TY - THES A1 - Herrmann, Leonie Judith Maria T1 - TP53 Mutationen und Polymorphismen bei erwachsenen Patienten mit Nebennierenrindenkarzinom T1 - TP53 mutations and polymorphisms in adult patients with adrenocortical carcinoma N2 - Das Nebennierenrindenkarzinom (NNR-Ca) gehört mit einer Inzidenz von 1-2/1000000 zu den seltenen malignen Neubildungen. Neben Sarkomen, Hirntumoren, Brustkrebs und Leukämie gehört das NNR-Ca zu den Kerntumoren, durch die das selten vorkommende autosomal dominante Tumor-Prädispositions Syndrom, das Li Fraumeni Syndrom (LFS) gekennzeichnet ist. Das LFS wird mit Keimbahnmutationen im Tumorsuppressor Gen TP53 in Verbindung gebracht. Die vorliegende Arbeit untersucht TP53 Keimbahnmutationen und -polymorphismen und ihre Auswirkung auf klinische Faktoren bei einem großen Kollektiv von erwachsenen NNR-Ca Patienten. Es wurde DNS aus Blut und teilweise aus Tumorgewebe von Patienten aus dem Deutschen Nebennierenrindenkarzinom Register extrahiert und die Exons 2 bis 11 von TP53 sequenziert. Darüber hinaus wurde der Nachweis der Mutationen und eines Loss of Heterozgosity von TP53 im Tumorgewebe und die immunhistochemische Färbung von p53 vorgenommen. Die anschließende Auswertung der Daten erfolgte unter Einbeziehung des klinischen Verlaufs der Krankheit bei den Patienten. In dieser Arbeit konnten vier NNR-Ca Patienten (3,9 %) mit mindestens einer Keimbahnmutation im TP53 identifiziert werden, bei den unter 40-jährigen entspricht dies einem Anteil von 13,0 %. Unter der Altersgrenze von 40 Jahren sollte daher ein TP53 Mutationsscreening erwogen werden. Die Auswertung der Polymorphismen zeigte, dass diese einen Einfluss auf die Entstehung und den klinischen Verlauf des NNR-Cas zu haben scheinen, jedoch weitere Studien nötig sind. N2 - Adrenocortical cancer (ACC) is a rare malignancy with an incidence of 1-2 cases per million population. Li Fraumeni Syndrom (LFS) is a rare autosomal dominant cancer predisposition syndrome that is characterized by sarcoma, brain tumor, breast cancer, leukaemia, and ACC. LFS is associated with germline mutations in the tumor supressor gene TP53. This study investigates TP53 germline mutations and polymorphisms and their impact on clinical characteristics of a large cohort of adult patients with ACC. DNA was extracted from peripheral blood and tumor tissue derived from patients from the German ACC registry and sequencing was performed on exons 2-11 and adjacent introns. Tumor tissue was analyzed for loss of heterozygosity of TP53 and p53 immunohistochemitry. Analysis was performed by taking clinical characteristics of ACC patients into consideration. Four ACC patients (3.9%) were carriers of at least one TP53 germline mutation corresponding to 13% below the age of 40 years. In younger adults (<40 yr) with ACC screening for TP53 mutations should be considered. While further studies are needed to validate the data, the analysis of TP53 polymorphisms showed possible impact of polymorphisms on development and course of ACC. KW - TP53 KW - Nebennierenrindenkarzinom KW - Adrenocortical cancer KW - Mutationen KW - Polymorphismen KW - LOH KW - Li Fraumeni Syndrom KW - R337H KW - mutation KW - polymorphism KW - Li Fraumeni syndrome KW - LOH KW - R337H Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93786 ER - TY - THES A1 - Wiest, Stephanie T1 - Mutationen im Leukaemia-Inhibitory-Factor (LIF)-Gen bei wiederholtem Implantationsversagen nach extrakorporaler Befruchtung T1 - Leukaemia inhibitory factor (LIF) gene mutations in women with recurrent failure of implantation after extracorporal fertilization N2 - Das Implantationsversagen stellt die häufigste Ursache für den Misserfolg der menschlichen Reproduktion dar und spielt wahrscheinlich eine bedeutende Rolle bei wiederholt erfolgloser assistierter Reproduktion (IVF/ICSI und ET). Die hormonell eingeleitete Regulation der Implantation beinhaltet eine komplexe Folge von Signalen zwischen Embryo und Endometrium, deren regelrechter Ablauf für die erfolgreiche Einrichtung einer Schwangerschaft entscheidend ist. Eine