TY - THES A1 - Drescher [geb. Knievel], Eva T1 - Das KCNJ6-Gen als Kandidatengen für Persönlichkeitsstörungen T1 - The KCNJ6 gene as a candidate gene for personality disorders N2 - Persönlichkeit wird zum einen durch genetische Einflüsse, zum anderen durch Erziehung und Umweltfaktoren geprägt. In heutigen Tagen ist es weitestgehend akzeptiert, dass das menschliche Naturell und die Persönlichkeit durch vielfältige genetische Faktoren beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Genotypisierung an einer Patientenstichprobe, bestehend aus Patienten der Universitätsklinik Würzburg, mit der gesicherten Diagnose einer Persönlichkeitsstörung, und einem Kollektiv aus gesunden Probanden (Bevölkerungskollektiv) durchgeführt. Es wurden zwei verschiedene Gen-Polymorphismen (rs7275707 und rs722557) des Kandidatengens KCNJ6 hinsichtlich ihrer Beteiligung an Persönlichkeitsstörungen untersucht. Das von diesem Gen codierte Protein ist ein G-protein aktivierter einwärtsgleichrichtender Kaliumkanal (GIRK2). Es konnte zwar ein signifikanter Zusammenhang zwischen einem Single-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) in dem Kandidatengen KCNJ6 und der antisozialen sowie Borderline-Persönlichkeitsstörung nachgewiesen werden, die molekulargenetischen Entstehungswege bis hin zur phänotypischen Ausprägung der Persönlichkeitsstörung sind allerdings multifaktoriell und an viele Rezeptor- und Neurotransmittersysteme gekoppelt. Der Ursprung kann auf den Austausch bzw. die Variation einer einzelnen Base im DNA-Strang zurückgeführt werden, im Ganzen betrachtet bleiben die Entstehung der Persönlichkeit und die daran gekoppelten Störungen aber ein multidimensionaler Prozess. N2 - Personality of a human beiing is based on the one hand on genetic conditions, on the other hand on education and social environment. Nowadays it is broadly accepted, that human disposition and personality is influenced by a variety of genentic factors. In this study we compared patients with a diagnosis of a personality disorder in comparison to healthy candidates via genotyping. We focused on the role of the two gene polymorphisms (rs 7275707 and rs 722557) of the candidate gene KCNJ6. This gene encodes for an inwardly rectifying potassium channel (GIRK2). Though an association between one single nucleotide polymorphism(SNP) of our candidate gene and the antisocial personality disorder and the Borderline-Disorder was found, the molecular genetic pathways from the origin to the expression of the phenotype is multifactorial and linked to many systems of receptors and neurotransmitters. The origin of a disorder can be explained by the exchange of one base in the DNS, but in total the development of personality and the linked disorders are a multidimensional process. KW - Kaliumkanal KW - Borderline-Persönlichkeitsstörung KW - Dissoziale Persönlichkeitsstörung KW - KCNJ6 KW - GIRK 2 KW - G-protein inwardly rectifying potassium channel Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162231 ER - TY - THES A1 - Förster, Sabrina T1 - Regulation des Kaliumausstroms im ABA- und Jasmonatvermittelten Stomaschluss T1 - Regulation of Potassium Efflux in the ABA- and Jasmonate-controlled Stomatal Closure N2 - Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden. N2 - Stomata are microscopically small pores in the leaf surface of land plants, through which the leaf tissue is supplied with CO2. To protect the plant from both desiccation and infection by pathogens, a mechanism evolved to adjust the pore width to the plant’s needs by movement of the surrounding guard cells. A dense signaling network controls these movements and is able to integrate external as well as internal stimuli. Stomatal closure is osmotically driven by the loss of turgor in guard cells caused by efflux of ions such as K+. In this work, we investigated the regulation by phosphorylation of the main K+ efflux channel for stomatal closure, GORK. The following results were obtained with electrophysiological measurements via the DEVC- technique: GORK is phosphorylated by OST1 in a Ca2+- independent and by CBL1/9-CIPK5 as well as CBL1-CIPK23 in a Ca2+-dependent manner. CBL1 anchors CIPK5 at the plasma membrane and must bind Ca2+ for activation of CIPK5. CIPK5 requires both ATP binding and a conformational change for phosphorylation of GORK. For the first time it was shown that the PP2C phosphatase ABI2 interacts directly with an ion channel and inhibits its activity. ABI2 also interacts with the kinases OST1, CIPK5 and CIPK23, implying a control by ABI2 over channel activity in multiple ways. OST1 and ABI2 link GORK regulation with the ABA signaling pathway. Guard cells of gork1-2, cbl1/cbl9 and cipk5-2 are insensitive to MeJA, but not to ABA. This represents a direct connection between JA signal transduction and Ca2+ signaling. In this work, further hints could be found for the complex interplay of the phytohormones ABA, JA and the effector Coronatine of Pseudomonas. Here it was shown for the first time that guard cells respond differently to MeJA and the phytotoxin Coronatine, based on incubation time. Depending on the temporal sequence of perception, ABA and Coronatine act antagonistically on the pore width. Jasmonate signal transduction in guard cells leads to a minor synthesis of ABA as well as protein degradation via the ubiquitin/ 26S proteasome system and initiates stomatal closure requiring ABA receptors (PYR/PYLs). This work describes the JA-controlled regulation of the potassium efflux channel GORK as well as some differential aspects of ABA, JA