TY  - THES
A1  - Mildenberger, Michael
T1  - Untersuchung von im Tissue-Engineering-Verfahren hergestellten Oral-Mukosa-Äquivalenten mittels RT-qPCR (reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction)
T1  - Examination of tissue engineered oral mucosa equivalents by RT-qPCR (reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction)
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurden Fibroblasten und Keratinozyten, welche in vitro auf unterschiedlichen Scaffolds sowohl gemeinsam als auch in Monokulturen gezüchtet wurden, mittels Real-time PCR auf ihre Genausschüttung untersucht, um festzustellen wie sich die Unterlage auf die Genausschüttung auswirkt. Hierzu wurden die Proben sowohl auf die Genexpressionsmarker für die Basallamina Kollagen IV, Laminin 1 und 5 als auch auf die Genexpressionsmarker für die frühe Differenzierung Keratin K13 und K14 untersucht. Als Referenzgen wurde β-Actin ausgewählt, da dieses Gen in den Vorversuchen mit zwei weiteren Referenzgenen die stabilste Expression gezeigt hatte. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass nur in den Kokulturen von Keratinozyten und Fibroblasten eine ausgewogene Genexpression stattfindet, da sich die Zellen darin beeinflussen und regulieren.
N2  - Fibroblasts and keratinocytes were cultured in vitro on different scaffolds in monocultures and cocultures and examined by RT-qPCR for gene expression. Gene expression analysis was made for genes coding for basement Membrane collagen IV, laminin 1 and 5 and for early differentiation keratin K13 and K14. β-Actin was used as reference gene, because it showed in preliminary tests with two other reference genes most stable expression. Gene expression analysis showed only in cocultures of fibroblasts and keratinocytes balanced gene expression, because the two cell types affect and regulate each other.
KW  - Real time quantitative PCR
KW  - Tissue Engineering
KW  - Mundschleimhaut
KW  - Referenzgen
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155286
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kriegebaum, Ulrike
T1  - Entwicklung eines gewebenahen Konstruktes aus einer Matrix mit in vitro kultivierten Fibroblasten und Keratinozyten zum Ersatz der Oralmukosa unter Einsatz von Tissue Engineering
T1  - Development of a tissue-related construct of a matrix with in vitro cultured fibroblasts and keratinocytes to replace oral mucosa using tissue engineering
N2  - In der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie besteht ein großer Bedarf an Transplantaten zur intra- und extraoralen Defektdeckung in der chirurgischen Therapie, insbesondere für die Rekonstruktion nach Traumen oder Tumorresektionen für den Erhalt von Funktion und Ästhetik. Konventionelle Methoden wie die Verwendung von autologen, freien Spalt- und Vollhaut-Transplantaten zeigen Nachteile wie z. B. die Entnahmemorbidität der Spenderregion oder die Notwendigkeit eines zweiten chirurgischen Eingriffs zur Deckung des Entnahmedefektes. Zudem sind diese Transplantate nur in kleinen Mengen verfügbar oder haben eine unterschiedliche Gewebestruktur sowie andere Keratinisierungsmuster. Diese Nachteile sollen mit Hilfe eines im Tissue Engineering hergestellten Oralmukosa-Äquivalentes umgangen werden. Dazu wurden zunächst Methoden zur Isolierung und Kultivierung primärer, oraler Fibroblasten bzw. Keratinozyten entwickelt, die das Ausgangsmaterial für die Herstellung von Dermal-Äquivalenten