TY - THES A1 - Zilian, David T1 - Neuartige, empirische Scoring-Modelle für Protein-Ligand-Komplexe und computergestützte Entwicklung von Hsp70-Inhibitoren T1 - Novel empirical scoring-functions for protein-ligand complexes and computer-aided development of Hsp70 inhibitors N2 - Techniken des computergestützten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schlüsselrolle im strukturbasierten computergestützen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zunächst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergrößern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex beschäftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivität klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich überlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im nächsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinitäten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivität der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verfügbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repräsentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings ermöglicht. Für die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der größten, die bisher für die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datensätze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten für beide Datensätze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datensätzen zeigt - ein Phänomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datensätze ergab darüber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie über die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor für die protein-abhängigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verlässliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums möglich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' für die SFCscore-Funktionen definieren lässt. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zusätzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverlässlichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgeschätzt werden könnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren für das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur für die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Domänen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zunächst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erklärt werden. Für die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Domänen-System, dass verschiedene allostere Zustände einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilität auf die Stabilität der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen für das Protein durchgeführt. Diese zeigen, dass das Protein tatsächlich eine überdurchschnittlich hohe Flexibilität aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Domänen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgeführten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise dafür gefunden werden, dass die Mutationen, welche die für die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilität des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Domänenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilität auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verknüpft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt für die Inhibtion des Proteins darstellt. N2 - Methods of computational drug design play a crucial role in the development of new pharmaceutical drugs. The work presented here comprises the methodological development and the practical application of structure-based techniques in computational drug design. The first part of this dissertation focuses on the development of empirical scoring functions, which play an essential part in structure-based computer-aided drug design. The basis for this work are the empirical descriptors and scoring functions of the SFCscore software package. First, the influence of the training data composition on the prediction of empirical scoring functions was analyzed. A new training data set was created to spread the prediction range of the function and thus achieve a better separation of high and low affinity binders. The resulting function indeed yielded better predictions in the low affinity area compared to the original functions. In another approach, which also addresses the issue of discriminating active and inactive compounds, the Machine Learning method RandomForest (RF) was used to derive a classification model. Different to classical empirical scoring functions, this model no longer predicts a precise value but classifies the compounds according to their potential affinity as 'active' or 'inactive'. The example of the mycobacterial enzyme InhA showed that such models are clearly superior to different classical scoring function in terms of separating active and inactive compounds. The RandomForest algorithm was also used to derive a new scoring function for the prediction of binding affinities. This new function was implemented into the SFCscore software package under the name SFCscoreRF. This new function differs from the original SFCscore functions in several essentials points. On the one hand, the RF-algorithm is a non-linear method, which - in contrast to classical methods used for the derivation of empirical scoring functions - does not assume the additivity of the single descriptors. On the other hand, the algorithm allowes for using the whole set of available SFCscore descriptors and is therefore able to utilize a more comprehensive representation of a protein ligand complex as the basis for the prediction. Additionally, the training data set used to derive SFCscoreRF comprised 1005 complexes. This training set is one