TY - THES A1 - Grein, Hannah T1 - Proliferationsverhalten epithelialer Tumorzellen in Gegenwart von humanen mesenchymalen Stammzellen T1 - Proliferation pattern of tumor cells in present of human mesenchymal stem cells N2 - Die Stammzellforschung spielt eine zentrale Rolle in der Optimierung der zielgerichteten und selektiven Tumortherapie durch den angenommenen Tumortropismus von mesenchymalen Stammzellen. Bisher konnten keine eindeutigen Verhaltensmuster mesenchymaler Stammzellen in Gegenwart von Tumorzellen verzeichnet werden. Es gibt sowohl proliferationsfördernde als auch -hemmende Einflüsse. Mögliche Gründe für diese divergierenden Ergebnisse in Bezug auf die Tumorproliferation, im Speziellen auf die Kopf-Hals-Tumorzelllinie FaD, aufzudecken, war das Ziel dieser Arbeit. N2 - Stem cell research plays an important role in optimization of targeted and selective tumor therapy due to the assumed tumor tropism of mesenchymal stem cells. So far, no clear behavior patterns of mesenchymal stem cells in the presence of tumor cells have been recognized. There are both promoting and inhibiting influences on tumor cell proliferation. The aim of this work was to clarify reasons for these different results in relation of tumor proliferation, particularly in the head and neck cancer cell line FaDu. KW - BMSC KW - FaDu KW - Interaktion KW - Proliferation KW - Stammzelltherapie KW - Tumorzellen in Kopf und Hals Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214569 ER - TY - THES A1 - Schedler, Anette T1 - Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen zur Untersuchung des Einflusses von \(Aspergillus\) \(fumigatus\) auf die Hämostase T1 - Analysis of host-pathogen interactions to investigate the influence of \(Aspergillus\) \(fumigatus\) on haemostasis N2 - Als Hämostase bezeichnet man die Gesamtheit der Reaktionen, die zu einer effektiven Blutgerinnung beitragen. Sie lässt sich in die primäre (thrombozytäre) Hämostase, in die sekundäre (plasmatische) Hämostase und in das Fibrinolysesystem einteilen. Thrombozyten, oder auch Plättchen genannt, spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Sie binden an die durch eine Verletzung einer Blutgefäßwand freigelegten Faktoren, werden so aktiviert und aggregieren mit weiteren Thrombozyten, wodurch ein Thrombus entsteht, der die Verletzung verschließt. Zudem besitzen Thrombozyten Immunokompetenz und können mit anderen Immunzellen interagieren, über Rezeptoren Pathogene erkennen und sie direkt angreifen. Einer dieser Pathogene ist der opportunistische Pilz Aspergillus fumigatus. Dieser bildet im Verlauf seines Lebenszyklus 2,5 -3 µm kleine Konidien aus, die mit dem Wind verbreitet werden und bis tief in die Alveolen der menschlichen Lunge eingeatmet werden können. Während diese Konidien im gesunden Menschen durch das Immunsystem und andere Abwehrmechanismen eliminiert werden, können sie im immunsupprimierten Patienten, z. B. bei Patienten nach einer hämatopoietischen Stammzelltransplantation, auskeimen und verschiedene Krankheiten, sogenannte Aspergillosen, auslösen mit der Invasiven Aspergillose (IA) als schwerwiegendste Form. Diese ist assoziiert mit Gewebezerstörungen, Blutungen und Thrombenbildung am Ort der Infektion. Diese Komplikationen könnten auf einer überhöhten Immunantwort des Wirtes, auf dem mechanischen Eindringen des Pilzes in das Gewebe und die Blutgefäße oder auf einer Änderung der lokalen Hämostase durch sezernierte hydrolytische Enzyme (Proteasen) oder Sekundärmetabolite von A. fumigatus beruhen. Um diese Änderung der Hämostase im Verlauf einer IA zu analysieren, wurde der Einfluss von Morphologien (Konidien, geschwollene Konidien, Keimschläuche und Hyphen), deren Überstände, sowie von proteolytisch aktivem Überstand und von verschiedenen Sekundärmetaboliten von A. fumigatus auf die sekundäre Hämostase und die Aggregation und Aktivität von humanen Thrombozyten untersucht. Bei der Analyse der sekundären Hämostase konnte für keinen dieser eingesetzten Effektoren ein Einfluss festgestellt werden. Bei der Analyse der primären Hämostase und dem Einsatz von Morphologien und ihrer Überstände konnte für Hyphen und ihren ankonzentrierten Überstand eine aggregationssteigernde Wirkung auf Thrombozyten beobachtet werden, die möglicherweise auf Bestandteile der Zellwand von A. fumigatus, wie z. B. β-Galactosaminogalactan (GAG) zurückzuführen ist. Proteolytisch aktiver Überstand führte zu einer Aktivierung der Thrombozyten, die zum Teil auf die PrtT-abhängige proteolytische Spaltung und damit die Aktivierung der Thrombinrezeptoren PAR1 und/oder PAR4 auf der Thrombozytenoberfläche, zum Teil aber auch auf GAG zurückzuführen sein kann. Von den hier verwendeten Mykotoxinen Gliotoxin, Fumagillin, Citrinin, Verruculogen und Deoxynivalenol konnte für Gliotoxin ein negativer Einfluss auf die Thrombozytenaktivität nachgewiesen werden. Dieses Toxin inhibierte die Aggregation und die Aktivität der Thrombozyten, möglicherweise durch die Bildung von Disulfid-Brückenbindungen oder auch durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zudem wurde im Verlauf dieser Arbeit eine direkte Interaktion von Gliotoxin mit den ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 sowie mit dem Integrin αIIbβ3 postuliert, die so zwar nicht bestätigt, aber auch nicht vollständig wiederlegt werden konnte. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich zwei Wirkungen von A. fumigatus auf humane Thrombozyten: zum einen eine Aktivierung oder auch verstärkte Aggregation durch sezernierte Proteasen oder Zellwandbestandteile, zum anderen eine Hemmung durch Gliotoxin, was die bei einer IA beobachtete Thrombenbildung sowie die Blutungen erklären kann. Die Interaktion der aktivierten Thrombozyten mit den Zellen des Immunsystems sowie die zytotoxischen Eigenschaften von Gliotoxin könnten zudem für die beobachtete Gewebezerstörung verantwortlich sein. Dennoch ist weitere Forschung in diesem Gebiet unabdingbar, um die pathophysiologische Änderung der lokalen Hämostase durch A. fumigatus und seine Wirkung auf humane Thrombozyten besser zu verstehen und so eine schnellere Erkennung und Behandlung von Aspergillosen zu ermöglichen. N2 - The term haemostasis summarises the reactions that contribute to stop bleeding effectively. It can be divided into primary (thrombotic) haemostasis, secondary (plasmatic) haemostasis and fibrinolysis. Hereby platelets play an important role. Upon vascular injury platelets bind to released factors, get activated and aggregate with other platelets thereby forming a thrombus that seals the injury. Additionally, platelets possess immunocompetence: they can interact with other cells of the immune system, are able to recognise pathogens via receptors and to attack pathogens directly. One of those pathogens is the opportunistic fungus Aspergillus fumigatus. During its life cycle A. fumigatus produces 2.5 – 3 µm small conidia that are distributed by the air and that can be inhaled deep into the alveoli of the human lung. In healthy humans these conidia are eliminated by the immune system as well as other defence mechanisms. In the immunocompromised patient, e. g. patients that had a hematopoietic stem cell transplantation, the conidia can germinate and cause different diseases, named aspergilloses, with Invasive Aspergillosis (IA) as the most severe form. It is associated with tissue damages, bleedings and thrombus formations at the site of infection. These complications could be due to an over exaggerated immune response, to the mechanical infiltration into the tissue and the blood vessel by the fungus or to an alteration of the local haemostasis caused by secreted hydrolytic enzymes (proteases) or secondary metabolites of A. fumigatus. To characterise the alterations of the local haemostasis during an IA, the effect of different morphologies (conidia, swollen conidia, germ tubes and hyphae), their supernatants, as well as proteolytic active supernatant and secondary metabolites of A. fumigatus on the secondary haemostasis and the activity of human platelets was investigated. During the course of the analysis of the secondary haemostasis no influence of these effectors could be observed. In the course of the investigation of the effects of A. fumigatus on primary haemostasis using different morphologies and their supernatants, hyphae and their concentrated supernatant induced an increase of platelet aggregation. This increase might be caused by components of the cell wall of A. fumigatus, e. g. by β-Galactosaminogalactan (GAG). Proteolytic active supernatant led to an activation of thrombocytes which might be in part due to a PrtT-dependent cleavage and thereby activation of the thrombin-receptors PAR1 and/or PAR4 at the platelet surface as well as in part due to GAG. Of the secondary metabolites used (gliotoxin, fumagillin, citrinin, verruculogen and deoxynivalenol) a negative influence on the activity of the thrombocytes by gliotoxin could be observed. This toxin inhibited the aggregation and activation of thrombocytes maybe by the building of mixed disulphide bridges or by the formation of reactive oxygen species as well. Moreover a direct interaction of gliotoxin with the ADP-receptors P2Y1 and P2Y12 as well as with the integrin αIIbβ3 was postulated in the course of this study. This interaction could not be confirmed but also not disproved completely. The results presented here clearly show two effects of A. fumigatus on human thrombocytes: on one hand the activation or increased aggregation caused by secreted proteases or components of the cell wall, on the other hand the inhibition caused by gliotoxin. Those two effects might explain the bleedings and thrombus formations observed during an IA. The interaction of the activated platelets with immune cells as well as the cytotoxic properties of gliotoxin could be responsible for the tissue damages observed. Nevertheless further investigations are needed for a better understanding of the pathophysiological alteration of the local haemostasis by A. fumigatus and its influence on human thrombocytes to enable a faster identification and treatment of aspergilloses. KW - Aspergillus fumigatus KW - Aspergillose KW - Thrombozyt KW - Interaktion Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152512 ER - TY - THES A1 - Schölles, Kristina Joana T1 - Unterschiedliche Gehirnaktivierungsmuster bei psychiatrischen Patienten - eine Untersuchung mit funktioneller Nahinfrarotspektroskopie T1 - Different clusters of brain activation in psychiatric patients – an investigation with functional near-infrared spectroscopy N2 - Viele Patienten, die an Schizophrenie erkrankt sind, zeigen dauerhafte Einschränkungen in sozial-kommunikativen und sozial-kognitiven Kompetenzen. Dies führt oft zu sozialem Rückzug, erschwert alltägliche zwischenmenschliche Interaktion und mindert die Lebensqualität der Patienten deutlich. Jene Einschränkungen sind bei Patienten mit Negativsymptomatik oder chronischen Zuständen besonders ausgeprägt und könnten einer Minderaktivierung im Spiegelneuronensystem unterliegen. Ziel dieser Studie war es, Korrelate von Defiziten in der sozialen Interaktion bei schizophrenen Patienten mit überwiegender Negativsymptomatik im Gegensatz zu gesunden Kontrollpersonen auf verschiedenen Ebenen darzustellen. Hierfür wurde die Fähigkeit zur sozialen Kognition anhand zweier verschiedener psychologischer Testverfahren erhoben