and Coronatine triggered stomatal movements. KW - Ackerschmalwand KW - Stomata KW - Arabidopsis thaliana KW - Phophorylierung KW - Phytohormon KW - Spaltöffnung KW - Kaliumkanal KW - Abscisinsäure KW - Jasmonsäure KW - Pflanzenhormon Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115455 ER - TY - THES A1 - Kollert, Sina T1 - Kaliumkanäle der K2P-Familie kontrollieren die Aktivität neuronaler Zellen - TRESK als Regulator inflammatorischer Hyperalgesie T1 - Potassium channels of the K2P-family control the activity of neuronal cells - TRESK as regulator of inflammatory hyperalgesia N2 - Das Empfinden von Schmerz ist für uns überlebenswichtig. Chronischer Schmerz hingegen hat seine physiologische Bedeutung verloren und wird als eigenes Krankheitsbild angesehen. Schmerzempfindung beginnt mit der Nozizeption. Die Zellkörper nozizeptiver Neurone befinden sich in den Spinalganglien (Hinterwurzelganglion, dorsal root ganglion DRG) und Trigeminalganglien (TG). In den DRG-Neuronen macht der Zwei-Poren-Kaliumkanal (K2P) TRESK die Hauptkomponente eines Kaliumstromes, des „standing outward currents“ IKSO, aus. Die physiologische Hauptaufgabe der TRESK-Kanäle liegt in der Regulation der zellulären Erregbarkeit nozizeptiver Neurone. Während einer Entzündungsreaktion werden Entzündungsmediatoren wie Histamin, Bradykinin, Serotonin und Lysophosphatidsäure (LPA) ausgeschüttet und können durch die Aktivierung ihrer G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) oder direkte Interaktion mit Ionenkanälen die nozizeptive Erregung beeinflussen. Durch Anwendung von RT-PCR und eines neu entwickelten Antikörpers wurde die Ko-Expression von TRESK-Kanälen zusammen mit Kanälen der Transient-Receptor-Potential-Kationenkanalfamilie (TRP) und LPA-Rezeptoren in DRG-Neuronen nachgewiesen. Durch rekombinante Ko-Expression von TRESK-Kanälen und LPA2-Rezeptoren in Xenopus Oozyten konnte durch Zugabe von LPA eine fast 10-fache Aktivierung des basalen K+-Stromes erzielt werden. Die Auswertung der Dosis-Wirkungskurve ergab einen EC50-Wert von 0,2 µM LPA. Die LPA-induzierte TRESK-Stromaktivierung konnte durch die Verwendung des mutierten Kanals TRESK[PQAVAD] oder durch die Zugabe des Phospholipase C (PLC) Inhibitors U73122 verhindert werden. Dies zeigt die Beteiligung des PLC-Signalwegs und die Bindung von Calcineurin an den TRESK-Kanal bei der Stromaktivierung. TRESK ist das einzige Mitglied der K2P-Familie, das eine LPA-induzierte Aktivierung des Stromes zeigt. TREK- und TASK-1-Ströme werden durch LPA inhibiert. In DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser wird Nozizeption durch die Aktivierung von TRPV1-Kanälen durch Hitze oder Capsaicin, dem Inhaltsstoff des Chilis, und zusätzlich durch die Substanz LPA verursacht. Ein weiteres Mitglied der TRP-Familie, der TRPA1-Kanal, ist bei der verstärkten Nozizeption während einer Entzündung involviert. Werden TRESK- und TRP-Kanäle in Xenopus Oozyten ko-exprimiert, verursacht LPA gleichzeitig einen Kationeneinwärts- wie auch -auswärtsstrom. Unter diesen Bedingungen verschob sich das Umkehrpotenzial in einen Bereich zwischen den Umkehrpotenzialen von Oozyten, die nur den K+-Kanal exprimieren und von Oozyten, die nur den unspezifischen Kationenkanal exprimieren. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die LPA-induzierte Ko-Aktivierung von TRP-Kanälen und TRESK zu einer Begrenzung des exzitatorischen Effekts führen kann. Die DRG-ähnlichen F11-Zellen exprimieren keine TRESK-Kanäle. Sie sind in der Lage durch Strompulse Aktionspotenziale zu generieren. Mit TRESK transfizierte F11-Zellen zeigten eine Verschiebung des Umkehrpotenzials in negative Richtung, einen größeren Auswärtsstrom und den Verlust von spannungsgesteuerten Natriumkanälen. Auch hohe Strompulse konnten keine Aktionspotenziale mehr auslösen. Bei Spannungs-Klemme-Messungen von primären DRG-Neuronen von TRESK[wt]-Mäusen erhöhte sich der IKSO nach Zugabe von LPA um über 20 %. Im Gegensatz dazu zeigten DRG-Neurone von TRESK[ko]-Mäusen unter diesen Bedingungen eine leichte Hemmung des IKSO von etwa 10 %. In Neuronen, die TRPV1 exprimieren, führte LPA nicht nur zum Anstieg des IKSO, sondern auch zur Aktivierung eines Einwärtsstromes (TRPV1). Im Vergleich dazu wurde in TRESK[ko]-Neuronen durch LPA nur der Einwärtsstrom aktiviert. In Strom-Klemme-Experimenten führte LPA-Applikation zur Entstehung von Aktionspotenzialen mit höherer Frequenz in Zellen von TRESK[ko]-Mäusen im Vergleich zu Zellen von TRESK[wt]-Mäusen. Zusätzlich wurde die Erregung, die durch Strompulse von 100 pA ausgelöst wurde, in den beiden Genotypen durch LPA unterschiedlich moduliert. Die Aktionspotenzialfrequenz in TRESK[wt]-Neuronen wurde gesenkt, in TRESK[ko]-Neuronen wurde sie erhöht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Erregung nozizeptiver Neurone durch LPA aufgrund der Ko-Aktivierung der TRESK-Kanäle abgeschwächt werden kann. Die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen wird strak durch die Aktivität und Expression der TRESK-Kanäle kontrolliert. Deswegen sind TRESK-Kanäle gute Kandidaten für die pharmakologische Behandlung von Schmerzkrankheiten. N2 - Pain sensation is essential for survival. Chronic pain lost its physiological function and is categorized as a disease. Pain sensation is initiated by nociception. The cell bodies of nociceptive neurons are located in dorsal root ganglia (DRG) and trigeminal ganglia (TG). In DRG neurons TRESK two-pore-domain potassium channels (K2P) constitute the major current component of the standing outward current IKSO. A prominent physiological