of the largest data sets used to train an empirical scoring function. The evaluation against two widely-used benchmark sets confirmed that SFCscoreRF yields superior predicitons as compared to the original functions. The comparison with other functions tested for these benchmarks shows that SFCscoreRF also achieves top results on an international level. Further analyses using a leave-cluster-out validation scheme and the participation in the CSAR 2012 Benchmark Exercise revealed that - similar to other scoring functions - SFCscoreRF shows varying performances when applied to protein-specific data sets. Additionally, by analysing the results of the CSAR 2012 data sets, valuable insight were gained regarding the prediction of docking poses and the statistical significance for the evaluation and comparison of scoring functions. The fact that empirical scoring functions are trained within a certain chemical space, is an important reason for the target-dependent performance observed in this work. Reliable predictions can only be expected within the calibrated area. Different approaches for the definition of this ``applicability domain'' are presented in this work. PCA analyses have been used to create a two dimensional representation of the ``applicability domain''. Additionally, different numerical descriptors have been tested to estimate the reliability of SFCscore predicitons. The RF-proximity has been found to be a promising starting point for future research. The development of new inhibitors for the molecular chaperone Hsp70 - a promising target in the therapy of multiple myeloma - comprises the second part of this dissertation. The basis for this work was a lead structure that was found in a previous work and attacks a novel binding pocket in the interface between the two domains of the Hsp70 protein. The optimization and development of that lead structure - a tetrahydroisochinolinone - was the primary focus of the present work. Potential binding poses in the interface were elucidated by detailed docking analyses. Based on that information, a compound library was compiled, which was synthezised and biologically analyzed by cooperation partners within the CRU 216. The resulting structure activity relationships can partially be explained on the basis of the corresponding docking poses. However, some of the effects remain unexplained. For the further development of new derivatives a comprehensive experimental characterization of the current compounds is needed. This information can be used as a basis for the refinement of the existing binding models. Hsp70 is a two-domain system, which can visit different allosteric states. To further investigate the effects of the resulting flexibility on the stability of the structure and on inhibitor binding, molecular dynamics simulations were conducted. These simulations show an above-average felxibility of the protein, which is primarily dominated by the movement of the two domains NBD and SBD relatively to each other. However, the basic conformation that is observed in the crystal structure hscaz, which was used in this work, remains stable in all simulations. Furthermore, the trajectories showed no evidence that the mutations, in which hscaz differs from the wild type protein, have a significant effect on the overall protein conformation. Although, the overall conformation of the interface between NDB and SBD remains stable, the exact conformation in this area is signficantly influenced by the domain movement. As this region includes the binding pocket of the tetrahydroisochinolinones, the conformational space of this area was analyzed in detail. The analyses expectedly reveal a high flexibility in the interface area that is dominated by the SBD-NBD movement. Furthermore, it could be shown that the conformation and dynamics can be influenced by a bound ligand (apoptozole), in terms of an induced fit mechanism. It is highly probable that the binding of the tetrahydroisochinolinones trigger similar effects, influencing the binding mechanism of this compound class. Thus, molecular dynamics simulations should play a crucial role in the future development of new compounds. The analyses also show that the dynamics of the interface region have large effects on the overall structure of the protein and vice versa. Especially, the relative orientation of NBD and SBD has a large impact on the binding pocket. This underlines the hypothesis that the interface region constitutes a promising target area for the inhibition of Hsp70. KW - Arzneimittelforschung KW - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign KW - Structure-based drug design KW - Computational chemistry KW - Molekulardesign KW - Proteine KW - Hitzeschock-Proteine KW - Scoring-Funktionen KW - Docking KW - molekulardynamische Simulationen KW - Hsp70 KW - Strukturoptimierung KW - scoring functions KW - molecular dynamics KW - lead structure optimization KW - Ligand KW - Maschinelles Lernen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105055 ER - TY - THES A1 - Hein, Michael T1 - Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen und Entwurf niedermolekularer MIP-Inhibitoren T1 - Development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses and design of small-molecule MIP inhibitors N2 - Dockingbasierte Ansätze zählen zu den wichtigsten Komponenten im virtuellen Screening. Sie dienen der Vorhersage der Ligandposition und -konformation in der Bindetasche sowie der Abschätzung der Bindungsaffinität zum Protein. Bis heute stellt die korrekte Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen ein noch nicht vollständig gelöstes Problem für Scoringfunktionen dar. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist daher der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gewidmet. Der Fokus eines ersten Teilprojektes lag auf der Berücksichtigung der Absättigung vergrabener Wasserstoffbrückenakzeptoren (HBA) und -donoren (HBD) bei der Bewertung von Docking-Lösungen. Nicht-abgesättigte vergrabene HBA und HBD stellen einen der Bindungsaffinität abträglichen Beitrag dar, der bis dato aufgrund fehlender Struktur- bzw. Affinitätsdaten in Scoringfunktionen vernachlässigt wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer detaillierten Untersuchung zur Häufigkeit vergrabener nicht-abgesättigter HBA und HBD in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes eine empirische Filterfunktion („vnaHB“-Filterfunktion) entwickelt, die unerwünschte Ligandbindeposen erkennt und von der Bewertung mittels Scoringfunktionen ausschließt. Der praktische Nutzen der empirischen Filterfunktion wurde für die Scoringfunktionen SFCscore und DSX anhand vorgenerierter Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes untersucht. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass eine Absättigung vergrabener polarer Gruppen in Protein-Ligand-Komplexen für eine hochaffine Protein-Ligand-Bindung notwendig ist, da vergrabene nicht-abgesättigte HBA und HBD nur selten auftreten. Eine vollständige Absättigung durch entsprechende Proteinpartner wird für ca. 48 % der untersuchten Komplexe beobachtet, ca. 92 % weisen weniger als drei hauptsächlich schwache, nicht-abgesättigte HBA bzw. HBD (z. B. Etherfunktionen) auf. Unter Einbeziehung von Wassermolekülen in die Häufigkeitsanalyse sind sogar für ca. 61 % aller Komplexe alle wasserstoffbrückenbindenden Gruppen abgesättigt. Im Gegensatz zu DSX werden für SFCscore nach Anwendung der empirischen Filterfunktion erhöhte Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose (≤ 2.0 Å Abweichung) unter den am besten bewerteten Docking-Posen erzielt. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::229m) werden Steigerungen dieses als „Docking Power“ bezeichneten Kriteriums für die Top-3-Posen (Erfolgsrate für die Identifizierung einer kristallnahen 2.0 Å Pose unter den besten drei Docking-Lösungen) von 63.1 % auf 64.2 % beobachtet. In einem weiteren Teilprojekt wurden repulsive Protein-Ligand-Kontakte infolge sterischer Überlappungen der Bindungspartner bei der Bewertung von Docking-Lösungen berücksichtigt. Die adäquate Einbeziehung solcher repulsiver Kontakte im Scoring ist für die Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen entscheidend, jedoch aufgrund fehlender Affinitäts- bzw. Strukturdaten problematisch. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des Lennard-Jones-Potentiales des AMBER-Kraftfeldes zunächst ein neuer Deskriptor zur Beschreibung repulsiver Kontakte („Clash“-Deskriptor) entwickelt und zur Untersuchung der Häufigkeit ungünstiger Protein-Ligand-Kontakte in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes herangezogen. Eine aus der Häufigkeitsverteilung abgeleitete empirische Filterfunktion („Clash“-Filterfunktion) wurde anschließend der Bewertung von Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes mittels der Scoringfunktionen SFCscore und DSX vorgeschaltet, um unerwünschte Ligandbindeposen auszuschließen. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass vorwiegend schwache repulsive Kontakte in Protein-Ligand-Komplexen auftreten. So werden in 75 % der Komplexe des Hartshorn-Datensatzes abstoßende Potentiale unter 0.462 kcal/mol beobachtet. Zwar betragen die ungünstigen Beiträge pro Komplex für 50 % aller Strukturen ca. 0.8 kcal/mol bis 2.5 kcal/mol, jedoch können diese auf Ungenauigkeiten der Kristallstrukturen zurückzuführen sein bzw. durch günstige Protein-Ligand-Wechselwirkungen kompensiert werden. Die Anwendung der „Clash“-Filterfunktion zeigt signifikante Verbesserungen der Docking Power für SFCscore. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::frag) werden Steigerungen der Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose unter den drei am besten bewerteten Docking-Lösungen von 61.4 % auf 86.9 % erzielt, was an die Docking Power der bis dato besten Scoringfunktionen aus der Literatur (z. B. DSX, GlideScore::SP) heranreicht (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). Die „Clash“-Filterfunktion allein ist auch der Kombination der „Clash“- und der „vnaHB“-Filterfunktion überlegen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf die Einbeziehung von Decoy-Daten (Struktur- und Affinitätsdaten schwach affiner und inaktiver Liganden) im Zuge der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gelegt. Dadurch soll eine adäquate Berücksichtigung ungünstiger Beiträge zur Bindungsaffinität ermöglicht werden, die für die Richtigkeit und Zuverlässigkeit ermittelter Vorhersagen essentiell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden binäre Klassifizierungsmodelle zur Bewertung von Docking-Lösungen entwickelt, die die Einbeziehung von Decoy-Daten ohne die Verfügbarkeit von Affinitätsdaten erlauben. Der Random-Forest-Algorithmus (RF), SFCscore-Deskriptoren, der neu entwickelte „Clash“-Deskriptor, und die Decoy-Datensätze von Cheng und Huang (Trainingsdaten) bilden die Grundlage des leistungsfähigsten Klassifizierungsmodells. Der praktische Nutzen des „besten“ RF-Modells wurde nach Kombination mit der Scoringfunktion DSX anhand der Docking Power für das Auffinden einer kristallnahen Pose auf Rang 1 am unabhängigen Cheng-/Huang- (Komplexe, die nicht in den Trainingsdaten enthalten sind) und CSAR-2012-Testdatensatz untersucht. Gegenüber einer alleinigen Anwendung von DSX werden an beiden Testdatensätzen weitere Verbesserungen der