TY - THES A1 - Raab, Viktoria Maria T1 - Histologische Charakterisierung Vaccinia-Virus infizierter humaner Tumore im Mausmodell T1 - Histological charaterization of Vaccinia-Virus infected human tumors in mice N2 - Onkolytische Viren spielen eine immer bedeutendere Rolle für die Tumorforschung, weil in zahlreichen präklinischen Studien gezeigt werden konnte, dass viral bedingte Onkolyse zu einer Tumorregression führt. Ein äußerst vielversprechender Kandidat der onkolytischen Viren ist das Vaccinia-Virus. In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem attenuierten Vaccinia-Virus GLV-1h68 gearbeitet, welches nach systemischer Applikation eine Regression von Tumoren verursacht. Obwohl bereits zahlreiche onkolytische Viren in klinischen Studien Anwendung finden, sind zugrunde liegende Abläufe bei einer Virusinfektion solider Tumore sowie Mechanismen, welche für die Tumorregression verantwortlich sind, immer noch nicht erschlossen. Um Aufschluss über notwendige Parameter für eine effiziente Infektion eines soliden Tumors mit GLV-1h68 zu erlangen, wurden im ersten Teil dieser Arbeit die uninfizierte Tumormikroumgebung sowie stromale Veränderungen in der frühe Phase der Infektion untersucht. Als Tumormodell diente hierbei ein humanes autologes Melanomzellpaar (888-MEL und 1936-MEL). Diese beiden Zelllinien sind Teil einer Reihe von fünf verschiedenen Melanomzelllinien, welche alle aus den widerkehrenden Metastasen eines einzelnen Patienten (Patient 888) isoliert wurden. 888-MEL zeigt nach Virusinfektion mit GLV-1h68 ein regredierendes Verhalten (therapeutischer Index: 88,0) und ist somit respondierend nach GLV-1h68-Infektion. 1936-MEL hingegen zeigte mit einem therapeutischen Index von 13,7 ein nur schwach verlangsamtes Wachstum solider Tumore, und ist somit schwach-respondierend nach GLV-1h68-Infektion. Als ein Grund, weshalb diese beiden autologen Melanomzelllinien unterschiedlich auf GLV-1h68-Infektion reagieren, wurde die Anzahl der Viruspartikel vermutet, welche 1 dpi im soliden Tumor vorliegt. Eine mögliche Korrelation zwischen initialem viralen Titer 1 dpi und späterer Tumorregression konnte experimentell aber nicht nachgewiesen werden. Zwei voneinander unabhängige Experimentreihen zeigten, dass bei identischer systemischer Applikation in den beiden soliden Tumoren kein Unterschied des viralen Titers vorlag. Weiterhin wurden die Komponenten der Tumormikroumgebung und ihr möglicher Einfluss auf die Effizienz der Virusinfektion untersucht. Immunhistologische Studien zeigten, dass es im uninfizierten Zustand bei soliden 888-MEL Tumoren zu einer massiven Infiltration CD45-positiver Zellen kam, die bei 1936-MEL-Tumoren jedoch nicht zu finden war. Die Beobachtung steht in Übereinstimmung mit Ergebnissen einer vergleichenden Microarray-Analyse, die das Infiltrat CD45-positiver Zellen in 888-MEL Tumoren genauer charakterisierte. Es wurde mit Microarray-Analyse eine erhöhte Expression chemotaktischer Moleküle in soliden 888-MEL Tumoren nachgewiesen. Unter anderem wird CCL8 (MCP-2) erhöht exprimiert. Als chemotaktisches Molekül hat CCL8 eine erhöhte Monozyteninfiltration zur Folge. Weiterhin wurde eine erhöhte Expression von MIF (macrophage migration inhibitory factor) und dem entsprechendem Rezeptor CD74 in uninfizierten 888-MEL-Tumoren gemessen. MIF induziert als proinflammatorisches Zytokin die Synthese inflammatorischer Mediatoren. Dies erklärt die Anhäufung CD45-positiver Zellen in der Tumormikroumgebung. Durch eine erhöhte Expression MHC II-verwandter Gene in soliden 888-MEL- Tumoren wurden die CD45-positiven Zellen als Monozyten identifiziert. Um die Funktion der Immunzellen zu analysieren, wurde durch eine intraperitoneale Applikation des Zytostatikums Cyclophosphamid eine Monozytendepletion induziert. Diese Immundepletion resultierte in soliden 888-MEL- Tumoren in einer signifikant verringerten Virusreplikation und -Ausbreitung nach Infektion mit GLV-1h68. Diese Ergebnisse implizieren, dass durch eine erhöhte Infiltration CD45-positiver Zellen in die Tumormikroumgebung die GLV-1h68-Infektion und -Replikation erleichtert wird. Nach Ausbreitung der Infektion kommt es in respondierenden Tumoren nach einem ersten Wachtumsarrest zu einer Tumorregression. Um Aufschluss über den beteiligten Mechanismus bei der Tumorregression zu