TY  - THES
A1  - Fieseler, Lars
T1  - Entdeckung des neuen Candidatus Phylums Poribacteria
T1  - Discovery of the novel candidate phylum Poribacteria
N2  - Marine Schwämme (Porifera) sind sessile Invertebraten, deren Biomasse bis zu 60% von assoziierten Mikroorganismen gebildet werden kann. Dieses mikrobielle Konsortium ist phylogenetisch komplex, die monophyletischen Abstammungslinien sind hochgradig wirtsspezifisch und bisher konnte kein Vertreter dieser Mikroflora kultiviert werden. In seiner Zusammensetzung unterscheidet sich dieses Konsortium sowohl von der Mikroflora mariner Sedimente, als auch vom marinen Bakterioplankton. Durch 16S rRNA Sequenzanalysen und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte während dieser Arbeit das neue Candidatus Phylum Poribacteria kultivierungsunabhängig identifiziert werden. Poribacteria bilden definitionsgemäß ein unabhängiges Candidatus Phylum, da sie weniger als 75% Sequenzhomologie innerhalb der 16S rRNA zu anderen prokaryontischen Phyla zeigen. Sie sind verwandt mit Planctomycetes. Der Name „Poribacteria“ wurde gewählt, da diese Organismen spezifisch mit marinen Porifera assoziiert zu sein scheinen. Bisher konnten Poribacteria in Porifera der Ordnungen Verongida, Haplosclerida und Lithistida nachgewiesen werden, während sie in den Ordnungen Poecilosclerida, Agelasida, Halichondrida und Hadromerida nicht nachweisbar waren. Im marinen Sediment und im Bakterioplankton wurden Poribacteria ebenfalls nicht detektiert. Durch FISH Analysen wurde deutlich, dass Poribacteria in A. aerophoba (Verongida) eine abundante Fraktion der assoziierten Mikroflora bilden. Da Vertreter des mikrobiellen Konsortiums mariner Schwämme bisher nicht kultiviert werden konnten, wurde das „Metagenom“ dieser Mikroorganismen durch die ex situ Isolierung hoch molekularer DNA direkt kloniert. Eine Charakterisierung von Metagenomen erlaubt unabhängig von der Kultivierbarkeit der entsprechenden Organismen direkte Einblicke in deren Genotyp und liefert so eine erste Verbindung zwischen phylogenetischer Diversität und physiologischen Eigenschaften. Für die Erstellung der Metagenombank wurde mikrobielle Biomasse aus A. aerophoba vom Mesohyl getrennt und lysiert und die gereinigte DNA in Fosmid Vektoren in E. coli kloniert. Die resultierende Metagenombank APAE02 umfasst ca. 1,1 Gb hoch molekularer prokaryontischer genomischer DNA. Eine Bestimmung der in dieser Metagenombank archivierten mikrobiellen Diversität lieferte zusätzlich zu bekannten 16S rRNA kodierenden Loci aus Cyanobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria und Gammaproteobacteria einen 16S rRNA kodierenden poribakteriellen Fosmidklon. Die Annotation der flankierenden genomischen Regionen des 16S rRNA Gens führte zur Detektion eines unterbrochenen rrn Operons, eines wahrscheinlich neuen Transporters, einer neuen Molybdän enthaltenen Oxidoreduktase und orthologer „open reading frames“ (ORFs) aus Rhodopirellula baltica (Planctomycetes) in Poribacteria. Die Charakterisierung dieses 38,7 kb DNA Fragmentes stellt die Basis für weitere genomische Untersuchungen an Poribacteria dar. Metagenombanken repräsentieren eine reichhaltige Quelle zum Nachweis neuer Enzyme oder Biosyntheseoperons. Somit konnten in der Metagenombank APAE02 neuartige Typ I Polyketidsynthasen (PKS) nachgewiesen werden. Phylogenetische Analysen der Ketosynthasedomäne zeigten, dass diese Systeme nicht herkömmlichen Typ I cis-AT bzw. trans-AT (Acyltransferase) PKS Systemen zugeordnet werden können. Die kodierenden Bereiche der PKS Systeme sind mit nur ca. 10 kb relativ klein. Im Gegensatz zu der Organisation sich wiederholender multipler Module herkömmlicher PKS Typ I Systeme bestehen sie nur aus einem einzigen Modul und könnten vermutlich bei der Synthese von Fettsäuren beteiligt sein. Die Struktur und Funktion der Produkte ist bisher unbekannt. Generell ist durch in silico Analysen eine Abbildung des „funktionellen Repertoires“ unkultivierter Mikroorganismen möglich. Es wäre denkbar, dass durch weitere Studien fundierte Einblicke in den Genpool der Poribacteria und anderer Organismen des mikrobiellen Konsortiums aus Poriferen eröffnet werden, um metabolische Eigenschaften zu rekonstruieren und die Mechanismen zur Interaktion mit dem Wirt verstehen zu können.
