TY - THES A1 - Troge, Anja T1 - Studien am Flagellensystem des Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (EcN) im Hinblick auf seine Funktion als Probiotikum T1 - Studies on the flagellar system of Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) with regard to its function as a probiotic N2 - Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) gehört zu den am besten untersuchten und charakterisierten probiotischen Bakterienstämmen. Seit Beginn des letzten Jahrhunderts wird er als Medikament eingesetzt, um verschiedene Darmerkrankungen wie z.B. Diarrhöe, entzündliche Darmerkrankungen und Verstopfung zu behandeln. Die Flagelle des EcN vermittelt Beweglichkeit und kann die Produktion von humanem β-Defensin 2 (hBD2) durch Epithelzellen induzieren. Somit ist dieses Organell direkt in die probiotische Funktion des EcN involviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Flagellen anderer Bakterien, wie z.B. dem probiotischen Stamm Bacillus cereus CH oder den pathogenen Stämmen Pseudomonas aeruginosa und Clostridium difficile, die Adhäsion an intestinalen Mucus, welcher von Epithelzellen sekretiert wird, vermitteln. Allerdings blieb unklar, welcher Teil der Flagelle an welche Mucuskomponente bindet. Die Fähigkeit effizient an Wirtgewebe zu adhärieren wird als wichtiges Attribut eines probiotischen Stammes angesehen. Ex vivo Adhäsionsstudien mit Kryoschnitten humaner Darmbiopsien haben gezeigt, dass die Flagelle des EcN in die effiziente Adhäsion an humanes Darmgewebe involviert sein muss. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Funktion der Flagelle des EcN als Adhäsin untersucht. Zunächst wurde die hyperflagellierte Variante EcN ATHF isoliert und durch verschiedene Experimente, z.B. Schwärmagartests und Elektronenmikroskopie, charakterisiert. Weitere ex vivo Adhäsionsstudien mit EcN ATHF zeigten eine höhere Adhäsionseffizienz dieser hyperflagellierten Variante und bestätigten damit die Rolle der Flagelle bei der effizienten Adhäsion von EcN an die Kryoschnitte der humanen Darmbiopsien. Interessanterweise fungierte die Flagelle in in vitro Studien mit den humanen Epithelzellen Caco-2 und T24 nicht als Adhäsin. Diese Unterschiede zwischen den in vitro und ex vivo Studien führten zu der Annahme, dass die Flagelle des EcN in vivo die Adhäsion an Mucus vermittelt, welcher von den Caco-2- und T24-Zellen nicht produziert wird, aber in den Kryoschnitten der Darmbiopsien nachgewiesen wurde. Diese Vermutung wurde durch in vitro Adhäsionsstudien mit der Mucin-produzierenden Epithelzelllinie LS174-T bestätigt, da die Flagellen für eine effektive Adhäsion an diese Zellen essentiell waren. Zudem reduzierte die Präinkubation flagellierter EcN-Stämme mit Mucin2 ihre Adhäsionseffizienz an Kryoschnitte humaner Darmbiopsien. Um die direkte Interaktion zwischen Flagellen des EcN Wildtyps und Mucus zu zeigen, wurde ein ELISA etabliert. Es konnte eine direkte konzentrationsabhängige Interaktion zwischen isolierten Flagellen des EcN Wildtyps und Mucin2, bzw. humanem Mucus (Kolon) beobachtet werden. Interessanterweise konnte keine Interaktion zwischen isolierten Flagellen des EcN Wildtyps und murinem Mucus (Duodenum, Ileum, Caecum, Colon) festgestellt werden. Dies weist darauf hin, dass die Mucuszusammensetzung zwischen verschiedenen Spezies variiert. Verschiedene Kohlenhydrate, welche bekannte Mucusbestandteile sind, wurden auf ihre Interaktion mit der Flagelle von EcN getestet und Gluconat wurde als ein Rezeptor identifiziert. Die Präinkubation isolierter Flagellen mit Gluconat reduzierte ihre Interaktion mit Mucin2, bzw. humanem Mucus signifikant. Zudem wurde die oberflächenexponierte Domäne D3 des Flagellins, der Hauptuntereinheit der Flagelle, als möglicher Interaktionspartner von Mucin2, bzw. humanem Mucus ausgeschlossen. Flagellen, die aus einer Domäne D3 Deletionsmutante isoliert wurden, zeigten sogar eine effizientere Bindung an Mucin2, bzw. humanen Mucus. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Änderungen des pH-Wertes signifikante Effekte auf die Interaktion zwischen Mucus und isolierten Flagellen hatten, vermutlich aufgrund von Konformationsänderungen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Flagelle als neues und scheinbar wichtigstes Adhäsin in vivo für den probiotischen Stamm EcN identifiziert. Hierfür wurden sowohl eine hyperflagellierte Variante, eine ΔfliC Mutante, sowie der dazugehörige komplementierte Stamm verwendet. EcN ist zudem der erste probiotische Stamm für den eine direkte Bindung der Flagellen an humanen Mucus nachgewiesen werden konnte. Die Mucuskomponente Gluconat konnte dabei als wichtiger Rezeptor identifiziert werden. Da einige pathogene Bakterien ihre Flagelle zur Adhäsion an Wirtsgewebe nutzen, könnte dieses Organell EcN dazu befähigen, mit Pathogenen um die erfolgreiche Kolonisierung des Darms zu konkurrieren, was als wichtige Eigenschaft eines Probiotikums betrachtet wird. N2 - Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) is one of the best studied and characterized probiotic bacterial strains. It is in use as a drug since the beginning of last century to treat various diseases and dysfunctions of the human intestinal tract, e.g. diarrhea, inflammatory bowel diseases and obstipation. The flagellum of EcN mediates motility and is able to induce human beta defensin 2 (hBD2) production by epithelial cells. Therefore, this organelle is directly involved in EcN’s probiotic function. It has been shown that the flagella of several other bacteria, including the probiotic strain Bacillus cereus CH or the pathogenic strains Pseudomonas aeruginosa and Clostridium difficile, mediate adhesion to intestinal mucus, which is secreted by epithelial cells. However it remained unclear which part of the flagella binds to which mucus component. The ability to adhere efficiently to host tissue is considered to be an important attribute for a probiotic strain. Ex vivo adhesion studies with cryosections of human gut biopsies have revealed, that the flagellum of EcN must be involved in efficient adhesion to human intestinal tissue. Thus, the function of EcN’s flagellum as an adhesin was investigated in this work. First, the hyperflagellated variant EcN ATHF was isolated and characterized by several experiments, e.g. motility tests and electron microscopy. Further ex vivo adhesion studies with EcN ATHF demonstrated a higher adhesion efficiency of this hyperflagellated variant confirming the role of the flagellum for adhesion of EcN to cryosections of human gut biopsies. Interestingly, EcN’s flagellum did not function as an adhesin in in vitro adhesion studies with the human epithelial cells Caco-2 and T24. These differences between the in vitro and ex vivo studies led to the assumption, that in vivo the flagellum of EcN mediates adhesion to mucus, which is not produced by Caco-2 and T24 cells, but was shown to be present in the cryosections of human gut biopsies. This was confirmed by in vitro adhesion studies with the mucin-producing epithelial cell line LS174-T, as flagella were essential for efficient adhesion to these cells. Furthermore, preincubation of flagellated EcN strains with mucin2 (porcine stomach) reduced their adhesion effiency to cryosections of human gut biopsies. To demonstrate the direct interaction between flagella from EcN wildtype and mucus, an ELISA was established. A direct concentration-dependent interaction between isolated flagella from EcN wildtype and mucin2 as well as human mucus (Colon) could be observed. In contrast, there was no direct interaction between isolated flagella from EcN wildtype and murine mucus (Duodenum, Ileum, Ceacum, Colon), indicating that mucus composition varies among different species. By testing different carbohydrates - known to be constituents of mucus - for their interaction with the flagellum of EcN, gluconate was identified as one receptor. Preincubation of isolated flagella with gluconate significantly reduced their interaction with mucin2 or human mucus. Additionally, the surface exposed domain D3 of flagellin, the major subunit of the flagellum, could be excluded to be responsible for the interaction with mucin2 or human mucus. Flagella, which were isolated from a domain D3 deficient mutant, bound even more efficient to mucin2 as well as to human mucus. Furthermore the change of pH had significant effects on the interaction between mucus and isolated flagella, probably due to conformational changes. In summary, this study identified the flagellum as a novel and apparently major adhesin in vivo of the probiotic EcN by employing a hyperflagellated variant, a ΔfliC mutant as well as the corresponding complemented strain. Additionally, EcN is so far the first probiotic strain, for which it has been shown, that its flagella directly bind to human mucus. Thereby the mucus component gluconate was identified as an important receptor. As some pathogens have been reported to use their flagella for adhesion to human host tissue, this organelle might enable EcN to compete with pathogens for successful colonization of the gut, which has been postulated to be a prerequisite for probiotics. KW - Escherichia coli KW - Probiotikum KW - Geißel KW - Adhäsion KW - Adhärenz KW - E.coli Nissle 1917 KW - Flagelle KW - adhesion KW - E. coli Nissle 1917 KW - flagellum Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74201 ER - TY - THES A1 - Schiller, Roswitha Dorothee T1 - Studien zu Virulenzeigenschaften typischer und atypischer uropathogener Escherichia coli T1 - Studies on virulence properties of typical and atypical uropathogenic Escherichia coli N2 - Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre liefern immer mehr Hinweise darauf, dass eine klare Unterscheidung von Fitness- und Virulenzfaktoren in