TY - THES A1 - Rennemeier, Claudia T1 - Charakterisierung der Thrombospondin-1 vermittelten Anheftung von Streptococcus pneumoniae an humane Wirtszellen T1 - Characterisation of the Thrombospondin-1 mediated adherence of Streptococcus pneumoniae to human host cells N2 - Thrombospondin-1 (TSP1) ist ein matrizelluläres, Calcium-bindendes Glykoprotein, das an der Regulation verschiedener zellulärer Prozesse beteiligt ist. TSP1 wird von unterschiedlichen Zelltypen gebildet und ist vor allem in den α-Granula der Thrombozyten zu finden, aus denen es nach deren Aktivierung sekretiert wird. Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive humanpathogene Bakterien. Sie besiedeln asymptomatisch den menschlichen Respirationstrakt und können schwerwiegende lokale Infektionen und lebensbedrohliche Erkrankungen, wie z.B. Sepsis, bakterielle Meningitis oder invasive Pneumonien auslösen. Die Anheftung von S. pneumoniae an Wirtsstrukturen ist ein initialer Schritt für die Kolonisierung mukosaler Epitheloberflächen. In dieser Arbeit wird die Bedeutung des humanen TSP1 für die Pathogen-Wirt Interaktion analysiert und der Effekt für die Pathogenese demonstriert. Verschiedene Bindungsstudien und durchflusszytometrische Analysen zeigten eine Assoziation von S. pneumoniae an aktivierte Thrombozyten und an lösliches und immobilisiertes TSP1. In in vitro Infektionsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass wirtszellgebundenes TSP1 die Adhärenz an und Invasion in Epithel- bzw. Endothelzellen vermittelt. TSP1 übernimmt die Funktion als Brückenmolekül zwischen S. pneumoniae und eukaryontischen Wirtszellen. Zur Charakterisierung des bakteriellen Adhäsins für TSP1 wurden die Pneumokokken mit dem proteolytischen Enzym Pronase E bzw. mit der Zucker oxidierenden Substanz Natriumperiodat inkubiert. Eine Behandlung mit Natriumperiodat reduzierte die TSP1 vermittelte Adhärenz der Pneumokokken an humane Wirtszellen. Im Gegensatz dazu hatte die Behandlung mit Pronase E keinen Einfluss auf die TSP1 vermittelte Anheftung von S. pneumoniae an eukaryontische Zellen. Diese Ergebnisse deuten an, dass es sich bei dem bakteriellen Adhäsin für TSP1 um eine oberflächenlokalisierte Glykostruktur der Pneumokokken handelt. Die TSP1 vermittelte bakterielle Adhärenz der Pneumokokken an Wirtszellen konnte durch Pneumokokken-spezifisches Phosphorylcholin bzw. durch Lipoteichonsäuren nicht reduziert werden. Im Gegensatz dazu wurde die TSP1 vermittelte Adhärenz von S. pneumoniae an Wirtszellen durch Zugabe von löslichem Peptidoglykan signifikant inhibiert. In verschiedenen Bindungsstudien wurde das Peptidoglykan als Pneumokokken-Adhäsin für TSP1 identifiziert. Weiterhin wurde herausgestellt, dass nicht nur S. pneumoniae, sondern auch andere Gram-positive pathogene Bakterien, wie Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes und verschiedene apathogene Bakterien mit TSP1 interagieren, im Gegensatz zu Gram-negativen Bakterien. Es konnte gezeigt werden, dass TSP1 das Peptidoglykan aller getesteten Gram-positiven Bakterien erkennt. Diese Beobachtung weist auf einen allgemeingültigen Mechanismus der Bakterien-Wirt Interaktion hin, der wahrscheinlich von großer Bedeutung für die Pathogenese Gram-positiver Bakterien ist. Als Rezeptoren für TSP1 auf der Wirtszellseite wurden Proteoglykane auf der Oberfläche von eukaryontischen Zellen identifiziert. Weiterhin konnte herausgestellt werden, dass eine Interaktion der Gram-positiven Bakterien mit TSP1 nicht nur eine Adhärenz an Wirtszellen vermittelt, sondern die Bakterien vor einer Phagozytose durch primäre Granulozyten schützt. Zusammenfassend beweisen diese Ergebnisse eine spezifische Interaktion von Gram-positiven Bakterien mit TSP1, die zur bakteriellen Kolonisierung des Wirtsgewebes beiträgt. Das Peptidoglykan übernimmt die Funktion eines bakteriellen Adhäsins für TSP1, so dass TSP1 als molekulare Brücke die Interaktion von Gram-positiven Bakterien und Wirtszell-Proteoglykanen vermittelt. Diese Untersuchungen tragen in bedeutender Weise zu einem besseren Verständnis der Pathogenese von Infektionen durch S. pneumoniae und anderen Gram-positiven Bakterien bei. N2 - Thrombospondin-1 (TSP1) is a matricellular glycoprotein that has key roles in interactions between human cells and components of the extracellular matrix. TSP1 is produced by different cell types and is mainly found in the α-granules