TY - THES A1 - Kastner, Carolin T1 - LASP1 – ein neuer, phosphorylierungs-abhängiger Bindungspartner von CrkL in CML T1 - LASP1 – a new, phosphorylation-dependent binding partner of CrkL in CML N2 - Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die einer malignen Erkrankung zugrunde liegen, ist der Schlüssel zur Entwicklung zielgerichteter und effektiver therapeutischer Möglichkeiten. Für das LIM und SH3 Domänen Protein 1, LASP1, konnte im Kontext zahl-reicher Tumorerkrankungen wie dem Mamma-Karzinom, dem Prostata-Karzinom oder dem Ovarial-Karzinom eine Überexpression ebenso wie eine Korrelation mit Aggressivität und Prognose der Tumorerkrankung gezeigt werden. Bisher war eine Relevanz von LASP1 jedoch nur für solide Tumorerkrankungen nachgewiesen worden. Kürzlich allerdings wurde lasp1 als eines von 6 Genen identifiziert, die eine exaktere Vorhersage von Krankheitsprogress und -rezidiv bei Patienten mit einer chronischen myeloischen Leukämie (CML) zulassen sollen. Zudem konnte, wie bereits bei zahlreichen anderen, soliden Tumorerkrankungen, eine signifikante Überexpression des lasp1-Gens in CML-Zellen nachgewiesen werden.Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen beschäftigte ich mich im Rahmen dieser Arbeit mit der Frage, welche Funktion LASP1 im Netz der einer CML zugrunde liegenden, molekularen Mechanismen übernimmt. Mittels verschiedener Interaktionsassays konnte LASP1 als ein neuer, phosphorylierungs-abhängiger Bindungspartner von CrkL, dem wohl prominentesten Substrat der BCR-ABL-Kinase, identifiziert werden. Dabei impliziert das Attribut „phosphorylierungs-abhängig“ sowohl den Phosphorylierungsstatus von LASP1 als auch des Interaktionspartners CrkL. Wie in Vorarbeiten gezeigt, stellt das Tyrosin 171 in der Aminosäurensequenz von LASP1 eine Phosphorylierungsstelle für die BCR-ABL-Kinase dar; mit LASP1 wurde somit auch ein neues Substrat dieser konstitutiv aktiven Tyrosinkinase entdeckt. Phosphoryliert an Tyrosin 171 kann LASP1 an die SH2-Domäne von CrkL, genauer an das FLVR-Motif innerhalb dieser, binden. Jedoch selbst an Tyrosin 207 durch die BCR-ABL-Kinase phosphoryliert, blockiert CrkL die eigene SH2-Domäne durch intramolekulare Wechselwirkungen für andere Protein-Protein-Interaktionen in gewissem Umfang. Diese neu gewonnenen Erkenntnisse liefern ein weiteres Puzzlestück zum Verständnis des molekularen Netzwerks, das einer CML-Erkrankung zugrunde liegt und tragen so dazu bei, die Therapieoptionen dieser stetig zu verbessern. N2 - Understanding the molecular mechanisms underlying a malignant disease makes it possible to develop targeted and effective therapeutic options. For numerous malignant disease such as breast cancer, prostata cancer or ovarial cancer it has been shown that the LIM and SH3 domain protein 1, LASP1, is overexpresssed and that there is a correlation with regard to aggressive growth and outcome of the tumour. So far relevance of LASP1 has only been proven for solid tumours. However recently lasp1 was identified as a component of six genes that may allow to predict more reliably disease´s progress and relapse in CML patients. In addition to that a significant overexpression of lasp1 in CML cells has been discov-ered, a phenomenon already known from a lot of solid malignant tumours. Based on these new findings, i dealt with the issue of the function of LASP1 in the network of molecular mechanisms underlying CML. Using different kinds of interaction assays, LASP1 was identified as a new, phosphorylation-dependent ligand of CrkL, the most prominent substrate of the BCR-ABL-kinase. In this case the attribute "phosphorylation-dependent“ refers to the phosphorylation status of LASP1 as well as of its binding-partner CrkL. As shown in preliminary studies, tyrosine 171 is a phosphorylation site for BCR-ABL-kinase within the AS sequence of LASP1; therefore, with LASP1, a new substrate of this constitutive active tyrosine kinase has been discovered. When phosphorylated on tyrosine 171, LASP1 is able to bind to the SH2-domain of CrkL, more exactly to the FLVR-motive within this domain. But when CrkL is phos-phorylated on tyrosine 207 by BCR-ABL-kinase, there are intramolecular interactions that block the SH2-domain of CrkL for other protein-protein-interactions. These new findings help to understand the molecular network under-lying a CML disease and may contribute to continuous