Fülle von Faktoren wie Zytokine und Wachstumsfaktoren spielen hier eine bedeutende Rolle. Unter diesen Mediatoren ist auch Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) am Implantationsvorgang beteiligt. Bei weiblichen Mäusen mit einer homozygoten Inaktivierung des LIF-Gens bleibt nach erfolgreicher Befruchtung ihrer Oozyten die Implantation aus, obwohl ihre Blastozysten lebensfähig sind. Die mütterliche LIF-Produktion ist also essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft bei Mäusen. Für die Beteiligung LIFs an der Kontrolle des Implantationsvorgangs auch beim Menschen gibt es eine Reihe von Hinweisen. Das LIF-Protein wird im menschlichen Endometrium zyklusabhängig mit einem Maximum zum Zeitpunkt der Implantation produziert. Menschliche Blastozysten exprimieren zum Zeitpunkt der Implantation mRNA für LIF-Rezeptoren, so dass sie als Ziel der Zytokinwirkung gelten. Ein Mangel an LIF könnte im Zusammenhang mit einigen Formen von Infertilität stehen. In uteriner Spülflüssigkeit idiopathisch infertiler Frauen wurden reduzierte LIF-Konzentrationen nachgewiesen, endometriale Zellen infertiler Frauen, sezernierten signifikant weniger LIF als die fertiler Frauen. Als Grundlage dieser Veränderungen werden Mutationen im LIF-Gen vermutet, die zu reduzierter endometrialer Produktion oder verminderter biologischer Aktivität des Zytokins führen und eine gestörte Implantation der Blastozyste im menschlichen Endometrium zur Folge haben. Im Vorfeld konnte bereits eine signifikant erhöhte Prävalenz von heterozygoten Mutationen im menschlichen LIF-Gen in einer Population von Frauen mit unterschiedlichen Infertilitätsursachen nachgewiesen werden. Bislang liegen nur unzureichende Daten zur Prävalenz von Mutationen im LIF-Gen als mögliche Ursache für ein Implantationsversagen vor. Der Nachweis von Mutationen im LIF-Gen könnte einerseits diagnostisch zur Beurteilung der endometrialen Rezeptivität und der Prognose eines IVF/ICSI-Behandlungsversuches genutzt werden. Andererseits hätte der Nachweis eines LIF-Mangels auf dem Boden einer LIF-Gen-Mutation auch therapeutische Konsequenzen, wenn in Zukunft die Substitution LIFs möglich wäre. Ziel dieser Arbeit war es, die Häufigkeit und Art der Mutationen im LIF-Gen bei Frauen mit wiederholt erfolgloser IVF/ICSI-Behandlung zu untersuchen, um ihre Bedeutung für das Implantationsversagen bei der assistierten Reproduktion beurteilen zu können, und zu prüfen, ob der Einsatz eines geeigneten Screeningverfahrens auf LIF-Gen-Mutationen bei diesen Patientinnen sinnvoll erscheint. Zu diesem Zweck wurden 50 Patientinnen mit wiederholtem IVF/ICSI-Versagen und 105 fertile Frauen als Kontrollgruppe auf das Vorliegen von Mutationen im LIF-Gen untersucht. Zum diesem Screening dienten die standardisierte DNA-Extraktion, deren Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Single-Strand Conformation Polymorphism-Analyse (SSCP). Zeigte sich bei der SSCP-Analyse ein abnormes Laufverhalten in den Elektrophoresebanden, erfolgte anschließend die Sequenzierung des DNA-Abschnittes zur Bestätigung und Identifizierung der genetischen Alteration als Mutation oder Polymorphismus. Eine Patientin wies im Exon 3 des LIF-Gens eine heterozygote Transversion (G3453T) auf, welche die Struktur und Funktion des LIF-Proteins jedoch nicht beeinflusst, so dass es sich nicht um eine Mutation, sondern um einen funktionell unbedeutenden Polymorphismus handelt. In einem Fall der Kontrollgruppe fand sich ebenfalls ein Polymorphismus, eine Transition (C3235T) im Intron zwischen Exon 2 und 3. Mutationen mit Auswirkungen auf das Expressionsniveau oder die Bioaktivität LIFs konnten nicht aufgedeckt werden. Die Mutationsrate bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen nach IVF/ICSI-Therapie ist demnach sehr niedrig und gegenüber fertilen Frauen nicht signifikant erhöht. Damit stehen die Resultate dieser Arbeit im Einklang mit Ergebnissen früherer Studien, wonach LIF beim Menschen zwar eine wichtige Teilfunktion bei der Steuerung des komplexen Implantationsvorganges einnimmt, aber nicht