TY - THES A1 - Prinz, Michaela T1 - Inhibitoren der AChE, BuChE und der Amyloid-beta-Aggregation vom Pyridylenhydrazon-Typ T1 - Inhibitors of AChE, BuChE and amyloid-beta-aggregation of pyridylenhydrazone-type N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und biologischen Testung von Anti-Alzheimer-Substanzen, die nicht nur auf einen Angriffspunkt der Krankheit abzielen, sondern an mehreren krankheitsauslösenden bzw. krankheitsfördernden Punkten inhibierend wirken können. Als Leitstruktur dienten bereits bekannte Acetylcholinesteraseinhibitoren der DUO-Reihe, welche sukzessive abgewandelt wurden, bis die entscheidenden Strukturmerkmale für eine Acetylcholinesterasehemmung herausgefiltert waren. Wichtig für die Interaktion mit der Acetylcholinesterase ist ein quartärer Stickstoff sowie aromatische Reste in seiner näheren Umgebung. Durch die Pyridylen-Hydrazone ist dies gewährleistet. Aufgrund dessen wurde eine Substanzbibliothek synthetisiert, die nun die Acetylcholinesterasehemmung mit einer Inhibition der Fibrillenbildung verbindet. Synthese: Aus 4-Chlorpyridin-Hydrochlorid wurde zuerst die freie Base freigesetzt und diese mit Hydrazin-Hydrochlorid zu 4 Hydrazinylpyridin-Hydrochlorid umgesetzt. Dieses reagierte im nächsten Schritt mit dem entsprechenden Aldehyd in einer SN2-Reaktion zu den Zwischenstufen 2-14, die nun einen variablen Rest an der Hydrazinylgruppe tragen. Im letzten Schritt erfolgte die Quarternisierung mit Hilfe des entsprechenden Alkylbromids, wodurch am Pyridylrest derivatisiert wurde und schlussendlich die Verbindungen 2A-14O erhalten wurden. Dieser letzte Schritt, welcher anfangs durch klassische Erhitzung zum Rückfluss in DMF durchgeführt wurde, konnte zuerst durch die Durchführung im Bombenrohr zeitlich verkürzt werden und schließlich in der Mikrowelle optimiert werden, was zu einer Reduktion der Reaktionszeit von 500 h auf 3 h führte. Die Testung der Substanzen bezüglich ihrer AChE- und BuChE-Hemmung erfolgte mittels Ellman’s Test. Für die Testung der hemmenden Wirkung bezüglich der Fibrillen wurde zuerst das Testsystem mit Aβ (1-42) aufgebaut und anschließend auf ein verkürztes, elf Aminosäuren langes Peptid (HHQKLVFFAED), das mit Hilfe eine Peptidsynthesizers hergestellt wurde, übertragen. Nimmt man nun wieder Bezug auf den „Multi-target-Ansatz“, so lassen sich folgende Ergebnisse festhalten: Die Verbindung eines elektronen-ziehenden Substituenten am Phenylring an der Hydrazonseite mit einem Propylrest zwischen dem Phenylring und dem Pyridinrest ist vorteilhaft für die Kombination der Hemmung der Acetylcholinesterase und der Inhibiton der Aβ-Fibrillen (vgl. 13C). Während viele Substanzen selektiv gegenüber der Acetylcholinesterase sind, gibt es nur wenige, die selektiv die Butyrylcholinesterase hemmen. Eine Hemmung aller drei Angriffspunkte im niedrigen mikromolaren Bereich zeigten nur wenige Substanzen, und zwar die Verbindung mit jeweils einem Naphthylrest sowohl an der Hydrazon- als auch der Pyridin-Seite (14K: IC50 (AChE) = 1.12 µM; IC50 (BuChE) = 2.32 µM; IC50 (Fibrillen) = 2.5 µM). Zusätzlich wurden die Substanzen auf eine mögliche ROS-Hemmung von Kooperationspartnern getestet. Sie zeigten einen kleinen aber signifikanten Beitrag zur Reduzierung der ROS. Um erfolgreiche Wirkstoffe gegen die Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, ist deren Blut-Hirn-Schrankengängigkeit von entscheidender Bedeutung. Deshalb wurde von den Substanzen mittels HPLC der logP-Wert bestimmt. Die logP-Werte der Substanzen liegen in einem Bereich von 3.2 bis 4.4. Aufgrund dieser Ergebnisse und der berechneten pKS-Werte, welche im Bereich von 8.3 bis 10.2 liegen, kann davon ausgegangen werden, dass die Substanzen auf Grund der „sink“-Bedingungen die Blut-Hirn-Schranke überqueren können. Um eine definitive Aussage zur Blut-Hirn-Schrankengängigkeit treffen zu können, wurde ein Transwell-System mit cerebralen Endothelzellen entwickelt, die die Blut-Hirn-Schranke simulieren. Die Endothelzellen bilden hierbei eine dichte Monoschicht auf dem Filter aus, wobei die Substanzen nicht zwischen den Zellen hindurch diffundieren können, sondern den Weg durch die Zelle nehmen müssen. Die Messungen ergaben, dass die Substanzen zu ca. 90 % durch die Zellen diffundieren können und somit erfolgreich die Blut-Hirn-Schranke überqueren können. N2 - The thesis is dealing with the synthesis and biological evaluation of substances combating Alzheimer’s disease by using a multi-target approach. Starting point was the lead structure of the known acetylcholinesterase inhibitors of the DUO-series, which was successively modified to filter the crucial structural characteristics of the inhibition of acetylcholinesterase. Important for the interaction with acetylcholinesterase is a quaternary nitrogen as well as an aromatic moiety nearby. This is combined in the pyridylene-hydrazones. Therefore a library of substances has been synthesized