditions. Biofilm formation could be induced by subinhibitory concentrations of specific antibiotics or osmotic stress in 30 percent of the S. aureus strains. Also, biofilm formation could be stimulated in ica-positive S. epidermidis strains through these environmental factors. The study also revealed that there is an association between biofilm formation, antibiotic resistance and the occurrence of the insertion sequence IS256. Thus, IS256 was significantly more often detected in clinical S. epidermidis and S. aureus strains, while there was no difference in the occurrence of IS257 between clinical and saprophytic isolates. Most of the IS256-positive S. epidermidis strains carried the ica operon and were simultaneously resistant against at least two antibiotics. Furthermore, it was shown that IS256 is involved in phase variation of biofilm formation in vivo. In case of a clinical S. epidermidis strain that was isolated from a patient with a catheter-associated urinary tract infection, the insertion of the element in the icaC gene was detected resulting in a biofilm-negative phenotype. Subcultivation of the insertion mutant resulted in biofilm-forming variants after a few passages. Nucleotide sequencing indicated the complete excision of IS256 from the icaC gene including the duplicated target site sequence of seven base pairs. These data are in agreement with the results received in a recent in vitro study and show that IS256 has an influence on the ica-expression during an infection. In this study, phase variation of biofilm formation was also shown in S. aureus. After serial passages, several biofilm producers were derived from formerly biofilm-negative single colonies which could also revert to the biofilm-negative phenotype again. DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis showed that in the variants large DNA-rearrangements took place. In addition to the variable biofilm production, differences in the expression of the alternative transcription factor SigmaB were observed in the variants. Nucleotide sequencing of the sigB system indicated several point mutations in the SigB regulatory genes rsbU and rsbW of the variants. This implies that the SigB gene locus is subject to a strong genetic variability that results, in turn, in pleiotropic effects on gene expression in S. aureus. However, Northern blot analysis revealed that the biofilm formation in the S. aureus variants are not associated with the varying SigB expression.
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Staphylococcus epidermis
KW  - Biofilm
KW  - Molekulargenetik
KW  - Staphylokokken
KW  - nosokomiale Infektionen
KW  - Biofilmbildung
KW  - ica-Operon
KW  - Insertionssequenzen
KW  - Phasenvariation
KW  - Regulatorgene
KW  - staphylococci
KW  - nosocomial infections
KW  - biofilm formation
KW  - ica Operon
KW  - insertion sequences
KW  - phase variation
KW  - regulator genes
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181296
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TY  - THES
A1  - Zaum, Ann-Kathrin
T1  - Erweiterte Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen: vom Genpanel zum Whole Genome Sequencing
T1  - Extended diagnostics in neuromuscular disease: from gene panel to whole genome sequencing
N2  - Muskeln und Nerven bilden eine essentielle funktionelle Einheit für den Bewegungsapparat. Neuromuskuläre Erkrankungen lassen sich unterteilen in Krankheiten, denen ein muskuläres Problem zu Grunde liegt, wie zum Beispiel Muskeldystrophien (Muskeldystrophie Duchenne, DMD) und Myopathien (Myofibrilläre Myopathie, MFM), und in Erkrankungen aufgrund von Nervenschädigungen, wie zum Beispiel Neuropathien und spastische Paraplegien (SPG).
In den vier Teilen der vorliegenden Arbeit konnte sowohl das genetische wie auch das phänotypische Spektrum von neuromuskulären Krankheiten erweitert werden. Die dafür verwendeten Methoden reichen von der Sanger-Sequenzierung einzelner Gene über Next-Generation Sequencing (NGS)-Panel-Diagnostik, zu Whole Exome Sequencing (WES) und schließlich zu Whole Genome Sequencing (WGS). Zusätzlich wurde cDNA zur Detektion von Veränderungen im Transkriptom sequenziert.
Im ersten Teil wurde der klinische Phänotyp der Seipinopathien erweitert, der jetzt auch amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und multifokale motorische Neuropathie (MMN) beinhaltet. Dafür wurde eine Panel-Analyse durchgeführt, die eine bekannte Mutation in BSCL2 aufdeckte. Aufgrund des hiermit erweiterten Phänotyps der Seipinopathien sollten Mutationen in BSCL2 auch bei anderen Verdachtsdiagnosen, wie ALS oder MMN, berücksichtigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass in der Diagnostik SPGs und Charcot-Marie-Tooth Erkrankungen (CMTs) eine Überlappung zeigen und bei der Diagnose von Verdachtsfällen Gene aus beiden Krankheitsbereichen berücksichtigt werden sollten. Die Suche mit Hilfe eines Phänotyp-Filters hat sich dabei als erfolgreich erwiesen. Ungelöste Fälle sollten aber in regelmäßigen Abständen neu analysiert werden, da immer neue Gene mit den Phänotypen assoziiert werden. 
Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung von DMD-Patienten mit bisher ungeklärtem Genotyp. Durch eine RNA-Analyse des gesamten DMD-Transkripts wurden tief-intronische Mutationen aufgedeckt, die Einfluss auf das Spleißen haben. Durch diese Mutationen wurden intronische Sequenzen als Pseudoexons in die mRNA eingefügt. Diese Mutationsart scheint häufig unter ungeklärten DMD-Fällen zu sein, in unserer Kohorte von 5 DMD-Patienten wurden in zwei Fällen Pseudoexons entdeckt. Eine Besonderheit besteht darin, dass in der RNA-Analyse immer noch ein Rest Wildtyp-Transkript vorhanden war, wodurch die Patienten vermutlich einen milderen Becker-Phänotyp aufweisen. Ein weiterer ungeklärter DMD-Fall konnte durch die Sequenzierung der gesamten genomischen Sequenz aufgeklärt werden. Es wurde eine perizentrische Inversion entdeckt (46,Y,inv(X)(p21.1q13.3). Dies zeigt, dass WGS auch zur Detektion von großen Strukturvariationen geeignet ist.
Im dritten Teil wurden Spleißmutationen untersucht. Spleißmutationen wurden bisher nicht in TMEM5-assoziierter alpha-Dystroglykanopathie beschrieben und somit als neue Mutationsart für diese Erkrankung nachgewiesen. Dabei wurde auch die funktionelle Exostosin-Domäne in TMEM5 bestätigt. Eine RNA-Untersuchung verschiedener Spleißmutationen zeigte, dass Spleißmutationen häufig zu einem veränderten Transkript führen, auch wenn diese Mutationen weiter von der Konsensussequenz entfernt sind. Spleißmutation sollten daher häufiger in der Diagnostik berücksichtig und überprüft werden.
Im letzten Teil wurde eine strukturierte Diagnostik von MFM-Patienten beschrieben und neue Kandidaten-Gene für MFM vorgestellt. Es ist zu vermuten, dass auch Mutationen in Genen, die bisher für Kardiomyopathien, Kollagen Typ VI-Myopathien und Neuropathien beschrieben sind, einen MFM-Phänotyp verursachen können. Diese Ergebnisse erweitern das genetische Spektrum der MFM, was sich auf die Diagnostik dieser Erkrankungen auswirken sollte.
Im Laufe dieser Arbeit konnten damit die neuromuskulären Erkrankungen vieler Patienten genetisch geklärt werden. Neue Phänotypen und genetische Ursachen wurden beschrieben und es wurde gezeigt, dass sich WGS technisch für die Diagnostik, auch zur Detektion von großen Strukturvarianten, eignet.
N2  - Muscles and nerves form an essential functional unit for the locomotor system. Neuromuscular disorders are divided in diseases that have a muscular origin, such as muscular dystrophies (Duchenne muscular dystrophy, DMD) and myopathies (myofibrillar myopathies, MFM) and diseases based on neuron denervation, for instance neuropathies and spastic paraplegias (SPG).
The four parts of the present work expand the genetic and phenotypic spectrum of neuromuscular disorders. The used methods range from Sanger sequencing of single genes to panel next-generation sequencing (NGS) diagnostics, whole exome sequencing (WES) and finally to whole genome sequencing (WGS). Additionally, cDNA was sequenced to detect transcriptome changes.
In the first part, the clinical phenotype of seipinopathies has been expanded to include amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and multifocal motor neuropathy (MMN). An NGS panel was sequenced in three patients suffering from ALS, MMN and neuropathy. A known mutation in BSCL2 was detected which expands the phenotype of seipinopathies. Therefore, mutations in BSCL2 should be considered in patients with diagnosis such as ALS and MMN. Moreover, it was demonstrated that SPGs and Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) show a genetic overlap and genes of both diseases should be considered in genetic analysis. The use of a phenotype filter for variant analysis was successful. However, unsolved cases should be re-analysed in intervals, as new genes are frequently connected to phenotypes.
The second part concerns DMD patients with unresolved genotype. RNA-analysis of the whole DMD transcripts revealed deep-intronic variants that influence splicing and insert intronic sequences as pseudoexons in the mRNA. This kind of mutation appears to be common, as two of our five analysed patients had pseudoexons. What is particular about these cases is the fact that a rest of wild type DMD transcript remained, which possibly contributes to a milder Becker phenotype in the patients. In another unsolved DMD case WGS was performed and a pericentric inversion including DMD was discovered (46,Y,inv(X)(p21.1q13.3), which demonstrates that WGS is capable of detecting large structural anomalies. 
In the third part splice mutations were analysed. Splice mutations were unknown for TMEM5-related alpha-dystroglycanopathy and are now a new kind of mutation in this disease. At the same time the functional exostosin domain in TMEM5 was confirmed. RNA analysis of further splice mutations showed a frequent influence on splicing even if the mutation was far from the canonical splice site. Therefore, splice mutations should be verified and considered in diagnostics more often.