essentiell für seinen Erfolg ist. Aufgrund der niedrigen Prävalenz funktioneller Mutationen im LIF-Gen bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen nach einer IFV/ICSI-Behandlung erscheint ein Screening der betroffenen Patientinnen als Routinemaßnahme zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken nicht gerechtfertigt. N2 - Implantation failure is considered as a major cause of recurrent failure of IVF/ICSI and embryo transfer. Leukaemia inhibitory factor (LIF) is a glycoprotein that plays an important role in reproduction, and particularly in the regulation of implantation. It is normally produced by the endometrium with maximum levels at time of implantation. Decreased concentrations in uterine flushings have been reported to be associated with unexplained infertility. In this study, we have analysed the prevalence of functional LIF gene mutations in women with recurrent IVF/ICSI failure. 50 women with recurrent failure of implantation after IVF/ICSI and 105 controls were screened for LIF gene mutations. Standard genomic DNA extraction, PCR amplification of the LIF gene and single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis were performed to screen for gene alterations which were subsequently confirmed by DNA sequencing. In the study group, one heterozygous LIF gene polymorphism (G3453T) in exon 3 without affecting protein conformation was identified. In the control subjects, one polymorphism (C3235T) in the intron between exon 2 and 3 was found. Mutations with effect on production or biological activity of LIF protein in the endometrium couldn’t be detected. Our study showed a low prevalence of LIF gene mutations in women with recurrent failure of implantation after IVF/ICSI and no difference in frequency of LIF gene alterations when compared with fertile control subjects. Routine screening of LIF gene mutations in this group of women is not justified for the low prevalence of functional mutations. LIF may play a partial role in human implantation, but in contrast to animals it isn’t a crucial factor in successful human implantation. KW - Infertilität KW - assistierte Reproduktion KW - Implantationsversagen KW - Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) KW - Mutationen KW - infertility KW - reproductive medicine KW - failure of implantation KW - leukaemia inhibitory factor (LIF) KW - mutations Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12864 ER - TY - THES A1 - Johnson, Carron Claire Elizabeth T1 - Die Entwicklung des V-kappa-Immunglobulinrepertoire in Keimzentren der Tonsille T1 - The development of the v-kappa-immunoglobulin repertoire in germination centers of the tonsil N2 - Ziel der Arbeit war es, die Entwicklung des V-kappa-Immunglobulin-Repertoires in Keimzentren der Tonsille zu untersuchen. Dazu wurden 594 Sequenzen auf ihre v-kappa-Familienzugehörigkeit, die Verwendung der fünf verschieden J-kappas, ihre CDR3-Länge und auf stattgefundene Mutationen und deren Konsequenzen hin erforscht. Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen die Wichtigkeit der Evolution des V-kappa-Immunglobulin-Repertoires im Kleinkindalter. Die ermittelten Daten weisen im Vergleich zu Datenbanken der Altersstufen Neugeboren und Adult durchaus ähnliche Werte auf, deuten jedoch auch daraufhin, dass im Kleinkindalter besondere Anforderungen an die Präsenz von Leichtketten-Immunglobulinen gestellt werden. Es ergaben sich Hinweise für eine graduelle Entwicklung ausgehend vom Neugeborenen hin zum Erwachsenen. Die Aufgliederung in die fünf verschiedenen Reifestadien der B-Zellen gab unter anderem Aufschluss darüber, dass in den Stadien der Zentroblasten und der Zentrozyten Mutationen stattfinden. Die Analyse der Mutationen führte zu der Konklusion, dass ein differentieller Mutationsmechanismus existieren muss, der gezielt B-Zellen aus späteren Entwicklungsstufen in den Keimzentren erfasst. N2 - This thesis aimed to explore the development of the V-kappa-immunoglobulin-repertoire in germination centers of the tonsil. 