und zudem die Gehirnaktivierung während alltagsähnlicher sozialer Interaktion mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass schizophrene Patienten mit vorherrschender Negativsymptomatik unter größeren Beeinträchtigungen zumindest in Teilaspekten von sozialer Kognition leiden als gesunde Kontrollpersonen. Hierbei steht Negativsymptomatik in Zusammenhang mit einer schlechteren Leistung im „Reading Mind in the Eyes Test“, was als „Undermentalizing“ angesehen werden kann. In Bezug auf die neurophysiologischen Messungen von Gehirnaktivität während alltagsähnlicher sozialer Interaktion konnte in der gesunden Kontrollgruppe eine fronto-temporo-parietale Aktivierung festgestellt werden. Hierbei steht insbesondere die Aktivität im Bereich des linken inferioren Parietallappens in Übereinstimmung mit den Ergebnissen zweier vorangegangener Studien (Egetemeir et al. 2011; Herrmann et al. 2015). In der Gruppe der schizophrenen Patienten dieser Studie jedoch zeigte sich keine während „Joint action“ spezifische Aktivität in temporo-parietalen Gehirnregionen. Ebenso war die Gehirnaktivität in den klassischen Spiegelneuronenarealen bei den Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe vermindert. Stattdessen kam es in der Patientengruppe zu einer erhöhten präfrontalen Gehirnaktivierung. Diese verschiedenartige Aktivierungsstrategie bei „Joint action“ kann als kompensatorische Gehirnaktivität interpretiert werden, die es den Patienten ermöglicht, soziale Interaktion erfolgreich zu bewältigen. Falls etwa die entscheidende Rolle während der Bewältigung der vorliegenden „Joint action“-Aufgabe in der Vermittlung visuell-räumlicher Aufmerksamkeitsprozesse durch den inferioren Parietallappen liegt (Herrmann et al. 2015), ist denkbar, dass diese Fähigkeit durch kompensatorische Vorgänge im präfrontalen Kortex übernommen werden kann. Da die Patienten dieser Studie zumeist seit längerer Zeit oder in chronisch residualem Zustand an Schizophrenie mit Negativsymptomatik litten, liegt es nahe, dass sich die kompensatorischen Strategien im Laufe der Zeit durch das alltägliche Leben ausreichend etablieren konnten. Die verminderte Aktivität in Spiegelneuronenarealen innerhalb der Patientengruppe untermauert das Konzept zur Krankheitsentstehung der Schizophrenie von Mehta und Kollegen, welches besagt, dass Gene und Umweltfaktoren ein möglicherweise angeboren defektes Spiegelneuronensystem beeinflussen, wobei erniedrigte Spiegelneuronenaktivität mit Defiziten in sozial kognitiven Einschränkungen und Negativsymptomatik einhergehe (Mehta et al. 2014a). Diese Zusammenhänge können jedoch im Rahmen dieser Studie lediglich vermutet und nicht objektiviert werden. Durch die vorliegende Untersuchung konnte festgestellt werden, dass schizophrene Patienten mit Negativsymptomatik andere neuronale Strategien während alltagsähnlicher sozialer Interaktion nutzen als gesunde Personen, was einen weiteren Einblick in die neurobiologischen Grundlagen der Erkrankung erlaubt. N2 - Many schizophrenic patients show impairments in social cognitive skills especially those with negative symptoms. Often this leads to social withdrawal, aggravates every day social interaction and reduces the quality of life of the patients. Several of these aspects could underlie a deficit in the mirror neuron system (MNS). In the present study different aspects of social interaction were investigated and compared between 16 schizophrenic patients and 17 healthy controls. Therefore, the ability of social cognition was tested by two different neuropsychological tests. In addition to that, functional brain activity including activation of the MNS was measured by functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) during a real-life joint action task. This joint action paradigm was published before and led to a consistent activation of the left inferior parietal lobe (IPL) in healthy subjects (Egetemeir et al. 2011; Herrmann et al. 2015). The results show that schizophrenic patients with predominant negative symptoms use different clusters of neural activity during social interaction. By group contrast it could be shown that healthy participants had a significant higher activation in temporo-parietal regions than the patients who showed higher activation in prefrontal areas. Furthermore MNS activity was less in the patient than in the control group. Regarding social cognition patients performed worse in the “Reading the Mind in the Eyes Test”. But despite possible partial impairments in social cognition or dysfunctional brain regions it could be shown that schizophrenic patients are able to successfully manage social interaction through probably engaging compensatory brain strategies. KW - Schizophrenie KW - NIR-Spektroskopie KW - Interaktion KW - Spiegelneuron KW - NIRS KW - MNS KW - schizophrenia KW - joint-action KW - social interaction Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-138737 ER - TY - THES A1 - Zoeller, Maria Simone T1 - Lipidperoxidation in der inkompatiblen Pseudomonas-Arabidopsis Interaktion: Biosynthese von Pimelin- und Azelainsäure T1 - Lipidperoxidation in the incompatible Pseudomonas-Arabidopsis interaction: biosynthesis of pimelic and azelaic acid N2 - Die Biosynthese von fragmentierten Fettsäuren (kurzkettige Dicarbonsäuren und deren Oxocarbonsäure-Vorstufen) ist in den meisten Pflanzen noch unklar. Wichtige, bekannte Dicarbonsäuren sind Pimelinsäure (PIM) und Azelainsäure (AZA) mit den putativen Vorstufen 7-Oxo¬heptanonsäure (OHA) und 9-Oxononanonsäure (ONA). Es besteht großes Interesse die Biosynthese¬mechanismen und die Regulation der Synthese dieser Substanzen aufzuklären, da Fettsäure¬fragmente an wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind. PIM