role of TRESK channels has been attributed to the regulation of pain sensation. During inflammation mediators of pain e.g. histamine, bradykinin, serotonin and lysophosphatidic acid (LPA) are released and modulate nociceptive signaling by activation of their G-protein coupled receptors (GPCR) or ionic channels. By means of RT-PCR and a newly developed antibody the co-expression of TRESK channels, channels of the transient-receptor-potential (TRP) cation channel family and LPA receptors in DRG neurons were demonstrated. Recombinant co-expression of TRESK channels and LPA2 receptors in Xenopus oocytes revealed an almost 10 fold activation of basal K+ currents upon LPA application with an EC50 of 0.2 µM LPA. Using mutant TRESK[PQAVAD] or application of the phospholipase C (PLC) inhibitor U73122 blocked current augmentation by LPA indicating cellular signaling via PLC pathway and calcineurin binding to TRESK channels. TRESK was the only member of the K2P family that showed a LPA induced activation of current. TREK- und TASK-1 currents were inhibited through LPA. In small diameter DRG neurons nociception results from TRPV1 channel activation by painful stimuli including the inflammatory substance LPA or activation of TRPA1 channels during inflammation. When TRESK and TRP channels are co-expressed in Xenopus oocytes cationic inward and outward currents were simultaneously activated by LPA. Under these conditions the reversal potential of ramp recordings was intermediate to recordings from oocytes expressing only the K+ or the unspecific cation channel. Principally this finding demonstrates that TRESK activation by an inflammatory substance dampens noxious excitation induced by the same agent. DRG-like F11 cells lacking endogenous TRESK channels generate action potential upon current stimulation. However when TRESK channels were recombinantly expressed in F11 cells, they exhibit a shift of the reversal potential to more negative values, a larger outward current and a loss of voltage-gated sodium currents. Accordingly, depolarizing pulses failed to elicit action potentials. In patch-clamp recordings from primary cultured DRG neurons of TRESK[wt] mice IKSO currents increased after application of LPA by over 20 % whereas under these conditions IKSO currents of neurons from TRESK[ko] mice decreased moderately by about 10 %. In TRPV1 positive neurons LPA application induced in TRESK[wt] neurons not only an activation of the IKSO but also an increase of the inward (TRPV1) current. In contrast, in TRESK[ko] neurons LPA only activated an inward (TRPV1) current. Under current-clamp conditions LPA application elicited spike trains in DRG neurons, with higher frequency in cells of TRESK[ko] mice than in cells of TRESK[wt] animals. In addition, upon depolarizing pulses (100 pA) excitability was differentially modulated by LPA in these genotypes. Spike frequency was attenuated in TRESK[wt] neurons and augmented in TRESK[ko] neurons. Accordingly, excitation of nociceptive neurons by LPA is balanced by co-activation of TRESK channels. It is evident that the output of sensory neurons is strongly controlled by the activity and the expression of TRESK channels, which therefore are good candidates for the pharmacological treatment of pain disorders. KW - Kaliumkanal KW - Schmerz KW - Entzündungschmerz KW - Nozizeptor KW - Entzündung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119077 ER - TY - THES A1 - Eckert, Michaela Brigitte T1 - Die Wirkung von Antidepressiva auf neuronale und kardiale Tandemporen-Kaliumkanäle T1 - Effects of antidepressants on K2P-channels in neuronal and cardiac cells N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Wirkung von Antidepressiva auf K2P-Kanäle. Sie stellen wie spannungsabhängige Ca2+, Na+ und K+-Kanäle als neuronale Ionenkanäle aufgrund ihrer Expressionsmuster und physiologischen Eigenschaften potentielle Zielproteine für Antidepressiva dar. Darum werden K2P-Kanäle in heterologen Expressionssystemen von klinisch verabreichten Antidepressiva inhibiert. Die K2P-Kanäle TREK-1, TASK-1 und THIK-1 zeigten sich in dieser Arbeit alle sensitiv auf das Antidepressivum Fluoxetin, welches die Kaliumströme der Kanäle unterschiedlich stark inhibierte. Hierbei lieferten die vorliegenden Untersuchungen den Nachweis, dass TREK-1 auf Fluoxetin am meisten, THIK-1 am wenigsten sensitiv reagiert. Der humane TREK-1 wird durch Fluoxetin in den Expressionssystemen Oozyten und HEK-Zellen zu fast 80% inhibiert, wobei bei der humanen Zelllinie nur ein Zehntel der vorher eingesetzten Antidepressivakonzentration für die gleiche Inhibition des Auswärtsstroms notwendig war. Die vorliegende Arbeit weist Inhibitionen des Kanals bei einer Fluoxetinkonzentration von 1 µM nach, was der Serumkonzentration von depressiven Patienten entspricht. Zudem wird TREK-1 durch die Antidepressiva Maprotilin, Mirtazapin, Citalopram, Doxepin und Venlafaxin inhibiert, wobei letzteres kaum eine Wirkung zeigt. Alle verwendeten Antidepressiva nutzen die gleichen Angriffspunkte am Kanalprotein, da es bei einer Koapplikation mit einem weiteren Antidepressivum oder Benzodiazepin zu keiner Inhibitionsverstärkung kommt. Die Interaktion zwischen Antidepressivum und Kanalprotein verläuft mit großer Wahrscheinlichkeit direkt und ohne „second-messenger-Wege“. Hierbei konnten die porenformende Region und der C-Terminus des Kanals als Interaktionspartner ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Translations-Initiaton generiert zwei unterschiedliche Proteinprodukte aus einem TREK-1 Transkript, eine lange Version