of human thrombocytes and secreted upon their stimulation. Streptococcus pneumoniae are Gram-positive human bacteria which reside asymptomatically in the human respiratory tract, but can also cause local infections and life-threatening diseases such as sepsis, bacterial meningitis and pneumonia. A prerequisite for pneumococcal colonization of mucosal epithelial cells is the bacterial interaction with host cell structures. This study reports a novel role for human TSP1 in pathogen-host interactions. Binding assays and flow cytometric analysis demonstrate that S. pneumoniae specifically interacts with human TSP1. It is shown that S. pneumoniae binds to activated thrombocytes and recruits TSP1 from human plasma. Host-cell bound TSP1 promotes adherence of S. pneumoniae to human epithelial and endothelial cells, thereby acting as a molecular bridge between pneumococci and eukaryotic cells. To identify the bacterial adhesin for TSP1, pneumococci were incubated with the proteolytic enzyme pronase E and with sodium periodate, which oxidizes surface-exposed sugars. Pretreatment of the bacteria with sodium periodate, but not pronase E substantially reduced TSP1 mediated adherence to host cells, suggesting a glycoconjugate as the pneumococcal receptor for TSP1. Pneumococcal phosphorylcholine and lipoteichoic acids did not affect TSP1 mediated adherence of S. pneumoniae to host cells. In contrast, attachment of pneumococci to host cells via TSP1 was blocked by soluble peptidoglycan, indicating the recognition of bacterial peptidoglycan by TSP1. Further studies demonstrate that in addition to S. pneumoniae other Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes and several apathogenic bacteria interact with TSP1. Gram-negative bacteria did not interact with TSP1. Further it is shown that TSP1 recognizes the peptidoglycan of all tested Gram-positive bacteria, suggesting a general mechanism of bacteria-host protein interaction which probably has a significant impact on the pathogenesis of Gram-positive bacteria. Host cell proteoglycans were identified as the cellular receptors for TSP1. It is demonstrated that the bacterial binding to TSP1 does not only support adhesion to host cells, but can also protect the bacteria from phagocytosis by granulocytes. In conclusion, the results demonstrate an exploitation of TSP1 by Gram-positive bacteria which supports bacterial colonization of host tissues. In this scenario peptidoglycan functions as adhesin and TSP1 acts as a molecular bridge, linking Gram-positive bacteria with proteoglycan receptors on the host cells. These studies contribute to a better understanding of infections by S. pneumoniae and other Gram-positive bacteria. KW - Streptococcus pneumoniae KW - Thrombospondin KW - Adhäsion KW - Streptococcus pneumoniae KW - Thrombospondin-1 KW - Adhärenz KW - humane Wirtszellen KW - Streptococcus pneumoniae KW - Thrombospondin-1 KW - adherence KW - human host cells Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23183 ER - TY - THES A1 - Somplatzki, Daniela T1 - Untersuchungen zur Rolle von PavA und der Fibronektin-vermittelten Interaktion von Streptococcus pneumoniae mit humanen Wirtszellen T1 - Role of PavA and fibronectin-mediated interactions of Streptococcus pneumoniae with host cells N2 - Der human pathogene Erreger Streptococcus pneumoniae besiedelt symptomlos den Nasenrachenraum des Menschen, löst aber auch Infektionen wie Otitis Media und invasive Erkrankungen wie Pneumonie und Meningitis aus. Einen essentiellen Schritt für den Infektionsprozess stellt die Anheftung von S. pneumoniae an die Epithel- und Endothelzellen des Wirtes dar. Im Infektionsverlauf ist auch das nachfolgende Eindringen der pathogenen Mikroorganismen in das humane Gewebe von wichtiger Bedeutung. An dieser Interaktion zwischen Erreger und Wirtszellen sind sowohl bakterielle Virulenzfaktoren als auch Komponenten des Wirtes beteiligt. Der pneumococcal adherence and virulence factor A (PavA) von S. pneumoniae ist ein Fibronektin-bindendes Oberflächenprotein und ist essentiell für die Virulenz in einem Sepsis- und einem Pneumonie-Mausinfektionsmodell (Holmes et al., 2001; Lau et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte PavA zusätzlich in einem experimentellen Maus-Meningitis-Modell als Virulenzfaktor identifiziert werden. In in vitro Infektionsstudien zeigten pavA-defiziente