The last part describes a structured approach when diagnosing MFM patients and introduces new candidate genes for MFM. It appears that mutations in genes formerly associated with cardiomyopathies, collagen type VI-related myopathies and neuropathies can cause an MFM phenotype. These results expand the genetic spectrum of MFM which should be considered in diagnostics.
In the course of this dissertation the neuromuscular diseases of many patients could be solved genetically. New phenotypes and genotypes were described and it was proven that WGS is technically suitable for genetic diagnostic, even for the detection of large structural variants.
KW  - Neuromuskuläre Krankheit
KW  - Mensch
KW  - Next-Generation Sequencing
KW  - Neuromuskuläre Erkrankungen
KW  - Molekulargenetik
KW  - Humangenetik
KW  - Human genetics
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176314
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TY  - THES
A1  - Ebert-Dümig, Regina
T1  - Expression und Regulation 1,25(OH) 2 -Vitamin D 3-responsiver Gene in monozytären Zellen
T1  - Expression and regulation of 1,25 dihydroxyvitamin D3 responsive genes in monocytic cells
N2  - Das Secosterid Vitamin D3 wird durch die Nahrung aufgenommen oder im Organismus synthetisiert, wobei eine Reaktion in der Haut durch einen photochemischen Prozess katalysiert wird.Durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere wird Vitamin D3 über 25(OH) Vitamin D3 zum aktiven 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon. 1,25(OH)2 Vitamin D3 hat eine wichtige Funktion im Knochenstoffwechsel, es reguliert die Ca2+-Resorption im Dünndarm. Die 1,25(OH)2 Vitamin D3-Synthese in der Niere wird durch Parathormon (PTH) kontrolliert. Ist die Serum Ca2+-Konzentration niedrig, wird PTH ausgeschüttet und die 1a-Hydroxylase, das 25(OH) Vitamin D3-aktivierende Enzym, stimuliert. Das Prinzip der (Seco)steroid-Aktivierung und -Inaktivierung in glandulären Organen, wie Leber und Niere mit anschließender Freisetzung der aktiven Hormone und Transport zu den jeweiligen Zielgeweben gilt heute nicht mehr uneingeschränkt. Auch Einzelzellen sind in der Lage Steroid-modifizierende Enzyme, die Hydroxylasen und Dehydrogenasen, zu exprimieren. Monozytäre Zellen exprimieren das 1,25(OH)2 Vitamin D3-aktivierende und das -inaktivierende Enzym, die 1a-Hydroxylase und die 24-Hydroxylase. Sie sind somit in der Lage, 1,25(OH)2 Vitamin D3 zu sezernieren, welches parakrin auf Nachbarzellen wirken kann. In diesem Zusammenhang wurde die Expression und Regulation der 1a-Hydroxylase in peripheren Blutmonozyten (PBM) und monozytären THP1-Zellen untersucht. Durch Supplementation der Zellen mit dem Substrat 25(OH) Vitamin D3 konnte die Produktion an aktivem 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon in PBM signifikant gesteigert werden. In PBM konnte im Gegensatz zum systemischen Ca2+-Stoffwechsel nur ein geringer Einfluss auf die 1a-Hydroxylase-Aktivität beobachtet werden. Durch RT-PCR-Amplifikation konnte eine Expression des PTH Rezeptors Typ 1 (PTHR1) in PBM und Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Ein weiterer Ligand des PTHR1 ist PTH related Protein (PTHrP), ein Faktor der die Tumorhyperkalzämie propagiert. Durch Markierungsexperimente mit fluoreszenz-markiertem PTHrP konnte gezeigt werden, dass PTHrP an die Zellmembran von PBM und Dendritischen Zellen bindet und in den Zellkern von Dendritischen Zellen transportiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsive Gene in Monozyten/Makrophagen untersucht. Die Expression der 24-Hydroxylase wird innerhalb der Differenzierung von myeloischen THP1-Zellen zu Makrophagen- bzw. Osteoklasten-ähnlichen Zellen transient induziert. Als weiteres 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsives Gen wurde die Expression von Osteopontin (OPN) untersucht. OPN ist ein vor allem in Knochen vorkommendes Matrixprotein, das wesentlich an der Zelladhäsion beteiligt ist. OPN wird in THP1-Zellen im Zuge der Differenzierung zunehmend exprimiert. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte OPN in Granulomen von Morbus Crohn- und Leberschnitten detektiert werden. Es spielt hier eine wesentliche Rolle bei der Granulomentstehung. Die Thioredoxin Reduktase 1 (TR1) ist ein Selenoenzym, welches maßgeblich an der Reduktion von Disulfidbindungen in Proteinen beteiligt ist. Es moduliert Protein/Protein- und Protein/DNA-Interaktionen wie die Bindung der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB an DNA-responsive Elemente. Die Expression der TR1 wird in THP1-Zellen im Rahmen der Differenzierung induziert und ist in differenzierten Zellen maximal. Aktivitätsmessungen deckten sich mit dieser Beobachtung. In peripheren Blutmonozyten steigt die TR-Aktivität alleine durch Adhäsion der Zellen an das Kulturgefäß und nach Behandlung mit 1,25(OH)2 Vitamin D3. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigten eine Abhängigkeit der TR-Aktivität vom Differenzierungsgrad der Zellen und der Supplementation des Mediums mit dem Spurenelement Selen. Die Expression weiterer Selenoproteine in monozytären Zellen wurde nachgewiesen. So konnten durch 75Selenit-Markierungsexperimente neun Selenoproteine in THP1-Zellen detektiert werden, von denen fünf sezerniert werden. Ein weiteres, in monozytären Zellen charakterisiertes Selenoprotein ist die zelluläre Glutathionperoxidase. Ihre Aktivität konnte in Selenit-supplementierten Zellen um das 70fache gesteigert werden. Die Kultivierung monozytärer Zellen unter Selenit-Supplementation beeinflusst die Funktion dieser Zellen wesentlich. So konnte beobachtet werden, dass die Anzahl an phagozytierenden, zu Makrophagen differenzierten THP1-Zellen nach Selenit-Supplementation abnahm, während die Phagozytoserate der einzelnen Zellen anstieg. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass monozytäre Zellen mit Komponenten des 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon produzieren, sezernieren und inaktivieren können. Die lokale Kontrolle der 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsiver Gene, wie die Expression des Selenoproteins TR1, das einen direkten Einfluss auf den Redoxstatus und den Abbau reaktiver Sauerstoffverbindungen in diesen und Nachbarzellen ausübt.
N2  - The secosteroid 1,25(OH)2 vitamin D3 is either taken up by our daily diet or it is formed by a photochemical prosess in the skin. In liver and kidney vitamin D3 is hydroxylated in two steps to 25(OH) vitamin D3 and the active hormone 1,25(OH)2 vitamin D3. 1,25(OH)2 vitamin D3 plays an important role in bone metabolism. It is a key regulatorof the resorption of Ca2+ in the intestine. In the kidney 1,25(OH)2 vitamin D3 synthesis is controlled by parathyroid hormone (PTH). When the concentration of serum Ca2+ is low, PTH is secreted and 1a-hydroxylase, the 25(OH) vitamin D3 activating enzyme is induced in kidney. The picture of (seco)steroid activation and inactivation in glandular organs, like the liver and kidney, and the release and transport of the activated hormone to the target tissues has been modified recently. Single cells are also able to express steroid-modifying enzymes like hydroxylases and dehydrogenases. Monocytes express the 1,25(OH)2 vitamin D3-activating and the inactivating enzyme, i.e. the 1a-hydroxylase and the 24-hydroxylase. Thus they are able to build and secrete 1,25(OH)2 vitamin D3 which can act on neighbouring cells in a paracrine way. In this context the expression and regulation of the 1a-hydroxylase in peripheral blood monocytes (PBM) and THP1 cells was investigated. By supplementation of cells with the substrate 25(OH) vitamin D3 the production of active 1,25(OH)2 vitamin D3 hormone could be enhanced significantly in PBM. In PBM only a slight influence of PTH on 1a-hydroxylase activity could be observed, in contrast to the regulation in systemic Ca2+-metabolism. An expression of PTH receptor type 1 (PTHR1) could be verified by RT-PCR from whole RNA isolated from PBM and dendritic cells. A further ligand of PTHR1 is PTH related protein (PTHrP), a factor which propagates the humoral hypercalcemia of malignancy. Labeling experiments with a fluorescently marked PTHrP showed clustered membrane staining of PBM and dendritic cells and a transport to the nucleus of dendritic cells. The expression of 1,25(OH)2 vitamin D3-responsive genes in monocytes/macrophages was investigated. 24-hydroxylase is induced transiently during the differentiation of myeloid THP1 cells to macrophages and osteoclast-like cells, respectively. Next, the expression of osteopontin (OPN), a further 1,25(OH)2 vitamin D3 responsive gene was studied. OPN is a matrix protein that is mainly found in bone, it carries a RGD-motive in its aminoacid sequence which can bind to integrins and is involved in cell adhesion. The expression of OPN is increased during differentiation of THP1 cells. By immunohistochemistry OPN could be detected in Crohn's disease and liver granulomas where it also plays an important role in granuloma formation. The thioredoxin reductase 1 (TR1) is a selenoenzyme that is mainly involved in the reduction of disulfide bonds of proteins. It modulates protein/protein and protein/DNA interactions like the binding of the transkription factors AP1 and NFkB to DNA-responsive elements. The expression of TR1 mRNA is induced during differentiation and is maximal in differentiated cells. Activity measurments parallel these observations. In PBM TR-activity is increased by the event of adhesion of cells to the culture dish and after treatment with 1,25(OH)2 vitamin D3. A dependence of TR-activity on the degree of differentiation of cells and the supplementation of the medium with the trace element selenium was observed. The expression of further selenoproteins in monocytic cells was investigated. In THP1 cells nine selenoproteins could be detected By labeling experiments with 75selenite. Five were found as secreted proteins in the culture supernatant. In monocytes cellular glutathione peroxidase (cGPx) is a well characterized selenoprotein. Activity could be increased 70fold by selenit supplementation. Under selenite supplementation the number of differentiated THP1 cells capable of phagocytosis was diminished while the rate of phagocytosis of single cells was enhanced. Taken together, the experiments clearly indicate that monocytic cells are equipped with the components of 1,25(OH)2 vitamin D3 metabolism and thus are capable of 1,25(OH)2 vitamin D3 hormone synthesis, secretion and turnover. Moreover, local control of 1,25(OH)2 vitamin D3 synthesis and inactivation directly regulates the expression of 1,25(OH)2 vitamin D3-responsive genes like the selenoprotein TR and thus even impacts on the cellular redox-status and defense against reactive oxygen species in these and neighbouring cells.