ist eine essentielle Vorstufe von Biotin in Mikroben, Pilzen und Pflanzen. Bisher konnte die Biosynthese von PIM nur in Bakterien (E. coli und B. subtilis) aufgeklärt werden. Es gibt keine Hinweise auf einen analogen Mechanismus in Pflanzen. Eine biologische Aktivität von AZA bei Pflanzen konnte erst vor kurzem beschrieben werden. Eine Forschergruppe identifizierte AZA als Metabolit, der nach Infektion mit dem Pathogen Pseudomonas syringae vermehrt im Phloemsaft von Arabidopsis vorhanden ist und der in Pflanzen eine lokale und systemische Resistenz gegenüber dem Pathogen induziert. In Tieren sind Fettsäurefragmente ebenfalls Gegenstand aktueller Forschung. Es ist bekannt, dass eine nichtenzymatische oxidative Fragmentierung von Fettsäurehydroperoxiden in komplexen Membranlipiden als Folge von oxidativem Stress abläuft. Phospholipide mit veresterter ONA / AZA spielen aufgrund ihrer Struktur eine Rolle als endogene Liganden bei Reaktionen des angeborenen Immunsystems. Ziel dieser Arbeit war es, die Mechanismen der Oxidation von Fettsäuren und deren Fragmentierung in Pflanzen aufzuklären. Weiterhin sollte die Rolle der oxidierten Fragmente in der Immunantwort der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht werden. In Pflanzen wurden fragmentierte Fettsäuren im Rahmen dieser Arbeit erstmals in komplexen Lipiden identifiziert und verschiedene Hypothesen zur Bildung von Fettsäurefragmenten experimentell überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass die Biosynthese der Fettsäurefragmente in A. thaliana ausgehend von zwei- oder dreifach ungesättigten Fettsäuren stattfindet. 9- und 13-Lipoxygenasen (LOX1, LOX5 und LOX2) spielen dabei keine essentielle Rolle. Die Fettsäurefragmente konnten in Arabidopsis in freier Form und in komplexen Lipiden verestert (ausschließlich in Galactolipiden) detektiert werden. Applikationsexperimente zeigten, dass die Biosynthese der Fettsäurefragmente in den komplexen Lipiden auf nichtenzymatischem Wege in situ stattfindet. Dabei wird in Übereinstimmung mit den experimentellen in vitro und in vivo Daten als Reaktionsmechanismus die Dimer-Hypothese der Arbeitsgruppe um Alan Brash vorgeschlagen. In grünen Pflanzenteilen verläuft die Biosynthese demzufolge in drei Schritten ab: Im ersten Schritt entsteht ein „Pool“ von oxidierten Galactolipiden mit Hydroperoxid-Acylketten (mit konjugierten Dienen). Diese Hydroperoxide entstehen fortlaufend durch Oxidation der Fettsäureacyle mittels Singulett Sauerstoff in Plastiden. Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae (avirulenter Stamm) wird der „Pool“ von Galactolipidperoxiden durch die katalytische Einwirkung von freien Radikalen und der LOX2 erhöht. Im zweiten Schritt findet eine Radikal-katalysierte Addition von Peroxylradikalen an Fettsäurehydroperoxide statt, wobei Lipid-Peroxid-Dimere gebildet werden. Diese instabilen Zwischenprodukte zerfallen spontan in vier Produkte, darunter zwei Aldehyd-Fragmente, ein Alkoxyradikal und ein Hydroxylradikal. Bemerkenswert ist, dass durch die Fragmentierung des Dimers weitere Radikale de novo entstehen. Im dritten Schritt können die in Galactolipiden veresterten Oxocarbonsäuren zu Dicarbonsäuren oxidiert werden. Hydroperoxide, die Vorläufer der Fettsäurefragmente, wurden in freier Form und in komplexen Lipiden verestert analysiert. Unter basalen Bedingungen liegt sowohl bei den freien, als auch bei den veresterten Hydroxyfettsäuren ein fast komplett Singulett Sauerstoff abhängiger Oxidationsmechanismus vor. Drei Galactolipid Hauptspezies (Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG)-18:3-16:3, Digalactosyldiacylglycerol (DGDG)-18:3-18:3 und DGDG-18:3-16:3) sind hoch oxidiert (5 bis 9 Mol-%, relativ zur jeweiligen Vorstufe). MGDG-18:3-18:3, ebenso wie Phosphatidylglycerol-, Phosphatidylinositol- und Triacylglycerol-Hydroxyfettsäurespezies liegen basal nur schwach oxidiert vor (< 2 Mol-%). Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae kommt es zu einer massiven Lipid Biosynthese und Oxidation durch die 13-Lipoxygenase LOX2, Singulett Sauerstoff und freie Radikale. Der Oxidationsgrad der Hydroxyfettsäuren in den Galactolipiden ändert sich kaum. Innerhalb der Triacylglycerole kommt es zu einem großen Anstieg der oxidierten Spezies (auf 12 bis 38 Mol-%). Die Oxidation und Fragmentierung der Fettsäuren in den Galactolipiden unter basalen Bedingungen und induziert durch die Pathogenbehandlung, stellen einen wichtigen biochemischen Prozess dar, auf dem PIM und AZA entstehen. N2 - The biosynthesis of fragmented fatty acids (short chain bicarboxylic acids and their precursor oxoacids) has not been established in plants. Important and common bicarboxylic fatty acids are pimelic acid and azelaic acid (PIM and AZA) and their putative precursors 7-oxoheptanoic acid (OHA) and 9-oxononanoic acid (ONA). Interest in the biogenetic origin of these unusual fatty acids stems from the fact that these fragmented fatty acids are involved in important biological processes. PIM is an established precursor of biotin in bacteria, fungi and plants. PIM biosynthesis has only recently been clarified in bacteria (E. coli and B. subtilis) and there is yet no evidence that an analogous pathway is operative in plants. Moreover, AZA has been identified as a pathogen-induced metabolite in Arabidopsis vascular sap that has been reported to prime local and systemic resistance against the pathogen Pseudomonas syringae. In animals, non-enzymatic fragmentation of fatty acid hydroperoxides is known to occur in complex membrane lipids during oxidative stress. ONA and AZA comprising phospholipids serve as endogenous pattern recognition ligands in the innate immune system of animals. The aim of this work was to clarify the mechanisms of fatty acid oxidation and fragmentation as well as the function of the oxidized fragments in the immune response of the model plant Arabidopsis thaliana. Within this work, fragmented fatty acids have been identified in complex lipids of plants for the first time and different hypotheses for the biosynthesis of fragmented fatty acids were examined. It could be shown that dienoic or trienoic fatty acids are precursors of fatty acid fragments in Arabidopsis thaliana. 