Docking Power erzielt (Cheng-/Huang-Testdatensatz: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012-Testdatensatz: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). Das „beste“ Modell zeichnet sich durch die zuverlässige Vorhersage richtig-positiver Docking-Lösungen für einige wenige Komplexe aus, für die DSX keine kristallnahe Ligandkonformation identifizieren kann. Ein visueller Vergleich der jeweils am besten bewerteten RF- und DSX-Pose für diese Komplexe zeigt Vorteile des RF-Modells hinsichtlich der Erkennung für die Protein-Ligand-Bindung essentieller Wechselwirkungen. Die Untersuchung der Bedeutung einzelner SFCscore-Deskriptoren für die Klassifizierung von Docking-Lösungen sowie die Analyse der Misserfolge nach Anwendung des Modells geben wertvolle Hinweise zur weiteren Optimierung der bestehenden Methode. Hinsichtlich der zu bewertenden Eigenschaften ausgeglichenere Trainingsdaten, Weiterentwicklungen bestehender SFCscore-Deskriptoren sowie die Implementierung neuer Deskriptoren zur Beschreibung bis dato nicht-berücksichtigter Beiträge zur Bindungsaffinität stellen Ansatzpunkte zur Verbesserung dar. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit umfasst die Anwendung dockingbasierter Methoden im Rahmen der Entwicklung neuer Inhibitoren des „Macrophage Infectivity Potentiator“-(MIP)-Proteins von Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei. Das MIP-Protein von Legionella pneumophila stellt einen wichtigen Virulenzfaktor und daher ein attraktives Zielprotein für die Therapie der Legionellose dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgten systematische Optimierungen des Pipecolinsäure-Sulfonamides 1, des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM). Nach Hot-Spot-Analysen der Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Die Ergebnisse der Hot-Spot-Analysen zeigen günstige Wechselwirkungsbereiche für Donorgruppen und hydrophobe Substituenten in meta-Position sowie Akzeptorgruppen in para-Position des Benzylringes von 1 auf. Die Einführung einer Nitrofunktion in para-Position des Benzylringes von 1 (2h) resultiert in einer erhöhten MIP-Inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), was wahrscheinlich auf die Ausbildung einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke zu Gly116 zurückzuführen ist. Selektivitätsverbesserungen gegenüber dem strukturverwandten humanen FKBP12-Protein werden insbesondere für das para-Aminoderivat von 1 (2n) erzielt (Selektivitätsindex (1): 45, Selektivitätsindex (2n): 4.2; mit Selektivitätsindex = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring (2s) führt zu einer verbesserten Löslichkeit bei vergleichbarer MIP-Inhibition. Das MIP-Protein von Burkholderia pseudomallei spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Melioidose und stellt daher ein attraktives Zielprotein für die Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. In der vorliegenden Arbeit erfolgten Optimierungen des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors 1. Ausgehend von einem Strukturvergleich von Burkholderia pseudomallei MIP mit Legionella pneumophila MIP und einer Hot-Spot-Analyse der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Der Strukturvergleich zeigt eine hohe Homologie beider Bindetaschen. Größere konformelle Änderungen werden lediglich für den von Ala94, Gly95, Val97 und Ile98 geformten Bindetaschenbereich beobachtet, was unterschiedliche Optimierungsstrategien für 1 erforderlich macht. Günstige Wechselwirkungsbereiche der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche finden sich einerseits für Donorgruppen oder hydrophobe Substituenten in para-Position des Benzylringes (Region A) von 1, andererseits für Akzeptor- bzw. Donorgruppen in para- bzw. meta-/para-Position des Trimethoxyphenylringes (Region B). Anhand von Docking-Studien konnten sowohl für Variationen in Region A als auch in Region B aussichtsreiche Kandidaten identifiziert werden. Initiale MIP-Inhibitionsmessungen der bis dato synthetisierten Derivate deuten auf erhöhte Hemmungen im Vergleich zu 1 hin. Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring führt auch hier zu vergleichbarer MIP-Inhibition bei verbesserter Löslichkeit. Derzeit sind weitere Synthesen und Testungen aussichtsreicher Liganden durch die Kooperationspartner geplant. Die Ergebnisse der Inhibitionsmessungen sollen deren Nutzen als MIP-Inhibitoren aufzeigen und wertvolle Informationen für weitere Zyklen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns liefern. N2 - Docking-based approaches belong to important virtual screening components and aim at predicting both the ligand position and conformation within the protein binding site as well as the binding affinity. To date scoring functions are still not fully reliable in correctly identifying near-native ligand conformations generated by docking. Thus, the first part of the current work is dedicated to the development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses. A first project focused on considering the saturation of hydrogen bond acceptors (HBA) and donors (HBD) for the evaluation of docking poses. Since structural and affinity data are missing, current scoring functions neglect unpaired buried HBA and HBD, which strongly disfavour high-affinity binding. Based on a detailed frequency analysis of unpaired buried HBA and HBD within high-quality protein-ligand complexes of the Hartshorn dataset, an empirical filter function (“vnaHB” filter function) was developed to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with scoring functions. The practical benefit of the filter function was investigated for the scoring functions SFCscore and DSX using