des Proteins mit 426 Aminosäuren und zusätzlich eine kurze Version mit 374 Aminosäuren, welcher die ersten 52 N-terminalen Aminosäuren fehlen. Die Fluoxetin-Sensitivität von TREK-1 [N52] verringert sich um 70%. Dies verdeutlicht, dass die ersten 52 Aminosäuren essentiell zur TREK-1 Interaktion mit Antidepressiva beitragen. N2 - The study at hand is about the effect of antidepressants on K2P-channels. As neuronal ion-channels like voltage-gated Ca2+, Na+ and K+-channels, the K2P-channels constitute a potential target for antidepressants because of their tissue expression and physiological characteristics. Clinically prescribed antidepressants inhibit the K2P-channels in heterologous expression systems for that reason. In our experiments the K2P-channels TREK-1, TASK-1 and THIK-1 were sensitive to the antidepressant Fluoxetine, which inhibited the potassium current in different ways. The study provides evidence that TREK-1 reacts to Fluoxetine most sensitively whereas THIK-1 reacts least. The humane TREK-1 is inhibited up to 80% by Fluoxetine in expression systems oocytes and HEK-cells, in which only a tenth of the antidepressant concentration induced the same current inhibition. Our experiments showed already a channel block already at 1 µM Fluoxetine concentration, which is conform to the antidepressant serum concentration of depressive patients. Furthermore TREK-1 is inhibited by the antidepressants Maprotiline, Mirtazapine, Citalopram, Doxepin and Venlafaxine, whereas the last one showed least effects. The used antidepressants occupy the same targets at the channel protein, because a coapplication with a further antidepressant or benzodiazepine didn´t increase the maximum channel block. The interaction between antidepressant and channel protein is working directly without second messenger pathway. The pore forming region and the C-terminus of the channels could be excluded as interaction partner. Alternative translation initiation (ATI) generates two different protein products from a single transcript of TREK-1, a long version of the protein with 426 amino acids and in addition a short version with 374 amino acids, lacking the first 52 amino acids at the N-terminus. The sensitivity of TREK-1[N52] to fluoxetine declined by 70% indicating that the first 52 amino acids essentially contribute to the interaction of TREK-1 with the antidepressant. KW - Kaliumkanal KW - Antidepressivum KW - Kaliumstrom KW - Fluoxetin KW - Venlafaxin KW - potassium-channel KW - antidepressant KW - potassium KW - Fluoxetine KW - Venlafaxine Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65804 ER - TY - THES A1 - Erxleben, Franziska T1 - cDNA-Microarray-Analyse von ZNS-Kaliumkanal defizienten Mäusen T1 - cDNA-Microarry-Analysis of CNS-potassium channel deficient mice N2 - Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips“, die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchführung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen für die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen Möglichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach möglichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsvermögen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkanälen mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkanäle und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse möglich macht. Die Tatsache, dass Säugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkanälen entwickelt haben und im ständigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kanälen so interessant und wichtig für die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zurückgeführt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verfügung, die es ermöglicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und mögliche Kompensationsvorgänge aufzudecken. Damit können Zusammenhänge ermittelt werden, die die Grundlage für weitere Forschungen sein können, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln können. N2 - The aims of this dissertation were the creation of a „potassium channel chip“, the development of adequate measurement method and strategy of analysis, the performance of developmental experiments and the analysis of the status of genexpression and the occurring mechanisms of compensation in a knockout mouse stem. In beginning the selection of the potassium channel genes to be considered as interesting part of the microarray and the compilation of the sequence information was the main part of the work. Starting from this the choice of the adequate cDNA-microarray-technology and the preparation of the implementation was possible. The first experiments performed in the course of the method development have given a hint on the problems connected with every microarray. However they also have shown the great possibilities of the microarray technology. In the ollowing series of measurements like the investigation of variation of expression during the juvenile development and the comparison of different parts of the brain with the whole brain were performed. The studies were completed by the investigation of the TRESK-Knockout mouse stem in comparison to its wild type. The centre of these studies was the question for possible mechanisms of compensation. As a result kcnk16 - being part of the same gene family as TRESK - can be named as an interesting candidate to be investigated for its function and capacity of compensation in the future. In my dissertation I was able to show that the microarray technology is an adequate method for the comparison of genexpression