KW  - Vitamin D3
KW  - Stoffwechsel
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Molekulargenetik
KW  - 1
KW  - 25 Dihydroxyvitamin D3
KW  - Monozyten
KW  - Selenit
KW  - Selenoprotein
KW  - 1
KW  - 25 dihydroxyvitamin D3
KW  - monocyte
KW  - selenite
KW  - selenoprotein
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1101
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dellinger, Eva
T1  - Expression von Myotubularin und seiner Mutanten im bakteriellen System
T1  - Expression of myotubularin and its mutations in a bacterial system
N2  - Die X-gebundene Myotubuläre Myopathie (XLMTM) ist eine sehr seltene und schwere angeborene Muskelschwäche, die durch Mutationen im MTM 1 Gen verursacht wird. In der histopathologischen Untersuchung ist auffällig, dass die Muskelfasern fetalen Myotuben ähneln. Das Gen MTM 1 wurde auf Xq28 lokalisiert und kodiert für das Protein Myotubularin. Die Myotubularine stellen eine große Familie eukaryotischer Lipid-Phosphatasen und Anti-Phosphatasen dar. Da der direkte Nachweis von Myotubularin in Muskelbiopsien von Patienten aufgrund der sehr niedrigen Expression nicht gelingt, weder durch immunhistochemische Methoden noch im Western-Blot oder durch einen spezifischen Enzymtest, steht ein funktioneller Test für die gefundenen Genmutationen nicht unmittelbar zur Verfügung. In der Arbeit sollte versucht werden, zunächst Wildtyp-Myotubularin im bakteriel-len System zu exprimieren, im Western-Blot nachzuweisen und die Phosphatase-Enzymaktivität in vitro zu messen. Als Substrat für Myotubularin wurde p-Nitrophenolphosphat verwendet. In der Durchfüh-rung des experimentellen Teils zeigten sich verschiedene Probleme, aus denen sich jedoch interessante Schlüsse ziehen liessen. Zum ei-nen konnte der Verdacht bekräftigt werden, dass Myotubularin keine Dual-spezifische Phosphatase ist, wie zunächst angenommen wurde. Problematisch war auch, dass der E.coli M15 Bakterienstamm an-scheindend selbst so viele eigene Phosphatasen produzierte, die das Substrat p-Nitrophenolphosphat dephosphorylierten. Diese Hintergrundgrundaktivität störte die eigentliche Aktivitätsmessung des Myotubularins und machte diese kaum verwertbar. Ebenso zeigte sich, dass das Myotubularin in dem untersuchten bakteriellen System nicht in größeren Mengen exprimiert wurde. Letzendlich ergab dies die Schlussfolgerung, dass zukünftige Untersuchungen berücksichtigen sollten, dass eukaryontische Expressionssysteme sich offensichtlich besser für die Mitglieder der Genfamilie der Myotubularine eigenen und dass Myotubularine Lipidphopshatasen sind mit in vivo sehr spe-zifischen Substraten (Phopshatidyl-Inositolphosphate). Jedes artifizielle Substrat sollte diese natürlichen Strukturen möglichst nachahmen.
N2  - X-linked myotubular myopathy ist a very rare and severe muscle diseasse. It is cause by a mutation in the MTM1 gene. The musclefibres have a significant similarity to fetal mytotubes. The gene MTM1 was located on Xq28 und is encoding a protein called myotubularin. The myotubularin family consists of eucaryontic lipid phosphatases and anti-phosphatases. The detection of myotubularin in biopsies ist not possible, neither by immunological methods nor by Western Blot or specific enzyme-testing. The goal was to express myotubularin in a bacterial system, to detect it by western blot and to measure the phosphatase activity in vitro. As a substrate for myotubularin p-nitrophenophosphate was used. Several problems occured during testing, which lead to some interesting conclusions. For one, the suspicion that myotubularin ist no dual-specific phosphatase could be confirmed. Another problem was, that the M 15 e. coli bacteria itself seemed to produce phosphatases, that dephosphorylate p-nitrophenolphosphate. That made screening the activity of myotubularin nearly impossible. Also, myotubularin was not expressed in large amounts in M 15 e-coli cells. In the end it turned out that for further tests, an eukaryontic system should be used for expression, and that myotubularine is a lipid-phosphatase with very specific substrates in vivo. Every artifical substrate should imitate that natural structure als closely as possible.