erlangen, wurden GLV-1h68-infizierte-Tumore in der späten Phase der Infektion untersucht. Drei mögliche Mechanismen viral verursachter Onkolyse wurden beschrieben: Tumorzell-spezifische Onkolyse, Zerstörung der Tumorvaskulatur oder anti-tumorale Immunantwort. Für diese Experimente wurden humane Brustkarzinomzellen als Tumormodell verwendet. Mit diesem Tumormodell sollte analysiert werden, welcher der drei bislang diskutierten Mechanismen bei einer GLV-1h68-Infektion vorlag. Als erstes zeigten histologische Studien, dass Virusinfektion und -Replikation zu ausgedehnten Tumornekrosen führen. Dabei blieben die Blutgefäße in uninfizierten und auch in infizierten Bereichen des Tumors intakt und funktionell aktiv. Systemische Perfusion der Vaskulatur mit Lektin zeigte, dass die Tumorvaskulatur an das periphere Blutgefäßsystem angeschlossen war. Nachfolgende Experimente zeigten, dass Endothelzellen nicht durch die Viren infiziert wurden, wohingegen aber Endothelzell-ummantelnde, Gefäß-stabilisierende Perizyten nur in uninfizierten, nicht aber in infizierten Bereichen des Tumors vorkamen. Perizyten wurden möglicherweise durch Virusinfektion lysiert. Morphologische und funktionelle Analyse der Blutgefäße im Tumor zeigte, dass GLV-1h68-Infektion Hyperpermeabilität, Vasodilatation und eine erhöhte Expression des Adhäsionsmoleküls CD31 verursachte. Eine erhöhte CD31-Expression erleichtert eine Infiltration rekrutierter Immunzellen. Das konnte durch immunhistochemische Färbung von CD45 und MHC II besonders in intratumoralen Bereichen gezeigt werden. Durch Cyclophosphamid-vermittelte Immunsuppression wurde nachgewiesen, dass diese rekrutierten Immunzellen keinen ausschlaggebenden Einfluss auf die Tumorregression haben. Nach Immundepletion in soliden GI-101A-Tumoren konnte eine verstärkte Virusinfektion, effektivere Onkolyse und frühzeitigere Tumorregression nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass der dominierende Mechanismus, welcher zur Tumorregression führt, die Onkolyse ist. N2 - Preclinical application of oncolytic viruses to induce virus-mediated tumor rejection revealed promising results in the past few years. Vaccinia virus GLV-1h68, used in this study, was shown to induce complete tumor disappearance upon infection. However the exact underlying mechanisms of viral infection and virus-mediated tumor regression are still not well understood. This study describes the characterization of the early phase of a GLV-1h68 infection and the role of stromal components as well as the mechanisms involved in tumor regression. To address the question, which components are necessary for an effective GLV-1h68 infection, followed by successive rounds of viral replication, the first part of this study focused on the characterization of the early phase of Vaccinia virus infection in a human autologous melanoma system. Five different cell lines were previously generated from a melanoma patient experiencing several reoccurrences in a 12 year span. The melanoma cell line expanded from a metastasis at an early time point (888-MEL) retained responsiveness to GLV-1h68 treatment, while the subsequent cell line 1936-MEL (studied here), became non-responsive to the same treatment. To address the influence of the amount of viral particles homing to the tumor within initial 24 hpi, 888-MEL and 1936-MEL tumors were compared. It could clearly be demonstrated, that the initial homing of viral particles is not the reason for further effective viral replication and spreading. The comparative viral titers were measured in 888-MEL and 1936-MEL tumors 1 dpi and found similar. Immuno-histological comparison of xenografts generated with 888-MEL or 1936-MEL revealed a massive infiltration of CD45-positive cells in 888-MEL tumors, but not in 1936-MEL tumors. Comparative microarray analysis of uninfected 888-MEL and 1936-MEL solid tumors supported these findings. Beside a significant up-regulation of CCL8 in 888-MEL tumors, an increased expression of CD74/MIF suggests an increased monocyte infiltration in 888-MEL uninfected tumors, which is not apparent in 1936-MEL tumors. To gain better understanding of an immune cell infiltration into solid 888-MEL tumors, a monocyte depletion study using the immunosuppressive agent cyclophosphamide (CPA) was carried out. This treatment