between members of ion channel families. The bases of the microarray analysis of potassium channels with a individually designed microarray are on the one side the knowledge of the genetics and function of the potassium channels and on the other side the technology which allows this kind of analysis. The fact that mammalian organism like mouse and human have developed such a great number of potassium channels and are using these in the regular cell metabolism in a comprehensive way shows the importance of this ion channel family and makes the research on these channels so interesting and important for fundamental research. A multiplicity of diseases can be attributed indirectly or directly to gene malfunctions in potassium channels. With microarray a technology is available, which permits to investigate the expression of these genes directly and to discover possible ways of compensation. By this coherences can be identified being the basis for continuative research which one day will make it possible to really understand and treat diseases like depression. KW - Maus KW - Knockout KW - Kaliumkanal KW - Zentralnervensystem KW - Microarray KW - DNS-Chip KW - Knock-out Maus KW - TRESK KW - Zentralnervensystem KW - Hirnzelle KW - Ionenkanal KW - Spannungskontrollierter Ionenkanal KW - Differentielle Genexpression KW - Potassium channel KW - Microarray KW - CNS KW - Genexpression KW - Knock out Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65640 ER - TY - THES A1 - Dobler, Tina Melanie T1 - Tandemporenkaliumkanäle in der Amygdala T1 - Tandem Pore Potassium Channels in the Amygdala N2 - Die Neurone der medialen Amygdala spielen eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von unkonditionierter Angst und aggressivem Verhalten (Nelson and Trainor, 2007). Ihre Erregbarkeit wird höchstwahrscheinlich durch eine Hintergrundleitfähigkeit von K2P-Kanälen und ihrem molekularen Korrelat reguliert. Bisher sind 15 dieser K2P-Kanäle bekannt. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Expression und die physiologische Funktion des TASK-3, einem säure-sensitivem K2P-Kanal, in dieser Gehirnregion untersucht. Bisher konnte die TASK-3-Expression durch in situ-Hybridisierungen in erwachsenen Ratten gezeigt werden (Karschin et al., 2001). Entsprechend konnten wir einen, dem TASK-3 ähnlichen Strom, durch elektrophysiologische Ganzzellmessungen in akuten Hirnschnitten nachweisen. Um die Beteiligung des TASK-3 an diesem Gesamtstrom zu überprüfen, verwendeten wir den selektiven TASK-3 Antagonisten Ruthenium Rot oder veränderten den extrazellulären pH-Wert auf pH 6,4. Ruthenium-Rot- bzw. pH-sensitive Neurone zeigten ein negativeres Ruhemembranpotential (-56.31 mV ± 1.51; n = 17) als die Neurone, die nicht sensitive für Ruthenium-Rot oder pH-Veränderungen waren (-48.39 mV ± 1.55; n = 13; p = 0.001). Zusätzlich verstärkte Ruthenium Rot die Aktionspotenzialfrequenz und die Aktionspotenzialbreite bei Stromapplikation in den Zellen mit einem positiveren Ruhemembranpotenzial. Unsere in situ-Hybridisierungen in C57/Bl6 Mäusen zeigten eine starke Expression des TASK-3-Kanals in den Neuronen der medialen Amygdala. Darum wurde die Erregbarkeit von TASK-3 Wildtypneuronen mit denen von TASK-3-Knockoutneurone verglichen. Wir konnten einen säuresensitiven Kaliumstrom in den TASK-3 Wildtypzellen identifizieren, welche in den TASK-3 Knockoutzellen abwesend war. Überraschenderweise tauchten keine Unterschiede in der Aktionspotenzialform, dem Ruhemembranpotenzial oder des Rheobasestrom auf. Verhaltenstests zeigten, dass TASK-3 Wildtyp Mäuse auf die Präsentation von TMT, ein Duftstoff aus den Fäkalien von Füchsen, stärker freezen, als TASK-3 Knockoutmäuse. Dies zeigt, dass ein Fehlen des TASK-3 zu einer geringeren Furchtantwort beiträgt. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass TASK-3 bei der zellulären Erregbarkeit von Neuronen der medialen Amygdala von Ratten eine große Rolle spielt. Diese TASK-3-Kanäle sind in der medialen Amygdala von Mäusen ebenso exprimiert, wo sie zur Verarbeitung von Furchtverhalten beitragen. N2 - Neurones of the medial amygdala play an important role in processing unconditioned fear and aggressive behaviour (Nelson and Trainor, 2007). Their excitability is supposed to be regulated by a background conductance with two-pore domain potassium channels (K2P) as its molecular correlate. So far, there are 15 K2P channels known. In this thesis the expression and the physiological function of TASK-3, an acid-sensitive K2P-channel, in this brain region was investigated. Previously, there was a TASK-3 channel expression in the medial amygdala from adult rats demonstrated by in situ-hybridisation (Karschin et al., 2001). Correspondingly, we also detected a TASK-3-like current by electrophysiological whole-cell measurements in acute brain slices. To identify the contribution of TASK-3 to the standing outward current (IKso) upon depolarising pulses we used the selective TASK-3 antagonist ruthenium red (RR) or acidification to pH 6.4. RR- or pH-sensitive neurones showed a more hyperpolarised resting membrane potential (-56.31 mV ± 1.51; n = 17) compared to neurones lacking TASK-3-like currents (-48.39 mV ± 1.55; n = 13; p = 0.001). In addition, Ruthenium Red enhanced action potential frequency and action potential width during current injections in the more hyperpolarised cells. Our in situ-hybridizations in C57/Bl6 mice indicate that the same member of the K2P, acid sensitive TASK-3 channel, is also strongly expressed in neurones of the medial amygdala of mice. We therefore