TY - THES A1 - Memmel, Elisabeth T1 - Vom Glycochip zur lebenden Zelle - Studien zu Infektions- und Tumor-relevanten Kohlenhydrat-Erkennungsprozessen T1 - From Glycochips to Living Cells - investigating carbohydrate recognition processes relevant for infections and tumor diseases N2 - Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen sind häufig entscheidend beteiligt an verschiedenen einer Infektion oder malignen Erkrankung zugrunde liegenden molekularen Erkennungs-prozessen, die zu Adhäsion, Zell-Zell-Interaktion sowie Immunreaktion und -toleranz führen. Trotz der hohen Relevanz für Diagnostik und Therapie dieser Erkrankungen sind die betreffenden Strukturen und Mechanismen bisher nur ungenügend untersucht und verstanden. Ziel dieser stark interdisziplinär angelegten Arbeit war es daher, Methoden der Fachbereiche Chemie und Pharmazie, Biologie und Medizin, aber auch Physik zu kombinieren, um Kohlenhydraterkennungsprozesse im Detail zu untersuchen und auf dieser Basis strukturell neuartige diagnostische und therapeutische Anwendungen zu entwerfen. Die hochkomplexe Zusammensetzung einer Zelloberfläche wurde zunächst auf ihren Glycan-anteil reduziert und stark vereinfacht auf der Oberfläche sogenannter Glycochips imitiert. Die verwendeten Systeme auf Basis einer Gold- bzw. Glasoberfläche ergänzen sich optimal in ihrer Eignung für komplementäre analytische Methoden wie Massenspektrometrie sowie quantifizierbare Fluoreszenzspektroskopie. Der Übergang auf die lebende Zelloberfläche gelang mit Hilfe des Metabolic Glyco-engineering, das die kovalente Präsentation definierter Motive durch eine Cycloaddition zwischen zwei bioorthogonalen Reaktionspartnern (z.B. Azid und Alkin) ermöglicht. Auf diese Weise wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Sauer (Universität Würzburg) zunächst die Dichte und Verteilung verschiedener Oberflächenglycane auf humanen Zellen mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) bestimmt. Diese Parameter zeigten im Modell des Glycochips einen entscheidenden Einfluss auf Bindungsereignisse und multivalente Erkennung und zählen auch auf natürlichen Zelloberflächen – in engem Zusammenhang mit der lateralen und temporalen Dynamik der Motive – zu den wichtigen Faktoren molekularer Erkennungsprozesse. Die gezielte Modifikation zellulärer Oberflächenglycane eignet sich aber auch selbst als Methode zur Beeinflussung molekularer Wechselwirkungsprozesse. Dies wurde anhand des humanpathogenen Bakteriums S. aureus gezeigt, dessen Adhäsion auf Epithelzellen der Blasenwand durch Metabolic Glycoengineering partiell unterdrückt werden konnte. In einem ergänzenden Projekt wurden zwei potentielle Metabolite eines konventionellen Antibiotikums – des Nitroxolins – mit bakteriostatischer sowie antiadhäsiver Wirksamkeit dargestellt. Diese dienten als Referenzsubstanzen zur Verifizierung der postulierten Struktur der Derivate, werden aber auch selbst auf ihr Wirkprofil hin untersucht. Gleichzeitig stehen sie zusammen mit der Grundverbindung zudem als Referenz für die Wirkstärke potentieller neu entwickelter Antiadhäsiva zur Verfügung. N2 - Interactions between carbohydrates and proteins often are crucial factors in the molecular recognition processes of infectious diseases or cancer, leading to adhesion and cell cell interaction, as well as immune response and immune tolerance. Despite of their high pertinence for diagnostics and successful therapeutic treatment of those diseases, the structures and mechanisms involved are still insufficiently studied and poorly understood. So it was the aim of this strongly interdisciplinary oriented dissertation, to study carbohydrate recognition processes on molecular basis and in detail by combining methods from different scientific schools like chemistry and pharmacy, biology and medicine, as well as physics. Based on the achieved results innovative diagnostic and therapeutic applications should be proposed. Initially the highly complex structural composition of a living cells’ surface was reduced to its’ glycan fraction and mimicked on the surface of so-called glycochips in a very simplified manner. Two systems, based on gold and glass surfaces respectively, were used due to their complementary applicability for different analytical methods like mass spectrometry and quantitative fluorescence spectroscopy. The step forward towards living cell surfaces was achieved by metabolic glycoengineering, a method that enables the covalent installation of defined binding motifs by performing a cycloaddition between two bioorthogonal reaction partners (e.g. azide and alkyne). In cooperation with the group of Prof. Dr. Markus Sauer (Universität Würzburg) this technique was used to determine the density and spatial distribution of different cell surface glycans on human cell lines with high resolution fluorescence microscopy (dSTORM). In the glycochip model these parameters exhibited a key value for binding processes and multivalent recognition. Even on native cell surfaces they are crucial factors of molecular recognition processes – closely related to the lateral and temporal dynamics of the structural motifs. In addition the specific modification of