Pneumokokkenmutanten eine signifikant verringerte Adhärenz an und Invasion in alveoläre Epithelzellen A549 von Typ II Pneumozyten, in Larynxkarzinomzellen HEp-2, in humane Hirnendothelzellen HBMEC und in humane Nabelschnurendothelzellen HUVEC. Diese Zelllinien repräsentieren modellhaft typische Gewebezellen, mit denen S. pneumoniae während des Infektionsprozesses in Kontakt treten kann. Die signifikante Reduktion der Adhärenz der pavA-Mutante ist auf die Mutagenese des pavA-Gens zurückzuführen, da die Komplementierung mit einem aktiven pavA-Gen die Adhärenz an die humanen Zellen wiederherstellte. In Inhibitionsstudien blockierte anti-PavA-Antiserum die bakterielle Bindung an immobilisiertes Fibronektin, die über den C-terminalen Bereich des PavA-Proteins vermittelt wird. Im Gegensatz dazu wurde die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Wirtszellen in Inhibitionsstudien mit anti-PavA-Antiserum oder rekombinantem PavA-Protein nicht blockiert. Zusammenfassend ist PavA ein wichtiger Virulenzfaktor für die Infektion und das Überleben der Erreger in vivo und spielt gleichzeitig auch eine Rolle während der Adhärenz von Pneumokokken an die humanen Wirtszellen in vitro. Allerdings beeinflusst PavA den Anheftungsprozess nicht direkt als Adhäsin, sondern scheint die Funktion anderer, wichtiger, bisher unbekannter Virulenzfaktoren von S. pneumoniae zu regulieren. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde die Interaktion von S. pneumoniae mit dem Glykoprotein Fibronektin und deren Bedeutung für die Kolonisierung und den Infektionsmechanismus in vitro untersucht. S. pneumoniae bindet direkt an immobilisiertes Fibronektin (van der Flier et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pneumokokken Fibronektin sowohl wirtsunabhängig aus dem Plasma rekrutieren als auch reines lösliches Fibronektin binden können. Dabei binden Pneumokokken sowohl die multimere, zelluläre Form des Fibronektins als auch das lösliche, dimere Plasma-Fibronektin. Die Zugabe von Fibronektin verstärkt die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Nasopharynxepithelzellen Detroit 562, die Larynxzellen HEp-2, die Bronchialepithelzellen A549 und die Hirnendothelzellen HBMEC. Die Fibronektin-vermittelte Anheftung von Pneumokokken an die Nasopharynxzellen Detroit 562 und die Hirnendothelzellen HBMEC erfolgt wahrscheinlich über die Heparin-Bindungsdomäne, da die bakterielle Adhärenz durch die Zugabe von Heparin inhibiert wird. Weitere Inhibitionsstudien zeigten, dass weder die Präinkubation der Erreger mit anti-PavA-Antiserum noch die Zugabe von rekombinantem PavA-Protein die Fibronektin-vermittelte Adhärenz an die Wirtszellen blockierte. Die Interaktion von S. pneumoniae über das Brückenmolekül Fibronektin mit den humanen Wirtszellen findet damit nicht über das Fibronektin-bindende Oberflächenprotein PavA statt. Fibronektin vermittelt nicht nur die Adhärenz von S. pneumoniae an die Wirtszellen, sondern auch deren Internalisierung. In Inhibitionsstudien mit spezifischen Inhibitoren des Aktin-Zytoskeletts und der Mikrotubuli konnte gezeigt werden, dass die Dynamik des Zytoskeletts eine essentielle Rolle für die Fibronektin-vermittelte Internalisierung der Pneumokokken in die Wirtszellen spielt. Außerdem wurde durch die Zugabe von pharmakologischen Inhibitoren der Tyrosin Kinasen, der Familie der Src-Kinasen und der Phosphatidylinositol (PI-3)-Kinase die Fibronektin-vermittelte bakterielle Invasion in humane Zellen signifikant blockiert. Die Invasion von S. pneumoniae in Mausfibroblasten, die defizient für die fokale Adhäsionskinase (FAK) waren, war im Vergleich zu der bakteriellen Invasion in die Wildtyp-Fibroblasten reduziert. Diese Ergebnisse zeigen die Beteiligung der Src-Kinasen, der PI-3-Kinase und der FAK an der Signaltransduktion, die für die Fibronektin-vermittelte Invasion von S. pneumoniae in eukaryotische Zellen notwendig ist. N2 - The human pathogen Streptococcus pneumoniae causes infections such as otitis media, pneumonia and meningitis. Pneumococci colonize asymptomatically the human nasopharynx. But they can migrate also to the lungs and after breaching the lung barrier spread throughout the human body and induce severe invasive diseases. Adhesion of S. pneumoniae to epithelial and endothelial host cells is an essential first step for the establishment of colonization and invasive infections. Moreover