594 sequences were examined for their V-kappa-family, the use of the five J-kappas, their CDR3-length and for mutations and their consequences. The results of this thesis underline the importance of the evolution of the V-kappa-repertoire in infant age. The data that was found, shows quite similar results to earlier examinations on newborn and adult people, but also points to there being special demands on light-chain-immunoglobulins during infant age. There were pointers to a gradual development from the newborn to the adult. The differentiation of the five maturity stages showed that the mutation of the immunoglobulin sequence mainly takes place at the stage of centroblasts and centrocytes. The analysis of the mutations led to the conclusion that there must be a differential mutation mechanism that especially aims at B-cells in more mature stages. KW - Immunglobulin KW - V-kappa KW - Reifestadien KW - Mutationen KW - Nukleotide KW - immunoglobulin KW - v-kappa KW - maturity stages KW - mutations KW - nukleotids Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9311 ER - TY - THES A1 - Möller, Kerstin T1 - Die Bedeutung von Mutationen im Hämagglutinin des Masernvirus für Neurovirulenz und Antikörpererkennung T1 - The role of mutations in the hemagglutinin of measles virus for neurovirulence and antibody recognition N2 - Masernvirus (MV) ist ein negativ-strängiges RNA-Virus, das im Menschen und im Nagermodell zu akuten und subakuten Enzephalitiden führen kann. Es wurde beschrieben, dass bestimmte Antikörperescape-Mutanten des MV neurovirulent, andere nicht neurovirulent sind (Liebert et al., 1994). Mit Hilfe von rekombinanten Masernviren, konnte ich diejenigen Aminosäuren charakterisieren, die einerseits für die Bindung monoklonaler, neutralisierender anti-MV-H-Antikörper (K29, K71, Nc32 und L77) und andererseits für die Neurovirulenz verantwortlich sind. Bei den rekombinanten MV wurde das von Duprex et al. (1999) als Neurovirulenz vermittelnd beschriebene H-Gen des nagerhirnadaptierten neurovirulenten CAM/RB-Stammes in das Grundgerüst des nicht neurovirulenten Edtag (molekularer Klon des Vakzinestammes Edm) kloniert. Über gerichtete Mutagenese wurden die jeweiligen Mutationen in dieses CAM/RB H-Gen eingefügt. Mittels der FACS-Analyse konnten die Aminosäureänderungen identifiziert werden, die für die Bindung der jeweiligen Antikörper verantwortlich sind. Sie befinden sich nach einem Strukturmodell der H-Proteine (Langedijk et al., 1997) im Membran-distalen Teil, den so genannten Propellern. Im Einzelnen sind folgende Aminosäureänderungen im Hämagglutinin-Protein für den Escape verantwortlich: L77 – 377 Arg -> Gln und 378 Met -> Lys; Nc32 – 388 Gly -> Ser; K71 – 492 Glu -> Lys und 550 Ser -> Pro; K29 – 535 Glu -> Gly. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die beiden Aminosäureveränderungen an den Positionen 195 und 200 gemeinsam für die Neurovirulenz verantwortlich sind und nicht assoziiert sind mit den Mutationen für den Antikörperescape. Der Aminosäureaustausch an Position 200 bei neurovirulenten Viren führt zum Verlust einer benutzten Glykosylierungsstelle. Diese Mutation ist jedoch nicht alleine für das unterschiedliche Neurovirulenzverhalten der Viren verantwortlich, sondern es muss gleichzeitig der Austausch an Position 195 vorhanden sein, der eine positive Ladung im H-Molekül entfernt. Diese beiden Mutationen sind nach dem Strukturmodell nach Langedijk im Stamm2-Bereich angesiedelt. Sind im H-Protein an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Gly und Ser vorhanden, so findet im Gehirn neugeborener Lewis-Ratten eine verstärkte Virusvermehrung und Ausbreitung statt, die die akute Enzephalitis mit Expression typischer proinflammatorischer Zytokine zur Folge hat. Werden an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Arg und Asn exprimiert, so ist der Verlauf der Infektion inapparent. In dieser Arbeit wurde auch ein Zellkultursystem gemischter Hirnzellen neugeborener Lewis-Ratten etabliert, das die Unterschiede der Virusausbreitung in vivo reflektiert und mit dem weitere Untersuchungen zum Mechanismus der