resulted in a highly significant reduction of viral replication and spreading in 888-MEL tumors following infection with GLV-1h68. These results demonstrated that the replication efficiency of GLV-1h68 is higher in 888-MEL xenografts compared to 1936-MEL. The enhanced replication is in direct correlation with a higher number of CD45-positive cells, which infiltrated the tumor site prior to virus injection. Through successive rounds of viral replication the virus can spread throughout the tumor and induces tumor regression. To gain insights into mechanisms involved in tumor regression, late stages of a GLV-1h68 infection were characterized in human breast tumor xenografts (GI-101A). Theoretically oncolytic virus therapy could be based on three different mechanisms: by tumor cell specific oncolysis, by destruction of the tumor vasculature or by an anti-tumoral immunological response. Here the contribution of the three factors was analyzed. Histological examination showed that viral infection of GI-101A tumors led to broad tumor necrosis. However, the tumor vasculature in infected tumor areas remained functional and endothelial cells were not infected neither in tumors nor in cultured cells. It was further demonstrated, that viral tumor colonization activated the tumor endothelium leading to vascular hyperpermeability, vessel dilatation and an increased expression of the adhesion molecule CD31, which in a next step facilitated infiltration of inflammatory cell. This could be visualized by immunohistochemical staining of MHCII- and CD45-positive cells. The stainings revealed increased intratumoral infiltration of immune cells within infected tumor xenografts. The recruited immune cells however, do not seem to be causative for the tumorregression, since immunosuppression of GLV-1h68-infected animals led to increased viral replication and broader distribution in the tumor tissue, resulting in more efficient oncolysis and earlier start of the tumor regression phase. In summary, these results indicate that GLV-1h68 mediated oncolysis is the primary mechanism of tumor regression. Therefore, enhancing the viral replication and distribution within the tumor microenvironment should lead to improved therapeutic results in preclinical studies and clinical applications. KW - Vaccinia-Virus KW - Leukozyt KW - Allgemeine Entzündungsreaktion KW - Immunstimulation KW - Immunsuppression KW - Vaccinia-Virus KW - inflammation KW - leukocyte KW - innate immunity Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49024 ER - TY - THES A1 - Schröttle, Angelika T1 - Die Inhibition der Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen durch endotheliales Stickstoffmonoxid T1 - The inhibition of leukocyte-endothelial cell-interactions by endothelial nitric oxide N2 - Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase in Hinblick auf die Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei der spontanen Arterioskleroseentwicklung zu untersuchen. Apolipoprotein E knockout-Mäuse und Apolipoprotein E knockout/endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase knockout-Mäuse dienten dabei als genetisches Modell. Durch IVM-, Real-time PCR-, Western Blot und immunhistochemische Versuche konnte gezeigt werden, dass apoE/eNOS dko-Tiere im Vergleich zu apoE ko-Kontrollen signifikant erhöhte L/E-Interaktionen, eine verstärkte endotheliale Adhäsionsmolekülexpression und eine gesteigerte Makrophagen-Infiltration in die Gefäßwand aufweisen. Duplexsonographisch vergleichbare Widerstands-Indices bei beiden Genotypen belegen eine ähnliche Hämodynamik und schließen veränderte Flussbedingungen als Ursache der erhöhten L/E-Interaktionen aus. Zusammenfassend kann man sagen, dass die verminderte NO-Produktion in apoE/eNOS dko-Mäusen die gesteigerten Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen in diesem Modell bedingt und andere Quellen vaskulären Stickstoffmonoxids, genauer gesagt nNOS und iNOS, dies nicht zu kompensieren vermögen. Überraschenderweise nahm die eNOS-Deletion keinen Einfluss auf die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen, was gegen eine bedeutende Rolle von Blutplättchen bei der beschleunigten Arterioskleroseentwicklung von apoE/eNOS dko-Mäusen spricht. N2 - It was the aim of the study to analyse the role of the endothelial