TY  - THES
A1  - Dreykluft, Angela
T1  - Charakterisierung immunmodulatorischer Effekte von Zellen monozytären Ursprungs : Bedeutung für die Hemmung ungewollter Immunantworten?
T1  - Characterisation of immunomodulatory effects of monocyte-derived cells: Relevance for suppressing unwanted immune responses?
N2  - Immunzellen mit hemmenden bzw. regulatorischen Eigenschaften erscheinen sehr attraktiv, um ungewollte Immunantworten, wie sie z.B. nach Transplan¬tationen auftreten, selektiv zu hemmen. In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass sich mit GM-CSF und IL-4 immunregulatorische Dendritische Zellen (IL-4 DC) aus hämatopoetischen Vorläuferzellen des Knochenmarks der Lewis-Ratte generieren lassen. In der vorliegenden Arbeit wurden Makrophagen aus Knochenmarkvorläuferzellen mit M-CSF und IL-4 (IL-4 Makrophagen) generiert und mit den IL-4 DC hinsichtlich ihres Phänotyps und ihrer immunologischen Eigenschaften verglichen. M-CSF Makrophagen, die nur mit M-CSF generiert wurden, dienten hierbei als Kontrolle. Im Gegensatz zu reifen DC (mDC), die aus der Milz isoliert wurden, sind weder M-CSF Makrophagen noch IL-4 Makrophagen bzw. IL-4 DC in der Lage, naive T Lymphozyten in vitro zu aktivieren. Zudem wurde eine Zellzahl-abhängige Hemmung der mDC induzierten T Zell-Aktivierung beobachtet. So hemmten IL-4 Makrophagen die mDC-induzierte T-Zellproliferation nahezu vollständig (bis zu 96%), wenn sie in einem Zellverhältnis von 1:1 (IL-4 Makrophagen:mDC) als Kompetitorzellen eingesetzt wurden. Ähnliche Effekte waren auch für M-CSF Makrophagen und IL-4 DC zu beobachten. Zwar ist nicht geklärt, wie die Zellen diesen hemmenden Effekt vermitteln, doch lassen die Daten der vorliegenden Arbeit sowohl einen durch Oberflächenmoleküle als auch lösliche Mediatoren vermittelten Mechanismus für möglich erscheinen. Durchflusszytometrische Analysen, ergänzt durch Immunhistochemie und Real time PCR, zeigten für IL-4 Makrophagen und M-CSF Makrophagen einen Phänotyp, der gegenüber IL-4 DC, eine geringere Expression von CD80 und CD86 auf der Zelloberfläche aufwies. Die IL-4 DC wiesen ihrerseits eine geringe Expression von CD80 und CD86 in Vergleich zu mDC auf, wie in vorangegangenen Arbeiten gezeigt wurde. Alle drei Subpopulationen waren positiv für MHC I und CD40, während IL-4 Makrophagen und IL-4 DC zusätzlich positiv für MHC II waren. T Lymphozyten in Kokultur mit IL-4 Makrophagen bzw. mit M-CSF Makrophagen oder IL-4 DC wiesen nur eine geringe Proliferation auf, wenn sie anschließend mit mDC restimuliert wurden. Diese Daten deuten darauf hin, dass IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC naive T-Lymphozyten dauerhaft in ihrer Restimulierung hemmen. Dieser anergische Zustand ist möglicherweise auf die unzureichende Kostimulation zurückzuführen. Zudem wurde bei den mit IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC kokultivierten T Lymphozyten eine geringfügig erhöhte Rate an apoptotischen Zellen gemessen als bei T Lymphozyten, die zuvor alleine oder mit mDC kultiviert wurden. Auch von IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC sezernierte lösliche Faktoren können eine Rolle bei der Hemmung der T-Zellaktivierung spielen. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC, hemmten die mDC-induzierte T-Zellaktivierung mit einer Suppressionsrate von 81-85%. Mit einer nahezu vollständigen Hemmung der T-Zellaktivierung war der Effekt von Überständen aus 48-stündigen Kulturen sogar noch stärker. Wie anhand von ELISA und real time PCR gezeigt wurde, exprimierten IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC das immuninhibitorische Zytokin TGF-Beta, das für die beobachtete Hemmung der T-Zellproliferation verantwortlich sein könnte. Die Ergebnisse zeigen somit, dass die aus Knochenmarkvorläuferzellen generierten IL-4 Makrophagen und M-CSF Makrophagen die Aktivierung naiver T-Lymphozyten hemmen. Diese Eigenschaft teilen sie sich mit IL-4 DC trotz deutlicher Unterschiede bei den Phänotypen dieser Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass die aus hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks hergestellten Dendritische Zellen und Makrophagen die Aktivierung naiver T-Lymphozyten effektiv hemmen. Der Mechanismus, wie dieser hemmende Effekt vermittelt wird, ist zurzeit noch unbekannt und sollte in weiteren Arbeiten analysiert werden. Von grundlegender Bedeutung wäre der erfolgreiche Nachweis, dass diese Zellen ungewollte Immunantworten antigen¬spezifisch hemmen.