N2  - Marine sponges (Porifera) are sessile invertebrates which are associated with a phylogenetically complex, yet host-specific microbial consortium. The microorganisms can contribute up to 60% of the sponge biomass. None of the corresponding bacteria could be cultivated applying standard laboratory culturing techniques. Among this microbiota 16S rRNA gene sequence analyses and fluorescence in situ hybridization (FISH) revealed the detection of a novel candidate phylum, termed Poribacteria, independently of cultivation. By definition Poribacteria represent a candidate phylum, because they exhibit less than 75% similarity with 16S rRNA sequences of other bacterial phyla. They are moderately related to Planctomycetes. The name “Poribacteria” was chosen to acknowledge their specific association with marine Porifera. Poribacteria have been detected in sponges of the orders Verongida, Haplosclerida and Lithistida, while they could not be detected in Poecilosclerida, Agelasida, Halichondrida and Hadromerida and neither in marine sediments or bacterioplankton. FISH analyses implied that Poribacteria represent an abundant and metabolically active part of the microbial consortium of A. aerophoba. Because none of the sponge-associated microorganisms have been cultivated so far, the ex situ isolation and cloning of the corresponding “metagenome” was performed. Metagenomics enables first insights into the biology and genotypes of so far uncultured microbes. For the construction of the DNA library microbial biomass was separated from the mesohyl of A. aerophoba and lysed, followed by cloning of the purified DNA into a fosmid vector in E. coli. The constructed metagenome library harbours ca. 1.1 Gb of procaryotic high molecular weight genomic DNA. A determination of the phylogenetic diversity filed in this library resulted in the detection of sponge specific microbial lineages of the Cyanobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria und Gammaproteobacteria as well as a poribacterial 16S rRNA gene encoding clone. The annotation of the 16S rRNA gene flanking genomic regions revealed an unlinked rrn operon, a putatively novel transporter, channel or pore, a new molybden containing oxidoreductase and orthologous open reading frames (ORFs) of Rhodopirellula baltica (Planctomycetes) in Poribacteria. The 38.7 kb poribacterial clone now provides a starting point for further genomic studies. Metagenome libraries represent a rich source for the detection of novel enzymes or biosyntheses operons. Therefore the metagenome library was further screened which led to the discovery of a novel kind of type I polyketidesynthases (PKS) among the sponge microbiota. Phylogenetic analyses suggested that the PKS systems do not belong to the conventional cis-AT or trans-AT (acyltransferase) PKS systems. The coding regions are relatively small (10 kb). The systems contain only one module which is in contrast to the iterative multiple modul structure of conventional PKS type I systems. The sponge-derived PKS systems may be involved in the syntheses of fatty acids. In general in silico analyses allows the documentation of genomic features of uncultured microbes. Further sequencing of metagenome clones could provide additional insights into the genepool of Poribacteria and other members of the sponge microbial consortium, which could lead to the description of metabolic properties and the mechanisms behind their interaction with the sponge host.
