TY - THES A1 - Thoma, Ingeborg T1 - Cyclopentenon-Phytoprostane als Induktoren von pflanzlichen Abwehrreaktionen T1 - Cyclopentenone phytoprostanes as inducers of plant defense reactions N2 - Lipidperoxidation kann entweder durch Lipoxygenasen oder reaktive Sauerstoffspezies ausgelöst werden. Enzymatische Oxidation von alpha-Linolensäure kann zur Biosynthese von zyklischen Oxylipinen vom Typ der Jasmonate führen, wohingegen durch freie Radikal-katalysierte Oxidation von alpha-Linolensäure mehrerere Klassen zyklischer Oxylipine, den Phytoprostanen entstehen können. Eine dieser Phytoprostanklassen, Phytoprostane E1 (PPE1), kommen ubiquitär in Pflanzen vor. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PPE1 in planta in neuartige Cyclopentenon-Phytoprostane, die PPA1 und PPB1 umgewandelt werden. Eine gesteigerte Bildung von PPE1, PPA1 und PPB1 wurde sowohl nach Peroxid-Behandlung von Tabak-Zellkulturen als auch nach Behandlung von Tomatenpflanzen mit dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea beobachtet. Darüberhinaus besitzen PPA1 und PPB1 biologische Wirkung. Sie stimulierten beispielsweise die Bildung von Phytoalexinen in mehreren Zellkulturen. Diese Daten implizieren, dass die Bildung von Phytoprostanen eine Folge von oxidativem Stress in Pflanzen ist und dass Phytoprostane pflanzliche Abwehrmechanismen induzieren können. N2 - Lipid peroxidation may be initiated by lipoxygenases or by reactive oxygen species. Enzymatic axidation of alpha-linolenic acid can result in the biosynthesis of cyclic oxylipins of the jasmoate type while free-radical-catalyzed oxidation of alpha-linolenate may yield several classes of cyclic oxylipins termed phytoprostanes in vivo. One of these classes, the E1-phytoprostanes (PPE1) occur ubiquitously in plants. In this work it is shown that PPE1 are converted to novel cyclopentenone A1- and B1-phytoprostanes in planta. Enhanced formation of PPE1, PPA1 and PPB1 is observed after peroxide stress in tobacco cell cultures as well as after infection of tomato plants with a necrotrophic fungus botrytis cinerea. Furthermore PPA and PPB1 display powerfull biological activity, i.e. they stimulate biosynthesis of phytoalexins in several cell cultures. Data collected so far infer that enhanced phytoprostane formation is a general consequence of oxidative stress in plants. Futhermore phytoprostanes are potent inducers of plant defens mechanisms. KW - Pflanzen KW - Oxidativer Stress KW - Abwehrreaktion KW - Phytoprostane KW - Abwehr KW - Fettsäuren KW - Jasmonsäure KW - ROS KW - phytoprostanes KW - plant defense KW - fatty acid KW - jasmonic acid KW - ROS Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6857 ER - TY - THES A1 - Stangl, Christoph T1 - Lichtgesteuerte Manipulation Zentraler Second Messenger in Pflanzen T1 - Manipulation of Crucial Second Messengers in Plants by light N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unveröffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz über das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einwärts-Ströme gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei annähernd unabhängig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in höheren Pflanzen gezeigt werden. Nach Bestätigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zusätzlich und unter der Kontrolle eines östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der Möglichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums über Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind phänotypische Auffälligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verzögerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verzögerte Keimung normal und uneingeschränkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschläuche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unverändertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ansätzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Über den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsfähiges Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt. N2 - In this study, light-activated nucleotide cyclases based on bPAC (= BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), and the direct light-activated cation channel channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) have been used to non-invasively manipulate the level of the second messengers cAMP, cGMP and calcium as well as the membrane potential in plant cells by means of light. After transient transfection of N. benthamiana, the expression of the two channelrhodopsin variants C128A and C128T (unpublished data from Ronnie Gueta and G. Nagel 2008; Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010) as well as their correct localization in the plasma membrane, was shown by fluorescence microscopy imaging. The general function of channelrhodopsin as a light-activated cation channel was shown for the first time electrophysiologically in higher plants. Using impalement measurements on leaf discs, blue-light-induced depolarizations of the plasma membrane could reproducibly be evoked, which followed the given light pattern in duration and frequency. By Patch-Clamp recordings on N. benthamiana protoplasts, clear blue-light-induced inward currents were demonstrated. The expression of both employed channelrhodopsin variants C128A and C128T was almost independent from supplementation of Retinal during their expression. Furthermore, expression and function of the light activated adenylyl cyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011) and a therefrom derived light activated guanylyl cyclase bPGC::YFP (according to Ryu et al., 2010) was shown for the first time in higher plants. Two stable transgenic plant lines have been generated, which, aside to the constitutively expressed calcium reporter protein Aequorin, express the light-activated nucleotide cyclases bPAC::YFP and bPGC::YFP, respectively, under the control of an estrogen-inducible glucocorticoid promotor (Zuo et al., 2000). Also in these transgenic plants, expression and function of both light-activated nucleotide cyclases was shown. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 192 - For the first time, blue-light-induced calcium signatures in plant cells were evoked by illumination of leafdiscs of the transgenic plant lines as an implication of an elevated cNMP-level. Beside the possibility to manipulate cNMP-levels as well as the free cytoplasmic calcium concentration in those plants by means of light, a direct interrelation between these two second messengers was shown. Also physiological impairments in the generated plant lines were observed. The germination of bPAC::YFP expressing seeds was considerably delayed when grown in light. Further, the pollen tube growth of transiently bPAC::YFP-transfected pollen of Nicotiana SR-1 was fully stopped by illumination with blue light, whereas normal growth was documented under dark conditions. In contrast, bPGC-transfected pollen did not show affected growth of their pollen tubes neither in darkness nor upon blue light illumination. Beside the generated stable transgenic plant lines, two stable transgenic Arabidopsis thaliana Col-0-Aequorin cell-culture lines have been generated in an analogous approach. Also in this case, the expression of bPGC::YFP and bPAC::YFP was estrogen-inducibly expressed under control of the glucocorticoid-promotor (Zuo et al., 2000), and expression as well as function was shown by means of fluorescence microscopy imaging and cNMP-quantification using ELISA. Furthermore, a fused construct of the cAMP-gated cation channel CNGA2 (C460W-E583M, according to Rich et al., 2001) and the light activated adenylyl-cyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) was cloned using a 2A-sequence (Tang et al., 2009) and expressed in oocytes. The function of this construct has been shown electrophysiologically and immunologically. KW - Calciumion KW - Sekundärer Bote KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lichtgesteuerte Manipulation KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lightinduced manipulation KW - Pflanzen KW - Licht Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85940 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Barbara T1 - Untersuchungen zur Regulation der Invertaseaktivität und zu Invertaseinhibitoren aus Pflanzenextrakten T1 - Investigations about Changes in Activities of Invertases and about Invertase Inhibitors N2 - Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energieträger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden Überblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt. Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielfältige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen in der Aktivität durch verschiedene Einflüsse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen. Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorgängen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase-Isomaltase aus dem Dünndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden. Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkstärke verschiedener Inhibitoren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer Struktur zueinander sehr ähnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivität. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol führt teilweise zu einer erhöhten Invertaseaktivität und Calystegin B2 verfügt nur über ein beschränktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivität. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegenüber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat. Für die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchgeführt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten könnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde größtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgeführt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten. N2 - The cleavage of different sugars is a fundamental process in all living organisms. In this thesis, enzymes which cleave sucrose – an important messenger molecule and energy carrier - in glucose and fructose were analyzed. It shows a broad overview of sucrose cleaving enzymes, which for the first time, combines α-glucosidases and β-fructofuranosidases and their inhibitors. Invertases (β-fructofuranosidases, fructose split-off) play a pivotal role in plant metabolism and are regulated in varied manners. Investigations about the changes in activities of different invertase preparations by different influences were done in vitro. It could be shown that temperature optimum of invertases is impressingly high. The behavior of alkaline / neutral invertase differentiates in many tests from that of others invertases. Also in animals and human beings, sucrose cleaving enzymes, named α-glucosidase or sucrase (glucose split-off), are part of important processes like glycosilation of proteins or digestion. The human sucrase-isomaltase from small intestine is a target in diabetes therapy. As an active subunit the sucrase could be expressed in the yeast Pichia pastoris for the first time. Aside from the enzymes, the spectrum of activity and the potency of different invertase inhibitors were analyzed. It could be shown that acarbose, which is used in diabetes therapy, can also inhibit plant invertases. DMDP, miglitol and calystegine B2, structurally similar