bzw. von organotypischen Kokulturen in vitro bilden. Die Zellen wurden sowohl histologisch als auch immunhistochemisch charakterisiert und nach Optimierung der Kulturbedingungen zur Entwicklung von Oralmukosa-Äquivalenten (OMÄs) eingesetzt. Dabei ist auch die Wahl eines geeigneten Trägermaterials ein entscheidender Faktor. Deshalb wurden in dieser Arbeit verschiedene Unterlagen auf Eignung als Scaffold für das Tissue Engineering von Oralmukosa getestet. Unter anderem wurden die Materialien Vicryl (resorbierbares Polyglactin-910-Netz), DRT (dermale Regenerationsmatrix aus bovinem Kollagen-I vernetzt mit einem Glycosaminoglycan) und TFE (equine Kollagen-I-Membran) in Zellkulturversuchen auf Biokompatibilität und Stabilität geprüft. Dazu wurden zunächst Fibroblasten auf die Scaffolds ausgesät um Dermal-Äquivalente (DÄs) zu erhalten. Das Wachstum der Zellen wurde mittels Elektronenmikroskopie sowie immunhistochemischen Methoden untersucht. Die Analyse zeigte gutes Zellwachstum und somit gute Biokompatibilität auf allen verwendeten Materialien. In folgenden Experimenten wurden zusätzlich Keratinozyten auf DÄs ausgesät und somit organotypische OMÄs entwickelt. Die generierten Konstrukte wurden mit Hilfe von IIF-Färbungen von Kryoschnitten sowie RT-qPCR bezüglich ihrer Zellarchitektur, ihrer Fähigkeit zur Bildung einer Basalmembran und ihrer Fähigkeit zur Differenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, dass auf allen drei Trägern Fibroblasten-Keratinozyten Kulturen hergestellt werden konnten. Dabei zeigte Vicryl eine gute Biostabilität, jedoch ohne Ausbildung der natürlichen Stratifizierung der Keratinozytenschichten. Auf TFE dagegen zeigte sich die beste Architektur und Proliferation der Zellen mit Stratifizierung der Keratinozyten, allerdings eine schlechte Biostabilität. DRT stellte sich als die Matrix heraus, die die gewünschten Eigenschaften am besten vereint. Das Ergebnis war jedoch im Bezug auf die Dicke der Epithelschicht sowie deren Differenzierung und Ausbildung einer Basalmembran noch zu verbessern. Dies konnte mit Hilfe der Kulturmethode an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erreicht werden. Jedoch gelang bezüglich der Zellarchitektur noch immer kein optimales Ergebnis. Erst der Einsatz einer weiteren Membran, SIS (azellularisierter Schweinedarm), die durch ihren natürlichen Ursprung ähnlich strukturiert ist wie humane Submukosa, zeigte, dass die angewandte Methodik zur Herstellung von OMÄs funktionierte. Auf diesem Träger gelang die Herstellung eines Transplantates, das eine mit normaler Oralmukosa vergleichbare, reguläre Zellarchitektur mit dermaler und epidermaler Komponente aufwies, die qualitativ noch besser war als auf TFE. Auch die Biostabilität während des Versuchszeitraumes war wie bei Vicryl und DRT gegeben. Die Neusynthese einer Basalmembran konnte mittels IIF-Färbung nachgewiesen werden. Die Proliferation der Keratinozyten war in der Basalschicht lokalisiert und nahm Richtung apikal ab. Lediglich eine Differenzierung des Transplantates war mittels immunhistochemischer Methoden nicht nachweisbar. Auf diese Weise konnte in der vorliegenden Arbeit ein OMÄ entwickelt werden, dessen Aufbau mit dem von natürlicher Oralmukosa vergleichbar war. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse dienen somit als Grundlage zur Optimierung und Verwirklichung des klinischen Einsatzes von mittels Tissue Engineering hergestellten, autologen OMÄs.