vielen Fällen, insbesondere bei extraintestinal pathogenen Escherichia coli, nicht möglich ist. So lässt sich auch bei Harnwegsinfektionen verursachenden E. coli den bakteriellen und teils stammspezifischen Faktoren oftmals nicht eindeutig eine typische Virulenz- oder Fitness-assoziierte Funktion zuordnen. Zudem werden in neueren Studien immer häufiger atypische uropathogene Isolate von E. coli beschrieben, die in ihrem „Virulenzrepertoire“ deutlich von typischen uropathogenen E. coli (UPEC) abweichen, da sie keine klassischen UPEC-Virulenzfaktoren aufweisen. In dieser Arbeit wurden daher Virulenzeigenschaften typischer als auch atypischer UPEC untersucht. Der Effekt eines bestimmten bakteriellen Faktors auf den Wirtsorganismus wird teilweise indirekt durch sekundäre Modifikation bedingt. Dies offenbart sich beispielsweise am Autotransporterprotein AIDA-I, dessen Konformation durch posttranslationale Glykosylierung stabilisiert wird, wodurch es seine Funktionalität als Adhäsin erhält. Da bisherige Studien zum AIDA-I homologen Autotransporterprotein Antigen 43 (Ag43) auf der Analyse von künstlich glykosyliertem Protein basieren, lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Untersuchung der natürlichen Glykosylierung von Ag43 in UPEC Stamm 536. Es zeigte sich, dass beide Ag43-Varianten von E. coli Stamm 536 natürlicherweise glykosyliert vorliegen, der Grad der Glykosylierung jedoch wesentlich geringer ausfällt als bei natürlich glykosyliertem AIDA-I. Inwieweit die natürliche Glykosylierung von Ag43 zu dessen Funktionalität beiträgt, kann erst durch die Identifizierung der für die Ag43-Glykosylierung verantwortlichen Glykosyltransferase geklärt werden. Die in silico-Analyse des Genoms von UPEC Stamm 536 für potentielle Glykosyltransferasen von Ag43 lieferte neun Kandidatengene. Die Gene wurde teils im Wildtyp-Hintergrund, teils im rfaH-negativen Hintergrund von E. coli Stamm 536 deletiert und die Mutanten im Anschluss phänotypisch charakterisiert. Die Deletion der Kandidatengene waaF, waaG und waaQ, die für Glykosyltransferasen des LPS-Biosynthesesystems kodieren, führte zu den deutlichsten Unterschieden in Bezug auf Motilität, Curli/Zellulose-Produktion, Hämolyseaktivität und Expression von Typ 1 Fimbrien. Der Einfluss des „knock-out“ der Kandidatengene auf die Glykosylierung von Ag43 muss in weiterführenden Studien untersucht werden. Zur Charakterisierung des uropathogenen Virulenzpotentials verschiedener E. coli Stämme in vivo hat sich in den letzten Jahren das murine Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion etabliert. Mit Hilfe dieses Modells wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl spezifische Deletionsmutanten prototypischer UPEC als auch atypische E. coli Harnwegsisolate bezüglich ihrer Urovirulenz getestet und verglichen. Bei der Untersuchung der klassischen UPEC lag der Fokus auf der möglichen Urovirulenzmodulation durch die folgenden spezifischen Faktoren: dem Autotransporterprotein Ag43, dem „Response regulator“ UvrY, dem Polyketid Colibactin sowie dem Exopolysaccharid poly-β-1,6-N-Acetylglucosamin (PGA). Für Ag43 war bei der Etablierung einer Harnwegsinfektion keine eindeutige Funktion feststellbar. Es ist jedoch denkbar, dass Ag43 zur Langzeitpersistenz im Harnwegstrakt beitragen kann, was in weiteren Studien belegt werden sollte. Die Expression von UvrY in der natürlichen uvrY-Deletionsmutante UPEC Stamm 536 ließ keine Erhöhung des Urovirulenzpotentials im Mausmodell erkennen. In diesem Zusammenhang konnte allerdings gezeigt werden, dass die Expression des Genotoxins Colibactin in UPEC Stamm 536 dessen Virulenz signifikant herabsetzte. Die Untersuchungen zur Relevanz des Exopolysaccharids PGA belegen deutlich, dass PGA für die Langzeitpersistenz von E. coli im murinen Harnwegstrakt benötigt wird. Für die initiale Kolonisierung scheint PGA hingegen keine Bedeutung zu haben. Für atypische UPEC Isolate, die Charakteristika von STEC und EAEC zeigen und sich in ihrem Virulenzmuster deutlich von prototypischen UPEC unterscheiden, ließ sich im murinen Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion, verglichen mit dem UPEC Modellorganismus 536, ein ähnliches, teils sogar erhöhtes uropathogenes Virulenzpotential nachweisen. Die Ergebnisse der Arbeit untermauern somit die heutige Vorstellung bezüglich der Entwicklung und Etablierung einer Harnwegsinfektion, dass verschiedene E. coli Stämme unterschiedliche (Kontroll-) Mechanismen entwickelt haben, um erfolgreich den Harnwegstrakt kolonisieren und eine Infektion auslösen zu können. Zudem weisen sie darauf hin, dass diese Fähigkeit nicht auf Isolate typischer phylogenetischer UPEC Entwicklungslinien beschränkt und auf das Vorhandensein charakteristischer UPEC Virulenzfaktoren angewiesen ist. N2 - Research findings over the last years indicate that in many cases, including extraintestinal pathogenic Escherichia coli, a clear distinction between fitness and virulence factors is not possible. Accordingly, the classical distinction of often strain-specific virulence- and fitness-related traits of uropathogenic E. coli (UPEC) can often not be made. Furthermore, recent studies describe atypical UPEC isolates. These isolates remarkably differ in their “virulence repertoire” compared to typical UPEC, because they lack classical UPEC-related virulence factors. Therefore, the aim of the present study was the investigation of virulence properties of typical as well as atypical UPEC strains. The effect of a certain bacterial factor upon the host organism is in part indirectly influenced by secondary modifications. For instance, the conformation of the autotransporter protein AIDA-I is stabilized by posttranslational glycosylation which in turn confers its functionality as an adhesin. Prior studies on the AIDA-I homologous autotransporter protein antigen 43 (Ag43) are based on the analysis of the artificially glycosylated protein. Thus, a key aspect of the current work was to elucidate the naturally occurring glycosylation of Ag43 in UPEC strain 536. For both Ag43 variants of E. coli 536 natural glycosylation was detected. However, Ag43 was less glycosylated than naturally glycosylated AIDA-I. The future identification of the glycosyltransferase responsible for natural glycosylation of Ag43 will help to determine the impact of this posttranslational modification on the functionality of Ag43. In silico analysis of the UPEC strain 536 genome regarding potential glycosyltransferases of Ag43 revealed nine candidate genes. Corresponding deletion mutants of the identified genes were constructed in part in the wild type strain background and in part in the rfaH-negative background of UPEC 536. The most prominent differences concerning motility, curli/cellulose production, hemolytic activity and expression of type 1 fimbriae were observed upon deletion of the genes waaF, waaG or waaQ coding for glycosyltransferases of the LPS biosynthesis pathway. The impact of the deleted candidate genes on the glycosylation of Ag43 has to be further investigated. In recent years the murine model of ascending urinary tract infection was established to characterize the uropathogenic potential of E. coli strains in vivo. By means of this model the uropathogenic potential of different specific “knock-out” mutants of prototypic UPEC strains as well as of atypical E. coli urinary tract isolates was tested and compared. The analysis of the impact of specific factors on the uropathogenic potential of classical UPEC strains focused on the autotransporter protein Ag43, the response regulator UvrY, the genotoxin colibactin, and the exopolysaccharide poly-β-1,6-N-acetylglucosamine (PGA). Ag43 did not exhibit a distinct function during the establishment of urinary tract infection in mice. However, it is conceivable that Ag43 can contribute to long-term persistence in the urinary tract, which should be covered in further studies. Expression of UvrY in the natural uvrY-negative UPEC strain 536 did not increase the uropathogenic potential. However, expression of the genotoxin colibactin significantly reduced the urovirulence of UPEC strain 536. The exopolysaccharide PGA was shown to contribute to long-term persistence of UPEC in the murine model of urinary tract infection. For the initial colonization of the urinary tract, PGA seems to be dispensable. The atypical UPEC isolates investigated in this study display typical characteristics of STEC and EAEC and differ significantly in their virulence gene content compared to prototypic UPEC strains. Nevertheless, in the murine model of ascending UTI many atypical UPEC isolates exhibited a comparable and sometimes even increased uropathogenic potential relative to UPEC model strain 536. The results of this work support the current idea regarding the development and establishment of a urinary tract infection that different E. coli strains have evolved diverse (control-) mechanisms to successfully colonize the urinary tract and provoke an infection. In addition, the findings point out that the ability to cause a urinary tract infection is not limited to phylogenetic lineages of classical UPEC isolates and the presence of characteristic UPEC virulence traits. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektion KW - Glykosylierung KW - UPEC KW - Autotransporterprotein KW - Glykosyltransferase KW - murines Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103907 ER - TY - THES A1 - Rund, Stefan A. T1 - Interferenz des probiotischen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 mit Adhäsion, Replikation und Shiga Toxin Produktion von EHEC Stämmen in vitro T1 - Interference of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 with adhesion, replication and Shiga toxin production of EHEC strains in vitro N2 - E. coli Nissle 1917 (EcN) zählt durch seine fast hundertjährige Nutzung als Arzneimittel und aufgrund der weitreichenden Forschung während der letzten Jahrzehnte mittlerweile zu einem der am besten untersuchten Probiotika. EcN wird als Medikament zur Remissionserhaltung von Patienten mit Kolitis, bei chronischer Verstopfung und bei Durchfall von Kleinkindern eingesetzt. Der enteroaggregative – hämorrhagische - E. coli (EAHEC) mit dem Serotyp O104:H4 war 2011 in Deutschland für den bisher größten EHEC-Ausbruch seit Beginn der Aufzeichnungen verantwortlich. Es fehlt bis zum heutigen Tage immer noch an effektiven Möglichkeiten einer Infektionsprophylaxe oder einer Behandlung der Erkrankung. Ein alternatives Therapeutikum wird daher dringend benötigt. In dieser Arbeit wurden die antagonistischen Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme wie dem EHEC Stamm EDL933 oder klinischen EAHEC O104:H4 Isolaten untersucht. Es wurden die Auswirkungen von EcN auf die Adhäsion an humane Epithelzellen, das Wachstum und die Shiga Toxin Produktion der pathogenen Stämme untersucht. Zusätzlich wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen nachgewiesen. Zunächst wurde die Adhäsionseffizienz der verschiedenen E. coli Stämme bestimmt. Der am schlechtesten an die humanen Epithelzelllinien Caco-2 und LS-174T adhärierende Stamm war EcN. Dies ist insofern überraschend, da von Probiotika erwartet wird, besser als Pathogene an Epithelzellen zu adhärieren. Dem ungeachtet konnte jedoch gezeigt werden, dass EcN die Adhäsion von zwei EAHEC O104:H4 Isolaten, des nahe verwandten enteroaggregativen E. coli (EAEC) Stammes 55989 und des enterohämorrhagischen (EHEC) E. coli Stammes O157:H7 EDL933 an beide Zelllinen hemmt. Die von EcN produzierten Mikrozine M und H47 konnten hier für einen Teil des beobachteten anti-adhäsiven Effektes von EcN auf die pathogenen E. coli Stämme verantwortlich gemacht werden. Die Mikrozine wurden hier als einzige Substanz, die das Wachstum der pathogenen E. coli Stämme beeinflusst, identifiziert. Einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von EAHEC und EHEC Stämmen ist das Shiga Toxin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EcN die Shiga Toxin Produktion der am häufigsten auftretenden EHEC Stämme (´Big Five´: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) und der klinischen Isolate von EAHEC O104:H4 im Zellkulturmedium DMEM hemmt. Auffällig war, dass die Stx1 Produktion von EHEC O103:H2 und O111:H- nicht nur von EcN, sondern auch von E. coli K-12 Stamm MG1655, gehemmt wurde, im Gegensatz zur EcN-spezifischen Blockierung der Stx2-Produktion in den Serotypen O104:H4, O26:H11, O145:H25. Die Reduktion der Stx-Produktion in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, sowie EHEC O26:H11 war zum Teil von der Mikrozinproduktion abhängig. Diese hatte jedoch keinen Einfluss auf die Stx-Produktion in EHEC O157:H7 EDL933 und EHEC O145:H25. Bei Verwendung von LB-Medium zeigte sich im Gegensatz zum DMEM-Medium keine Mikrozin-Abhängigkeit der Toxinproduktion bei den EAHEC Isolaten TY3730 und TY3456. Die Toxinproduktion von EHEC EDL933 wurde ebenfalls nicht durch die Deletion der Mikrozin-Gene in EcN beeinflusst. Studien der Toxinproduktion in SCEM-Medium zeigten ebenfalls eine EcN-Dosisabhängige Reduktion der Stx-Produktion in Co-Kultur. Um den Mechanismus der Hemmung der Stx-Produktion zu untersuchen, wurden Versuche mit der EcN-Mutante EcN::luxS durchgeführt. Diese Deletion des AI-2 ´Quorum sensing´ Moleküls in EcN hatte allerdings keinen Einfluss auf die Hemmung der Stx-Produktion. Der Einsatz von Acetat führte, im Gegensatz zu publizierten Ergebnissen, nicht zu einer Reduktion der Stx-Produktion. Auch eine Beeinflussung der Lyse der EHEC-Bakterien, oder der Verminderung der Sekretion von Shiga Toxin durch EcN, konnte widerlegt werden. Zur Untersuchung der Stx-Expression wurde ein Assay mit einem biolumineszenten C-P (Chromosom-Plasmid) Reporter System etabliert. Damit konnte die Shiga Toxin Expression im Stammhintergrund EHEC EDL933 in Echtzeit untersucht werden. Hier wurde wiederum eine Reduktion der Shiga Toxin Expression in Co-Kultur mit EcN erfolgreich nachgewiesen. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass EcN nicht nur die Shiga Toxin Produktion von nicht-induzierten EAHEC Bakterien, sondern auch in mit Mitomycin C induzierten Bakterien hemmt. Als wichtiger Sicherheitsaspekt einer Behandlung mit EcN wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen untersucht. Die Infektion der Bakterien wurde hierbei mit stx-spezifischer PCR, Phagen-Plaque-Assay, Stx-ELISA und K+-Efflux Assay untersucht. Es konnte durch diese verschiedenen Methoden erfolgreich gezeigt werden, dass EcN nicht durch Shiga Toxin Phagen infiziert wird. Als möglicher Resistenzmechanismus kommt hier eine Mutation vom Phagenrezeptor LamB in Frage, was jedoch noch bestätigt werden muss. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wichtige antagonistische Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme untersucht, die als Grundlage von neuen und dringend benötigten Behandlungen von EHEC-Infektionen dienen können. N2 - Due to extensive studies in the last decades and its centennial application as a pharmaceutical, E. coli Nissle 1917 (EcN) is among the best characterized probiotics. EcN is used as remedy for remission maintenance of ulcerative colitis, chronic obstipation and diarrhea in children. The enteroaggregative – haemorrhagic - E. coli (EAHEC) strain O104:H4 was responisible for one of the biggest outbreaks of EHEC recorded so far, that took place in Germany in 2011. Currently, there is no effective prophylaxis or treatment available for EHEC infections in humans. Therefore, alternative therapeutics are desperately needed. The antagonistic effects of EcN on pathogenic E. coli strains like the EHEC O157:H7 strain EDL933 or clinical isolates of EAHEC O104:H4 were investigated in this study. The influence of EcN on adhesion to human epithelial cell lines, the growth and the Shiga toxin production of pathogenic strains were analysed. Furthermore, the resistence of EcN against Shiga toxin phages was proven. Initially, the adhesion efficiency of EcN and pathogenic E. coli strains were determined in monocultures. EcN showed the lowest number of adhering bacteria to Caco-2 and LS-174T cells. This was insofar surprising, since probiotics are expected to adhere more efficiently to epithelial cells than pathogens. Regardless of this fact, it could be shown that EcN is inhibiting the adhesion of two EAHEC O104:H4 isolates, the closely related EAEC strain 55989 and the EHEC O157:H7 strain EDL933 to both cell lines. The microzins M and H47, which are produced by EcN, can be held responsible for a fraction of the observed anti-adhesive effect of EcN. The Microzins were also identified as the only substance that was influencing the growth of the pathogenic E. coli strains. One of the most important virulence factors of EHEC and EAHEC strains is Shiga toxin. In this study could be shown, that EcN is inhibiting the Shiga toxin production of the most common EHEC strains (big five: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) and two clinical isolates of EAHEC O104:H4 in the cell culture medium DMEM. Interesingly, the Shiga toxin 1 production of EHEC O103:H2 and O111:H- was not only reduced by EcN, but also the E. coli K-12 strain MG1655. In contrast, the Stx2 production of the serotypes O104:H4, O26:H11, O145:H25 was only blocked by EcN. The reduction of the Shiga toxin production in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, as well as EHEC O26:H11 was partly dependent on the microcin production of EcN. No influence of microzins on the Stx production of EHEC O157:H7 EDL933 and EHEC O145:H25 was detected. When using LB-medium instead of DMEM-medium, no influence of microzin on the Shiga toxin production of neither EAHEC TY3730 and TY3456, nor EHEC EDL933 could be shown. Experiments with SCEM-medium also resulted in an EcN-dose-dependent inhibition of Shiga toxin production of pathogenic E. coli strains in co-culture with EcN. In order to investigate the mechanism responsible for the observed effects, the EcN mutant EcN::luxS was used in co-culture experiments. However, the deletion of the quorum sensing molecule AI-2 in EcN::luxS had no influence on the Stx production. Using acetate in the experiments did not, in contrast to published results, lead to a reduction of Shiga toxin production. In addition, an influence of EcN on lysis of EHEC strains or the secretion of Shiga toxin could be ruled out. To study the Shiga toxin expression an assay with a bioluminescent C-P (chromosome-plasmid) reporter system was successfully established. Here, Shiga toxin expression could be monitored in real time with the strain background EHEC EDL933. Moreover, a reduction of Shiga toxin expression in co-culture with EcN could be detected. In further experiments could be shown, that EcN is not only reducing the Shiga toxin production in uninduced bacteria, but also in the Mitomycin C induced EAHEC O104:H4 strain TY3730. An important safety issue, in order to use EcN as a pharmaceutical against EHEC strains, is the resistance of EcN against Shiga toxin phages. The infection of bacteria was here investigated with phage plaque assay, stx-PCR, Stx-ELISA and K+-efflux assay. With these different methods could be successfully shown, that EcN is not infected by the tested Shiga toxin phages. A mutation in the phage receptor LamB could be a possible, but still unconfirmed, phage resistance mechanism of EcN. In summary, this study showed important antagonistic effects of EcN against pathogenic E. coli strains, which could be the foundation of new and desperately needed treatment options of EHEC infections. KW - EHEC KW - Probiotikum KW - Escherichia coli KW - E. coli Nissle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104837 ER - TY - THES A1 - Reidl, Sebastian T1 - Funktionale Charakterisierung an der Biofilmbildung beteiligter Faktoren pathogener und kommensaler Escherichia coli T1 - Functional characterization of biofilm-associated traits of pathogenic and commensal Escherichia coli N2 - Multizelluläre Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. Häufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizelluläre Lebensweise von humanpathogenen Erregern zurückführen. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-Stämme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazelluläre polymere Substanzen, Adhäsine oder Oberflächen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft trägt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder ähnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Hierfür wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adhäsin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 ΔfimΔflu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypstämmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zusätzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah (‘Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase’) durchgeführt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladhäsionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I (‘Adhesin Involved in Diffuse Adherence’) enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte für Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adhäsin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalität des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante führte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinitäten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazität des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Domänen anderer Autotransporter auf. Für viele dieser Proteine konnte bereits eine adhäsive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine mögliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollständig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde für Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellulären Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erhöhter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint für die Funktionalität von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen ermöglicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur für die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abhängigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen. N2 - Bacteria living in multicellular communities, i.e. biofilms, have evolved into a major health problem. Most chronic or recurrent diseases including nosocomial infections can be traced back to the multicellular lifestyle of pathogenic agents. Both facultative and obligate pathogenic strains of Escherichia coli express a multitude of diverse factors contributing to biofilm formation like flagella, extracellular polymeric substances, adhesins, or surface-exposed proteins, e.g. autotransporters. This work presents the functional characterization of the surface-associated protein antigen 43 (Ag43). Due to its autoaggregating phenotype, Ag43 is also involved in the formation of microcolonies and biofilms. Antigen 43 represents an autotransporter protein frequently expressed by all Escherichia coli pathotypes. Interestingly, many E. coli isolates encode multiple identical or orthologous copies of agn43 which are usually associated with mobile genetic elements (genomic islands, plasmids). Here, the antigen 43 variants of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strain 536 (O6:K15:H31), commensal isolate E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1), and E. coli K-12 strain MG1655 (OR:H48:K-) have been analyzed. For this purpose, the different agn43-alleles were cloned into a capable vector system and subsequently expressed in Escherichia coli K-12 strain MG1655 ΔfimΔflu lacking the genes encoding type 1-fimbrial adhesins (fim) and antigen 43 (flu). Due to the occurrence of posttranslational glycosylation of Ag43 in wild type strains, experiments were additionally carried out upon co-expression of the heterologous AIDA-I-specific heptosyl transferase Aah (Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase). On the basis of binding studies (intermolecular autoaggregation, adhesion to eukaryotic cells) individual properties could be detected for each Ag43-variant. However, compared to AIDA-I (Adhesin Involved in Diffuse Adherence) of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains, antigen 43 was shown to act as a weak adhesin. Additionally, O-glycosylation partly influenced protein functions. Depending on the variant tested, posttranslational modification by Aah either resulted in significantly reduced affinities or had no effect on the binding capacity of Ag43. Furthermore, antigen 43 exhibits structural homologies compared to certain domains of related autotransporters. For many of these proteins, an adhesion- or invasion-mediating function could be demonstrated. To date, the interaction of Ag43 with a putative eukaryotic receptor has not been determined, yet. Here, it is shown for the first time that antigen 43 specifically binds to components of the extracellular matrix. Overlay assays and ELISAs identified collagen and laminin as epithelial receptors for Ag43. Taken together, the results obtained in this study confirm the functional role of antigen 43 in biofilm formation as well as its effect during bacterial colonization of epithelial tissues. Expression of the Escherichia coli-specific autotransporter protein is directly correlated to the improved fitness of bacteria infecting the human host. Aah-mediated O-glycosylation seems not to be strictly required for the function of Ag43. The second aim of this work was the design and development of a test system which can be used for the differentiation of (uro-)pathogenic microorganisms in biofilms. For this purpose, the FISH (Fluorescence-in-situ-Hybridization)-technique has been optimized for diagnostic applications. Depending on the specimen, the protocol can also be adapted to the analysis of (multispecies) biofilms. KW - Escherichia coli KW - Biofilm KW - Adhäsine KW - Glykosylierung KW - Extrazelluläre Matrix KW - Kollagen KW - Laminin KW - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung KW - Katheter KW - Autotransporterprotein KW - Fitneßfaktor KW - autotransporter protein KW - fitness factor Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35684 ER - TY - THES A1 - Reichardt, Elisabeth T1 - Untersuchungen zur Verbreitung von Virulenzfaktoren extraintestinal pathogener Escherichia coli-Stämme bei Isolaten boviner Mastitiden T1 - Studies on the spread of virulence factors of extra intestinal Pathogenic Escherichia coli strains in isolates of bovine Mastitiden N2 - In dieser Arbeit werden die Ergebnisse der molekular-epidemiologischen Analyse von Virulenzgenen im Genom von insgesamt 222 Escherichia coli (E. coli)-Isolaten dargestellt, die von Mastitis-Fällen bei Rindern isoliert wurden. Mit Hilfe der Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion wurde die Verbreitung von 42 potentiellen Virulenzfaktor-Genen extraintestinal pathogener E. coli (ExPEC) analysiert. Neben der quantitativen Bestimmung des Vorkommens jedes Einzelgens wurde in dieser Arbeit eine differenzierte Auswertung von Genkombinationen bei E. coli Mastitis-Isolaten vorgenommen. Diese ermittelten genetischen Muster werden zur 1. Prävalenz der in der Gesamtheit der Isolate, 2. Prävalenz in den phylogenetischen ECOR-Gruppen, 3. akut klinischen und chronischen Mastitis-Episoden und 4. dem Vorkommen spezifisch tierpathogener Adhäsine korreliert. Die Mastitis-Isolate konnten aufgrund der Virulenzmarkerverteilung und Phylogenie keinem bestimmten charakteristischen Pathotyp zugeordnet werden. Die überwiegende Mehrzahl der Mastitis-Isolate zeigte aufgrund einer geringen Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene sowie der Zugehörigkeit zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A und B1 ein geringes Virulenzpotential extraintestinal pathogener E. coli. Die Mehrzahl der Stämme enthielt eine singuläre Virulenzdeterminante (83 Stämme; 37,4 %), eine Zweierkombination (69 Stämme; 31,1 %) oder eine Dreierkombination von Virulenzgenen (34 Stämme; 15,3 %). Vier Gene für Virulenzfaktoren in Kombination zeigten sich lediglich in sieben Stämmen (3,1 %). Insbesondere die Anwesenheit von 5 bis 18 differenten Virulenzgenen pro Genom traten nur mit einer geringen Frequenz in zusammen 16 Isolaten (7,2 %) auf. Das absolut häufigste Virulenz-assoziierte Gen, das nachgewiesen wurde, war fimH, das für die mannosespezifische Adhäsinuntereinheit der Typ1-Fimbrien kodiert. Insgesamt gaben 88,7 % aller 222 untersuchten Stämme ein positives Signal in der Multiplex-PCR, und zwar 89,9 % der 199 klinischen Isolate sowie 85,7 % der Isolate chronischer Mastitiden. In etwa der Hälfte aller untersuchten Stämme trat auch das Gen traT auf, das Serumresistenz vermittelt (43,7 %). Die Genkombination fimH-traT wurde in wechselnden Konstellationen in insgesamt 83 Stämmen (37,3 %) gefunden. Sie ist damit die häufigste Virulenzgenkombination in den untersuchten E. coli-Genomen mit multiplen Virulenzdeterminanten. Da bei Rinder-Mastitis besonders in den schweren Fällen systemische Verläufe fördernde Faktoren wie Serumresistenz eine bedeutende Rolle spielen, könnte hier eine Selektion auf genetische Kopplung von traT mit fimH vorliegen. Deutlich geringere Prävalenzen wiesen die Virulenzgene für α-Hämolysin (hlyA, 10,8 %), den Yersiniabactinrezeptor (fyuA, 