TY  - THES
A1  - Wicker, Monika
T1  - Vergleichende Analyse zwischen Candida albicans und Candida dubliniensis unter besonderer Berücksichtigung des Transkriptionsfaktors Rim101
T1  - Comparing analysis between Candida albicans and Candida dubliniensis under special consideration of the transcription factor Rim101
N2  - C.dubliniensis kann, wie auch die nahe verwandte Spezies C.albicans, als Antwort auf eine Reihe von Umweltfaktoren von der Hefeform in echtes filamentöses Wachstum übergehen. Bei der Regulation des pH-abhängigen Dimorphismus von C.dubliniensis spielt, wie bei verschiedenen anderen Pilzspezies der Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Rim101 eine zentrale Rolle. Dieser weist mit 85% zwar eine im Speziesvergleich geringe Aminosäure-identität zu C.albicans-Rim101 auf, zeigt jedoch die gleiche pH-abhängige Expression wie C.albicans-RIM101, ist in C.albicans funktionell aktiv und kann die typischen Defekte einer C.albicans-rim101-Nullmutante komplementieren. C.dubliniensis-Rim101 ist zudem beteiligt an der Regulation des Wachstums bei 45°C und der Koloniefärbung auf CHROM agar-Candida, zwei Eigenschaften, in denen sich C.albicans und C.dubliniensis unterscheiden. Ursache für diese speziesspezifische Merkmalsausprägung ist die bei C.dubliniensis deutlich stärkere Expression von RIM101. Ein weiterer phänotypischer Unterschied zwischen C.albicans und C.dubliniensis betrifft mit der Fähigkeit zu Filamentierung und invasivem Wachstum zwei für C.albicans nachgewiesenermaßen wichtige Virulenzfaktoren. Auf Kochblutagar, nach 24 - 48-stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO2, bildet C.dubliniensis glatte, weiß-glänzende, scharf begrenzte halbkugelförmige Kolonien, während C.albicans-Kolonien eine rauhe, grau erscheinende Oberfläche aufweisen und mit Ausläufern in den umgebenden Agar einwachsen. Auslösend für die ausgeprägte Filamentierung von C.albicans ist das additive Zusammenwirken von erhöhtem CO2-Gehalt, erhöhter Temperatur und einem noch nicht endgültig identifizierten Bestandteil des Kochblutagars. Mit einer Sensitivität von 95,8% und einer Spezifität von 100% eignet sich dieses Verfahren auch als einfacher diagnostischer Test. Auf molekularer Ebene sind Efg1 und Cph1 an der Filamentierungsauslösung beteiligt, wobei Efg1 aber eine wesentlich größere Bedeutung zukommt. Rim101 scheint keinen Einfluss zu haben.
N2  - C.dubliniensis, a species closely related to C.albicans, can switch from a budding yeast form to true hyphal morphology in response to various environmental signals. Like in several other fungi, the pathway controlling the pH-response of C.dubliniensis contains a zinc finger transcription factor: Rim101. On the level of amino acids, C.dubliniensis -Rim101 shows 85% sequence identity to C.albicans -Rim101, which is less than most of the other proteins compared up to now. Nevertheless C.dubliniensis -Rim101 is functionally active in C.albicans and can complement the typical filamentation defects of a C.albicans rim101 delta mutant. Besides this, Rim101 is involved in the regulation of two phenotypic differences between C.albicans and C.dubliniensis. The growth deficit of C.dubliniensis at temperatures above 42°C and its dark green colour during growth on CHROMagar-Candida depends on the higher level of RIM101 expression in C.dubliniensis compared with C.albicans. C.albicans mutants with multiple copies of RIM101 resemble the phenotype of C.dubliniensis. During our studies, we found another phenotypic difference between C.albicans and C.dubliniensis, that concerns hyphal formation and invasive growth, two well known and important virulence factors of C.albicans. After incubation at 37°C and 5%CO2 on Choco-agar for 24 - 48 hours, C.dubliniensis forms smooth white hemispherical colonies. C.albicans colonies are rough grey and filaments invade the surrounding agar. The abundant filamentation of C.albicans under these conditions requires the combination of an elevated CO2-level, high temperature and a component of the Choco-agar as “chemical inductor”. As phenotypic identification of C.dubliniensis under these growth conditions has a sensitivity of 95,8% and a specificity of 100%, it can be used as a simple diagnostically test. With regard to the transcription pathways, Efg1 and Cph1 are involved in the induction of filamentation under these specific growth conditions, although the role of Efg1 is more important. Rim101 seems to have no influence.