N2  - Immune cells with suppressive or regulatory properties appear very attractive for selective suppression of unwanted immune responses, occurring for example after transplantation. In previous studies, we showed that immunoregulatory dendritic cells can be generated from rat bone marrow haematopoietic precursor cells with GM-CSF and IL-4 (so-called IL-4 DC). In the present study, bone marrow derived macrophages generated in the presence of M-CSF plus IL-4 (IL-4 macrophages) were compared to IL-4 DC in view of their phenotype and immunological functions. M-CSF macrophages generated with M-CSF alone were used as controls. In contrast to mature splenic dendritic cells (mDC), M-CSF macrophages, IL-4 macrophages and IL-4 DC were not able to activate naïve T lymphocytes in vitro. Moreover, used as competitor cells, a dose-dependent suppression of mDC-stimulated allogeneic T cell activation was observed. At a cell ratio of 1:1 (IL-4 macrophages:mDC), IL-4 macrophages induced a suppression rate of 96%. M-CSF macrophages and IL-4 DC demonstrated similar effects at the same cell ratio. It is not clear how the cells mediated the suppressive effect, but this study presents evidence for both a cell surface mediated mechanism and a mechanism mediated by soluble factors. Flow cytometric, immunohistochemical and real time PCR analysis demonstrated a unique phenotype for IL-4 macrophages and M-CSF macrophages. Their surface expression of CD80 and CD86 was lower in comparison to the expression found on IL-4 DC whose surface expression of costimulatory molecules was reduced in comparison to mDC as shown in previous studies. Therefore, insufficient costimulation could be the reason for the observed inability of the three subsets to activate naïve T lymphocytes. All three subsets were positive for MHC I and CD40, and additionally, IL-4 macrophages and IL-4 DC were clearly positive for MHC II. T lymphocytes co-cultured with IL-4 macrophages, M-CSF macrophages or IL-4 DC, demonstrated a minimal proliferation when subsequently restimulated with mDC. This indicates that IL-4 macrophages, M-CSF macrophages and IL4-DC induced a stable hyporesponsiveness (anergy) in these T lymphocytes, which is probably due to the insufficient costimulation. Moreover, a marginally increased rate of apoptosis was detected in T lymphocytes collected from the competition assays with IL-4 macrophages, M-CSF macrophages and IL4-DC in contrast to T lymphocytes cultured alone or with mDC during the competition assays. Soluble inhibitory factors secreted by IL-4 macrophages, M-CSF macrophages or IL-4 DC could also play a role in T cell suppression. Supernatant of one million M-CSF macrophages, IL-4 macrophages and IL-4 DC collected after 24h of culture suppressed mDC-induced T cell proliferation with a suppression rate of 81-85%. The suppressive effect of the supernatant collected after 48h was even stronger with a suppression rate of 90-100%. As shown in ELISA and real time PCR analysis, IL-4 macrophages, M-CSF macrophages and IL4-DC expressed the immunoinhibitory cytokine TGF-beta that might be involved in T cell suppression. In conclusion, these results show that the bone-marrow derived IL-4 macrophages and M-CSF macrophages suppress the activation and proliferation of naïve T lymphocytes. They share this feature with the bone marrow derived IL-4 DC despite different phenotypes. The results of this study indicate that dendritic cells and macrophages derived from haematopoietic stem cells of the bone marrow share the same suppressive properties. The mechanism how these cells mediate their suppressive effect is still unknown and should be analysed in further studies. In this context, these cells should be able to suppress unwanted immune responses in an antigen specific manner.