12,2 %) sowie das ebenfalls an der Serumresistenz beteiligte Gen iss (8,5 %) auf. Nur 13 (5,8 %) der 222 E. coli-Isolate besaßen keines der untersuchten Virulenzgene. Das Fehlen bekannter Virulenzgene in diesen Stämmen deutet darauf hin, dass weitere unberücksichtigte Faktoren eine Rolle bei der Virulenz von Mastitisisolaten spielen könnten oder der Status des Wirtsorganismus in diesen Fällen ausschlaggebend für eine erfolgreiche Infektion des Euters sein könnte. Offensichtlich sind die meisten der untersuchten E. coli- Virulenzfaktoren für die Pathogenese der Rindermastitis von untergeordneter Bedeutung. Von den 222 Isolaten zählten insgesamt 137 Stämme zur phylogenetischen Linie (ECOR-Gruppe) A, 62 zur ECOR-Gruppe B1, 20 zur ECOR-Gruppe B2 und 14 zur Gruppe D. Die Stämme, die zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A, B1 und D gehören, unterschieden sich hinsichtlich der Prävalenz der Virulenzfaktormuster nicht vom Gesamtbild. Lediglich Isolate der ECOR-Gruppe B2 wiesen eine für sie typische Häufung von Virulenzgenclustern auf. Das relativ geringe Vorkommen bzw. weitgehende Fehlen (5 von 8) von Adhäsingenen spezifisch tierpathogener E. coli lässt darauf schließen, dass bislang beschriebenen Rinder-pathogenen E. coli keine Bedeutung als Verursacher einer Rindermastitis zukommt. Für die Analyse der chronischen Verlaufsform der Mastitis standen nur 21 Isolate zur Verfügung, die keinen hinreichend gesicherten Vergleich zu den Fällen mit akuter klinischer Mastitis (199 Stämme insgesamt) erlauben. Die auffällige Zunahme des Hämolysingens hlyA (23,8 %) gegenüber 9,5 % in den klinischen Isolaten (und 10,8 % in allen Stämmen) müsste in künftigen Untersuchungen invasiven Verhaltens der ExPEC beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass eine bovine Mastitis durch verschiedene E. coli-Varianten hervorgerufen werden kann und ein großes Potential extraintestinaler Virulenzfaktoren dazu nicht erforderlich ist. Entscheidend ist eine durch das fimH-Gen vermittelte Adhäsion, in der Hälfte der untersuchten Fälle unterstützt durch das Serumresistenz vermittelnde Gen traT. N2 - Studies on the spread of virulence factors of extra intestinal Pathogenic Escherichia coli strains in isolates of bovine Mastitiden KW - Escherichia coli KW - Escherichia coli-Stämme KW - extraintestinal pathogener E. coli KW - Virulenzfaktoren KW - Mastitis KW - Escherichia coli strains Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53884 ER - TY - THES A1 - Piechaczek, Katharine T1 - Untersuchungen zum Einfluß der Pathogenitätsinseln I536 und II536 auf die Genexpression des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 T1 - Studies on the influence of the pathogenicity islands I536 and II536 on the gene expression of the gene expression of the uropathogenic Escherichia coli strain 536 N2 - Escherichia coli wird als der häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit auslösen zu können, benötigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen Stämmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-Hämolysin, die Adhäsine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Ausprägung der Virulenz hängt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenitätsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 führt zum Verlust der Virulenz und zur Zerstörung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilität und die Enterobaktin- und a-Hämolysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenitätsinseln I536 und II536 für die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zunächst eine Proteomanalyse durchgeführt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von präparativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kulturüberstandsfraktionen der untersuchten Stämme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen Stämme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgeführt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten Stämmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abhängiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in ähnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenität wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren überprüft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgeführt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden. N2 - Escherichia coli is one of the common causes of urinary tract infections. Pathogenic E. coli differ from non-pathogenic E. coli variants by the presence of certain virulence factors which contribute to their ability to cause disease. The uropathogenic E. coli strain 536 (O6:K15:H31) is able to produce different virulence factors such as a-hemolysin, fimbrial adhesins (P-, type 1 and S-fimbriae) and specific capsules. Furthermore the bacteria produce iron uptake systems like enterobactin and yersiniabactin and have the capacity to survive in human serum. The development of pathogenicity is connected to pathogenicity islands (PAI I536-V536). All four PAIs are associated with tRNA genes. The deletion of PAI I536 and PAI II536 results in the truncation of the associated tRNA gene and loss of virulence. The deletion of PAI II536 results in the truncation of the leuX gene. PAI II536 as well as leuX deletion mutants show a reduced production of type 1 fimbriae, flagellae and of the iron uptake system enterobactin. Furthermore, they show delayed hemolysin production and a reduced serum resistance. Additionally, the leuX-encoded tRNA5Leu may also regulate the expression of various other genes. The aim of this work was the further characterization and analysis of the role of PAI I536/II536 and of the tRNA5Leu for protein expression as well as for the regulation and expression of two site-specific recombinases, FimB and FimE, of the E. coli strain 536. Firstly, the protein expression patterns of E. coli 536 and different derivatives were studied. Differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536, its mutants 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) and strain 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. With the help of preparative 2 D-gel electrophoresis 39 differentially expressed intracellular proteins could be identified. The identities of 37 proteins have been determined by MALDI-TOF mass spectrometry in Halle. Two of these proteins show no matches in sequence databases. The preparations of the culture supernatants resulted in 2 D proteinpatterns from which three protein spots whose expression is markedly altered in the different strains are identified. The influence of the tRNA5Leu on the expression of outer membrane proteins was also studied. Differences in the protein expression patterns of the wild-type strain 536 and the mutants were analyzed by one- and two-dimensional gel electrophoresis. The analysis of 2 D protein patterns of outer membrane preparation resulted in the detection of some proteinspots whose expression was altered in the different strain backgrounds. It was identified during the proteom analysis that tha expression of the YgaG protein was shown to be reduced in a leuX-negative background. This protein shows a strong homology to the LuxS protein of Vibrio harveyi. The LuxS protein is a component of the quorum sensing system. It has been shown that many bacteria express proteins similar to LuxS of V. harveyi and that quorum sensing may play a role in pathogenicity. To investigate whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli strain 536, a ygaG deletion mutant was made. In addition, differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536 and the ygaG mutant were analyzed by 2 D gel electrophoresis. Whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli Strain 536 has not be investigated. In order to get a deeper insight into the role of the tRNA5Leu as a potential regulator of the expression of the typ 1-fimbriae, a transcriptional fusion between the promotor area of fimB and fimE and the lacZ gene lacking its own promotor was constructed. However the transcription of fimB and fimE did not show any significant differences between the wild-type strain 536 and the leuX-mutant 536D102. KW - Escherichia coli KW - Harnwegskrankheit KW - Virulenzfaktor KW - Proteom KW - Proteom KW - Pathogenitätsinseln KW - leuX-tRNA KW - uropathogener E. coli Stamm 536 KW - Proteomics KW - Pathogenicity islands KW - leuX-tRNA KW - uropathogenic E. coli strain 536 Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1862 ER - TY - THES A1 - Oswald, Sibylle T1 - Molekularbiologische Untersuchungen des probiotischen Escherichia coli Stammes DSM 6601 und Entwicklung der stammeigenen Plasmide als Klonierungsvektoren T1 - Molecular investigations of the probiotic Escherichia coli strain DSM 6601 and development of the indigenous plasmids as cloning vectors N2 - Der apathogene E. coli Stamm DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) kann als Modellorganismus für die Verwendung eines kommensalen Gram-negativen Bakterienstammes als Probiotikum angesehen werden. Dieser E. coli Stamm wurde intensiv erforscht und seine Eigenschaften sind daher gut charakterisiert. Der probiotische Charakter dieses Bakterienstammes ist auf gute Kolonisierungseigenschaften des menschlichen Darms, immunmodulatorische Effekte und antagonistische Wirkungen zurückzuführen. Der E. coli Stamm DSM 6601 wird seit einigen Jahrzehnten zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt und seine therapeutische Wirksamkeit ist wissenschaftlich bewiesen. Daher eignet sich dieser Stamm als Modellstamm für die Entwicklung eines bakteriellen Lebendvektors, der für mukosale Immunisierungen oder die zielgerichtete Lieferung von therapeutischen Molekülen in den Darm eingesetzt werden könnte. Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der kryptischen Plasmide pMUT1 und pMUT2 des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 durch Analyse der DNA-Sequenz. Die Analyse ergab, dass das Plasmid pMUT1 ein Replikationssystem vom ColE1-Typ, ein Mobilisierungssystem sowie eine Stabilitätsregion enthält, während das Plasmid pMUT2 ein ColE2-ähnliches Replikationssystem und ein anderes Mobilisierungssystem besitzt. In beiden Plasmiden konnten keine weiteren offenen Leserahmen mit bekannter Funktion identifiziert werden. Des Weiteren wurde ein spezifisches PCR-Nachweissystem für den E. coli Stamm DSM 6601 etabliert, das auf einer Methode zur direkten DNA-Isolierung aus Stuhlproben und einem optimierten PCR-Protokoll für auf den kryptischen Plasmiden basierende Primerkombinationen beruht. Dadurch konnte eine Sensitivität von 10(3)-10(4) Bakterien/0,1 g Stuhl erreicht werden, die vergleichbar mit den Nachweisgrenzen anderer beschriebener PCR-Nachweissysteme ist. Durch Analysen von Patientenstuhlproben wurde die Spezifität und der diagnostische Nutzen dieses PCR-Nachweissystems bestätigt. Darüber hinaus wurde eine plasmidfreie Variante des E. coli Stammes DSM 6601 hergestellt. Durch funktionelle Untersuchungen dieses Stammes konnten keine Unterschiede im Vergleich zu dem Wildtyp festgestellt werden, wodurch eine mögliche Funktion der beiden kryptischen Plasmide weiterhin unklar bleibt. Diese plasmidfreie Variante kann als Lebendvektor für rekombinante Plasmide auf Basis der Plasmide pMUT1 und pMUT2 verwendet werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601. Durch Integration von Antibiotika-Resistenzkassetten in die Plasmide pMUT1 und pMUT2 wurden Klonierungsvektoren konstruiert, die auch nach Insertion weiterer DNA-Fragmente ohne Antibiotika-Selektionsdruck stabil in diesem Stamm beibehalten werden. Zusätzlich wurde durch die stabile Expression von fluoreszierenden Proteinen ein visuelles Nachweissystem etabliert, das bei in vivo Experimenten verwendet werden kann. Dadurch wird die Möglichkeit geboten, Erkenntnisse über Kolonisierungseigenschaften sowie Interaktionen des E. coli Stammes DSM 6601 mit endogenen Mikroorganismen und Zellen des Darmimmunsystems zu erlangen, was zur Aufklärung der Wirkungsweise dieses Stammes beitragen könnte. Im Hinblick auf die Entwicklung eines Lebendvakzins auf der Basis des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 wurden Adhäsine von humanpathogenen enterohämorrhagischen E. coli und von tierpathogenen enterotoxischen E. coli in diesem Stamm exprimiert. Bei ersten Immunisierungsversuchen in Mäusen konnte jedoch keine Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen diese Adhäsine nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des E. coli Stammes DSM 6601 auf die Invasivität von Salmonellen in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Typ 1- und F1C-Fimbrien keine Rolle bei dem inhibitorischen Effekt in vitro spielen und dass durch diesen E. coli Stamm in konventionellen Mäusen keine inhibitorischen Wirkungen nachzuweisen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden durch die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren und die Etablierung von Nachweissystemen für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601 die Grundlage für den Einsatz dieses Stammes als Lebendvektor und für in vivo Untersuchungen, die zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieses Stammes beitragen könnten. N2 - The nonpathogenic E. coli strain DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) can be considered as model organism for the employment of a commensal Gram-negative bacterial strain as a probiotic. This E. coli strain has been intensively investigated and therefore its properties are well characterized. The probiotic character of this strain is due to excellent colonization properties of the human gut, immunomodulatory effects and antagonistic activities. The E. coli strain DSM 6601 has been used for decades for the treatment of various gastrointestinal diseases and its therapeutic efficacy is scientifically proved. Therefore, this strain is suited as a model strain for the development of a bacterial live vector, which might be used for mucosal immunization or localized delivery of therapeutic molecules into the intestine. One major aim of this work was the characterization of the cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2 of probiotic E. coli strain DSM 6601 by DNA sequence analysis. The analysis showed that plasmid pMUT1 carries a replication system of ColE1-type, a mobilization system as well as a stabilization region, whereas plasmid pMUT2 contains a ColE2-like replication system and another mobilization system. Further open reading frames with known function were not identified in both plasmids. Furthermore, a specific PCR detection system for E. coli strain DSM 6601 was established, which uses a method for direct isolation of DNA from faecal samples and an optimized PCR protocol for primer combinations based on the cryptic plasmids. Thereby, a sensitivity of 10(3)-10(4) bacteria/0,1 g faeces was achieved that is comparable with detection limits of other described PCR detection systems. The specifity and diagnostic utility of this PCR detection system was confirmed by analysis of faecal samples from patients. In addition, a plasmid-free variant of E. coli strain DSM 6601 was constructed. Functional analyses of this strain detected no differences compared to the wildtype, whereby the possible function of both cryptic plasmids still remains unclear. This plasmid-free variant can be used as live vector for recombinant plasmids based on the plasmids pMUT1 and pMUT2. Another aim of this work was the development of stable cloning vectors for the probiotic E. coli strain DSM 6601. Cloning vectors were constructed by integration of antibiotic resistance cassettes in the plasmids pMUT1 and pMUT2, which are still stably maintained following insertion of additional DNA fragments without selection pressure by antibiotics. Furthermore, a visual detection system was established by the stable expression of fluorescent proteins that can be used in in vivo experiments. This offers the opportunity to gain knowledge of colonization properties as well as interactions of E. coli strain DSM 6601 with endogenous microorganisms and cells of the gut’s immune system, which might contribute to explain the mode of action of this strain. With regard to the development of a live vaccine based on the probiotic E. coli strain DSM 6601, adhesins of human pathogenic enterohaemorrhagic E. coli and animal pathogenic enterotoxigenic E. coli were expressed in this strain. Induction of specific immune responses to these adhesins were not demonstrated by first immunization experiments in mice. Moreover, the inhibitory effect of the E. coli strain DSM 6601 on Salmonella invasion was investigated in vivo and in vitro. It was demonstrated that type 1 and F1C fimbriae have no influence on the inhibitory effect in vitro and that no inhibitory effects could be established in conventional mice by this E. coli strain. By the development of stable cloning vectors and the establishment of detection systems for the E. coli strain DSM 6601, the results of this work provide the basis for the employment of this strain as live vector and for in vivo investigations, which might contribute to explain this strain’s mode of action. KW - Escherichia coli KW - Probiotikum KW - Molekularbiologie KW - Plasmidcharakterisierung KW - Klonierungsvektoren KW - PCR-Nachweissystem KW - bakterieller Lebendvektor KW - plasmid characterization KW - cloning vectors KW - PCR detection system KW - bacterial live vector Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23935 ER - TY - THES A1 - Mordhorst, Ines Louise T1 - Phylogenetische und funktionelle Analysen zur Kapsel O-Acetyltransferase NeuO von Escherichia coli K1 T1 - Phylogenetic and functional analysis on the capsule O-acetyltransferase NeuO of Escherichia coli K1 N2 - Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen. N2 - Escherichia coli is a commensal of the human and animal intestinal tract. Some strains have the ability to cause extraintestinal disease in humans such as urinary tract infections, neonatal meningitis and septicemia, but also animal infection such as avian colisepticemia. A major virulence factor of the bacterium is the K1 capsule composed of α-2,8-linked sialic acid monomers, which can be phase variably O-acetylated at a high frequency. In 2005, it was shown that the enzyme responsible for O-acetylation is the O-acetyltransferase NeuO, which is encoded by the K1-specific prophage CUS-3. The distribution of neuO as well as the functional relevance of the K1 capsule O-acetylation for the bacterium were largely unknown at the start of the thesis. A strain collection comprising 183 E. coli K1 strains was established. The E. coli K1 isolates derived from stool samples of healthy donors, human urinary tract infections, human invasive diseases like newborn meningitis and bacteremia, and from avian colisepticemia. All isolates were typed by multilocus sequence typing (MLST). Thirty-nine sequence types (ST) and five sequence type complexes (STC) were identified. The major share of the strains belonged to the STC95 (80 strains, 44%). 