9- and 13-lipoxygenases (LOX1, LOX5 and LOX2) are not essential for biosynthesis. In Arabidopsis fragmented fatty acids could be identified in free form and esterified in complex lipids, exclusively galactolipids. Application experiments revealed that biosynthesis of fatty acid fragments takes place in galactolipids in situ in a non-enzymatic way. Interpretation of in vitro and in vivo results lets suggest a reaction mechanism due to dimer hypothesis from Alan Brashs working group. The fragmentation process in green organelles was found to proceed through three steps. An initial and essential event is the formation of a pool of galactolipids comprising acyl hydroperoxides with conjugated dienes. These hydroperoxides are generated continuously in plastids through oxidation of fatty acyls by singlet oxygen. After infection with the avirulent strain of Pseudomonas syringae pathovar tomato the pool of galactolipid-peroxides is increased by catalytic impact of free radicals and lipoxygenases. In a second step, peroxy radical addition to fatty acid hydroperoxides results in dimerization of peroxides thereby forming an unstable intermediate that spontaneously decomposes to yield two aldehyde fragments, an alkoxy radical and a hydroxy radical. Notably, decomposition of the dimer leads to a de novo production of radicals. In a third step oxoacids esterified in galactolipids could be oxidized into bicarboxylic acids in a radical catalyzed process. Hydroperoxides, precursors of fatty acid fragments, were analyzed reduced to hydroxy fatty acids, in free form and esterified in complex lipids. Under basal conditions, some complex lipids were found to be highly and almost exclusively oxidized by singlet oxygen. Three galactolipid species (monogalactosyldiacylglycerole (MGDG)-18:3-16:3, digalactosyldiacylglycerole (DGDG)-18:3-18:3 and DGDG-18:3-16:3) showed highest level of oxidation with 5 to 9 mol-% (relative to their precursors). MGDG-18:3-18:3, as well as phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol and triacylglycerol species are only slightly oxidized (< 2 mol-%). After P. syringae infection, massive lipid biosynthesis and oxidation by 13-lipoxygenase LOX2, singlet oxygen and free radicals was observed. Degree of oxidation in galactolipids was almost the same but hydroxylated triacylglycerol species showed a strong increase (up to 12 until 38 mol-%). Basal and pathogen-induced fatty acyl oxidation and fragmentation in galactolipids might be an important and general biochemical process yielding the essential biotin precursor PIM and AZA, which has previously been shown to prime the local and systemic immune response of A. thaliana. KW - Schmalwand KW - Arabidopsis KW - Pseudomonas KW - Interaktion KW - Pimelinsäure KW - Azelainsäure KW - Arabidopsis KW - Pseudomonas KW - interaction KW - pimelic acid KW - azelaic acid Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71614 ER - TY - THES A1 - Kraich, Michael T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System T1 - Structural and functional studies of the interaction between ligand and receptor in the interleukin-4 and interleukin-13 system N2 - Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. N2 - Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules. KW - Renaturierung KW - Ligand KW - Biochemie KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 13 KW - Interaktion KW - Rezeptor KW - Immunologie KW - Allergie KW - Allerg KW - Proteinbiochemie KW - BIAcore KW - Oberflächenplasmonresonanz (SPR) KW - Strukturbiologie KW - interleukin-4 KW - interleukin-13 KW - protein interaction KW - BIAcore KW - structural biology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655 ER - TY - THES A1 - Kretzschmar, Martin T1 - Antigenpräsentation zwischen naiven CD4+ T-Lymphozyten und dendritischen Zellen: Interaktionsdynamik und Kalzium-Signalgebung in 3D Kollagenmatrices und multizellulären Aggregaten T1 - Antigen Presentation of naive CD4+ T-Lymphocytes and dendritic Cells: Interaction dynamics and Calcium Signalling in 3D Collagen Matrices and multicellular Aggregates N2 - Die Interaktion von CD4+ T-Zellen mit antigenpräsentierenden dendritischen Zellen (DC) verläuft in statischen und dynamischen Phasen, die jeweils zur Ausbildung einer immunologischen Synapse und T-Zell-Aktivierung führen. Um die Signalgebung in den stabilen wie auch dynamischen Phasen näher zu charakterisieren, wurde der Kalziumeinstrom während der T-Zell-Aktivierung zeitaufgelöst untersucht. Dies wurde in 3D Kollagenmatrices und zusätzlich in 3D Zellclustern durchgeführt, um zu klären, ob sich dynamische produktive Kontakte auch in kollagenfreien, räumlich komplexen Mikromileus ausbilden. Kokulturen aus murinen, naiven CD4+ T-Zellen (DO 11.10) und Ova-Peptid beladenen DC (BALB/c) in 3D Kollagenmatrix sowie die T-Zell/DC Cluster in Flüssigkultur wurden mittels Konfokalmikroskopie gefilmt. Die Zelldynamik wurde digital analysiert. Der Ca2+-Einstrom der T-Zellen wurde mittels zeitaufgelöster Fluo 3-Detektion semiquantitativ analysiert. Sowohl im Kollagengel wie auch in Flüssigkulturen erfolgte wenige Sekunden nach der initialen Kontaktaufnahme über die