pre-generated docking poses of the Cheng dataset. As shown in the frequency analysis, the saturation of buried polar groups is of utmost importance for high-affinity binding, as unpaired buried HBA and HBD are extremely rare. A complete saturation by proper protein counterparts is observed for about 48 % of all complexes under study, whereas approximately 92 % have less than three, mostly weak unpaired buried HBA or HBD (e.g. ether functions). Including also the saturation by water molecules reveals that actually for about 61 % of all complexes every hydrogen bonding group is saturated. Unlike DSX, the application of the filter function with SFCscore results in higher success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the top scored poses, a criterion termed “Docking Power”. For the best SFCscore function (SFCscore::229m) the Docking Power with respect to the top three poses increases from 63.1 % to 64.2 %. A further project focused on considering repulsive intermolecular contacts due to sterical overlap of the protein-ligand binding partners for the evaluation of docking poses. Although an inclusion of such repulsive contacts in scoring is of utmost importance for the identification of protein-bound ligand conformations, it remains challenging because of missing structural and affinity data. Based on the Lennard-Jones potential of the AMBER force field a new descriptor accounting for repulsive protein-ligand contacts (“clash” descriptor) was developed and used for analysing the frequency of unfavourable protein-ligand contacts among high-quality structures of the Hartshorn dataset. An empirical filter function (“clash” filter function) derived from the frequency distribution was applied to pre-generated docking poses of the Cheng dataset to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with SFCscore and DSX. As shown in the frequency analysis, mostly weakly repulsive contacts occur within protein-ligand complexes. For 75 % of the complexes of the Hartshorn dataset repulsive potentials of less than 0.462 kcal/mol are observed. Indeed, unfavourable contributions add up to not more than 0.8 kcal/mol to 2.5 kcal/mol per complex for 50 % of all structures; values in this range may be attributed to inaccuracies of crystal structures or could be counterbalanced by favourable protein-ligand interactions. The application of the “clash” filter function shows significant improvements of the Docking Power of SFCscore. For the best SFCscore function (SFCscore::frag) the success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the three top scored poses increases from 61.4 % to 86.9 %, which is comparable to the Docking Power of the best scoring functions (e.g. DSX, GlideScore::SP) currently available in literature (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). The “clash” filter function alone is also superior to the combination of the “clash” and the “vnaHB” filter function. Another focus of the work was the inclusion of decoy data (structure and affinity data of weakly active and inactive ligands) in scoring function development. Thus, unfavourable contributions to the binding affinity should be adequately considered, which appears essential for improving accuracy and reliability of the predictions. Within the scope of this work a binary classification model was developed for the evaluation of docking poses, allowing the inclusion of decoy poses without affinity data. The random forest algorithm (RF), SFCscore descriptors, the new “clash” descriptor, and the decoy datasets of Cheng and Huang (training data) provide the basis of the best-performing model. The practical benefit of the “best” RF model was investigated after combination with the scoring function DSX based on the Docking Power for identifying a near-native pose on rank 1 using the independent Cheng/Huang (only complexes not used for training) and the CSAR-2012 dataset. With respect to the standalone application of DSX, improvements of the Docking Power regarding both test sets are achieved (Cheng/Huang test set: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012 test set: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). A key feature of the “best” model are reliable predictions of true positive docking poses for those complexes for which DSX fails to identify a near-native ligand conformation. A visual comparison of the best RF and DSX pose highlights advantages of the RF model regarding the recognition of interactions crucial for protein-ligand binding. The importance analysis of SFCscore descriptors for the classification of docking poses as well as the investigation of failures after model application provide useful hints for further improvements. Thus, more property-balanced training data, the further development of established SFCscore descriptors, and the implementation of new descriptors accounting for neglected contributions to the binding affinity constitute possible starting points for future improvements. The second part of this work is dedicated to the application of docking-based methods for the development of new inhibitors of the "`Macrophage Infectivity Potentiator"'-(MIP) proteins of Legionella pneumophila and Burkholderia pseudomallei. The MIP protein of Legionella pneumophila constitutes an important virulence factor and thus an attractive target for the treatment of legionellosis. Within the scope of this work the pipecolic acid sulfonamide 1, one of the best small-molecule MIP inhibitors to date (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM), was systematically optimised. After hot spot analysis of the binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing MIP inhibition. The