nitric oxide synthase with regard to the leukocyte-endothelial cell-interactions in spontaneous arteriosclerosis development. Apolipoprotein E knockout mice and apolipoprotein E/endothelial nitric oxide synthase double knockout mice served as genetic models. Intravital microscopy, real-time PCR, western blot and immunohistochemical experiments revealed significantly increased leukocyte-endothelial cell (L/E)-interactions, an elevated expression of endothelial surface adhesion molecules and a heightened macrophage infiltration in carotid arteries in apoE/eNOS dko mice compared to apoE ko control animals. Comparable resistance indexes in duplex ultrasonography of both genotypes show similar hemodynamics and exclude altered flow conditions as cause of increased L/E-interactions. In summary you can say that reduced NO-production in apoE/eNOS dko mice causes the increased L/E-interactions and that other sources of vascular nitric oxide, more precisely nNOS and iNOS, are unable to compensate for that. Surprisingly, eNOS deletion didn’t influence platelet-endothelial cell-interactions, which argues against an important role of platelets in accelerated arteriosclerosis development of apoE/eNOS dko mice. KW - Arteriosklerose KW - Stickstoffmonoxid KW - Leukozyt KW - Endothel KW - endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase KW - Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen KW - endotheliale Adhäsionsmoleküle KW - ApoE/eNOS dko-Mäuse KW - arteriosclerosis KW - endothelial nitric oxide synthase KW - leukocyte-endothelial-interactions KW - endothelial adhesion molecules Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54411 ER - TY - THES A1 - Albers, Martin T1 - Frequenzanalyse und Subtypisierung lambda 3r-positiver CD19-positiver B-Zellen bei Magenkarzinompatienten T1 - Frequency-analysis and subtyping of lambda 3r-positive CD19-positive b-cells in stomach cancer patients N2 - Ausgehend von einer potentiell anti-Tumor-aktiven B-Zellen des menschlichen Immunsystem haben sich durch die Untersuchung des peripheren Blutes auf das Vorliegen von lambda3r-positiven, CD19+B-Zellen bei Magenkarzinompatienten und Probanden unterschiedlichen Alters einige sehr interessante Ergebnisse im Bereich der B-Zellimmunität ergeben. Es scheint dabei eine Art B-Zell-Immunosurveillance in Form dieser B-Zellen, sowohl bei Karzinompatienten, als auch bei Gesunden von früher Kindheit an zu geben. Die relative Verteilung dieser Zellen ändert sich dabei im Laufe des Lebens ensprechend den Veränderungen des gesamten B-Zellkompartiments. Es findet eine Abnahme mit dem Alter statt. Im Falle des Auftretens eines Magenkarzinoms kommt es dann zu einer relativen Expansion der in dieser Arbeit beschriebenen lambda3r-positiven CD19+B-Zellen trotz einer gleichzeitig stattfindenden bisher nicht erklärlichen Involution des restlichen B-Zellsystems. Bei der relativen Zunahme dieser Zellen handelt es sich um eine Art Boosterung. Das expandierte Zellkompartiment zeigt dabei Reifungstendenzen, sichtbar im Verlust des Oberflächenmoleküls IgD sowie der Expression von CD27 und IgG. Dem Oberflächenmarker CD5 scheint im Gegensatz zur initialen Hypothese bei der Erst-beschreibung der SC-1-positiven B-Zelle keine zentrale Rolle zuzukommen. N2 - This project could identify a subset of CD19-positive b-cells within humans that shows strong correlation to the event of stomach cancer. This subset was proven to be in peripheral blood of healthy donors from early ages on and seems to be part of a kind of immunosurveillance system. In case of stomach cancer there is a differentiation of these cells from naive into mature b-cells. The main characteristics of the analysed cells is the CD19 antigen and the expression of the light chain gene lambda 3r in about 90%. In this study we compared the frequency and subtypes of these cells in healthy donors and stomach cancer patients. This setting allowed us also the quantitative and qualitative comparison of tho whole b-cell compartment at different ages and in the case of malignancy. KW - FACS KW - Magenkrebs KW - Immunsystem KW - Leukozyt KW - B-Zelle KW - Tumorantigen KW - Immunglobuline KW - b-cells KW - stomach cancer KW - CD 5 KW - lambda 3r KW - immunoglobuline Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37666 ER -