KW  - Molekulargenetik
KW  - Erbkrankheit
KW  - Muskelentwicklung
KW  - Myotubuläre Myopathie
KW  - MTM
KW  - Myotubular Myopathy
KW  - MTM
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25366
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TY  - THES
A1  - Endt, Daniela
T1  - Fanconi Anämie : Entwicklung von hämatopoetischen Mosaiken sowie funktionelle Studien von FANCO (RAD51C) und FANCN (PALB2)
T1  - Fanconi Anämie : Development of hematopoetic mosaicism and functional studies of FANCO (RAD51C) and FANCN (PALB2)
N2  - Zur Wahrung der Genomstabilität entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen führen. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi Anämie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilität führen. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowie bereits im jugendlichen Alter erhöhten Tumor-raten und Anämien geprägt. Bisher wurden Defekte in 19 verschiedenen Genen als ursächlich für diese Erkrankung diskutiert. Anhand des betroffenen Gens können nur begrenzt Rückschlüsse auf die Ausprä-gung des Phänotyps geschlossen werden, vielmehr scheinen die Art der Mutation und deren Position im Gen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Im Laufe der Zeit wurden immer mehr Patienten mit mild ausgeprägtem Erkrankungsbild beobachtet. Eine mögliche Erklärung hierfür liefern milde Mutationen, eine weitere das Vorhandensein von Mosaiken blutbildender Zellen. Zu letzterem führt die Reversion einer der beiden Mutationen. Diese Art der „natürlichen Gentherapie“ wurde bei 10-30% der FA-Patienten beobachtet. Um die Entwicklung von Reversionen besser zu verstehen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die Untersuchung verschiedener Zelllinien von 5 Patienten im Alter von 11 (Pat. 5) bis 33 (Pat. 4) Jahren. Die FA-A-Patienten 1 und 2 wurden bereits von Gross et al. 2002 als Mosaikpatienten beschrieben. Für die weiteren Patienten führten unterschiedliche Aspekte, wie normale Blutwerte, MMC-tolerante lympho-blastoide Zelllinien und gDNA-Analysen des Blutes zum Mosaikverdacht. Nähere Analysen bestätigten für die FA-D2-Patienten (Pat. 4, 5) ebenfalls das Vorliegen einer Reversion in den Blutzellen. Allen Patienten gemein war die Reversion in Form einer Rückmutation (Pat. 1: c.971T>G, Pat. 2: c.856 C>T, Pat. 4: c.3467-2A>G, Pat. 5: c.3707G>A), welche meist in einem oder in der Nähe eines Mutationsmotives vorlag. Zur Einschätzung des Mosaikstatus in den Patientenblutzellen wurden, neben der meist mehrjährigen Be-obachtung der Blutwerte (Thrombo-, Mono-, Granulo-, Lymphozyten, Hämoglobin), gDNA-, Chromoso-menbruch- und Zellzyklusanalysen durchgeführt. Chromosomenbruchanalysen von Metaphasen der T-Lymphozyten der Patienten 4 und 5 zeigten nach MMC-Behandlung die mosaik-typische bimodale Vertei-lung der Chromosomenbruchraten. Die nur moderat erhöhten Bruchraten in Metaphasen des Patienten 1 sprachen für eine starke Reversion. Zur besseren Abschätzung des Mosaikstatus wurden Zellzyklusanaly-sen an Mischungsreihen aus FA- und nicht FA- Blut durchgeführt. Die Detektionsgrenze für FA-Mosaike lag bei einem Anteil von 30% Zellen mit spontanem/MMC-induziertem G2-Phasen-Arrest. In Anlehnung an Mischungskurven wurden für die vier Patienten Reversionen von 0% (Pat. 4) bis 90-95% (Pat. 2) ange-nommen. Die gDNA-Analyse MACS-sortierter T-/B-Lympho-, Mono- und Granulozyten sowie von Fib-roblasten und lymphoblastoiden Zelllinien ermöglichte einen detaillierten Einblick in die Mosaikstatus auf molekularer Ebene. Wir fanden bei allen Patienten einen unterschiedlich stark ausgeprägten Mosaikstatus ihrer Blutzellreihen. Tendenziell scheinen die Reversionsgrade mit der Zell-Lebensdauer korrelieren, hier-bei zeigen kurzlebige Zellen (Mono-, Granulo-, B-Lymphozyten) höhere Reversionsgrade als langlebige T-Lymphozyten. Das Auftreten von gleichen Reversionen in allen Zelllinien lässt eine Reversion in einer gemeinsamen Vorläuferzelle vermuten. Als Besonderheit fanden wir, unseren Erachtens erstmalig, eine komplette Reversion einer Knochenmark-Fibroblastenzelllinie (Pat. 1). Häufig in Kultur stattfindende Re-versionen in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten wir für alle vier Patienten. Die Mosaikentstehung im Patientenblut konnte mit allen Methoden bestätigt werden. Jede Methode wies Vor- und Nachteile auf. Zur Abschätzung der Mosaikstatus empfiehlt sich deshalb eine Kombination der Methoden.
Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit Interaktionen des FANCO (RAD51C) innerhalb der RAD51 Paraloge (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) und mit RAD51. Die Analysen erfolgten im Mammalian Two- und Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Die Untersuchungen bestätigten die meisten der bisher detektierten Interaktionen, welche zur Ausbildung des RAD51C-XRCC3 Komplexes und des, aus den Subkomplexen RAD51B-RAD51C (BC) und RAD51D-XRCC2 (DX2) bestehenden, BCDX2-Komplex führen. Die M3H-Analysen weisen auf eine wichtige Rolle des RAD51B-Proteins bei der Ausprägung dieses Komplexes hin. Es scheint die Ausbildung der RAD51C-RAD51D-Interaktion erst zu ermöglichen und zusätzlich, anders als bisher beobachtet, auch mit XRCC2 zu interagieren. Diese Interaktion wiederum wird durch die Anwesenheit von RAD51D stark gefördert. Unsere M2H-/M3H-Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ausbildung der Subkomplexe für die Entstehung des BDCX2-Komplexes wichtig ist und dieser vermutlich als Ringstruktur vorliegt. Zusätzlich fanden wir Hinweise auf mögliche Wechselwir-kungen zwischen den BCDX2- und den XRCC3-Komplexproteinen. Aufgrund der Beteiligung der Protei-ne an der Doppelstrangläsionsreparatur wurde die Auswirkung von MMC-induzierten DNA-Schäden un-tersucht. Diese führten innerhalb der Subkomplexe zu gegensätzlichen Änderungen der Interaktionsinten-sität. Während die Substanz im DX2-Komplex zum Sinken der Interaktionsstärke führte, erhöhte sich diese im BC-Komplex. Die in der Literatur beschriebene und charakterisierte RAD51C-FANCN-Interation war im M2H-Test nicht darstellbar. Möglicherweise würde diese jedoch durch die Anwesenheit eines drit-ten Proteins gefördert werden. Zusätzlich wurde ein RAD51C-Protein, welches die Patientenmutation R258H enthielt, überprüft. Es zeigte nur in der M3H-Analyse, mit pMRAD51D und nativem RAD51B, nach Behandlung mit MMC eine reduzierte Interaktionsstärke im Vergleich zum Wildtyp. Dies unter-streicht einmal mehr die als hypomorph beschriebene Mutation des Proteins.
Das dritte Projekt, die angestrebte Strukturaufklärung des RAD51C-Proteins erwies sich als schwierig. Eine für eine Kristallisation ausreichende Proteinmenge konnte, weder im E. coli-System noch in Insektenzellen oder in Co-Expression mit seinem Interaktionspartner XRCC3, isoliert und aufgereinigt werden. Elektro-phoretische Mobility Shift Assays des CX3-Proteinkomplexes mit DNA-Strukturen (ssDNA, Open Fork, 3‘-/ 5‘-Überhang-Struktur), zeigten eine Bevorzugung des 3‘-Überhang-DNA-Substrates. Diese Art der Analyse könnte in weiterführenden Analysen zur Abschätzung der Auswirkung von Patientenmutationen herangezogen werden. bb
N2  - For maintaining genomic stability several repair mechanisms have evolved. Defects in these mechanisms lead to diverse diseases. One of these Fanconi Anemia (FA), first described in 1927, evoked by deficient mechanism of interstrand crosslinks. As causative reason defects within the FA-BRCA pathway were iden-tified leading to chromosome instability. To date 19 different genes were found to cause Fanconi Anemia. Most commonly for the clinical picture of FA are congenital malformations, progressive bone marrow defects as like an increased tumor rates and anemia at a juvenile age. Knowing the affected gene only lim-ited conclusions could be considered of the phenotypical appearance. More likely the kind of mutation and the affected position within the gene seems to correlate with the severity of the disease. Over the time an elevated number of patients with mild phenotype were observed. One possible explanation may be mild mutations another a mosaic state developed within the blood forming cells. The latter was caused by rever-sion of one of both mutations. This kind of “natural gene therapy” was observed in the blood of 10 up to 30 % FA- patients. To get better insights in to the mosaic development we investigated different cell lines of five patients aged between 11 (pat. 5) and 33 (pat. 4) years. Both FA-A patients (pat. 1, 2) were described as mosaic patients before by Gross et al. 2002. The other patients arouse suspicion for developing mosai-cism by different aspects like normal blood counts, MMC tolerant lymphoblastiode cell lines and analyzing gDNA from blood. Detailed analyses confirmed the reversion of one mutation in blood of the FA-D2 patients (pat. 4, 5). In common for all four mosaic was the kind of reversion, a back mutation (pat. 1: c.971T>G, pat. 2: c.856 C>T, pat. 4: c.3467-2A>G, pat. 5: c.3707G>A) mostly in or near by a mutation motive. To get insights in to the mosaic state of the patients’ blood