KW  - Schwämme
KW  - Bakterien
KW  - Systematik
KW  - Genanalyse
KW  - 16S rRNA
KW  - Metagenomik
KW  - Poribacteria
KW  - Demospongiae
KW  - 16S rRNA
KW  - metagenomics
KW  - environmental genomics
KW  - poribacteria
KW  - demospongiae
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13283
ER  - 
TY  - THES
A1  - Valenza, Giuseppe
T1  - Kulturunabhängige Analyse der subgingivalen bakteriellen Flora bei Hypophosphatasiepatienten
T1  - Culture-indipendent analysis of subgingival bacterial flora in hypophosphatasia patients
N2  - Kurzfassung in deutsch Ziel dieser Studie war die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque bei einem Hypophosphatasiepatientenkollektiv durch Anwendung der 16S rRNA Technologie. Das Kollektiv bestand aus sieben männlichen Patienten mit einer infantil-juvenilen Hypophosphatasie. Es sollten mikrobiologische Evidenzen für oder gegen die Hypothese einer frühen Parodontitis bei Hypophosphatasiepatienten gewonnen werden. Subgingivale Plaqueproben wurden von jedem Patienten entnommen. Anschließend folgte die DNA Extraktion aus den Plaqueproben und die Amplifikation der 16S rRNA Gene mittels zweier verschiedener universeller Primer-Paare: 27f/519r; 515f/1525r. Die PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Dann folgte ein Vergleich der Sequenzen mit der Genbank Database durch den BLAST-Server des National Center for Biotechnology Information (NBCI, Bethesda, MD, USA). Insgesamt wurden zwei verschiedene 16S rRNA Genbanken erstellt und 101 Klone pro Genbank identifiziert. Mit der 27f/519r PCR wurden 15 bakterielle Familien, mit der 515f/1525r PCR 10 bakterielle Familien identifiziert. 66 Phylotypen wurden in der 27f/519r Genbank identifiziert, 41 in der 515f/1525r Genbank. Der Coverage war 50% in der 27f/519r Genbank und 73% in der zweiten Genbank. In allgemeinen zeigte sich ein hoher Anzahl der Keime der physiologischen Plaqueflora (Streptococcus sp. und Actinomyces sp.), dagegen kamen putative Parodontalpathogene wie Porphyromonas gingivalis, Filifactor alocis, Tannerella forsythensis, Campylobacter rectus niemals vor. Die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque erbrachte eine deutlich andere Zusammensetzung im Vergleich zu Padodontitispatienten. Es zeigte sich somit keine mikrobiologische Evidenz für eine Parodontitis bei dem Hypophosphatasiepatientenkollektiv.
N2  - Kurzfassung in englisch In this study the bacterial diversity of the subgingival plaque from seven male patients with childhood-type hypophosphatasia (HOPS) was analyzed by 16S rRNA gene cloning and sequencing with the purpose to find out microbiological evidences of periodontitis. 202 sequences were analyzed: 66 phylotypes were identified within the clone libraries based on PCR using the primers 27f/519r (number of clones n=101; coverage C=50%), and 41 phylotypes within the clone libraries 515f/1525r (n=101; C=73%). We recovered only three of 20 putative pathogens, which were proposed recently by Paster et al. (2001) to be associated with periodontitis. Significant was that known putative periodontal pathogens such as Porphyromonas gingivalis, Filifactor alocis, Tannerella forsythensis and Campylobacter rectus were not identified in any patient. These results seem to exclude a periodontitis in the hypophosphatasia collective.
KW  - Hypophosphatasie
KW  - Parodontitis
KW  - 16S rRNA
KW  - Hypophosphatasia
KW  - Periodontitis
KW  - 16S rRNA
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7094
ER  - 
TY  - THES
A1  - Grimm, Dorothee
T1  - Entwicklung von neuen Nachweismethoden für Legionellen und Amöben und ihre Anwendung in ökologischen Studien
T1  - Development and evaluation of novel detection systems specific for legionellae and amoebae and their application in ecological studies
N2  - Legionella pneumophila wurde 1976 als Erreger der Legionellose, einer schweren Form von Lungenentzündung, identifiziert. Die inzwischen 42 Arten umfassende Gattung ist weltweit in aquatischen Biotopen verbreitet. Die Bakterien leben vergesellschaftet mit anderen Mikroorganismen in Biofilmen oder intrazellulär in Protozoen. Sie haben ein duales Wirtssystem, das heißt, sie sind in der Lage, sich sowohl in Einzellern als auch in humanen Phagozyten zu vermehren. Für die Erweiterung ihrer Habitate spielen verschiedene Umweltfaktoren eine Rolle. Eine exakte und schnelle Detektion und Identifikation der humanpathogenen Keime ist sowohl für die Lokalisierung der Infektionsquelle als auch für eine rechtzeitige Therapie der Patienten von großer Bedeutung. Die Technik der fluoreszierenden in situ Hybridisierung (FISH) basiert