N2  - In oral and maxillofacial surgery, there is a great demand for oral mucosa equivalents for intra- and extraoral grafting as oral reconstruction after trauma or tumor resections to preserve function and aesthetics. Current methods of covering intraoral defects with autologous epidermal and dermal grafts show disadvantages, e.g. donor site morbidity or the need for a second surgical procedure to cover the harvesting site. These grafts are either only available in small amounts or have a different texture, such as a different keratinization pattern. These disadvantages could be avoided by using autologous tissue engineered mucosa equivalents. In a first step, a method for isolation and cultivation of primary oral fibroblasts and keratinocytes was developed. They formed the starting material for production of dermal equivalents (DEs) and organotypic cocultures in vitro. The cells were characterized both by histological staining and by immunohistochemical staining. After optimization of the cell culture conditions they were used for the development of oral mucosa equivalents (OMEs). Thereby the selection of a suitable scaffold is a decisive factor. Therefore, different matrices for the tissue engineering of oral mucosa have been studied in this thesis. Amongst others, the materials Vicryl (woven membrane of polyglactin 910), DRT (dermal regeneration template of cross-linked bovine tendon collagen and a glycosaminoglycan) and TFE (equine collagen I membrane) have been tested in cell-culture experiments for biocompatibility and stability. For this purpose first only fibroblasts were seeded on scaffolds to obtain DEs. Cell growth was examined by electron microscopy and immunohistochemical methods. The analysis showed good cell growth and good biocompatibility as well on all the used materials. In following experiments keratinocytes were seeded on dermal equivalents to develop organotypic co-cultures. The obtained constructs were characterized by immunohistochemical staining and gene expression analysis using RT-qPCR to get information about cell architecture, formation of a basal membrane and status of differentiation. It has been found, that it was possible to create fibroblast-keratinocyte-cultures on all three scaffolds. Thereby Vicryl showed a good biostability but no formation of the natural stratification of the epidermal cells. These findings are in contrast to the results on TFE. Here was the best architecture and proliferation of the cells with stratification of the newly formed epidermis, but bad biostability of the membrane. The combination of the desired properties could only be seen on DRT, but the thickness, differentiation and basal membrane formation of the epithelial layer needed to be improved. This was achieved by cultivation of the cells in the air liquid interface but there was still no optimal result. Only the use of another scaffold, SIS (acellular matrix from porcine small bowel) which has a similar structure to humane submucosa, shows functionality of the developed method of OME generation. On this scaffold the generation of a transplant succeeded even better than on TFE. It had dermal and epidermal components with regular cell architecture like native oral mucosa. Also the biostability during the experimental period was comparable with Vicryl and DRT. It has been possible to demonstrate the formation of a basal membrane by IIF staining. Keratinocyte proliferation was localized in the basal layer with declining proliferation activity in apical direction. Only differentiation could not be proven by means of immunohistochemistry. Thus the present thesis developed a method for creation of an OME with comparable organization to that of the native oral mucosa. The findings summarized in this study will serve as basis for optimization and realization of the clinical use of tissue engineered autologous OMEs.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Mundschleimhaut
KW  - Transplantat
KW  - Keratinozyten
KW  - Fibroblasten
KW  - Kokultur
KW  - Tissue Engineering
KW  - Biocompatible Materials
KW  - Oral Mucosa
KW  - Keratinocytes
KW  - Co-culture
KW  - Composite Graft
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57403
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wannhoff, Andreas
T1  - Identifizierung von Biomarkern der Belastung von Mundschleimhautzellen mit Schwermetallen und polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen
T1  - Identification of biomarkers for exposure of human oral mucosa to heavy metals or polycyclic aromatic hydrocarbons
N2  - Menschliche Mundschleimheut wurde ex-vivo gegenüber Schwermetallen (Blei) oder polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (Benzopyren) für Zeiten von 5Min. bis 360Min exponiert. Immunhistochemisch wurdne im Anschluss Marker für Apoptose, oxitaven und nitrogenen Stress untersucht. Hierbei zeigten sich jeweils charakteristische Veränderungen für aktive Caspase-3, 3-Nitrotyrosine und 8-epi-PGF2alpha. Proben von Rauchern wurden mit Nichtraucherproben verglichen und zeigten verminderte Werte für oxidativen und nitrogenen Stress.