103 of 183 E. coli K1 strains were neuO-positive (56%). The gene was found in 78 (98%) STC95 isolates, but only in 25 (24%) of 103 non-STC95 isolates. Therefore, there was an association of neuO with the STC95. With the help of DNA sequencing of internal fragments of CUS-3, distinct CUS-3 genotypes were assigned. There was a segregation of CUS-3 genotypes according to STs, suggesting coevolution of the prophage CUS-3 and its host. Some human and avian isolates were indistinguishable with respect to MLST, CUS-3 genotyping and the presence of genetic markers associated with extraintestinal pathogenic E. coli, which was compatible with the hypothesis of zoonotic transmission of these strains. Functional analyses performed in this study neither revealed an impact of NeuO-mediated K1 capsule O-acetylation on the ability of the bacteria to adhere to or invade into human brain microvascular endothelial cells, nor on the in vivo virulence of the bacteria in a chicken infection model. K1 capsule O-acetylation decreased in vivo chicken gut colonization and in vitro biofilm formation, while increasing E. coli K1 desiccation resistance. This study provides evidence that phase variable neuO expression and the subsequent O-acetylation of the E. coli K1 capsule serves as an efficient tool for the adaptation to changing environments. KW - Escherichia coli KW - Kapsel KW - Biofilm KW - Phylogenie KW - Virulenzfaktor KW - Acetylierung KW - Genexpression KW - O-Acetylierung KW - Multilokus-Sequenztypisierung KW - O-acetylation KW - multilocus sequence typing Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47880 ER - TY - THES A1 - Middendorf, Barbara T1 - Untersuchungen zur Instabilität von Pathogenitätsinseln des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 : "Island Probing" von PAI I(536) - PAI V(536) T1 - Studies on the instability of pathogenicity islands of the uropathogenic Escherichia coli strain 536: 'Island Probing' of PAI I(536) - PAI V(536) N2 - Der uropathogene Escherichia coli Stamm 536 (O6:K15:H31) stammt aus einem Patienten mit akuter Pyelonephritis und ist heute einer der Hauptmodellorganismen für Studien zum Vorkommen und zur Funktionalität von Pathogenitätsinseln (PAIs). Sein Genom enthält sechs genetische Elemente (PAI I(536) bis PAI VI(536)), die an unterschiedlichen Stellen des Chromosoms integriert sind und die Hauptkriterien für PAIs erfüllen. Sie kodieren für viele Virulenzfaktoren des Stammes, sind am 3' Ende von tRNA Genen integriert, enthalten teils kryptische Fragmente mobiler genetischer Elemente wie Integrase- oder Transposasegene und werden meist von IS Elementen oder 'direct repeats' (DRs) flankiert. Darüber hinaus haben sie die Tendenz, instabil zu sein und aus dem Chromosom zu deletieren. Mit Ausnahme von PAI IV(536) sind alle PAIs von E. coli 536 mit intakten Integrasegenen assoziiert, die zu int Genen des Coliphagen P4 bzw. des Shigella flexneri Phagen SfX ähnlich sind. Neuere Untersuchungen zeigen, daß diese Gene exprimiert werden und für funktionelle Enzyme kodieren. Zusätzlich werden die PAIs ebenfalls mit Ausnahme von PAI IV(536) von DRs unterschiedlicher Größe flankiert, die den Randbereichen von Prophagen im prokaryontischen Chromosom entsprechen. Es ist daher wahrscheinlich, daß PAI-Deletionen vergleichbar zum Insertions-/Exzisionsmechanismus von Bakteriophagen durch die jeweilige PAI-assoziierte Integrase vermittelt werden und durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs erfolgen. Die Instabilität von PAI I(536) und PAI II(536) ist schon früh belegt worden. Jede Insel kodiert für eine Hämolysindeterminante und ihre Kodeletion führt zu einem ahämolytischen Phänotyp, der mit einer Häufigkeit von 3×10(-5) in vivo und bis 1x10(-3) in vitro auftritt. Die Exzision erfolgt durch ortsspezifische Rekombination zwischen den 16 bp bzw. 18 bp großen flankierenden DRs der PAIs. Da den übrigen E. coli 536-spezifischen PAIs entsprechende phänotypische Marker fehlen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit das 'Island Probing'-Verfahren angewendet, um die Instabilität von PAI I(536) bis PAI V(536) im Detail zu untersuchen. Dazu wurde der negative Selektionsmarker sacB separat in die PAIs integriert. Zellen, die diesen Marker tragen, sind saccharosesensitiv und können nur in Gegenwart hoher Saccharosekonzentrationen wachsen, nachdem die sacB-markierte PAI aus dem Chromosom deletiert wurde. Auf diese Weise konnten von sacB-markierten Derivaten des Stammes E. coli 536 gezielt PAI-negative Zellen isoliert werden, um die Grunddeletionsraten der PAIs zu bestimmen und ihre Randbereiche zu analysieren. Zusätzlich wurde der Einfluß verschiedener Umwelteinflüsse wie niedrige/hohe Temperatur, osmotischer Streß, Nährstoffmangel, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Gegenwart konjugativer Plasmide auf die Exzisionsrate untersucht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, daß PAIs von E. coli 536 mit unterschiedlicher Häufigkeit deletieren. Während PAI II(536) und PAI III(536) mit Deletionsraten von 2×10(-5) bzw. 5x10(-5) am instabilsten sind, liegen die Exzisionsraten von PAI I(536) und PAI V(536) mit 2x10(-6) bzw. 1×10(-6) niedriger und deuten auf eine fortschreitende Stabilisierung dieser PAIs hin. Im Gegensatz dazu ist PAI IV(536) bereits vollständig stabil in das Chromosom eingebettet. Während die Exzision von PAI I(536), PAI II(536) und PAI V(536) RecA-unabhängig ist und auf ortsspezifischer Rekombination zwischen ihren flankierenden DRs beruht, treten bei PAI III(536) zwei alternative Deletionsmechanismen auf. Die Exzision dieser PAI erfolgt entweder vollständig durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs oder partiell durch homologe Rekombination zwischen zwei IS100 Elementen innerhalb der PAI. Unabhängig vom Rekombinationsmechanismus führt die Deletion aber in allen Fällen zur Bildung zirkulärer Intermediate (CIs), die vermutlich aufgrund fehlender Replikationsstartpunkte bei nachfolgenden Zellteilungen verlorengehen. Obwohl CIs von PAI II(536) und PAI III(536) mit Hilfe spezifischer PCR-Reaktionen identifiziert werden konnten, war ein PCR-Nachweis PAI I(536)- und PAI V(536)-spezifischer CIs bedingt durch die niedrigen Deletionsraten dieser Inseln nicht möglich. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, daß die Deletion von PAI II(536) und PAI III(536) bei niedriger Wachstumstemperatur, hoher Zelldichte und Nährstoffmangel in vitro induzierbar ist, d. h. unter Bedingungen, die auch in natürlichen Biofilmen auftreten können. Andere Bedingungen wie osmotischer Streß, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Anwesenheit konjugativer Plasmide haben keinen Einfluß auf die Deletionsrate der PAIs. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Instabilität von PAIs bei E. coli 536 in vivo eine wichtige Rolle spielt indem sie zur Genomflexibilität und Evolution sowie zur Modulation der Virulenzgenexpression der Bakterien beiträgt. N2 - The uropathogenic Escherichia coli strain 536 (O6:K15:H31) was originally isolated from a patient suffering from acute pyelonephritis and is now one of the best-characterized model organisms to study the existence and functionality of pathogenicity islands (PAIs). Its genome carries six genetic elements (PAI I(536)-PAI VI(536)), which are inserted at different sites of the chromosome and exhibit the main features of PAIs: They encode many virulence genes of this strain, they are inserted at the 3’ end of tRNA genes, they are associated with sometimes cryptic fragments of mobile genetic elements such as integrase genes or transposase genes, and they are flanked by IS elements or direct repeats (DRs). Furthermore, they have the tendency to be instable and to delete from the chromosome. With the exception of PAI IV(536) all PAIs of E. coli strain 536 are associated with intact integrase genes, which are similar to the int genes of coliphage P4 and the Shigella flexneri phage SfX, respectively. Recently, it was shown, that these genes can be expressed and code for functional enzymes. Furthermore, with exception of PAI IV(536), the PAIs of strain 536 are flanked by DRs of different size, which correspond to the left and right end junctions of prophages in the prokaryotic chromosome. Therefore, it is very likely, that comparable to the insertion/excision mechanism of bacteriophages the deletion of PAIs is mediated by the respective PAI-encoded integrase and functions via site-specific recombination between the flanking DRs. Instability of PAI I(536) and PAI II(536) has been described very early. Each island encodes a hly gene cluster and their co-deletion leads to a non-hemolytic phenotype, which can appear with a frequency of 3x10(-5) in vivo and up to 1x10(-3) in vitro. The excision of both PAIs is the result of site-specific recombination between their 16 bp and 18 bp flanking DRs, respectively. Since all other E. coli 536-specific PAIs lack a comparable phenotypic marker, we used the 'Island Probing' approach to investigate the instability of PAI I(536) to PAI V(536) in more detail. For this purpose, the counterselectable marker sacB was integrated separately into the PAIs. Cells carrying this marker have a sucrose sensitive phenotype and are only able to grow on high concentrations of sucrose after the deletion of the sacB-labeled PAI from the chromosome. Thus, we were able to isolate PAI-negative cells systematically from sacB-positive derivatives of E. coli strain 536 to estimate the basic deletion rate of the PAIs and to analyze their junctions to the chromosome in more detail. Additionally, the influence of different environmental conditions such as low or elevated temperature, osmotic stress, depletion of nutrients, subinhibitory concentrations of antibiotics, and the presence of conjugative plasmids on the excision rate of the PAIs was investigated. According to the data presented in this study, PAIs of E. coli strain 536 delete with different frequencies. While PAI II(536) and PAI III(536) are the most unstable islands with deletion rates of 2×10(-5) and 5×10(-5), respectively, the excision rates of PAI I(536) and PAI V(536) are lower with values of 2×10(-6) and 1×10(-6), respectively, which indicates a progressive stabilization of these