KW  - Makrophage
KW  - Monozyten-Makrophagen-System
KW  - Immunmodulation
KW  - Macrophage
KW  - Moncyte
KW  - Immunomodulation
KW  - T-cell inhibition
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24779
ER  - 
TY  - THES
A1  - Korte, Gabriele
T1  - Flavonoid-induzierte Cytotoxizität, Neuroprotektion und Immunmodulation im Zellmodell
T1  - Flavonoid-induced cytotoxicity, neuroprotection and immunmodulation in the cell model
N2  - Flavonoide sind weitverbreitete sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe. Ihr Beitrag zur Prävention von chronischen Erkrankungen wird zu großen Teilen auf immunmodulatorische und neuroprotektive Effekte zurückgeführt. Eine Voraussetzung für die Nutzung dieser Eigenschaften der Flavonoide stellt die Erfassung cytotoxischer Effekte dar. Mit Ausnahme von Xanthohumol und Quercetin ist für alle im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Flavonoide, Hispidulin, Baicalein, Scutellarein, Hesperetin, Chrysin, Apigenin, Naringenin, Catechin, Pelargonidinchlorid und EMD 21388, sowohl in T-Zellen (Jurkat) als auch in neuronalen (SK-N-SH)-Zellen nach 24-stündiger Inkubation eine geringgradige Cytotoxizität festzuhalten. Für Xanthohumol bzw. Quercetin wird ein halbmaximaler Verlust der Zellvitalität je nach Modell in Konzentrationen von 33-45 µM bzw. 118-208 µM erreicht. Der weiterführenden Charakterisierung (zVAD, DNA-Laddering) ist zu entnehmen, dass die zellulären Veränderungen substanzabhängig differieren und sowohl nekrotische Mechanismen (Xanthohumol) als auch apoptotische Vorgänge (Quercetin) einschließen. Eine erhöhte Lipidperoxidation im oberen Dosisbereich lässt darüber hinaus auf eine Beteiligung von oxidativem Stress an den von Xanthohumol-induzierten nekrotischen Prozessen schließen. Eine positive Einflussnahme auf die Zellvitalität durch Antioxidantien wie GSH und NAC lässt des Weiteren vermuten, dass die erfassten Flavonoid-induzierten Prozesse jeweils sensitiv zum Redoxzustand der Zelle sind. Während die Effekte von Xanthohumol auch in anderen Zellmodellen (HL-60) nachweisbar bleiben, verhält sich Quercetin nicht durchgehend vitalitätsmindernd. Unterschiede zwischen den Testsubstanzen bestehen auch hinsichtlich antioxidativer Effekte. Das Eliminieren freier Radikale zählt zu den wichtigsten Mechanismen, die bei Flavonoid-vermittelter Neuroprotektion eine Rolle spielen. Insgesamt sind alle diesbezüglich untersuchten Substanzen als starke Superoxidanionen-Radikalfänger einzustufen. Im Co-Inkubationsversuch zeigt Scutellarein den stärksten Effekt, gefolgt von Quercetin, Hispidulin und Xanthohumol. Im Prä-Inkubations-Versuchsmodell liegen in der Reihenfolge ihrer Effektstärken Xanthohumol vor Quercetin, Hispidulin und schließlich Scutellarein. Die modellabhängigen Konstanten können, unter Beteiligung einer passiven Diffusion der hydrophoben Flavonoidaglykone, auf eine substanzgebundene Membranpermeabilität zurückzuführen sein. Das antioxidative Potential der Flavonoide resultiert u.a. aus einer komplexen Einflußnahme auf die Genexpression in der Zelle. In der vorliegenden Arbeit sind anhand von cDNA-Arrays für mehrere Vertreter übereinstimmend Wechselwirkungen mit Genen der zellulären Abwehr dargestellt. Demnach führen Scutellarein, Hispidulin, Quercetin und Xanthohumol zu einer deutlich reduzierten Expressionsstärke von STK4, CHD4, ARHGDIB, IL16, ISG20, PFN1 und SOD2. Unter den Flavonoid-induzierten Veränderungen ragen die Effekte auf ADAR1 heraus, dessen Genexpression von Scutellarein bis auf ein 0,1-faches der Referenzwerte reduziert wird. Gleichsinnige Auswirkungen von Scutellarein auf die Expression von ADAR1-Protein in Western Blots unterstreichen diese Interaktion und legen nahe, dass ADAR-vermittelte enzymatische Deaminierungen durch Flavonoide moduliert werden können. Diese Beobachtung wird ergänzt durch den nachgewiesenen Effekt von Flavonoiden auf die Expression einer Reihe weiterer Gene (ADAR2, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3F und APOBEC3G), die analoge posttranskriptionale Mechanismen steuern und gleichermaßen in Immunabwehr und Neuroprotektion eingebunden sind. Zu den wichtigsten Substraten von ADAR zählen Glutamatrezeptoren. Erwartungsgemäß ist nach der Einwirkung von Scutellarein auf humane Zellen, die Glutamatrezeptoren exprimieren, ein Rückgang der Deaminierung im Bereich der Glutamatrezeptoruntereinheit GluR 2 zu verzeichnen (Q/R-Position). Dem entspricht in elektrophysiologischen Modellen eine gesteigerte Ca2+-Permeabilität der jeweiligen Ionenkanäle und eine veränderte neuronale Exzitabilität. Hieraus ergibt sich ein breites Spektrum zusätzlicher Optionen für die Induktion von gesundheitsrelevanten Flavonoidfunktionen in der Zelle. So spielt die Modulation von Deaminierungen zugleich eine entscheidende Rolle im Vermehrungszyklus viraler Erreger. Die Annahme einer möglichen antiviralen Qualität von Scutellarein wird durch ein HBV-Infektionsmodell anhand drei Parameter der Virusreplikation (Virus-DNA-Konzentration, HBs- bzw. HBe-Antigenproduktion) bestätigt. Offen bleibt auch nach ausführlicher Prüfung, ob der deutliche antivirale Effekt als das Produkt von Flavonoid-induzierten Veränderungen der Deaminierungsraten oder als Folge eines Effekts auf die virale Polymerase zu interpretieren ist. Die hier dargestellten Wirkmechanismen leisten einen Beitrag zum Verständnis der Bedeutung von Flavonoiden für neue Anwendungen in Neuroprotektion und Immunabwehr.