N2  - In this study samples of human oral mucosa were ex-vivo exposed to lead or benzopyrene to further investigate the influence of heavy metals and polycyclic aromatic hydrocarbons on apoptosis and generation of oxidative and nitrosative stress in human oral mucosa. Immunhistochemical staining was done for active-caspase-3, 8-epi-PGF2a and 3-nitrotyrosine as biomarkers for apoptosis as well as oxidative and nitrosative stress. Samples obtained from smokers where furthermore compared to non-smokers' samples. Activation of apoptosis and generation of oxidative and nitrosative stress already occured in oral mucosa cells after short-term, one-time exposure to lead or benzopyrene and is not limited to chronic exposure. In smokers' samples there seems to be a reduced generation of reactive oxygen or nitrogen species after exposure to benzopyrene.
KW  - Mundschleimhaut
KW  - Benzopyren
KW  - Polycyclische Aromaten
KW  - Blei
KW  - Schwermetall
KW  - Apoptosis
KW  - Oxidativer Stress
KW  - human oral mucosa
KW  - lead
KW  - benzopyrene
KW  - apoptosis
KW  - oxidative stress
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73302
ER  - 
TY  - THES
A1  - Alius, Jochen Klaus
T1  - Freies Jejunumtransplantat in die Mundhöhle : Immunhistochemische Analyse der Grenzstrukturen zwischen Transplantat und Mundschleimhaut mit bis zu 21 Jahren Transplantat-Liegedauer
T1  - Free autologous jejunal graft for reconstruction of the oral cavity : Immunohistochemical study
N2  - In vorliegender Studie wurde an histologischen Präparaten mittels immunhistochemischen Färbungen der Übergangsbereich zwischen oraler Mukosa und transplantiertem Jejunumsegment untersucht. Mit der Fragestellung ob sich die Strukturen im Übergangsbereich zwischen freiem Jejunumtransplantat und oraler Mukosa funktionell verändern und ob die Dünndarmepithelien einer morphologischen Umwandlung unterliegen. Zu diesem Zweck wurden die Gewebeschnitte nach der LSABC Methode mit verschiedenen Antikörpern markiert die spezifisch das zu bestimmende Epithel anfärbten. Die Differentzierung der Epithelien erfolgte durch für jede Epithelart spezifische Zytokeratine. Nachgewiesen wurde eine Abflachung des Zottenreliefs sowie eine numerische Becherzellatrophie. In unseren histologisch nachuntersuchten Gewebeproben stellte sich die Grenze zwischen transplantiertem Jejunumsegment und mehrschichtigem Plattenepithel exakt und scharf begrenzt dar. Weder Zellcluster von mehrschichtigem Plattenepithel im Bereich des Dünndarms, noch eine Transformationszone, wie sie bei Zellmetaplasie vorkommt konnte nachgewiesen werden. Auch hielten die dünndarmeigenen Gefäße die Grenze zwischen den beiden Geweben strikt ein und verliefen ebenso scharf begrenzt. Subepithelial zeigte sich zwar zu Beginn eine entzündlich bedingte Gefäßproliferation mit schütterem leukozytären Infiltrat, welches aber im Laufe der Zeit durch kollagenfasereiches Bindegewebe narbig ersetzt wurde. Die nachweisbaren CD 4 positiven Entzündungszellen waren nicht über das gewöhnliche Ausmaß vermehrt, es kommt zur Ausbildung einer Gewebsgrenze die von beiden Epithelien respektiert wird unter der Vereinigung des subepithelialen Bindegewebes. Dies alles kann als Bestätigung dafür angesehen werden, dass die Rekonstruktion großer Defekte mittels freiem Jejunumtransplantat auch über einen Zeitraum von mehr als 21 Jahren erfolgreich ist und das Transplantat seinen Anforderungen in der neuen Umgebung standhält.
N2  - Immunohistochemical study over 21 cases of free autologous jejunal grafts, for reconstruction the oral cavity.
KW  - Dünndarmtransplantat
KW  - Mundschleimhaut
KW  - free jejunal graft
KW  - oral cavity
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21548
ER  -