Vorderfront der T-Zelle ein starker Ca2+-Einstrom in die T-Zelle. Das Signal blieb während der gesamten Interaktion und der Ablöse-Phase, solange der Uropod der T-Zelle mit der DC verbunden war, kontinuierlich erhöht. In den sich spontan bildenden multizellulären Clustern erbrachte die morphodynamische Analyse von Kontakten Ca2+-positiver T-Zellen je 50% dynamische bzw. stabil-statische Kontakte, zu deren Dynamik sowohl die T-Zellen als auch die DC beitrugen. Die Geschwindigkeit der dynamischen Kontakte betrug ca. 4 μm/min (1-6 μm/min) und lag damit ca. 50-90% unterhalb der Geschwindigkeit der freien Migration im Kollagen. Analog zu Interaktionen im 3D Kollagengel wurden für Ca2+-positive T-Zellen produktive serielle und teils simultane Kontakte mit mehreren DC nachgewiesen. Der Nachweis dynamischer produktiver Kontakte in kollagenfreien Zellclustern legt einen promigratorischen Effekt der umgebenden räumlichen Komplexität selbst nahe. Das Spektrum von statischen und dynamischen Interaktionsphasen in Abhängigkeit von der räumlichen Komplexität repräsentiert so eine inhärente Eigenschaft der Zelldynamik von T-Zellen und bildet Teilaspekte des in vivo Verhaltens von T-Zellen in Lymphknoten ab. Zukünftige Studien sind notwendig, um zu klären, wie Interaktionscharakteristika auch zur Differenzierung, Effektorfunktion und/oder Anergie von T-Zellen beitragen. N2 - The interaction of CD4+ T cells with antigen presenting dendritic cells (DC) progresses in static and dynamic phases, each resulting in the formation of a immunologic synapse and subsequent activation of T cells. To characterise the signalling in static and dynamic contacts and to determine the dynamics of productive interactions in a collagen free 3D environment, time resolved calcium measurement was performed in 3D collagen matrices as well as in multicellular clusters. Murine naive CD4+ T cells (DO 11.10) and ova-peptide loaded dendritic cells (BALB/c) were coincubated in 3D collagen matrices or in liquid culture, here spontaniously aggregating to multicellular clusters. Interactions were filmed with confocal microscopy. Dynamics were digitally analysed. Ca2+ influx was semiquantitavely analysed by time resolved detection of Fluo 3. In collagen matrices as well as in liquid culture a strong Ca2+ influx within seconds after contact acquisition via the leading edge of the T cell was detected. This signal of elevated intracellular Ca2+ concentration was maintained during the whole interaction and detachement phase as long as the uropod was connected to the dentritic cell. In multicellular clusters 50% of contacts of T cells with elevated intracellular Ca2+ concentrations showed dynamic interaction characteristics with both, T cells and dendritic cells contributing to the dyamics of the interaction. Velocity of contacts was 4 μm/min (1-6 μm/min)witch is 50-90% less then the velocity of free migrating T cells in collagen. Multiple sequential and simulataneous contacts of Ca2+ T-cells with DC were registrated. The finding of dynamic contacts in collagen free 3D environments, as shown here in multicellular clusters, indicates a promigratory effect of the spatial complexity of environments itself.The spectrum of static and dynamic interactions in dependence to the spatial complexity of the environment indicates an intrinsic quality of the dynamics of T cells and may represent aspects of interaction behaviour of T cells in lymphnodes in vivo. Future studies will show, how this interaction characteristics influence differentiation and effector function of T cells. KW - Antigenpräsentation KW - Interaktion KW - Dynamik KW - Kalzium KW - Antigenpresentation KW - Interaction KW - Dynamics KW - Calcium Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18915 ER - TY - THES A1 - Brand, Normen T1 - Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine T1 - Localization, regulation and interactions of murine DNA replication proteins N2 - Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gewährleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform für weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abhängigkeit von Cdc6 und Cdt1 den prä-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase für die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies ermöglicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen für drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und räumlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivität und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgeführt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate für die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen ist für das Verständnis der Vorgänge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 und Plk1 & Dbf4 gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch überexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung für die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschränkt ist. Mit der erst kürzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilität des binären Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erhöhten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 führt. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzelluläre Lokalisation und die intranukleäre Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilität von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert. N2 - Eukaryotic DNA replication is a crucial event in the cell cycle ensuring precise duplication of the genome by the coordinated action of a multitude of proteins. To cope with this enormous logistical challenge DNA replication is organized in multiple steps comprising initiation processes, elongation and DNA repair. The initiation step is characterized by the chromatin association of the hexameric ORC (origin recognition complex) which selects controversely discussed DNA sequences as replication origins and serves as a landing pad for further protein components. The MCM complex consisting of the six subunits Mcm2-7 accomplishes the pre-RC in a Cdc6- and Cdt1-dependent manner and is supposed to be released from the origin following initiation to act as DNA helicase, triggering the unwinding of the DNA double helix. This allows the proteins of the elongation machinery to accurately synthezise DNA at distinct microscopically visible sites termed replication foci. A major component of replication foci, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) acts as a sliding clamp tethering the DNA polymerases and further replication factors to DNA. Within the scope of this thesis, the distribution of ORC, MCM and PCNA proteins was investigated in murine L fibroblasts by dual-color immunofluorescence (IF) studies. It could be shown that the proteins of the ORC, the MCM complex and the elongating machinery constitute locations for three different mechanistical events involved in DNA replication which occur at distinct and spatially separated sites, i. e. initiation, helicase activity and elongation. Additionally, IF studies suggest, that histone acetylation is involved in the selection of origins and the recruitment of the pre-RC to chromatin. The assembly of the pre-RC begins in mitosis and is regulated by the activity of multiple protein kinases. To test whether the key regulator of mitotic events, POLO-like kinase1 (Plk1), is capable of phosphorylating pre-RC components, in vitro kinase assays were carried out using full-length Plk1 and a kinase-deficient mutant Plk1 (K82M) as a negative control together with bacterially expressed target proteins. Orc2, Cdc7 and Cdc45 were found to be in vitro substrates of the Plk1 kinase. Furthermore, IF studies using specific antibodies against Orc2, Cdc7 and Cdc45 revealed conspicuous staining patterns for the Plk1 substrates in mitosis. While Orc2 was accumulated in the midbody region in telophase, Cdc7 was localized at the centrosomes and micotubules in anaphase. Cdc45 was found at the centrosomes and the microtubules from prometaphase to anaphase, and in the midbody region during telophase, strikingly matching the mitotic localization patterns of Plk1. The detection of protein-protein interactions is crucial for the understanding of the course of events in DNA replication. By using the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique interactions among components of the pre-RC were analyzed in living mammalian cells. The BRET studies revealed direct interactions between Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 and Plk1 & Dbf4. Furthermore, the influence of histone hyperacetylation, as well as the depletion of cyclin-dependent kinases (CDK) on the interaction between Orc2 and Orc3 was investigated. Orc2 and Orc3 were found to be localized in the nucleus and the cytoplasm. To investigate, whether nuclear import of Orc3 is a prerequisite for the interaction of Orc2 with Orc3 to occur, a putative nuclear localization signal (NLS) in the aminoterminal region of Orc3 was truncated in an EGFP-ORC3 fusion construct. Expression of this mutant in L fibroblasts and HEK293T cells resulted in exclusive cytoplasmatic localization. BRET assays using ORC2-Rluc and the NLS-deficient EGFP-ORC3 mutant were performed. In this experiment, a BRET signal was obtained which was indistinguishable from that obtained with wild-type EGFP-ORC3. Together, these findings strongly suggest that the interaction between Orc2 and Orc3 is not restricted to the nucleus. The nuclear as well as the cytoplasmatic distribution of the localization between Orc2 and Orc3 could furthermore be confirmed with a recently developed BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assay. FLIP (fluorescence loss in photobleaching) studies with BiFC-positive cells showing exclusive nuclear distribution revealed decreased mobility of Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) compared with EGFP fusion proteins of Orc2 (t ½ = 8 s) and Orc3 (t ½ = 6 s), suggesting that the association with its binding partner leads to an enhanced capability of Orc2 and Orc3 to bind to chromatin. Additionally, the influence of point mutations on the subcellular localization and intranuclear dynamics of a Cdc6-EGFP fusion protein, previously shown to be localized in replication foci, was analyzed. Further, the mobility of promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) and PML-associated proteins was investigated. KW - Maus KW - Replikation KW - Proteine KW - Interaktion KW - Regulation KW - DNA-Replikation KW - Zellzyklus-Kontrolle KW - präreplikativer Komplex KW - Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer KW - DNA replication KW - cell cycle control KW - pre-replicative complex KW - bioluminescence resonance energy transfer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057 ER - TY - THES A1 - Stürmer, Andrea T1 - Interaktionen und Lokalisationen der Replikationsproteine der Maus T1 - Interactions and Localizations of murine Replication Proteins N2 - Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des präreplikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgelöst wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich für die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivität der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin für den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den präreplikativen Komplex vervollständigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzuklären. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-Färbung mit Antikörpern gegen eine konservierte Domäne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antikörpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch für die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zusätzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte über Immunpräzipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin präzipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine während der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down“ des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System ermöglicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte Störung des Zellwachstums hin. Zusätzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollständig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen möglichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auffällig häufig lagen in MCM3-„knock-down“-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Phänotypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukleärer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zurückzuführen. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down“-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des präreplikativen Komplexes eine zusätzliche Funktion in der Mitose ausüben. N2 - The initiation of DNA replication is a highly conserved process which is subdivided into three steps. The first step is the binding of the “origin recognition complex” (ORC) to the replication origins in chromosomal DNA which triggers the assembly of the prereplicative complex at the origins. Subsequently the proteins CDC6 and the RLF-B/CDT1 bind to ORC which are both responsible for the recruitment of the heterohexameric MCM-complex to the prereplicative complex (preRC). The kinase CDC7/DBF4 licenses the origin after completion of the preRC by binding of the CDC45 protein. One task of this work was to dissolve the complex network of protein-protein interactions between the different initiator proteins using the method of FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Interactions were found between MCM5 and MCM3, MCM5 and MCM7, ORC5 and MCM7 as well as between CDT1 and MCM6. A further task of this work was to study the intracellular localization of the six murine MCM proteins in murine fibroblasts.In a MCM2-EGFP expressing cell population multinucleated cells occurred frequently. This indicates an incorrect cell division caused by overexpression of MCM2-EGFP and to a possible role of MCM2 in mitosis. Inspecting the intracellular localization of EGFP-fused MCM-proteins was shown, that EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, and EGFP-MCM7 were localized in the centrosomes. In contrast, the proteins MCM2-EGFP, EGFP-MCM2, MCM3-EGFP, EGFP-MCM3, MCM6-EGFP, MCM6-NLS-EGFP, MCM7-EGFP and MCM7-NLS-EGFP are not associated with centrosomes. The localization of endogeneous MCM proteins was analyzed by immunostaining using antibodies against a conserved region among all MCM proteins and also with specific antibodies against MCM3 and MCM6. Centrosomal localization was observed for the MCM proteins and in particular for MCM3 and MCM6. In addition to localization studies, immunoprecipitations showed that MCM3 and MCM6 precipitate with the centrosomal protein g-tubulin. The fact that all MCM proteins assemble at the centrosome, indicates that the MCM proteins act as a multiprotein complex at the centrosome. Since MCM3 and MCM6 are bound to centrosomes in all stages of mitosis these proteins may play a role in the progression of cell division. In the last part of this work, the function of MCM3 at the centrosome was analyzed by protein knock-down using the method of RNA interference. To approach this, an inducible MCM3siRNA-expressing system was established. Switching the transcription of MCM3siRNA on and off was made feasible using the TetOn-System. In this system the transcription is activated by addition of doxycycline, without doxycycline the transcription is switched-off. The influence of doxycycline on cell growth of the MCM3siRNA-expressing cell line was analyzed. By comparison to NIH/3T3 cells and NIH/3T3-TetOn cells a significantly reduced proliferation rate was observed after treatment with doxycycline. These results suggest a disturbance of cell growth by MCM3siRNA production. After treatment with doxycycline more cells are accumulated in G2/M phase compared to untreated cells. The expression of MCM3 was almost completely knocked-down by treatment of cells with doxycycline for 19 days. To analyze the influence of MCM3siRNA on other MCM proteins, the protein level of MCM6 was examined. An increased MCM6 expression was observed. This implies that MCM3siRNA influences the expression level of MCM6. More nuclei were frequently observed in MCM3 knocked-down cells. Cells with two nuclei as well as cells with an impaired number of nuclei were observed, indicating that probably the nuclei pass thruogh different cell cycle stages. Phenotypes observed after expression of MCM3siRNA showed defects in multiple stages of mitosis. The presence of multinucleated cells is apparently due to a blocked cytokinesis. Microtubuli were insufficiently organized and were deficiently bound to the cellular periphery. These results indicate an essential role of the MCM proteins in mitosis besides its described role in the establishment of the prereplicative complex. KW - Replikation KW - Maus KW - Proteine KW - Interaktion KW - Replikation KW - Lokalisation KW - Interaktion KW - Proteine KW - replication KW - localization KW - interaction KW - proteins Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9563 ER -