compared medial amygdaloid excitability in TASK-3 wildtype and TASK-3 knockout mice. We could detect an acid sensitive potassium current in the TASK-3 wildtype mice, which was absent in the TASK-3 knockout mice. Surprisingly, we could not detect significant differences in parameters defining the shape of an action potential, the resting membrane potential or the rheobase current. Behavioural tests analyzing the freezing behaviour showed that TASK-3 wildtype mice do react stronger to the frightful odour of TMT than TASK-3 knockout mice. Indicating, that TASK-3 knockout mice do have less fear response. Taken together, these data suggest that TASK-3 channels are very important in controlling cellular excitability of medial amygdaloid neurones in rats. These TASK-3 channels are also expressed in mice where they contribute to the fear behaviour of freezing. KW - Kaliumkanal KW - Corpus amygdaloideum KW - Schrecken KW - mediale Amygdala KW - Schreckstarre KW - TASK-3 KW - TMT KW - K2P KW - freezing Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57043 ER - TY - THES A1 - Fuchs, Lorenz T1 - Interaktion von Kir2-Kanälen mit 7-Helix-Rezeptoren T1 - Regulation of Kir2 channels by seven-helix-receptors N2 - Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (Kir), aktuell in die 7 Unterfamilien Kir1-Kir7 eingeteilt, sind an der Regulation einer Vielzahl von Körperfunktionen, beispielsweise Herzfrequenz, Erregbarkeit von Nervenzellen, Tonus von Gefäßmuskelzellen, Hormonsekretion oder Aktivierung von Immunzellen, beteiligt. Für die Kontrolle dieser Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Leitfähigkeit dieser Kanäle beeinflusst werden kann. Die Kir3-Unterfamilie (früher GIRK für G-protein-activated-K+-channels) wird beispielsweise obligat durch die direkte Bindung der beta/gamma-Untereinheit des trimeren Gi/0-Proteins aktiviert (Karschin, 1999). Es gibt Hinweise in der Literatur, dass auch die stark einwärts gleichrichtenden Kanäle der Kir2-Familie durch G-Proteine der Gq-Familie reguliert sein können. Dabei widersprechen sich insbesondere zwei Untersuchungen zur Spezifität der Interaktion (Jones, 1996; Chuang et al., 1997). Ebenso ist der intrazelluläre Signalweg bislang nicht hinreichend geklärt. Um dies genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit die Kir-Kanäle Kir2.1-Kir2.4 jeweils mit 5 verschiedenen Gq-gekoppelten Rezeptoren in Xenopus-Oozyten koexprimiert und mit der Technik der „Zwei-Elektroden-Spannungsklemme“ der Strom über die Kir-Kanäle vor und nach Rezeptoraktivierung mit dem jeweils physiologischen Rezeptoragonisten gemessen. Es zeigte sich, dass ausschließlich Kir2.3 nach Aktivierung des M1-Acetylcholinrezeptors inhibiert wird. Eine Sequenzanalyse zeigte in der Extrazellulärregion von Kir2.3 eine zu den anderen Kir2-Kanälen abweichende Aminosäuresequenz, welche durch Mutation aber als potentielle Bindestelle zur Vermittlung des inhibitorischen Effektes ausgeschlossen werden konnte. Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die Koexpression von Kir2.3 und M1-Acetylcholinrezeptor in bestimmten Gehirnregionen der Kontrolle neuronaler Erregbarkeit dient (Shen et al., 2007), ist es wahrscheinlich, dass derselbe Mechanismus auch in ventrikulären Kardiomyozyten existiert und dort als Schutzmechanismus vor vagaler Überstimulation fungiert. N2 - Inwardly rectifying K+ (Kir) channels, which can be classified into the subfamilies Kir1-Kir7, participate in the regulation of many functions of the human organism, e.g. heart rate, excitability of neurons or hormone release. In order to control these functions it is important that the conductance of these channels can be modulated. Channels of the Kir2 subfamily are regulated by Gi/o-coupled as well as Gq/11-coupled receptors. So far, it is still under debate whether these receptors selectively target to different members of the Kir2 subfamily. In order to investigate this issue rat Kir2.1-2.4 and Gq-coupled seven-helix receptors were coexpressed in Xenopus laevis oocytes and two electrode voltage-clamp measurements were performed recording the inwardly rectifying potassium currents before and after receptor activation. We showed that Kir2.3 is selectively inhibited by activation of the acetylcholine M1 receptor, whereas Kir2.1, 2.2 and 2.4 are not affected by activation of the M1 receptor. All other Gq-coupled receptors tested have no influence on Kir2 currents. Furthermore, mutation of a putative binding site within the extracellular loop between transmembrane region M1 and the pore region of rat Kir2.3 has no influence on M1 receptor induced inhibition. As it has been demonstrated that the cholinergic modulation of Kir2.3 channels selectively elevates dendritic excitability in certain brain areas (Shen et al., 2007), we postulate that the same mechanism also exists in cardiomyocytes in order to protect the heart function against an overwhelming parasympathetic stimulation. KW - Ionenkanal KW - Kaliumkanal KW - Muscarinrezeptor KW - Kir-Kanäle KW - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren KW - inward rectifier KW - seven-helix receptor KW - acetylcholine M1 receptor Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39000 ER - TY - THES A1 - Dunkel, Marcel T1 - Untersuchungen zur Translokation und Funktion von Tandem-Poren Kaliumkanälen der TPK-Familie aus Arabidopsis thaliana T1 - Targeting and function of Arabidopsis thaliana tandem pore potassium channels belonging to the TPK family N2 - • Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor. N2 - • The model plant Arabidopsis harbours 