KW  - C.albicans
KW  - C.dubliniensis
KW  - Dimorphismus
KW  - Rim101
KW  - CO2
KW  - C.albicans
KW  - C.dubliniensis
KW  - dimorhism
KW  - Rim101
KW  - CO2
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16694
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zeller, Daniel
T1  - Konsequenzen progressiver trunkierender Mutationen des Transkriptionsfaktors RIM101 in Candida albicans für Wachstum und pH-abhängigen Dimorphismus
T1  - Effects of successively truncated RIM101 allels in Candida albicans point to the role of a newly defined domain in regulating filamentation
N2  - Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren.
N2  - Among the environmental cues that influence morphological development in Candida albicans, the ambient pH has a defining role. The morphogenetic programme that is induced by this signal is termed “pH-regulated dimorphism”. In C. albicans the pH-response pathway activates Rim101p, which shows functional homologies to the transcription factors PacC of Aspergillus nidulans and Rim101p of Saccharomyces cerevisiae. Fundamental cell functions, including morphological development as well as cell wall biosynthesis are under the control of C. albicans-Rim101p. Insight into the roles of PHR1, PHR2 and the pH-response in polymorphism was gained through reversion analysis of homozygous phr2D mutants. Analyses of fourteen revertants demonstrated that they had acquired dominant activation mutations in RIM101 leading to premature stop codons. A null mutation of Efg1p was epistatic to the RIM101 mutation and suppressed filamentation but not RIM101 mediated activation of PHR1 expression. Thus, Rim101p effects are mediated both in an Efg1p-dependent and independent manner. We differentiated between RIM101 regions involved in the regulation of polymorphism from those controlling pH-dependent gene expression. We constructed 6 strains containing a carboxy-terminal truncated RIM101 gene by replacing codons 281, 305, 333, 385, 411 and 464 with nonsense codons. The replacement of codons 281, 305 and 333, located within or in proximity to the zinc-finger domain, did not allow growth at pH 4. Replacement of codons 385 and 411 resulted in strains which: (i) grew at pH 4, (ii) expressed the PHR1 gene at pH 4, but in contrast to mutagenesis of codon 464 (iii) were not able to filament at pH 4. These results suggest that the region located between codons 411 and 464 is essential for the Rim101p mediated induction of filamentation in C. albicans. In addition to beeing a regulator of morphological development, which is linked to pathogenesis, Rim101p also plays an important role in cell wall biosynthesis. Understanding the function of Rim101p in C. albicans will provide key insights into how these two fundamental processes are integrated. Besides the switch between growth forms, the secretion of aspartic proteases (SAPs) seems to be one of the important virulence factors in C. albicans. In order to provide an optimum adaption to different host niches, it is likely that various virulence factors are regulated in coordinated fashion by specific host signals. In the final part of this work, we started to investigate a potential role of Rim101p in regulating the expression of a set of SAP-genes. By using the URA3 gene of C. albicans as a reporter of gene expression, we tended to observe consequences of RIM101 mutations on the induction of SAP4, SAP5 and SAP6, which are members of a hypha-specific gene family. Linking the respective regulatory pathways of the known virulence factors might be a crucial step towards a comprehensive view of the pathogenetic process preceding candidiasis in humans.