improvement of therapeutic options. KW - Chronisch-myeloische Leukämie KW - Proteinsynthese KW - Domäne KW - Proteininteraktion Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187539 ER - TY - THES A1 - Schwarze, Simone T1 - Untersuchung von Faltungs- und Funktionsdynamik isolierter Proteindomänen mittels Fluoreszenzlöschung T1 - Investigation of folding and function dynamics of isolated Protein Domains using fluorescence quenching N2 - Proteine bestehen aus einer spezifischen Sequenz verschiedener Aminosäuren, die ihre charakteristische Funktion bestimmt. Die große Variabilität an Aminosäuresequenzen ermöglichte die Evolution einer nahezu unbegrenzten Anzahl an Proteinen. Meistens nehmen diese Schlüsselpositionen ein, von robusten Baustoffen bis hin zu molekularen Maschinen. Daher kann eine Fehlfunktion gravierende Auswirkungen auf das Leben haben, z.B. Krankheiten wie Alzheimer oder Epilepsi. Um die Funktionen und Fehlfunktionen zu verstehen, ist eine umfassende Kenntnis der Proteinfaltung, der Protein-Protein Assoziation, sowie den Dynamiken innerhalb von Proteinen erforderlich. Diese Vorgänge wurden in dieser Arbeit an drei isolierten Proteindomänen durch die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers untersucht. Der entfaltete Zustand der Bindungsdomäne BBL, das Teil des 2-oxo-acid Dehydrogenasekomplexes ist, wurde unter physiologischen Bedingungen mit Zirkulardichroismus (CD) und einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie analysiert. Beide Methoden zeigten übereinstimmend anhand von 20 in BBL einzeln eingefügten konservativen Punktmutationen, dass Seitenketteninteraktionen keine Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des denaturierten Zustandes, den Ausgangspunkt der Faltung, haben. Mit Hilfe der Dekonvolation der CD-Spektren wurde zudem gezeigt, dass die Reststruktur im denaturierten Zustand der helikalen Proteindomäne von β-Strängen und β-Kehren dominiert wird, die eine entscheidende Funktion bei der Faltung in den nativen Zustand haben könnten. Die N-terminale Domäne (NTD), der für die Materialforschung hochinteressanten Spinnen-seidenfaser, ist für die Polymerisation des Spinnenseidenfadens auf den pH-Wechsel von pH 7 auf pH 6 hin verantwortlich. Dieser für die Proteinfunktion wichtige Prozess wurde durch die Einbringung eines extrinsischen Fluoreszenzschalters, basierend auf der H-Dimerbildung, mit der Stopped-Flow-Technik untersucht. Es wurde gezeigt, dass die NTDs 104 mit einer Rate von 3 x 10^8 M-1 s-1 assoziieren und somit nahezu das Geschwindigkeitslimit der Protein-Protein Assoziation erreicht wird. Zwei geladenen Seitenketten, der D39 und D40, kommt eine entscheidende Funktion in dem Prozess zu, da eine Mutation dieser die Assoziation verhindert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die NTD auf eine Erhöhung der Ionenstärke entgegengesetzt zu anderen Proteinen verhält: die Dissoziation wird beschleunigt, die Assoziation nicht beeinflusst. Gleiches Verhalten wurde auf den einzelnen Austausch der übrigen protonierbaren Aminosäureseitenketten hin beobachtet, ausgenommen die Mutation der E119, welche die Dissoziation verlangsamt. Daher scheint der makromolekulare Dipol, der auf Grund der Ladungsverteilung in der NTD entsteht, die Assoziation maßgeblich zu beeinflussen. Glutamatrezeptoren sind an der schnellen synaptischen Signalweiterleitung im Nervensys-tem von Vertebraten beteiligt. Die Konformationen der Ligandenbindungsdomäne (LBD) haben dabei entscheidende Auswirkungen auf die Funktion des Gesamtrezeptors. Diese wurden mit einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie untersucht. Mit dieser Methode wurde ein dynamisches Bild der gebundenen sowie ungebundenen Form der AMPA-spezifischen Glutamatrezeptor 2-LBD gezeigt. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Dynamiken in Abhängigkeit der Bindung von den Agonisten Glutamat und AMPA, dem partiellen Agonisten Kainate oder Cyclothiazid (CTZ), welches eine Dimerisierung der LBDs bewirkt, unterschiedlich verändern. Dies könnte eine Auswirkung auf die Funktion der Rezeptoren haben. Die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers in dieser Arbeit hat gezeigt, dass diese die Möglichkeit bieten, unterschiedlichste Fragestellungen zu beantworten und so Einblicke in dynamische Funktionsweisen von Proteinen eröffnen. Kombiniert mit etablierten Fluoreszenzmethoden ist es so möglich quantitativ Kinetiken auf unterschiedlichen Zeitskalen zu untersuchen. N2 - Proteins are composed of a specific sequence of variable amino acids that specify their specific function. The vast variability of possible amino acid sequences allowed for the evolution of a nearly infinite number of different proteins. Mostly these will have key positions, reaching from strong building material to molecular machines. Therefore a malfunction will have an immense effect on life, i.e. diseases like Alzheimer disease or epilepsy. In order to understand the function and malfunction an intense understanding of the protein folding, the protein-protein association, as well as the protein dynamics is essential. These processes have been investigated in this thesis with three isolated protein domains by the application of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer-formation and by the photoinduced electron transfer. The unfolded state of the binding domain BBL, which is part of the 2-oxo-acid-dehydrogenase-complex, was analysed under physiological conditions by circular dichroism (CD), and a combination of photoinduced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Both methods showed accordingly, using 20 singly implanted conservative point mutations in BBL, that side-chain interactions have no effect on the secondary struc-ture of the denatured condition, the initial state of the folding. Using deconvolution on the CD spectra it was shown in addition, that the remaining structure of the helical protein domain in the denatured state is dominated by β-strands and β-turns. These may have a decisive function during the folding in the native state. The N-terminal domain of the spider silk fibre, which is of high interest for the material research, is responsible for the polymerisation of the spider silk fibre during the pH-change from pH 7 to pH 6. This important process for the protein function was investigated with the Stopped-Flow technique by the application of an extrinsic fluorescence switch, based on the H-dimer formation. It was shown, that NTDs associate with a rate of 3 x 10^8 M-1 s-1, and so nearly reach the speed limit of the protein-protein association. In this process two charged side chains, the D39 and D40, have a decisive function, as a mutation of these will 106 avoid the association. Furthermore it was shown, that the NTD will react in opposition to other proteins on the increase of the ionic strength: the dissociation will be speeded up, and the association is not influenced. The identical behaviour was observed with the single ex-change of the other protonable amino acid side chains, except for the mutation of E119, which retards dissociation. Therefore the macromolecular dipol, that is formed by the charge distribution of the NTD, is obviously influencing the association. Glutamate receptors participate in the fast synaptic signal transfer in vertebrates. Here dif-ferent conformations of the ligand binding domain (LBD) have decisive effects on the function of the entire receptor. These have been investigated with a combination of photoin-duced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Using this method a dynamic behaviour of the bound and unbound form of the AMPA specific glutamate receptor 2 LBD was shown. Furthermore it was shown, that the dynamics will change differently in dependence of the binding of the agonist glutamate and AMPA, the partial agonist kainate or Cyclothiazide (CTZ), which effects a dimerization of the LBDs. This may have an effect on the function of the receptors. The use of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer formation and the pho-toinduced electron transfer in this thesis has shown, that these offer the opportunity to an-swer a large range of questions and open a view to the dynamic functionality of proteins. Combined with established fluorescence methods it is possible to quantitatively investigate kinetic rates at different time scales. KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Fluoreszenzlöschung KW - Domäne KW - Proteindynamiken KW - H-Dimerbildung KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - Spinnenseide KW - Glutamatrezeptor KW - BBL KW - protein dynamics KW - fluorescence quenching KW - Proteindomänen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107080 ER - TY - THES A1 - Förster, Johanna R. T1 - Identifizierung und Analyse von Proteininteraktionen bei zwei Mitgliedern der MAGUK-p55-Subfamilie, MPP4 und MPP5 T1 - Identification and analysis of protein interactions of two members of the MAGUK p55 subfamily, MPP4 and MPP5 N2 - Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen waren das retinaspezifische palmitoylierte Membranprotein 4 (engl. membrane palmitoylated protein 4, MPP4) und das ubiquitär exprimierte MPP5, die beide zur großen Familie der Membran-assoziierten Guanylatkinasen (engl. membrane-associated guanylate kinases, MAGUKs) gehören. Beide Proteine haben wichtige organisatorische Funktionen als Adapterproteine in der Netzhaut. MPP4 ist am Aufbau von präsynaptischen Proteinkomplexen in den Photorezeptor-Ribbonsynapsen beteiligt. Ein Fehlen von MPP4 in Mäusen führt zum Verlust von einigen präsynaptischen Proteinen von der Ribbonsynapse, was eine wichtige Rolle von MPP4 für die Organisation dieses Komplexes indiziert. Um neue Komponenten dieses Multiproteinkomplexes zu identifizieren, wurde in der vorliegenden Arbeit ein proteomischer Ansatz etabliert. Dazu wurde der MPP4-assoziierte Proteinkomplex aus Proteinextrakten der bovinen Retina durch Immunaffinitätschromatographie isoliert, mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und resultierende Protein-spots massenspektrometrisch analysiert. Diese Untersuchungen identifizierten 18 kopräzipitierte Proteine. Darunter waren der bekannte Interaktionspartner Veli3 und das MAGUK-Protein PSD95. Für letzteres konnte gezeigt werden, dass speziell die β-Isoform von PSD95 mit MPP4 über die N-terminalen L27-Domänen heterodimerisiert. Daneben konnte die Assoziation von MPP4 mit Hsc70 und Recoverin durch unabhängige Bindungs-assays verifiziert werden, wobei diese Interaktionen indirekt waren und möglicherweise von retinaspezifischen Proteinen vermittelt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die herausragende Rolle von MPP4 als Gerüstprotein für die Organisation eines Proteinkomplexes der Photorezeptorsynapse, der an der Regulierung der Ca2+-Homöostase in den präsynaptischen Enden, sowie vermutlich auch an der Exozytose der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Die übrigen kopräzipitierten Proteine waren Bestandteile des Zytoskeletts und verschiedener Signalwege und wahrscheinlich unspezifische Kontaminanten. Das MPP5-Protein ist Teil eines evolutionär konservierten Proteinkomplexes, der für die Entstehung und Aufrechterhaltung der apikobasalen Polarität in Epithelzellen eine wichtige Rolle spielt und in der Netzhaut für die speziellen Zellverbindungen zwischen Müller-Gliazellen und Photorezeptoren in der externen limitierenden Membran essentiell ist. Mutationen, die zu Störungen in der Funktion dieses Proteinkomplexes führen, verursachen retinale Defekte bei Mensch (z.B. Retinitis Pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose), Maus, Zebrafisch und Fruchtfliege. Die PDZ-Domäne von MPP5 bindet an den C-Terminus der CRB-Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung einer Punktmutation in der PDZ-Domäne von MPP5 (V301N), funktionell untersucht. Diese hat im Zebrafisch eine fehlende Photorezeptoradhäsion und die Zerstörung der retinalen Architektur zur Folge. Es wurde gezeigt, dass die V301N-Mutation die Interaktion zwischen MPP5 und den drei CRB-Isoformen verhindert. Außerdem führt sie zu einer Fehllokalisierung von heterolog exprimiertem MPP5V301N in MDCK-Zellen, die zudem einen erhöhten transepithelialen Widerstand aufweisen. Über quantitative real-time PCR wurde in diesen Zellen eine verminderte Genexpression von Untereinheiten des apikalen epithelialen Natriumkanals ENaC und der basolateralen Na+/K+-ATPase festgestellt, was die Ursache für einen verminderten Ionenfluss durch die Zellschicht darstellen könnte. Somit übt heterolog exprimiertes MPP5V301N in MDCK-Zellen einen dominanten Effekt aus, der möglicherweise über einen Einfluss auf die Genregulation bestimmter Proteine vermittelt wird. Zur Untersuchung welche Auswirkungen die MPP5V301N-Mutation in vivo hat, wurde eine MPP5V301N-knock-in-Mauslinie generiert. Die bisherige Charakterisierung der Mäuse zeigte bei heterozygoten Tieren keinen äußerlich erkennbaren Phänotyp, wohingegen homozygote Mäuse nicht lebensfähig waren. Vermutlich führt das Vorkommen beider mutanter Allele in frühen embryonalen Stadien zum Abstoßen der Embryos. Das Mausmodell bietet