N2  - Flavonoids are common secondary plant metabolites that confer numerous nutritional health effects. Their role in preventing chronic diseases is attributed to immunmodulatory and neuroprotective effects among others. In order to fully exploit these properties the limitations imposed by the compounds cytotoxic profiles must be addressed. For the majority of compounds investigated, hispidulin, baicalein, scutellarein, hesperetin, chrysin, apigenin, naringenin, catechin, pelargonidinchloride and EMD 21388, the present study confirms minimal cytotoxicity in T-cells (Jurkat) and in neuronal cells (SK-N-SH). As for xanthohumol and quercetin a 50% decline in cell-vitality is observed at concentrations of 33-45 µM and 118-208 µM, respectively. Further characterization using zVAD and DNA-laddering indicate that cell-vitality may be compromised both by necrotic mechanisms (xanthohumol) and by apoptotic effects (quercetin). An increase in lipidperoxidation in the upper dose range suggests that oxidative stress may be involved in xanthohumol toxicity. As this is counteracted by antioxidants such as GSH and NAC, these flavonoids impact on cell-vitality is likely codetermined by the cells redox state. While the effects of xanthohumol extend to other cell models, quercetin toxicity in HL-60 cells is less pronounced. Test compounds are also found to differ with regard to antioxidative profiles. The elimination of free radicals is a key mechanism in flavonoid-induced neuroprotection and is shown to vary with different incubation protocols. In short incubation experiments (5 min; co-incubation) scutellarein is identified as the most powerful scavenger, followed by quercetin, hispidulin and xanthohumol. In prolonged incubations (24 hrs; prä-incubation) xanthohumol and quercetin are followed by hispidulin and scutellarein. Model-specific constants suggest that passive diffusion of the hydrophobic flavonoid-aglyca may occur across cell membranes, alongside with other modes of permeation. Flavonoids antioxidative potential is mediated by complex effects on gene expression. The present work uses data from cDNA-arrays to highlight interactions with genes involved in cellular defense. Specifically, scutellarein, hispidulin, quercetin and xanthohumol downregulate expression for STK4, CHD4, ARHGDIB, IL16, ISG20, PFN1 and SOD2. In addition, flavonoids consistently downregulate ADAR1-expression, which drops to 0,1-fold of reference values and is paralleled by scutellarein-effects on ADAR1-protein-expression. Together, these findings indicate, that ADAR-mediated enzymatic deamination may be modulated by flavonoids. Similar effects are noted on related genes (ADAR2, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3F and APOBEC3G), relevant to posttranscriptional processing underlying immune defense and neuroprotection. Glutamate receptors count among the most important neuronal substrates of ADAR. Following exposure to scutellarein a decrease in deamination rates is confirmed with respect to the glutamate receptor subunit GluR 2 (Q/R-site). As a result, an enhanced Ca2+-permeability of the respective ion channels is anticipated, and modified neuronal excitability. Overall, the regulation of enzymatic deamination by flavonoids offers opportunities for multilevel balancing of cell homeostasis. Thus deaminations may interfere with the replication cycle of viral pathogens. Using an ex-vivo HBV-infection model and three parameters of viral replication (viral load, HBs and HBe indices), antiviral properties of scutellarein are illustrated. Despite extensive investigation, it remains to be seen whether these effects can be ascribed to deaminations of viral DNA or to an interaction with other substrates, e.g. the viral polymerase. In summary, the present observations serve to foster our understanding of flavonoids roles in neuroprotection and immune defense.
KW  - Flavonoide
KW  - Cytotoxizität
KW  - Immunmodulation
KW  - Genexpression
KW  - Hepatitis-B-Virus
KW  - Neuroprotektion
KW  - cDNA-Array
KW  - Glutamatrezeptoren
KW  - Exzitotoxizität
KW  - posttranskriptionale Modifikation
KW  - neuroprotection
KW  - cDNA-array
KW  - glutamate receptors
KW  - excitotoxicity
KW  - posttranscriptional modification
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26627
ER  -