KW  - Candida albicans
KW  - pH
KW  - RIM101
KW  - Dimorphismus
KW  - Filamentierung
KW  - Candida albicans
KW  - pH
KW  - RIM101
KW  - dimorphism
KW  - filamentation
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11223
ER  - 
TY  - THES
A1  - El-Barkani, Abdelmalic
T1  - Molekulargenetische Charakterisierung des pH-regulierten Dimorphismus und der pH-abhängigen Genexpression von Candida albicans und Entwicklung eines Reportersystem für Candida glabrata
T1  - Molecular genetic Characterisation of the pH Regulated Dimorphism and the pH Dependent Gene Expression of Candida albicans and Development of a Reporter System for Candida glabrata
N2  - Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können.
N2  - Morphological development of the fungal pathogen C. albicans is profoundly affected by environmental signals. This morphological flexibility is considered an essential factor for pathogenicity of C. albicans. One of the important signals that regulates morphology of C. albicans is the ambient pH. Acidic pH restricts growth to the yeast form, whereas neutral pH permits development of the filamentous form. Superimposed on the pH restriction is a temperature requirement of approximately 37°C for filamentation. C. albicans responds to changes in environmental pH by differential expression of several genes including PHR1 and PHR2. PHR2 is an acid expressed gene that is not expressed at detectable levels above pH 6.5. Mutants lacking PHR2 are unable to grow at acidic pH and exhibit morphological defects. PHR1 is an alkaline expressed gene with the inverse pattern of expression. PHR1 and PHR2 encode functionally homologous proteins involved in cell wall biosynthesis, which is pivotal in determining cell shape changes during morphogenesis. The role of pH in development was investigated in this work by selecting revertants of phr2D mutants that had gained the ability to grow at acid pH. The extragenic suppressors in two independent revertants were identified as nonsense mutations in the pH response regulator RIM101 that resulted in a carboxy-terminal truncation of the open reading frame. These dominant active alleles conferred the ability to filament at acidic pH, to express PHR1, an alkaline expressed gene, at acidic pH and to repress the acid expressed gene PHR2. This indicates that RIM101 is a key regulator of the pH-dependent dimorphism in C. albicans. Furthermore these results suggest that the molecular mechanisms which control pH-dependent gene expression in Aspergillus nidulans and other fungi are also conserved in C. albicans. It was also observed that both the wild type and mutant alleles could act as multicopy suppressors of the temperature restriction on filamentation, allowing extensive filamentation at 29°C. This observation suggests that two environmental signals, pH and temperature, converge on common molecular targets. The ability of the activated alleles to promote filamentation was dependent upon the developmental regulator EFG1. The results suggest that RIM101 is responsible for the pH-dependence of hyphal development. C. albicans and C. glabrata are opportunistic pathogens which are able to colonize and infect many tissues and organs. This indicates that these organisms are well adapted for survival within the diverse environmental niches of the human host. C. albicans responds to different environmental signals, as described above, with the expression of certain genes, e.g. PHR1, PHR2 and RIM101. In contrast to C. albicans the gene regulation in the emerging pathogen C. glabrata is poorly understood. In order to develop a reporter system allowing studies on regulated gene expression in C. glabrata the functionality of the E. coli lacZ gene as a reporter of gene expression in C. glabrata was investigated. C. glabrata shuttle vectors suitable for the construction of translational fusions of a gene of interest to the E. coli lacZ reporter were generated. By fusing different promoters to the lacZ gene it could be shown that the E. coli lacZ gene provides a sensitive and inducible reporter displaying b-galactosidase activity in C. glabrata.
KW  - Candida albicans
KW  - Wasserstoffionenkonzentration
KW  - Genexpression
KW  - Torulopsis glabrata
KW  - Markierungsgen
KW  - Candida albicans
KW  - pH
KW  - Dimorphismus
KW  - Genexpression
KW  - RIM101
KW  - Candida glabrata
KW  - Reportergen
KW  - Candida albicans
KW  - pH
KW  - dimorphism
KW  - gene expression
KW  - RIM101
KW  - Candida glabrata
KW  - reporter gene
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1125
ER  -