die Basis für weitere Untersuchungen über die molekularen Konsequenzen einer Expression von MPP5V301N in der Netzhaut und anderen Geweben und wird Beiträge zur Aufklärung von Entstehungsmechanismen CRB1-MPP5-assoziierter Netzhauterkrankungen liefern. N2 - The objects of the present study were the retina specific membrane palmitoylated protein 4 (MPP4) and the ubiquitous expressed MPP5 protein which belong to the large family of the membrane-associated guanylate kinase homologs (MAGUKs). Both proteins have important organizational functions as adaptor proteins in the retina. MPP4 is involved in the assembly of presynaptic protein complexes in the photoreceptor synapses. The absence of MPP4 in mice leads to the loss of several presynaptic proteins from the ribbon synapse indicating an important role for MPP4 in organizing this complex. This work was aimed to identify new components of this multiprotein complex by establishing a proteomic approach. More precisely, the MPP4-associated protein complex was isolated with immunoaffinity chromatography from bovine retinal protein extracts followed by two-dimensional electrophoresis and analysis of the resulting protein spots by mass spectrometry. This analysis identified 18 co-precipitated proteins. Among these molecules the known interacting partner Veli3 and the MAGUK protein PSD95 were detected. For the latter, a selective association between MPP4 and the PSD95-β isoform was demonstrated showing specific heterodimerization of their N-terminal L27 domains. Additionally independent binding assays verified the association of MPP4 with recoverin and Hsc70. These interactions seem to be indirect and are presumably mediated by retina specific proteins in vivo. In summary, these findings support a protruding role for MPP4 as scaffolding protein for the organization of a protein complex of the photoreceptor synapses, which is involved in the regulation of Ca2+ homeostasis within the presynaptic terminals and eventually plays a role in synaptic vesicle exocytosis. The remaining co-precipitated proteins represented cytoskeletal constituents and components of different pathways and were probably unspecific contaminants. The MPP5 protein, a member of the evolutionarily conserved CRB protein complex, plays an important role in establishing and maintaining the apicobasal polarity of epithelial cells. Furthermore, this complex is essential for specific cell junctions between Müller glia cells and photoreceptors in the outer limiting membrane of the retina. Mutations that disrupt the function of this protein complex were reported to cause retinal defects in human (e.g. retinitis pigmentosa, Leber’s congenital amaurosis), mouse, zebrafish and fruit fly. The PDZ domain of MPP5 binds to the C-terminus of the CRB proteins. The present study aimed to analyze the consequences of a point mutation within the PDZ domain of MPP5 (V301N). In zebrafish, this mutation resulted in the loss of photoreceptor adhesion and in the disruption of retinal layers. It was demonstrated that the V301N mutation prevents the interaction between MPP5 and the three CRB isoforms. Additionally, heterologously expressed MPP5V301N mislocalizes in MDCK cells which furthermore develop an increased transepithelial resistance. Quantitative real-time PCR revealed decreased gene expression levels for subunits of the apical epithelial sodium channel (ENaC) and the basolateral Na+/K+-ATPase, supposedly causing the reduced ion movement through the cell layer. Thus, heterologously expressed MPP5V301N apparently has a dominant effect in MDCK cells which might be mediated by an influence on the gene expression of other yet unknown proteins. To further elucidate the MPP5V301N mutation in vivo, a knock in mouse line was generated. So far the characterization of these mice revealed no apparent phenotype for heterozygous animals, whereas homozygous mice were not viable. The presence of both mutant alleles presumably results in a rejection at early embryonic stages. The mouse model provides the basis to further analyze molecular consequences of MPP5V301N expression in the retina and other tissues and will contribute to enlighten the development of CRB1-MPP5-associated retinal diseases. KW - Netzhaut KW - Multiproteinkomplex KW - Domäne KW - Ribbon-Synapse KW - Proteomanalyse KW - MPP4 KW - PSD95 KW - MPP5 KW - ENaC KW - Na-K-ATPase KW - photoreceptor synapse KW - proteomic approach KW - multi protein complex KW - retina KW - PDZ domain Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37269 ER - TY - THES A1 - Renné, Thomas T1 - Strukturelle und funktionelle Analyse der Interaktion des Blutgerinnungsfaktors XI mit H-Kininogen T1 - Structural and functional analysis of coagulation factor XI binding to H-kininogen N2 - Im Blutplasma und auf Zelloberflächen bildet H-Kininogen entweder mit dem Blutgerinnungsfaktor XI oder Plasmakallikrein Komplexe. Die beiden Proteasenvorstufen binden über ihre homologen schweren Ketten, die jeweils aus vier Apple Domänen bestehen (F1-F4 bei Faktor XI und P1-P4 bei Kalllikrein), an HK. Die Kalllikrein/Kininogen Interaktion wird über Domäne P2 vermittelt. Im Gegensatz dazu soll FXI über F1 an Kininogen binden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Lokalisation der Kininogen-Bindungsstelle des Faktors XI und ein funktioneller Vergleich der Kalllikrein/Kininogen und Faktor XI/Kininogen Komplexe. Es zeigt sich, dass die relative Bindungsaffinität von HK an rekombinante Faktor XI-Einzeldomänen in der Reihenfolge F2 >> F4 > F1 >> F3 abfällt. Die Bedeutung der F2 Domäne für die Kininogen Bindung wird durch den monoklonale Antikörper αP2 unterstrichen, der die Faktor XI/Kininogen und die Kalllikrein/Kininogen Bindung mit einem apparenten IC50 von 8 nM blockiert und dessen Epitop auf die F2 Domäne kartiert wird. Eine Thrombozyten-spezifische Faktor XI-Splicevariante, der die N-terminale Hälfte der F2 Domäne fehlt, bindet 5-fach schlechter als Faktor XI an Kininogen. Nach Aktivierung wird Kallikrein und ein chimäres Faktor XI-Protein, bei dem F2 durch P2 ersetzt wurde, in P2 gespalten, was zur Verlust der Bindungsaffinität zu Kininogen führt. Im Gegensatz bleibt die Bindung von aktiviertem Faktor XI oder einem chimärem Kalllikrein-Protein, bei dem die P2 Domäne durch F2 ersetzt wurde, nach Aktivierung an Kininogen gebunden. Diese Daten zeigen, dass Faktor XI und Kallikrein über ihre Domänen 2 an Kininogen binden. Trotz homologer Bindungsmotive unterscheiden sich Faktor XI/Kininogen und Kallikrein/Kininogen Komplexe in ihrer Stabilität nach Aktivierung. Die Daten tragen dazu bei, die Regulation der Kallikrein-vermittelten Bradykininbildung bei Entzündungsprozessen und die Faktor XI-getriebene Fibrinbildung besser zu verstehen. N2 - Factor XI (FXI), the zymogen of the blood coagulation protease FXIa, and the structurally homologous protein plasma prekallikrein circulate in plasma in non-covalent complexes with H-kininogen (HK). HK binds to the heavy chains of FXI and of prekallikrein. Each chain contains four apple domains (F1 - F4 for FXI; P1 - P4 for prekallikrein). Previous studies had indicated that the HK binding site on FXI is located in F1, while the major HK binding site on prekallikrein is on P2. To determine the contribution of each FXI apple domain to FXI/HK complex formation, we examined binding of recombinant single apple domain-tPA fusion proteins to HK. The order of affinity from highest to lowest is F2 >> F4 > F1 >> F3. Monoclonal antibodies against F2 are superior to F4 or F1 antibodies as inhibitors of HK binding to FXI. Antibody αP2, raised against prekallikrein, cross-reacts with FXI F2 and inhibits FXI/HK binding with an IC50 of 8 nM. HK binding to a platelet specific FXI variant lacking the N-terminal half of F2 is reduced > 5-fold compared to full-length FXI. A chimeric FXI molecule in which F2 is replaced by P2, is cleaved within P2 during activation by factor XIIa, resulting in greatly reduced HK binding capacity. In contrast, wild-type FXI is not cleaved within F2, and its binding capacity for HK is unaffected by factor XIIa. Our data show that HK binding to FXI involves multiple apple domains, with F2 being most important. The findings demonstrate a similarity in mechanism for FXI and prekallikrein binding to HK. Although the zymogens complex HK via homologous binding motives the stability of FXI/HK and kallikrein/HK complexes is largely diffent following activation. The data may help to understand kallikrein-driven bradykinin formation in inflammation and FXI-mediated fibrin generation in thrombosis. KW - Gerinnungsfaktor XI KW - Blutgerinnung KW - Kallikrein-Kinin-System KW - Domäne KW - Apple Domäne KW - FXI KW - Kinin KW - intrinsische Gerinnungskaskade KW - Apple domain KW - FXI KW - kinin KW - intrinsic coagulation cascade Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25463 ER - TY - THES A1 - Bertram, Helge T1 - Bioinformatische Identifikation von Domänenunterschieden bei Parasit und Wirt am Beispiel der Malaria T1 - Bioinformatic identification of domain differences in parasite and host using malaria as an example N2 - Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann. N2 - The objective of this thesis is to obtain information, which may be advantageous for biotechnical and medical purposes. In order to achieve this aim it is first necessary to identify protein domains and essential regulatory RNA elements. In case of regulatory RNA elements this is accomplished by investigating Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylocuccus aureus as a model. In this case these elements are found in much promising vicinity to open reading frames coding for proteins (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Even more significant for the purpose of developing pharmaceuticals against parasites are differences of structure and sequence in protein domains (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Their identification is shown in a potential transport protein in Plasmodium falciparum. Subsequently the interaction of regulatory elements and domains in networks is considered (including experimental data). The resulting observations may lead to general conclusions concerning network reaction, as well as specific applications. Our example and field of interest are redox networks and Plasmodia causing malaria. It is not possible to cover the redox network state of a living cell using only pH measurements. Therefore small crystals of glutathione reductase are employed as a more suitable indicator, whose signal is digitally amplified (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). In order to bioinformatically modulate complex redox networks techniques of metabolic flux analysis are presented. They are also improved particularly to advance the understanding of interdependences and to facilitate the correct comprehension of such networks with as few elementary flux modes as possible. In this thesis the reduction of the number of elementary modes of large and intertwined metabolic networks succeeds with various methods. This leads to a simpler model of complex metabolic functions. For each of the methods used in this process the biochemically justified definition of external and internal metabolites constitutes the basis (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). In a more general sense methods of protein domain classification and new strategies for the control of microbial pathogens are considered. In reference to automated classification of protein domains a new system by Taylor (2002b) is compared with traditional systems, which require a varying degree of human intervention (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). In addition different methods of acquiring information on the cellular metabolic network from genomic data is discussed (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11). Furthermore a survey of the main fields of bioinformatic research in Würzburg is given (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Finally it is outlined how pathogenicity and virulence of bacteria may be made accessible to bioinformatic analysis (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). In the conclusion metabolic flux analysis is used for the identification of new strategies in the battle against Plasmodia: The comparison of metabolic pathways with glutathione and thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles and man aims at raising planned dysfunctions in the metabolism of Plasmodium or Anopheles without harming the human host. Valuable suggestions for medical applications and pharmacological targets are obtained. KW - Plasmodium falciparum KW - Domäne KW - Klassifikation KW - Bioinformatik KW - Redoxsystem KW - Glutathion-Reductase KW - Malariamücke KW - Mensch KW - Stoffwechselweg KW - Malaria KW - metabolische Fluxanalyse KW - Glutathionreduktase KW - Iron Responsive Elements KW - Proteindomänenklassifikation KW - malaria KW - metabolic fluxanalysis KW - glutathione reductase KW - iron responsive elements KW - classification of protein domains Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17188 ER -