results of the hot spot analysis show favourable interaction fields for donor groups and hydrophobic substituents in meta position as well as acceptor groups in para position of the benzyl ring of 1. Introducing a nitro function in para position of the benzyl ring of 1 (2h) results in an increased MIP inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), which is likely due to the formation of an additional hydrogen bond to Gly116. An improvement in the selectivity compared to the structurally related human FKBP12 protein is achieved particularly with the para amino derivative of 1 (2n) (selectivity index (1): 45, selectivity index (2n): 4.2, where the selectivity index = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (2s) leads to improved solubility and comparable MIP inhibition. The MIP protein of Burkholderia pseudomallei plays an important role in the pathogenesis of melioidosis and thus constitutes an attractive target for the development of new drugs against this disease. Within the scope of this work the currently best small-molecule MIP inhibitor 1 was optimised. Starting with a structural comparison of Burkholderia pseudomallei MIP and Legionella pneumophila MIP, as well as a hot spot analysis of the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing for MIP inhibition. The structural comparison reveals a high homology of the two binding pockets. Major conformational changes are observed for the binding pocket region formed by Ala94, Gly95, Val97 and Ile98, which necessitates different optimisation strategies for 1. Favourable interaction fields for the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket are found for donor groups or hydrophobic substituents in para position of the benzyl ring (region A) of 1 as well as for acceptor or donor groups in para or meta/para position of the trimethoxyphenyl ring (region B). On the basis of the docking studies promising candidates could be identified for variations in both regions. Initial MIP inhibition measurements of synthesised derivatives indicate increased inhibition compared to 1. Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (yielding a more soluble derivative) leads again to comparable MIP inhibition. Further syntheses and tests of promising ligands are currently being planned by the collaboration partners. The results of the inhibition measurements should demonstrate their suitability as MIP inhibitors and provide useful information for future structure-based drug design cycles. KW - Arzneimitteldesign KW - Computational chemistry KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia KW - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign KW - Docking KW - Scoringfunktionen KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia pseudomallei KW - Structure-based drug design KW - Docking KW - Scoring functions KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia pseudomallei KW - Maschinelles Lernen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101585 ER - TY - THES A1 - Busemann, Matthias T1 - Entwicklung chemometrischer Methoden für das in-silico-Wirkstoffdesign T1 - Development of chemometric techniques for the in-silico drug design N2 - Diese Dissertation beschreibt Methoden zur Lösung wichtiger anwendungsorientierter Aspekte des struktur- und ligandbasierten in-silico-Wirkstoffdesigns. Dabei liegt der Fokus auf der Entwicklung chemometrischer Verfahren und der Überprüfung ihrer Leistungsfähigkeit. Die vorgeschlagenen Algorithmen werden mit entsprechenden etablierten Techniken verglichen. Die folgenden Abschnitte fassen die Vorgehensweisen und Resultate in den einzelnen Projektbereichen zusammen. Identifizierung von Outliern. Die Untersuchung eines QSAR-Datensatzes mit dem Ziel der Outlier-Identifizierung wird in der Praxis häufig vernachlässigt. Dabei ist es offensichtlich, daß kein QSAR-Modell auf jede nur denkbare chemische Verbindung anwendbar sein kann. Vielmehr handelt es sich um empirische mathematische Modelle, die nur innerhalb jenes Datenraums Gültigkeit besitzen, der von den Trainingsobjekten aufgespannt wird. Daher ist jedes Modell auf gewisse Grenzen beschränkt, außerhalb derer eine verläßliche Vorhersage unmöglich ist. Die in dieser Arbeit entwickelte Methode ODD dient der Ermittlung dieser Grenzen und damit der Identifizierung von Outliern, also Objekten außerhalb des Anwendungsbereichs des Modells. Ziel der Entwicklung war ein nur auf den unabhängigen Variablen (X-Daten) basierendes Verfahren, das auch auf hochdimensionaleDatensätze anwendbar ist undweitestgehend auf den Eingriff des Benutzers (etwa die Definition von Grenzwerten) verzichtet. Ebenfalls wünschenswert war die Fähigkeit zur Identifikation von Inliern. Eine ausreichend hohe Geschwindigkeit sollte die Einsetzbarkeit im virtuellen Screening gewährleisten. Die Methode mußte der Überprüfung standhalten, den Vorhersagefehler eines Modells bei Vorhandensein extremer Outlier zu reduzieren, gleichzeitig aber unkritische Datensätze unbeeinflußt zu lassen. ODD basiert auf der Beurteilung der euklidischen Distanz eines Testobjekts zu seinem am nächsten benachbarten Trainingsobjekt. Der Schwellenwert für die Betrachtung eines Objekts als Outlier wird dabei aus der Verteilung der Nächster-Nachbar-Distanzen der Trainingsobjekte berechnet. Durch dieses intrinsische Maß ergibt sich die gewünschte Dimensionsunabhängigkeit und vor allem die automatische Anpassung des Grenzwerts an die Charakteristik des Kalibrierdatensatzes ohne Eingriff des Benutzers. Die Validierung zeigt, daß ODD extreme Outlier zuverlässig erkennt und sich gleichzeitig durch eine im Vergleich zu anderen gebräuchlichen Verfahren geringere Anzahl falsch