15 genes encoding potassium selective channels. Five of them belong to the structural class of tandem-pore K+ channels and are therefore called TPK channels. • Blast searches revealed the occurrence of TPK channels in many eucaryots, but not in procaryots. Plant TPK channels cluster in a phylogenetic analysis and branch into a TPK1- and a TPK2-subfamily. The evolution Arabidopsis TPK2-subfamily members (TPK2, TPK3, TPK4, and TPK5) can be attributed to distinct large-scale duplication events in ancestral genomes. Further more phylogenetic analysis showed the relatedness of the one-pore potassium channel KCO3 to TPK2. • The trafficking of the four vacuolar membrane intrinsic TPK channels (TPK1, TPK2, TPK3, and TPK5) utilizes the secretory path, from the endoplasmic reticulum (ER), via Golgi apparatus and maybe intermediate compartments to the lytic vacuole. The carboxy terminus (CT) of TPK1 was critically involved in both ER and Golgi sorting steps. The minimal requirement for vacuolar localisation was the proximal CT up to the Ca2+-binding EF-hand I. Due to mutational analyses one of several di-acidic motifs consisting of aspartate, leucin, and glutamate (aa 296-298) could be identified as the essential ER-export motif. By this TPK1 likely interacts with the coat of COPII vesicles, which adopt the ER to Golgi transport. Like TPK1 the orthologs of the TPK1-subfamily, but not the Arabidopsis homologs, exhibit the same di-acidic motif. In agreement vacuolar trafficking of TPK3 was independent of its CT. • TPK4 is the solely plasma membrane integral AtTPK channel and thus its currents can be recorded at the plasma membrane of Xenopus leavis oocytes. Mutation of in plant TPK channels perfectly conserved pore aspartates (D86N; D200N) knock-out TPK4 channel function and suggest a dimeric assembly similar to that of animal tandem-pore channels. Employing TPK4 as matrix for the expression of the pore domains of the vacuolar TPKs in Xenopus oocytes, I could show the capability of TPK2, TPK3 and TPK5 to complement TPK4. Therefore these channels probably form instantaneous, voltage-independent and potassium selective channels in the vacuolar membrane. Existence of one 14-3-3 binding motif each and one EF-hand (except TPK5) implicates Ca2+ and 14-3-3 dependent activation of those channels like seen for TPK1. • Further combination of structural, mutational and electrophysiological analyses led to the identification of another pore aspartat (Asp 110) essential for the potassium permeation and responsible for the inward rectification. The charged side chain of this Asp 110 faces the water cavity and thus could concentrate and coordinate potassium in the pore as well as interact with cationic blockers like e.g. Mg2+ or polyamine. Again, conservation among the Arabidopsis TPK2-subfamily members suggests that the vacuolar TPKs (except TPK1) are regulated by cytoplasmic blockers and exhibit weak inward rectifiying properties, too. • In contrast to inward rectification current reduction due to cytoplasmic acidification is voltage-independent and thus likely protonation dependent. Due to chimera and deletion mutants of TPK4 the possible sites of the pH-Sensor as well as the gate could be narrowed down to a few residues in the transition zone of transmembrane and cytoplasmic domains, but the essential residues remain elusive. KW - Vakuole KW - Translokation KW - Endoplasmatisches Retikulum KW - Kaliumkanal KW - TPK KW - KCO KW - ER-Export KW - diazidisches Motiv KW - DEVC KW - particle bombardment KW - double electrode voltage clamp KW - targeting Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34743 ER - TY - THES A1 - Kugler, Sabrina T1 - Wirkung von Cannabinoiden auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 T1 - Effects of cannabinoids on the two-pore-domain potassium channels TASK-1 and TASK-3 N2 - In dieser Arbeit wurde die Wirkung der ungesättigten Fettsäure Arachidonsäure, des Endocannabinoids Anandamid und des synthetischen Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN55,212-2 auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 untersucht. Dazu wurden an Xenopus Oozyten, denen die entsprechende Kanal-RNA injiziert wurde, in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme elektrophysiologische Messungen durchgeführt. Zunächst wurden für alle drei Substanzen Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt. Diese führten zu folgenden Ergebnissen: • TASK-1 wird durch WIN55,212-2 um bis zu ca. 81% gehemmt. Die IC50 beträgt 0,83 µM. Anandamid besitzt eine IC50 von 1,92 µM und hemmt den Strom um bis zu ca. 71%. Bei WIN55,212-2 bzw. bei Anandamid liegt mit einem Hill-Koeffizienten (nH) von 1,65 bzw. von 1,42 positive Kooperativität vor. Arachidonsäure hingegen inhibiert den Strom nur um bis zu ca. 63%. Die IC50 beträgt 11,3 µM. Der Hill-Koeffizient von 0,9 ergibt negative Kooperativität. • TASK-3 wird durch alle drei Substanzen deutlich weniger inhibiert. Die maximale Inhibition durch WIN55,212-2 [10µM] beträgt 32,4% (± 9,7). Fünf µM Anandamid bzw. 80 µM Arachidonsäure verursachen eine Hemmung um 32,1% (± 5,4) bzw. um 20,3% (± 5,5). Bei beiden Kanalproteinen wurde außerdem untersucht, welche Bedeutung den Aminosäuren in Position 243-248, die bei TASK-1 und TASK-3 mit Ausnahme einer Aminosäure übereinstimmen, bei der Wirkung von Cannabinoiden zukommt. Dazu wurden Mutationsstudien im Bereich des C-Terminus von TASK-1 und TASK-3 durchgeführt. • Es wurden die sechs Aminosäuren in Position 243-248 aus TASK-1 bzw. TASK-3 entfernt (TASK-1 [243-248] bzw. TASK-3 [243-248]). Die inhibitorische Wirkung von WIN55,212-, Anandamid und Arachidonsäure war bei TASK-1 [243-248] deutlich vermindert, während es bei TASK-3 [243-248] zu unterschiedlichen Effekten kam. • Der gesamte C-Terminus des TASK-1 wurde entfernt, mit Ausnahme der sechs Aminosäuren in Position 243-248. Außerdem wurden die endständigen Aminosäuren RSSV an das Restprotein angefügt, da diese für einen gut funktionierenden Transport in die Membran notwendig sind (TASK-1 [249-390RSSV]. Die Wirkungen von WIN55,212-2, Anandamid und Arachidonsäure entsprachen bei dieser Mutante denen, die beim TASK-1 [Wildtyp] beobachtet wurden. • Durch Punktmutation wurde beim TASK-3 Leucin an Position 247 durch Methionin ersetzt (TASK-3 [L247M]. Diese Mutante besitzt dadurch in Position 243-248 das gleiche Sequenzmotiv wie der TASK-1. Im Vergleich zum TASK-3 [Wildtyp] waren die Wirkungen der Cannabinoide bei dieser Mutante jedoch unverändert. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die untersuchten Cannabinoide eine rezeptorunabhängige, spezifische und reversible inhibitorische Wirkung auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 haben. Die Aminosäuren in Position 243-248 sind für diese Wirkung der Cannabinoide von wesentlicher Bedeutung. N2 - Effects of the fatty acid arachidonic acid, the endocannabinoid anandamide and the synthetic cannbinoid receptor agonist WIN55,212-2 on the two-pore-domain potassium channles TASK-1 and TASK-3 were examined using the Xenopus oocyte expression system. Electrophysiological recordings have been performed with the two-electrode-voltage-clamp technique. At first dose-response relationships between the channel-proteins and the cannabinoids have been performed. All three substances had inhibitory effects on both channels. On TASK-1 WIN55,212-2 showed the strongest inhibition (ca. 81%), followed by anandamide (ca. 71%) and arachidonic acid (ca.63%). The inhibitory effects of all three substances on TASK-3 have been low. Furthermore the C terminus was targeted for mutation in order to examine the importance of the six-residue sequence at position 243-248. TASK-1 and TASK-3 contain nearly the same sequence at this position except only one amino acid. The first mutations performed were TASK-1 [243-248] and TASK-3 [243-248], both lacking the amino acids in position 243-248. The lack of this sequence reduced inhibitory effects of the cannabinoids on TASK-1 [243-248] nearly completely. On TASK-3 [243-248] various effects could be observed. Deletion of the whole C terminus of TASK-1 except the amino-acids in position 243-248 and the terminal motif RSSV, crucial for membrane trafficing (TASK-1 [249-390RSSV], lead to very similar inhibitory effects of the cannabinoids as on TASK-1 [wild-type]. The amino acid leucin of TASK-3 at position 247 has been changed to methionin (TASK-3 [L247M]) in order to construct a mutation of TASK-3 containing the same sequence as TASK-1. The effects of the examined cannabinoids on TASK-3 [L247M] did not differ from those on TASK-3 [wild-type]. These results suggest, that anandamide, arachidonic acid and WIN55,212-2 inhibit the two-pore-domain potassium channels TASK-1 and TASK-3 specific and reversible, independently of receptors. The six-residue sequence at position 243-248 has a basic impact. KW - Kaliumkanal KW - Elektrophysiologie KW - Strommessung KW - Indischer Hanf KW - Arachidonsäure KW - Endocannabinoide KW - Xenopus Oozyten KW - Zwei-Elektroden-Spannungsklemme KW - Anandamid KW - WIN 55 KW - 212-2 KW - Xenopus oocytes KW - two-electrode-voltage clamp KW - anandamide KW - WIN 55 KW - 212-2 Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27922 ER - TY - THES A1 - Latz, Andreas T1 - Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana T1 - Localization, function and regulation of plant tandem-pore potassium-channels in Arabidopsis thaliana N2 - Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden. N2 - Localization - All TPK´s with the exception of TPK4 are located in the tonoplast. TPK4 however is localized in the plasmamembrane. - The 14-3-3 binding motif and the whole N-terminus does not play a role in the targeting process because swapping the N-termini has no effect on the targeting - The C-terminus might harbour a targeting motif as well as an assembly domain TPK4 - TPK4 is expressed in Nicotiana benthamiana after agro-infiltration and is localized in the plasmamembrane. - The electrophysiological properties of TPK4 expressed in tobacco are similar to TPK4 expressed in oocytes of Xenopus laevis. TPK1 - TPK1 interacts with the 14-3-3 protein GRF6 in a phosphospecific and isotypspecific manner. - Interaction of TPK1 with GRF6 leads to channel activation. - The kinases CPK3 and CPK29 are able to phosphorylate the 14-3-3 binding motif of TPK1 in vitro. - These kinases are activated by elevated levels of free cytosolic calcium. - The phosphatase responsible for the dephosphorylation of the 14-3-3 binding domain of TPK1 belongs to the family of the PP2A proteinphosphatases. - It is possible that the kinases are activated under salt stress conditions and thereby phosphorylate the 14-3-3 binding domain of TPK1 leading to the interaction with GRF1 and activation of TPK1. - Germination is reduced under salt stress conditions and limited K+ supply in tpk1.3 and cpk3.1 knockout plants. KW - Ackerschmalwand KW - Signaltransduktion KW - Vakuole KW - Kaliumkanal KW - Salzstress KW - 14-3-3 KW - Calcium KW - Proteinkinase KW - 14-3-3 . calcium KW - protein kinase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24915 ER -