auf der Bindung einer spezifischen, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonde an eine komplementäre Zielsequenz der ribosomalen RNA. In der vorliegenden Arbeit wurde für die in situ Hybridisierung eine neue 16S rRNA-gerichtete Sonde LEGPNE1 entwickelt, die spezifisch ist für L. pneumophila. In Versuchsreihen mit verschiedenen Bakterienkulturen wurden die Spezifität und Sensitivität der Gensonde ermittelt. LEGPNE1 erwies sich als artspezifisch und erkannte alle getesteten L. pneumophila-Stämme, ungeachtet ihrer Serogruppe. Nicht-pneumophila-Referenzstämme hybridisierten nicht mit der Sonde, ein einziger Basenaus-tausch in der Sequenz war für diese Unterscheidung ausreichend. Die Anwendung der Sonde wurde auch in Amöben-Infektionsassays und Umweltproben erfolgreich durchgeführt. Unterschiedliche, intrazellulär vorliegende Bakterien wurden von der Sonde spezifisch erkannt. Eine in situ Dokumentation der Infektions- und Vermehrungsrate war damit möglich. Durch die meist fakultativ intrazelluläre Lebensweise der Legionellen ist es wichtig, auch die Wirtszellen der Keime qualitativ zu detektieren und zu identifizieren. Die Entwicklung neuer Gensonden wurde daher auf die beiden bekannten Wirtsamöben Hartmannella und Naegleria ausgedehnt. Basierend auf Sequenzvergleichen wurden die gattungsspezifischen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konstruiert und in Versuchsreihen mit Referenzstämmen bei steigender Stringenz etabliert. Mit ihrer Hilfe konnten die Ergebnisse der zeit- und arbeitsaufwendigen Determination unbekannter Amöben anhand morphologischer Merkmale bestätigt werden. In situ Hybridisierungen mit einer Kombination von 16S und 18S rRNA-gerichteten Sonden wurden in Amöben-Infektionsassays mit Hartmannella vermiformis und L. pneumophila erfolgreich durchgeführt. Eine Interferenz der Sonden fand nicht statt. Die in situ Untersuchung der Struktur und Funktion komplexer mikrobieller Lebensgemeinschaften erfordert eine kultivierungsunabhängige und hochauflösende Methode, wie sie die fluoreszierende in situ Hybridisierung darstellt. Mit dem Ziel, mögliche Präferenzen der Legionellen für bestimmte Parameter, wie pH, Temperatur, elektrische Leitfähigkeit, Strömungsverhältnisse, zu erkennen und zu definieren, wurden mit Hilfe der neu entwickelten 16S rRNA-gerichteten Sonde 21 verschiedene Kaltwasserhabitate auf die Verbreitung von Legionella untersucht. Die Bakterien zeigten jedoch ein breites Toleranzspektrum gegenüber den gemessenen Parametern. Sie waren in nahezu allen beprobten Gewässern zu finden und ließen sich unabhängig von der Jahreszeit nachweisen. Die neue Sonde LEGPNE1 zeigte sich in in situ Hybridisierungen der Umweltproben als hochspezifisch. Mit ihr konnten auch nicht kultivierbare Legionellen detektiert werden. In drei Legionella-positiven Gewässern wurde außerdem das Vorkommen von Amöben untersucht. Es konnten insgesamt acht Amöbengattungen isoliert, kultiviert und bestimmt werden. Dominierend waren Stämme des nicht humanpathogenen Naegleria gruberi-Komplexes, Echinamoeba spp. und Echinamoeba-like Amöben. In einzelnen Proben wurden Acanthamoeba spp. Gruppe II, Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata und Vexillifera spp. gefunden. Durch in situ Hybridisierung mit den neuen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konnten die Ergebnisse der morphologischen Bestimmung der Amöben bestätigt werden. Auch die Amöben zeigten keine Präferenzen bezüglich der in den Standorten gemessenen Wasserparameter. Die in situ Hybridisierung mit rRNA-gerichteten Gensonden erlaubt eine Analyse der Struktur und Dynamik von Biozönosen, ermöglicht aber keine Aussage über die speziellen Aktivitäten der nachgewiesenen Bakterien. Eine Lösung hierfür könnte der spezifische in situ Nachweis von mRNA-Molekülen darstellen. Ein Problem hierbei stellt ihre, im Vergleich zu anderen Molekülen wie rRNA, sehr kurze Halbwertszeit und das Vorhandensein von nur wenigen Kopien pro Zelle dar. Daher ist im Anschluss an die in situ Hybridisierung in den meisten Fällen eine Signalamplifikation nötig, um ein detektierbares Signal zu erhalten. In dieser Arbeit sollte die für das iap-Gen in Listeria monocytogenes entwickelte Methode zum Nachweis der mip-mRNA in L. pneumophila etabliert werden. Erste Anwendungen in Dot blot- und in situ Hybridisierungen mit mehrfach DIG-markierten Polyribonukleotidsonden bzw. mit simultan eingesetzten, einfach DIG-markierten Oligonukleotiden zeigten noch nicht die gewünschte Spezifität. Diese Ergebnisse stellen jedoch eine wichtige Grundlage für zukünftige Experimente dar.