positiver Identifizierungen auszeichnet. Ensemble-Techniken. In einer vergleichenden Studie wurde die Leistungsfähigkeit verschiedener Ensemble-Techniken hinsichtlich ihres Einflusses auf den Vorhersagefehler untersucht. Dazu wurden umfangreiche Simulationen anhand mehrerer realer QSAR-Datensätze durchgeführt. Die Verwendung von Ensembles (d. h. einer Sammlung vielerModelle, diemit geringfügigmanipulierten Varianten des Trainingsdatensatzes kalibriert wurden) wirkt sich im allgemeinen positiv auf den Vorhersagefehler (RMSEP) aus. Diese Reduzierung des RMSEP wurde hier ermittelt und für verschiedenen Ansätze zur Ensemble-Generierung verglichen. Insgesamt betrachtet erwiesen sich die Methoden der konvexen Pseudodaten und des Baggings als die effektivsten Verfahren zur Ensemble-Generierung, da sie den Vorhersagefehler am deutlichsten verbesserten. Die konvexen Pseudodaten wurden erstmalig zur Erzeugung von Ensembles in der QSAR-Analyse eingesetzt; sie werden als neuer Standard zur Reduzierung des RMSEP bei QSAR-Problemen vorgeschlagen, die Regressionsmodelle auf Basis von latenten Variablen verwenden. Darüber hinaus bieten die Studien eine Abschätzung dermit Hilfe von Ensembles zu erzielenden Reduktion des Vorhersagefehlers bei typischen QSAR-Datensätzen. Virtuelles Screening. Beim virtuellen Screening handelt es sich um eine Technik zum Durchsuchen großer (virtueller)Molekülbibliotheken—oftmehrere Millionen Verbindungen — nach den aussichtsreichsten Wirkstoffkandidaten. Dies kann sowohl durch strukturbasierte als auch mit Hilfe ligandbasierter Verfahren geschehen. Es wurden umfangreiche Simulationen anhand sechs verschiedener Targets und einer Bibliothek von mehr als 90 000 Molekülen durchgeführt, um das Potential strukturbasierter (Docking mit FLEXX) und ligandbasierter (Ähnlichkeitssuchemitmehreren Referenzen) Verfahren zu vergleichen. Darüber hinauswurde durch Berechnung von Interaktionsfingerprints eineMöglichkeit geschaffen, die Information der beiden sonst getrennten Herangehensweisen zu kombinieren. Um den Einfluß des Klassifizierungsalgorithmus zu untersuchen, wurden verschiedene statistische Methoden zur Datenauswertung herangezogen. Als Bewertungskriterium für die Leistungsfähigkeit eines Verfahrens diente jeweils die Anzahl der wiedergefundenen aktiven Moleküle in der simulierten Screeningdatenbank. Die Resultate führen zu dem Schluß, daß ligandbasierte Verfahren, die einfacher einzusetzen sind aber mehr a-priori -Information benötigen, dem strukturbasierten virtuellen Screening hinsichtlich der Datenbankanreicherung überlegen sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, wie nutzbringend die Zusammenführung von strukturbasierter Information und solcher über das Interaktionsmuster bekanntermaßen aktiver Verbindungen für die Erhöhung der Wiederfindungsrate ist. Bei der Datenanalyse stellte sich heraus, daß im Mittel bestimmte statistische Methoden (minimale euklidische Distanz ED/Min bzw. Tanimoto-Ähnlichkeit der Integer-Fingerprints Int/Min) zu bevorzugen sind. Kovalentes Docking von Cathepsin-Inhibitoren. Die Cysteinproteasen Cathepsin B und L sind interessante pharmakologische Targets. Geeignete Inhibitoren stammen u. a. aus der Strukturklasse der Aziridine. Ein nukleophiler Angriff des Cysteinrests des Enzyms auf den elektrophilen Aziridinring führt hier zur Ausbildung einer kovalenten Ligand-Rezeptor-Bindung. Praktisch alle erhältlichen Dockingprogramme konzentrieren sich jedoch auf nicht-kovalente Ligand-Rezeptor-Interaktionen und lassen kein uneingeschränktes kovalentes Docking zu. Daher wurde für FLEXX ein Dockingprotokoll entworfen, das den entscheidenden nicht-kovalenten Zustand vor Ausbildung der kovalenten Bindung simulieren kann. Auf dieseWeise konnte untersucht werden, ob sich die Reaktionszentren von Ligand und Enzym ausreichend nahe für die Ausbildung einer kovalenten Bindung kommen. Der vorgestellte Ansatz läßt sich leicht auf andere kovalente Ligand-Rezeptor- Systeme übertragen und bietet somit eine breite Anwendbarkeit. Weiterhin wurde die Parametrisierung der in FLEXX vorgesehenen Interaktionsgeometrien an die strukturellen Eigenheiten der zu dockenden Aziridide angepaßt. Diese weisen nämlich formal eine Amidbindung auf, deren geometrische und elektronische Eigenschaften jedoch deutlich von den Werten eines typischen Amids abweichen. Die Ergebnisse der Dockingstudien liefern wertvolle Einblicke für das Verständnis der Selektivität der untersuchten Liganden bezüglich Cathepsin B beziehungsweise L. Umgekehrt erbringt die gute Übereinstimmung der FLEXX-Resultate mit den experimentell bestimmten Inhibitionskonstanten den Nachweis für die Validität des verwendeten Dockingprotokolls. N2 - This thesis describes methods for solving important application-oriented aspects of structure-based and ligand-based in silico drug design. The proposed algorithms are compared to well established techniques. The focus is particularly on the development and benchmarking of different chemometric techniques. In the following, the approaches and results within the different project areas are summarised. Outlier Identification. The inspection of QSAR datasets in order to identify prediction outliers is often omitted in practice. However, it is clear that no QSAR model is applicable to every conceivable chemical compound. Since QSAR models represent empirical mathematical models, these are only valid within the data space spanned by the training data. Hence, every model is restricted to certain borders beyond which a reliable prediction is impossible. The method ODD developed in this work can be used to determine these borders and thus to identify outliers. Those are objects