subsequent bacterial invasion into the human tissue is important for developing disease as well. Both, bacterial virulence factors and host components participate in the interaction of pneumococci and human cells. The pneumococcal adherence and virulence factor A (PavA) of S. pneumoniae is a fibronectin binding surface protein and a crucial virulence determinant in a sepsis and in a pneumonia mouse model of infection (Holmes et al., 2001; Lau et al., 2001). Within this study, PavA was identified as an important factor causing disease and promoting survival in an experimental mouse meningitis model. PavA-deficient mutants of S. pneumoniae showed significantly reduced adherence and invasion into the alveolar epithelial cell type A549 of type II pneumocytes, larynx carcinoma epithelial cells HEp-2, human brain derived endothelial cells HBMEC and human umbilical vein derived endothelial cells HUVEC. These cell lines represent typical cells of the human tissue that are involved in the progression of pneumococcal infections. The adhesion level of a pavA-knockout mutant was restored by re-introducing the entire pavA gene, indicating that the observed effect was due to pavA-deficiency. In inhibition studies the addition of anti-PavA antisera inhibited pneumococcal attachment to immobilized fibronectin. Binding of fibronectin was mediated by the C-terminal part of the PavA protein. In contrast, bacterial adherence and invasion into host cells was not influenced by addition of anti-PavA antisera or recombinant PavA protein. In conclusion, PavA plays a pivotal role in pneumococcal adherence to host cells in vitro and is an important virulence factor for the progression of pneumococcal disease and survival in vivo. PavA is not directly involved in the pneumococcal adhesion process by acting as an adhesin. The results indicated that PavA affects colonization and pneumococcal survival by modulating the function of important but yet unknown virulence determinants of S. pneumoniae. In the second part of this study the interaction of S. pneumoniae with the host glycoprotein fibronectin and its role in colonization in vitro was investigated. S. pneumoniae binds directly to immobilized fibronectin (van der Flier et al., 1995). In this study is shown that pneumococci recruite fibronectin from plasma in a species-unspecific manner and bind pure soluble fibronectin. S. pneumoniae interacts with the multimeric cellular form of fibronectin as well as with the soluble dimeric plasma fibronectin. Host-cell bound fibronectin significantly enhances pneumococcal adherence to the human nasopharyngeal epithelial cell line Detroit 562, to larynx cells HEp-2, to alveolar cells A549 and to brain endothelial cells HBMEC. Fibronectin-mediated pneumococcal adherence to the nasopharyngeal cells Detroit 562 and to the brain endothelial cells HBMEC is probably mediated by the heparin binding site due to the fact that bacterial adherence is inhibited by the addition of heparin. Further inhibition studies demonstrated that neither pneumococcal preincubation with anti-PavA antisera nor addition of recombinant PavA protein inhibited fibronectin-mediated adherence. These results indicate that fibronectin-mediated adherence was not due to binding of PavA to fibronectin. Fibronectin plays a key role in pneumococcal adherence to host cells and, in addition, promotes pneumococcal internalization. Inhibition studies with specific inhibitors of the actin cytoskeleton an the microtubulis showed an essential impact of the cytoskeleton dynamic on the fibronectin-mediated pneumococcal invasion into host cells. In addition, presence of pharmacological inhibitors of tyrosine kinases, Src-kinases and Phosphatidylinositol (PI-3)-kinase significantly blocked fibronectin-mediated bacterial invasion in human cells. Pneumococcal invasion into fibroblasts deficient for the focal adhesion kinase (FAK) was reduced compared to wildtype fibroblasts. These results indicate the involvement of Src-kinases, PI-3-kinase and FAK in signal transduction leading to fibronectin-mediated internalization of S. pneumoniae in eukaryotic cells. KW - Streptococcus pneumoniae KW - Virulenzfaktor KW - Fibronectin KW - Pneumokokken KW - Virulenzfaktor KW - Fibronektin KW - pneumococci KW - virulence factor KW - fibronectin Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23110 ER -