PAIs. In contrast, PAI IV(536) is already stably embedded in the chromosome. While the excision of PAI I(536), PAI II(536), and PAI V(536) is RecA-independent and is based on site-specific recombination between their flanking DRs, two alternative deletion mechanisms were identified in case of PAI III(536). This PAI either deletes in its entirety by site-specific recombination between its flanking DRs or partially by homologous recombination between two IS100 elements located within the PAI. Independent of the recombination mechanism, deletion leads in all cases to the formation of so-called circular intermediates (CIs), which lack an origin of replication and are probably lost during the following cell divisions. Such CIs of PAI II(536) and PAI III(536) were detected by specific PCR reactions, but an experimental proof of PAI I(536)- and PAI V(536)-specific CIs was not possible probably because of the low deletion rate of these islands. Interestingly, this study demonstrates for the first time that deletion of PAI II(536) and PAI III(536) is inducible by low incubation temperature, high cell density, and low nutrient supply, i.e. conditions that can also occur in natural biofilms. Other stimuli such as osmotic stress, subinhibitory antibiotic concentrations, or the presence of conjugative plasmids seem to have no effect on the deletion rates of the PAIs. In summary, the presented results suggest that instability of PAIs of the E. coli strain 536 is important in vivo by contributing to genome flexibility and evolution as well as to the modulation of virulence gene expression of the bacteria. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Pathogenitätsinseln KW - Genomplastizität KW - Deletionsrate KW - ortsspezifische/homologe Rekombination KW - zirkuläre Intermediate KW - pathogenicity islands KW - genome plasticity KW - deletion rate KW - site-specific/homologous recombination KW - circular intermediates Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16573 ER - TY - THES A1 - Michaelis, Kai T1 - Untersuchungen zur Genomstruktur und Biofilmbildung von pathogenen Escherichia coli Isolaten T1 - Analysis of genome structure and biofilm formation of pathogenic Escherichia coli strains N2 - Das Kerngenom pathogener Escherichia coli Isolate wird von zahlreichen variablen Regionen unterbrochen, die meist durch horizontalen Gentransfer erworben wurden und über das ganze Chromosom verteilt sind. Diese variablen Bereiche tragen häufig Gene für Virulenz- und Fitnessfaktoren und sind oftmals nur instabil in das Chromosom integriert. Um die Verbreitung variabler Bereiche, die insbesondere Virulenzfaktoren kodieren, innerhalb verschiedener klinischer Isolate näher untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein spezieller DNA-Array entwickelt. Dieser enthielt zahlreiche Sonden für Gene, die für die Virulenz von verschiedenen Erregern der Gattung E. coli als auch der Untergruppe Shigella charakteristisch sind. Mit diesem "Pathoarray" wurde die Verbreitung von Virulenzgenen in unterschiedlichen E. coli Isolaten untersucht. Zusätzlich wurden Unterschiede im Kerngenom mit Hilfe eines kommerziell erwerbbaren DNA-Arrays bestimmt. Ein Vergleich des Kerngenoms von uropathogenen Stämmen mit Derivaten, bei denen Pathogenitätsinseln deletiert sind, bestätigte die Auffassung, dass der Deletion von Pathogenitätsinseln ein spezieller Mechanismus zu Grunde liegt, von dem das Kerngenom nicht betroffen ist. Das Kerngenom der untersuchten Stämme war prinzipiell sehr konserviert und unterschied sich lediglich durch wenige Gene aus Bakteriophagen. Die größten Unterschiede wurden bei Genen beobachtet, die zum variablen Teil des Genoms gehören und charakteristisch für das jeweilige Isolat waren. Mit Hilfe der DNA-Array Technologie lassen sich auch Änderungen von Expressionsprofilen studieren, die von Mutationen oder durch Umwelteinflüsse bedingt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Transkriptomanalysen das RfaH-abhängige Regulon untersucht, insbesondere im Hinblick auf solche Gene, die die Biofilmbildung beeinflussen. Beim Vergleich der Transkriptome von E. coli 536rfaH mit dem Wildtyp wurde eine signifikant erhöhte Expression von Antigen 43 festgestellt. Im E. coli K-12 Stammhintergrund konnte dieses Oberflächenprotein als Hauptfaktor für die RfaH-abhängige Biofilmbildung identifiziert werden. Das verkürzte LPS-Kernoligosaccharid im Stamm MG1655rfaH hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die verstärkte Biofilmbildung. Vermutlich verstärkte die verbesserte Präsentation von Agn43 durch ein verkürztes LPS die Biofilmbildung signifikant. Andere Oberflächenstrukturen, wie die Colansäure-Kapsel, zeigten keinen Effekt auf die Biofilmbildung von E. coli MG1655rfaH. Neben den Expressionsprofilen der Stämme 536 und 536rfaH bei 37 Grad C wurden auch die Expressionsprofile bei 30 Grad C sowie von Biofilmen analysiert. Prinzipiell konnten bei allen untersuchten Wachstumsbedingungen nur geringe Unterschiede zwischen 536 und 536rfaH festgestellt werden. Beim Vergleich der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen (Temperatureffekt und planktonische Zellen vs. Biofilm) wurden jedoch deutliche Unterschiede beobachtet. Sowohl Gene des Kerngenoms als auch Gene von Pathogenitätsinseln waren temperaturabhängig reguliert. Bei E. coli Isolaten lassen sich neben genomischen Unterschieden auch phänotypische Unterschiede beobachten. Es wurde festgestellt, dass die Biofilmbildung von E. coli Isolaten abhängig von verschiedenen Faktoren und molekularen Mechanismen ist. Zudem konnte dargelegt werden, wie Unterschiede in der Zusammensetzung der äußeren Membran durch eine veränderte LPS-Struktur und die Expression von Adhäsinen die Biofilmbildung beeinflussen können. N2 - Evolutionary adaptation is the driving force for the variability observed within genomes of all different Escherichia coli pathotypes. Beside the core genome, shared by all strains, also variable regions, which can be strain-specific, are scattered on the chromosome. These flexible regions mostly encode virulence factors as well as other fitness factors and are acquired through horizontal gene transfer but are also characterised by their instability. To shed a closer light on the distribution of these virulence factors among different clinical isolates, DNA-arrays were used for genome comparisons. One aim of this Ph.D. thesis was the design of a DNA-array with specific probes for typical virulence-related genes of pathogenic E. coli. With this tool in hand, the distribution of virulence genes among several E. coli isolates was analysed. In addition to virulence related genes, also differences in the core genome of well-known uropathogenic isolates of E. coli were detected using DNA-array technology. Furthermore, the core genome of different wildtype strains was compared with derivatives shown to have lost pathogenicity islands. The results confirmed the assumption that PAI deletion from core genome is a specific process and underlies a specific mechanism. The core genome itself was very conserved and the observed small differences related to genes derived from different bacteriophages. The majority of differences were detected for the flexible regions, which differ in a strain-specific manner. DNA-array technology is also a versatile tool to gain insights in changes of gene expression levels caused by gene function disorders or environmental differences. The expression profiling approach using DNA-arrays was employed in the second part of this thesis. In this work, the RfaH-related regulon was studied by transcriptome analysis. Besides the already known effect of RfaH on facilitated capsule, LPS and alpha-haemolysin expression, the focus was set on genes involved in biofilm formation. Comparison of the 536rfaH and the wildtype strain transcriptomes revealed a significant upregulation of agn43 transcript levels. In order to study the underlying mechanisms of RfaH-dependent increased biofilm formation, selected mutants of E. coli K-12 and 536 were generated and tested for their biofilm forming capacities. In MG1655rfaH we could show that Agn43 is the major factor leading to biofilm formation. In addition, this phenotype was dependent on the LPS core truncation coming along within rfaH deficient strains. In conclusion, these results demonstrated that the LPS core truncation leads to unshielding of Agn43 in this strain, thus supporting autoaggregation and biofilm formation. Other surface structures like colanic acid had no influence on this effect. Besides the expression profiles of strains E. coli 536 and 536rfaH at 37 degrees, also expression profiles at 30 degrees and in biofilms were analysed. Typical differences in either stage were characterised. In general, when comparing the expression profiles from wildtype and mutant the changes observed were very small. However, the influence of temperature and also the mode of growth (planktonic cells vs. biofilm) affected the expression profiles in both strains more severely. In conclusion, E. coli strains not only differ in their genotypes, moreover complex phenotypic differences are observable. The obtained phenotypic differences in biofilm formation were shown to be multifactorial. The phenotype was attributed to variances in the composition of the outer membrane. In this context, the influence of LPS structures and adhesin expression was pointed out. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Transkriptomanalyse KW - Genomvariabilität KW - DNA-Array KW - Transkriptomanalyse KW - Biofilmbildung KW - Phasenvariation KW - genome variability KW - DNA-array KW - transcriptome analysis KW - biofilm formation KW - phase variation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17593 ER -