outside the data space spanned by the training data (i.e. the applicability domain of the model). The aim of the method is to detect outliers solely based on the predictor variables (X data). Moreover, the method must be capable to handle high-dimensional datasetswithminimal user interference (e.g. setting of cut-offs). Furthermore, the ability to identify inliers would be preferable. The computational speed should be high enough to apply the method to virtual screening. The developed technique had to prove that it provides a reduction of the model’s error of prediction if extreme outliers are present. At the same time, it should leave non-critical datasets unaffected. ODD is based on the evaluation of the Euclidean distance of a test object towards its nearest neighbouring training object. The cut-off for deeming an object as outlier is calculated from the distribution of the nearest neighbour distances of the training set. This intrinsic value leads to the desired independence from data dimensionality and, above all, to an automatic adjustment of the cut-off to the characteristics of the calibration dataset without any user intervention. The validation shows that ODD reliably identifies extreme outliers. On the other hand, it offers a low rate of false positives compared to other common techniques for outlier identification. Ensemble Techniques. In a benchmark study, the impact of different ensemble techniques on the prediction error was investigated. For this purpose, comprehensive simulations on several real QSAR datasets were carried out. The application of ensembles (i.e. a collection of many models trained with sligthly perturbed versions of the training set) usually lowers the error of prediction (RMSEP). The RMSEP reduction was determined and compared for different approaches of ensemble generation. Overall, the methods of convex pseudo data and bagging proved to be the most efficient ways for ensemble generation (i.e. they resulted in the largest reduction of the prediction error). Convex pseudo data, which were applied toQSAR data sets for the first time as ensemble technique, are proposed as the new standard for lowering RMSEP in QSAR problems using latent variable regression models. Furthermore, the effect size of ensemble averaging was quantified for typical QSAR data sets. Virtual Screening. Virtual screening is a technique to screen large (virtual) molecular databases — often several million compounds — for the most promising drug candidates. This can be done by structure-based as well as by ligand-based approaches. Comprehensive computations on six different targets and a library of more than 90 000 compounds were carried out to compare the potential of structure-based techniques (docking with FLEXX) and ligand-based techniques (similarity searching with multiple queries). In addition to that, interaction fingerprints were computed in order to combine the information of the otherwise distinct approaches. Several statistical methods were applied for data analysis to investigate the impact of the machine learning algorithm. Figure of merit for each approach was the number of active compounds retrieved from the assembled screening database with known actives. The results lead to the following conclusions: Ligand-based approaches, which are simpler to use but require more a priori information, turned out to be superior to structure-based virtual screening techniques in terms of database enrichment. In addition, it could be shown that combination of structure-based information with information of the interaction pattern of known actives is beneficial for increasing retrieval rates. Data analysis revealed that certain statistical methods (minimum Euclidean distance ED/Min, and Tanimoto similarity of integer fingerprints Int/Min, respectively) are on average to be preferred. Covalent Docking of Cathepsin Inhibitors. Cysteine proteases Cathepsin B and L are interesting pharmacological targets. Suitable inhibitors, amongst others, come from the structural class of aziridines. A nucleophilic attack of the enzyme’s active site cysteine moiety on the electrophilic aziridine ring leads to formation of a covalent bond between ligand and receptor. However, virtually all available docking programs concentrate on noncovalent ligand-receptor interactions and do not provide sophisticated, unrestricted covalent docking. Thus, a docking protocol for FLEXX was designed which is able to represent the essential non-covalent state before formation of the covalent bond. That way, it could be studied whether or not the reaction centres of both ligand and receptor adopt a position close enough to each other to actually form the covalent bond. The approach presented here can easily be transferred to other covalent ligand-receptor systems and therefore provides a broad applicability. Furthermore, the parametrisation of the FLEXX interaction geometries was adapted to account for the special structural features of aziridides. Those show a formal amide bond, but its geometric and electronic properties differ noticeably from a typical amide. The results of the docking studies provide valuable insights for understanding the Cathepsin B/L selectivity of the ligands under scrutiny. Vice versa, the good correspondence of the FLEXX results and the inhibition constants obtained experimentally provide evidence for the validity of the applied docking protocol. KW - Arzneimitteldesign KW - Chemometrie KW - Chemometrie KW - Outlier-Identifizierung KW - virtuelles Screening KW - Docking KW - Chemometrics KW - Outlier Detection KW - virtual screening KW - docking Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18777 ER -