N2  - Legionella pneumophila was identified in 1976 as the causative agent of a life-threatening atypical pneumonia. Today the genus comprises about 42 species which are spread worldwide in aquatic biotopes. The bacteria live in association with other microorganisms in biofilms as well as intracellularly in protozoa. They have a dual host system which means that they are able to replicate both in protozoans and in human phagocytes. Several environmental factors are known to play a role in their distribution. The ability to quickly detect and to exactly identify these potential human pathogens is important in order to recognize reservoirs for disease as well as to treat patients in due time. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique based on the reaction of a specific oligonucleotide, labeled with a fluorescence marker, with the complementary rRNA target region. In this work a new 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe LEGPNE1 for in situ hybridization was developed, which is specific for L. pneumophila. The specificity and the sensitivity of the probe were evaluated in experiments with different bacterial cultures. LEGPNE1 was demonstrated to be highly species-specific recognizing all tested strains of L. pneumophila independently of the serogroup. Non-pneumophila reference strains did not hybridize with the probe. Only one mismatch in the sequence was shown to be sufficient for the oligonucleotide to distinguish between complementary and nearly complementary sequences. The probe was also applied successfully to infected amoebal cells and environmental samples. Different bacteria located intracellularly were recognized specifically by the probe. This allows the in situ monitoring of bacterial infection and multiplication rates in amoebae. As legionellae presumably live most of the time as intracellular parasites, it is also important to be able to detect their hosts. Therefore, the design of new probes was extended to cover two known host amoebal genera, Hartmannella and Naegleria. Based on comparative sequence analysis the genus-specific 18S rRNA-targeted probes HART498 and NAEG1088 were constructed. Subsequently they were tested in hybridization series with different reference strains and gradually increasing stringency. Amoebal strains which had been identified previously based on their morphological features could be reconfirmed using in situ hybridization with these new oligonucleotides. In situ hybridization experiments of infection assays with Hartmannella vermiformis and Legionella pneumophila using a combination of 16S and 18S rRNA-targeted probes were done successfully. Interference of the probes with the results of the tests was not observed. For the analysis of the composition of complex microbial communities a culture-independent and highly specific method is required. This can be achieved by the fluorescence in situ hybridization. In order to determine potential preferences of legionellae for water parameters such as pH, temperature, conductivity, or water current, twenty-one different cold water habitats were examined for the presence of Legionella using the newly designed 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe. The bacteria were shown to be able to tolerate a broad range of the measured parameters. They could be found in nearly all of the habitats investigated independent of the season. The new probe LEGPNE1 was proved to detect L. pneumophila in environmental samples highly specifically, even if the cells were in a nonculturable state. Three Legionella-positive sampling sites were examined for the presence of amoebae. Using traditional culture methods followed by morphological determination, eight amoebal genera could be isolated and identified. Most abundant were strains of the apathogenic Naegleria gruberi-complex, Echinamoeba spp. and Echinamoeba-like amoebae. Other species including Acanthamoeba spp. (sequence type II), Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata and Vexillifera spp. were found sporadically. In situ hybridization experiments using the new 18S rRNA-targeted oligonucleotide probes HART498 and NAEG1088 confirmed the determinations done by morphological criteria. Concomitant analysis of selected water parameters revealed no preference of the protozoa for certain environmental conditions. In situ hybridization with rRNA-targeted oligonucleotide probes is a powerful tool to analyze structure and dynamics in biocenosis. However, this technique does not provide much information about the in situ function of the detected bacteria. The specific in situ detection of mRNA molecules allows to narrow this gap. One problem in the application of this method is the instability and low copy number of mRNA in each cell compared to other molecules like rRNA. Therefore, a signal amplification posterior to the in situ hybridization is required in most cases in order to generate a detectable signal. In this work the detection of the mRNA of mip in L. pneumophila was to be established using a protocol developed for the detection of iap in Listeria monocytogenes. However, first applications of dot blot and in situ hybridizations using DIG-conjugated polyribonucleotide probes and several DIG-labeled oligonucleotides applied simultaneously did not show the neccessary specificity. This technical approach will be essential for further experiments in this field of research.
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Freilebende Amöben
KW  - Nachweis
KW  - Ökosystem
KW  - Legionella pneumophila
KW  - freilebende Süßwasseramöben
KW  - Nachweis
KW  - Bestimmung
KW  - 16S rRNA
KW  - 18SrRNA
KW  - fluoreszierende in situ Hybridisierung
KW  - Legionella pneumophila
KW  - free-living freshwater amoebae
KW  - detection
KW  - identification
KW  - 16S rRNA
KW  - 18SrRNA
KW  - fluorescence in situ hybridization
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1351
ER  -