Neurovirulenz durchgeführt werden könnten. Anhand der durchgeführten Untersuchungen mit Ratten des CD46 transgenen Lewis-Modells konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit des Rezeptors CD46 das Virulenzverhalten der getesteten Viren nicht beeinflusst. Weder mit dem Vakzinestamm Edm noch mit einem nicht an Nager adaptierten Wildtypstamm, konnte nach intracerebraler Injektion eine akute Enzephalitis induziert werden. Die Untersuchungen zeigen, dass die Neurovirulenz des an Nager-adaptierte MV-Stammes CAM/RB essentiell von den Aminosäuren Gly und Ser an Position 195 und 200 im H-Protein abhängt und nicht durch die transgene Expression zellulärer Rezeptoren für MV vermittelt werden kann. N2 - Measles virus (MV) is a negative stranded RNA-virus, which may lead to acute and subacute encephalitis in men and experimentally also in rodents. It has been described that certain antibody escape mutants of MV are neurovirulent, whereas others are non-virulent (Liebert et al., 1994). Here I determined with the help of recombinant MV the amino acids which are responsible for the binding of neutralizing monoclonal anti MV-H-antibodies (K29, K71, Nc32 and L77) or for neurovirulence of MV. The H-gene of the rodent brain adapted strain CAM/RB which was described for determining neurovirulence by Duprex et al. (1999) was introduced into the non-neurovirulent backbone of Edtag, which is the molecular clone of the vaccine strain Edm. The respective mutations were introduced by site directed mutagenesis. In FACS-analysis I could determine the amino acid changes which are responsible for the binding of the anti H-antibodies. In a structural model for MV-H (Langedijk et al., 1997) this amino acids reside in the membrane distal part of the molecule - the so called propeller. The following amino acid changes in the hemagglutinin protein are responsible for the antibody escape: L77 – 377 Arg -> Gln und 378 Met -> Lys; Nc32 – 388 Gly -> Ser; K71 – 492 Glu -> Lys und 550 Ser -> Pro; K29 – 535 Glu -> Gly. In addition I found that the combined amino acid changes at positions 195 and 200 are responsible for neurovirulence but are not associated with the antibody escape. The amino acid change at position 200 leads to the loss of a used glycosylation site in neurovirulent strains. The mutation at position 200 is not alone responsible for the neurovirulence but requires the second associated mutation at position 195, which deletes an additional positive charge in the H-protein. These two mutations which are responsible for the neurovirulence reside in the stem2 region of the structural model according to Langedijk. If in the H-protein the amino acids at position 195 and 200 are Gly and Ser, the virus multiplication and spread is enhanced in the brain of newborn Lewis-rats and causes an acute encephalitis with expression of typical proinflammatory cytokines. If at position 195 and 200 the amino acids Arg and Asn are present, the infection stays inapparent. I could also establish a cell culture system of mixed primary rat brain cells, which reflects the difference in the viral spread in vivo and which may be to used further to investigate the mechanisms responsible for neurovirulence. Results obtained with CD46 transgenic Lewis-rats showed that the presence of the MV receptor CD46 does not influence the virulence of the tested strains. Neither the vaccine strain nor a wildtype strain not adapted to rodents could induce acute encephalitis after intracerebral injection. These findings suggest that the neurovirulence of the rodent-brain adapted MV-strain CAM/RB depends essentially on amino acids Gly and Ser at positions 195 and 200 in the H-protein, and cannot be mediated by the transgenic expression of cellular receptors for MV. KW - Mutation KW - Masernvirus KW - Encephalitis KW - Virulenz KW - Masern KW - Neurovirulenz KW - Antikörperescape KW - Hämagglutinin KW - Mutationen KW - measles KW - neurovirulence KW - antibodyescape KW - hemagglutinin KW - mutations Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-852 ER -