and evaluated for the inhibition of acetylcholinesterase and fibril formation. Synthesis: The free base of 4-chloropyridine-hydrochloride was produced and reacted with hydrazine-hydrochloride to give 4 hydrazinylpyridine-hydrochloride. Next, a corresponding aldehyde was added and the intermediates 2-14 including a variable moiety on the side of the hydrazinyl-group, were formed by a SN2-reaction. Finally the quaternization reaction with the corresponding alkylbromide was performed in order to introduce the residues at the side of the pyridyl moiety to achieve the final compounds 2A-14O. This step was carried out by classical heating to reflux in DMF, but could be improved by carrying out the reaction in a pressure vessel and even better in the microwave; here the reaction time could be reduced from 500 h to 3 h. The inhibitory activity of the compounds towards AChE and BuChE were performed with Ellman’s test. In order to determine the inhibition of fibril formation, the Thioflavin T assay was first established with Aβ (1-42) and afterwards transferred to a shortened peptide containing only eleven amino acids (HHQKLVFFAED). This peptide was synthesized with a peptide synthesizer. In summary, combining an electron-withdrawing substituent at the phenyl ring on the site of the hydrazon with a propylene spacer between the phenyl ring an the pyridyl rest is of advantage when both targets – acetylcholinesterase and Aβ fibril formation – should be equally inhibited (see 13C). While many substances are selective towards acetylcholinesterase, only a few inhibit the butyrylcholinesterase selectively. An inhibition of all of the three targets in a low micromolar range of concentration could only be revealed for few compounds, e. g. for compound 14K with naphthyl-substitution on both sides: IC50 (AChE) = 1.12 µM; IC50 (BuChE) = 2.32 µM; IC50 (fibrils) = 2.5 µM). Additionally the substances were tested on a possible ROS-inhibition, however, they showed only little, but significant influence on a reduced production of ROS. In order to develop successfully new compounds against Alzheimer’s disease, their blood-brain-penetration is very important. For this reason the logP-value of the substances has been determined by a HPLC method. The logP-values range from 3.2 to 4.4. Due to these results and the calculated pKA-values, which ranged between 8.3 and 10.2, it can be assumed that the substances are able to cross the blood-brain-barrier because of sink-conditions. In order to verify this statement, a transwell-assay with cerebral endothelial cell monolayer has been developed to simulate the blood-brain-barrier. The measurements of some representative compounds revealed a diffusion rate through the cells of about 90 %, indicating the blood-brain-penetration of the compounds. KW - Acetylcholinesterase KW - Amyloid KW - Alzheimer-Krankheit KW - Acetylcholinesterase KW - Amyloid KW - Alzheimer's Disease Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73626 ER - TY - THES A1 - Neumann, Arne T1 - Aktivierung phagozytierender Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts" und beta-Amyloid-Implikationen für die Pathogenese der Alzheimer'schen Demenz T1 - Activation of phagocytic cells by "Advanced Glycation Endproducts" and beta-Amyloid Implications for Alzheimer's Disease pathogenesis N2 - Typisch für die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unlöslicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrillärem beta-Amyloid, das durch Glykierungen verändert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrilläre beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod führen. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern überprüft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen näher untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung führen. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zunächst durch eine hochmolekulare Hyaluronsäure, wie sie nativ in der extrazellulären Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyaluronsäurefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyaluronsäuremolekülgröße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellulären Matrix, wie D-Glukuronsäure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringfügig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen während ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyaluronsäure in kleinere Bruchstücke zerschneiden können. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein Rückschluß auf einen bestimmten Rezeptor möglich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" für die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bezüglich ihrer Überlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizität des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung für die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranständige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies führte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, können zu einer NF-kappa-B Aktivierung führen. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht für die mikrogliavermittelte Neurotoxizität verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivität unmittelbar mit der Neurotoxizität korreliert ist. N2 - Senile plaques are a hallmark in Alzheimer's Disease progression. These plaques consist mainly of fibrillar beta-amyloid, which can be modified by glycation. In addition these plaques contain so called AGEs "Advanced Glycation Endproducts", emerging from nonenzymatic glycated proteins. Subsequent dehydration, condensation and oxidation produces a heterogenous group of heterocyclic, coloured and fluorescent compounds. These AGE modified proteins are resistant to proteases and their formation is irreversible. AGEs and beta-amyloid are able to activate Microglia cells, resulting in a neurotoxic effect, with several hypothesis of how microglia contribute to neuronal cell death. To investigate the neurotoxic effect murine microglia cells were used. The NF-kappa-B translocation into the nucleus was taken as an indicator of microglial activation. In this work conditions were investigated, that are necessary to activate murine microglia cells by AGE stimulation. High molecular weight hyaluronic acid from extracellular matrix, in its native form, is inhibiting activation of microglia cells in vitro. In contrast NF-kappa-B was activated in AGE stimulated microglia cells in the presence of low molecular weight hyaluronic acid fragments. Here it was shown that the ability to activate microglia cells is inversly proportional to the average size of the hyaluronic acid. The ability for activation of microglia cells was reduced only in parts by other extracellular matrix glycosaminoglycans, like D-glucuronic acid, N-acetylglucosaminoglycane or chondroitine-4-sulfate. Ab and AGEs release reactive oxyen species during their develompent, which were shown to be able to cleave hyaluronic acid into small fragments. The signal transduction of AGE activated microglia cells was examined by measurement of NF-kappa-B activation reduced by different inhibitors. A complex network of signaling pathways was detected, without revealing a certain receptor. Therefore an "in vitro model" was established, to find out the main neurotoxic component in the reaction of microglia cells. Again the signaling pathways were inhibited pharmacologically, using the cell free medium produced by these microglia cells as "conditioned medium" in neuronal cell culture. The murine neuronal cells were tested for their surviving in the conditioned medium, to correlate activated signal pathways with neurotoxicity. Inhibition of translation or transcription in microglia cells led to no reduction of the neurotoxic effect of the conditioned medium, nor did the inhibition of the mitochochondrial respiratory chain or the radical sources xanthine oxidase, lipoxygenase or cyclooxygenase. Inhibition of NADPH oxidse was able to reduce the neurotoxicity of the conditioned medium down to 30 per cent. The NADPH oxidase is an enzyme complex , releasing huge numbers of superoxide anion radicals during the "oxidative burst". The neurotoxic component was released 30 min after activation of microglia cells into the conditioned medium, was bigger than 50 kDa and was removed out of the conditioned medium by EDTA chelation followed by dialysis. To proof the importance of NADPH oxidase activation for neurotoxicity, a part of the NADPH oxidase, the membranebound gp91phox was disrupted by gene targeting. As a consequence these cells did not react with superoxide release, when treated with beta-amyloid or AGE. Conditioned medium of these cells was not neurotoxic, in contrast to that of the microglia cells with a functional NADPH oxidase. The reactive oxygen species resulting from the NADPH oxidase activity are able to activate NF-kappa-B. Because of the wide range of gene activation performed by NF-kappa-B, there are various potential neurotoxic gene products to consider. For that reason NF-kappa-B was stimulated sucessfully in microglia cells with exogenous hydrogen stimulation, without a neurotoxic result in the model system. Activated NF-kappa-B seems not to be responsible for the microglia mediated neurotoxicity, whereas there is a direct correlation of NADPH oxidase activity and neurotoxicity. KW - Alzheimer-Krankheit KW - Amyloid KW - Glykolisierung KW - Mikroglia KW - Zelltod KW - Alzheimer' schen Erkrankung KW - seniler Plaques KW - AGEs KW - Advanced Glycation Endproducts KW - Mikroglia KW - Hyaluronsäure KW - NF-kappa-B KW - Glykosaminoglykane KW - Alzheimer' Disease KW - senile plaque KW - AGEs KW - advanced glycation endproducts KW - hyaluronic acid KW - NF-kappa-B KW - glucosaminoglycane KW - ECM KW - amyloid Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1796 ER -