cell surface glycans itself can be used to manipulate molecular interaction processes. This could be shown for the human pathogenic bacterium Staphylococcus aureus by significant reduction of its adhesion potential towards epithelial cells derived from the human bladder after metabolic glycoengineering. Finally a supplementary project aimed to synthesize two prior postulated metabolites of the conventional antibiotic agent nitroxoline that shows bacteriostatic as well as antiadhesive effects. They were used as reference compounds to verify the postulated structure of the two derivatives and currently undergo further studies concerning their intrinsic mode of action. In addition to the parent molecule they also serve as reference compounds to estimate the potential of novel antiadhesives. KW - Microarray KW - Fluoreszenz KW - Adhäsion KW - MALDI-MS KW - Bioorganische Chemie KW - Kohlenhydrate KW - Glycochip KW - Galabiose KW - dSTORM KW - Nitroxolin KW - Metabolic Glycoengineering Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115825 ER - TY - THES A1 - Schwegmann, Michael T1 - Eine molekulare Fliegenfalle zur Erkennung von biologisch relevanten (poly)-anionischen Substraten T1 - a molecular flytrap for the recognition of biologically relevant (poly)-anionic substrates N2 - Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein multivalenter Rezeptor auf Basis von Guanidiniocarbonylpyrrolen zur Komplexierung von biologisch relevanten (poly)- anionischen Substraten wie Citrat, Malat und Tatrat dargestellt werden. Der Rezeptor bindet Citrat selbst in Gegenwart eines 1000fachen Überschusses an NaCl und einem 10fachen Überschuss an Bis-tris Puffer mit einer hohen Bindungskonstante von KAss = 86000 M-1 in Wasser. Wenn man Rezeptoren auf Metall- und Boronsäurebasis nicht berücksichtigt, handelt es sich nach meinem Wissen um den besten Citrat-Rezeptor, der in der Literatur bisher publiziert ist. Außerdem zeigt der Rezeptor mit einem Faktor von mindestens 8 eine hohe Selektivität für Citrat gegenüber anderen biologisch relevanten Dicarboxylaten wie Malat und Tatrat. Mithilfe von Bindungsstudien und Molecular Modeling Rechnungen konnte hergeleitet werden, welchen Einfluss die verschiedenen nicht-kovalenten Wechselwirkungen auf die Bindungskonstante haben. Dabei konnte gezeigt werden, dass Flexibilität, Hydroxy-Funktionen, pi-Stacking und Symmetrie bei den Substraten Einfluss auf die Bindungskonstanten zeigen, wobei vor allem die unpolaren Wechselwirkungen und die zusätzliche Hydroxy-Funktionen einen hohen Anteil an der Bindung zu haben scheinen. Neben der selektiven Erkennung von Citrat durch den Rezeptor konnte zusätzlich ein Sensorsystem mit Carboxyfluorescein auf Basis eines indicator displacement assays entwickelt werden, mit dem die Anwesenheit von Citrat im Gegensatz zu anderen Carboxylaten mit dem bloßen Auge (naked eye) erkannt werden kann. Neben den Polycarboxylaten zeigt der Rezeptor außerdem noch hohe Bindungskonstanten für polyanionische Zucker. So konnten z.B. für Glucophosphate mit UV-Spektroskopie Bindungskonstanten von KAss = ca. 20000 M-1 in dem sehr polaren Lösemittelgemisch 10 % DMSO/Wasser (pH = 4, Acetat-Puffer) gefunden werden. N2 - In the course of this work a multivalent receptor based on guanidiniocarbonyl-pyrrolcations for the complexation of biologically relevant (poly)-anionic substrates like citrate, malate or tatrate was synthesised. The receptor binds citrate in the presence of a 1000fold excess of NaCl and a 10fold excess of bis-tris buffer with a high binding constant of KAss = 86000 M-1 in water. To the best of my knowledge is hence the most efficient receptor for the binding of citrate in water reported so far, if receptors on metall- and boronic acid-basis are neglected. Furthermore receptor shows a high selectivity with a factor of at least 8 for citrate against other biologically relevant dicarboxylates like malate or tartrate. With the aid of binding studies and molecular modeling calculations could be determined, which influence the different non covalent interactions have on the binding constant. It was demonstrated in this way, that flexibility, hydroxyfunctions,pi-stacking and symmetry of the substrates have a major influence on the binding constant. Especially unpolar interactions and interactions with the hydroxy group seem to play a major role in the binding mode. In addition to the selective recognition of citrate with the receptor a sensor system with carboxyfluoresceine based on an indicator displacement assay (ida) could be developed. With this ida it was possible to detect citrate in contrast to other biologically relevant substrates with the naked eye. Furthermore the receptor showed high binding constants for anionic sugars. In a solvent mixture of 10 % DMSO/Water (pH = 4, acetate buffer) bindings constants of KAss = ca. 20000 M-1 were measured for the glucophosphates. KW - Supramolekulare Chemie KW - Rezeptor KW - Molekulare Erkennung KW - Molekulare Erkennung KW - Supramolekulare Chemie KW - Bioorganische Chemie KW - molecular recognition KW - supramolecular chemistry KW - bioorganic chemistry Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17829 ER -