cells, gDNA, chromosomal breakage and cell cycle analyses were performed and blood cell counts of thrombo-, mono-, granulo-, lymphocytes and haemoglobin were observed for several years. Chromosomal breakage analyses of t-lymphocytes met-aphases (pat. 4, 5) treated with MMC showed a mosaicism typical bimodal distribution. The only moderate increased chromosomal breakage rate in metaphases of patient 1 points out a strong pronounced reversion. For better estimation of the Mosaic state in patient blood we performed cell cycle analysis with mixtures of FA- and non FA-blood. Thereby we observed the border for mosaic detection at a degree of 30 % cells with spontaneous /MMC induced G2-phase arrest. Compared to the mixing study reversion degrees of 0 % (pat. 4) up to 90-95 % (pat. 2) were assumed for four of the patients. At molecular base gDNA analyses of MACS sorted T-/ B- lympho, mono and granulocytes as well as from fibroblasts and lymphoblastoide cell lines allowed a more detailed insight in to the mosaic statuses. In all patients we observed different distinct of mosaic state in their blood cell lines. We observed a tendency of correlation between reversion degree and the longevity of blood cells – cells with short life spans (mono-, granulo-, B-lymphoytes) showed higher reversion degrees than log living T-lymphocytes. The fact that we detected the same rever-sion in the different cell lines of a patient suggests a reversion within a common precursor cell. Further we observed, as we know for the first time, a reversion within a bone marrow fibroblast line (pat. 1). Four of our patients showed commonly observed reversions in cultured lymphoblastoide cell lines. With each of the tested methods we could show mosaic development in blood of our patients. Every of them showed pros and cons. For this reason a combination of the different methods would be recommendable for cal-culation of the mosaic state in patient blood.
The second project investigated the interactions of FANCO (RAD51C) within the group of the RAD51 paralogs (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) and with RAD51. Interactions were tested by Mammalian Two- and Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Our investigations confirm most of the up to now detected interactions leading to RAD51C-XRCC3-complex (CX3) and RAD51B-RAD51C-RAD51D-XRCC2 com-plex (BCDX2) formation – latter consisting of the subcomplexes RAD51B-RAD51C (BC) and RAD51D-XRCC2 (DX2). M3H analyses give a hint for the importance of the RAD51B protein for the BCDX2 complex formation. The protein seems to be necessary for RAD51C-RAD51D interaction and also to interact, other than intended before, with XRCC2. In turn this interaction seems to be strongly promoted by RAD51D. In M2H and M3H analyses we found evidence of the importance of subcomplex formation for the formation of the whole BCDX2 complex and that the complex may be a circular structure. Addi-tionaly we observed evidence for interdependency between the BCDX2- and the XRCC3- complex pro-teins. Because of the proteins involvement into the double strand lesion repair the effect of MMC induced DNA lesions were tested. MMC treatment leads to different changes of interaction within the subcom-plexes. We observed a decrease of interaction strength between RAD51D and XRCC2 and an increased interaction within the BC-complex. The interaction between RAD51C and FANCN was not detectable in our M2H assay but may be promoted by another protein in M3H analysis. Additionally we tested a RAD51C protein inherited the patient mutation R258H. Only in M3H analysis with pMRAD51D and native RAD51B and with additional MMC treatment reduced interaction strength was detectable compared to the wildtype RAD51C. This underlines the hypomorphic nature of the mutation described before.
The third project – the elucidation of the RAD51C protein structure proved to be difficult. We could not isolate and purify enough protein for crystallization, neither by expression within a E.coli or an insect cell system not even by co-expression of the complex partner XRCC3. Electrophoretic mobility shift assays of the CX3 complex with different DNA-structures (ssDNA, open fork, 3’- and 5’- overhang structures) showed preference for the 3’-overhang DNA substrate. This method may be used for further investiga-tions of mutations in patient DNA in future.
KW  - Fanconi Anämie
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KW  - Remission
KW  - Molekulargenetik
KW  - Fanconi Anämie
KW  - hämatopoetisches Mosaik
KW  - Reversion
KW  - RAD51C
KW  - FANCO
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127836
ER  -