imino sugars, differ extensively in their potency. DMDP is the most potent inhibitor, Miglitol partly increases invertase activity and calystegin B2 inhibits only some enzymes. Proteinaceous invertase inhibitors inhibit humane sucrase and yeast invertase as well as plant invertases; in P. pastoris expressed and glycosylated inhibitors showed no potency. As the only inhibitor, miglitol could selectively inhibit the alkaline / neutral invertase, inhibition occured at concentrations 1000 times lower than with other invertases. The search for new invertase inhibitors comprised a screening of different extracts and a literature research dealing with plants in diabetic therapy and plant derived glucosidase inhibitors. A large number of plants with potential active ingredients were investigated. The screening for new invertase inhibitors was mainly conducted with extracts of plants from traditional chinese medicine. As result, inhibitory extracts were found which should be further investigated. KW - Invertase KW - Inhibitor KW - Diabetes KW - Pflanzen KW - Alpha-Glucosidase KW - Invertase KW - Inhibitor KW - Alpha-Glucosidase KW - Diabetes Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71469 ER - TY - THES A1 - Rümer, Stefan T1 - Untersuchungen zur oxidativen Bildung von Stickstoffmonoxid in Pflanzen sowie zur Visualisierung von Stickstoffmonoxid mittels Fluoreszenzfarbstoffen T1 - Oxidative NO formation in plants and visualisation of nitric oxide with fluorescence indicators? N2 - Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiges, relativ stabiles Radikal, das in Pflanzen u. a. durch Reduktion aus Nitrit unter Katalyse des Enzyms Nitratreduktase gebildet wird. In tierischen Organismen wird NO dagegen über einen oxidativen Syntheseweg aus der Ami-nosäure L-Arginin katalysiert durch verschiedene Isoformen der NO-Synthasen (NOS) hergestellt. Es besitzt im tierischen System vielfältige Funktionen u. a. als Neurotransmitter sowie Blutfluss und -druck regulierendes Agens. Im Pflanzenreich werden NO u. a. Aufgaben bei der Regulierung von Spaltöffnungen, der Abwehr von Pathogenen sowie der Differenzierung der Xylemelemente zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Ziele: - Erforschung alternativer oxidativer Synthesewege von NO in Pflanzen und - Untersuchung der NO-Spezifität der DAF-Fluoreszenzfarbstoffe ausgehend Diskrepanzen zwischen Daten aus Floureszenzanalysen und der Gasphasen-Chemilumineszenz in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe und zahlreichen weiteren Publikationen. a) NO-Produktion aus Hydroxylaminen Hydroxylamin ist ein Zwischenprodukt bei der bakteriellen Denitrifizierung und wurde auch als Intermediat bei der Nitratreduktion in Pflanzen diskutiert. Hier wird gezeigt, dass Tabaksuspensionzellen in der Lage waren, exogenes Hydroxylamin schon in sehr niedrigen Konzentrationen (4 µM) zu NO zu oxidieren. Auch ein anderes HA-Derivat, nämlich der Hemmstoff der Alternativen Oxidase (AOX) in Mitochondrien, Salicylhydroxamsäure (SHAM), wurde zu NO oxidiert. Die Vermutung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) könn-ten bei diesem Oxidationsprozess eine Rolle spielen, wurde überprüft: Nach Einwirkung des ROS-abbauenden Enzyms Superoxid-Dismutase (SOD) konnte aber überraschender-weise keine Verminderung, sondern eher eine Steigerung der NO-Emission beobachtet werden. Die Rolle der SOD in diesem Reaktionsprozess ist daher noch nicht verstanden. b) NO-Detektion mittels Fluoreszenzindikatoren Zur Visualisierung und Lokalisierung von NO in tierischen und pflanzlichen Zellen und Geweben (in situ) mittels mikroskopischer (LSM) oder fluorimetrischer Methoden werden Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. DAF-2 oder DAF-FM verwendet. Diese Farbstoffe reagieren mit NO zu stark fluoreszierenden Triazol-Derivaten. Eine Situation, in der Pflanzen u. a. mit NO-Freisetzung reagieren, ist der Pathogenbefall. Wir untersuchten die Reaktion von Tabaksuspensionszellen auf den pilzlichen Elicitor Cryptogein, ein Protein des Oomyceten Phytophthora cryptogea. Im Filtrat der Zellen, die mit Cryptogein behandelt wurden, zeigte sich nach Zugabe von DAF-Farbstoffen ein starker Fluoreszenzanstieg. Um die fluoreszenzerhöhenden Stoffe zu charakterisieren, wurde das Filtrat vor der DAF-Zugabe verschiedentlich behandelt. Bei Zugabe von KCN bzw. Katalase zum Überstand, verringerte sich der Fluoreszenzanstieg. Gleichzeitige Behandlung der Zellen mit Cryptogein sowie dem NADPH-Oxidase-Inhibitor DPI unterband den Fluoreszenzanstieg im Überstand nahezu komplett. Enzym-Assays mit Amplex Rot zeigten die Anhäufung von H2O2 im Filtrat der elicitierten Zellen. Neben ROS werden von Pflanzenzellen auch Peroxidasen in den Apoplasten sekretiert, die mit Hilfe von H2O2 für eine verstärkte Quervernetzung der Zellwand sorgen. Sowohl in unbehandelten Kontrollzellen als auch in elicitierten Zellen wurde Peroxidase-Aktivität nachgewiesen. Nach Zugabe von H2O2 und DAF-2 zum Filtrat von Kontrollzellen ergab sich ein Fluoreszenzanstieg ähnlich dem im Filtrat von behandelten Zellen. Mit Hilfe eines einfachen In-vitro-Systems aus Meerettich-Peroxidase (MR-PO), Wasser-stoffperoxid (H2O2) und DAF-2 konnten noch höhere Fluoreszenzwerte erzielt werden, was die Vermutung der Fluoreszenzerhöhung ohne Anwesenheit von NO erhärtete. Um diese nicht aus einer Reaktion mit NO resultierenden DAF-Produkte näher zu charak-terisieren, wurden Trennungen mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschro-matographie mit Fluoreszenzdetektion (RP-HPLC-FL) und Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgeführt. Dabei wurden tatsächlich zwei neue Reaktionsprodukte festgestellt, die sich eindeutig von DAF-2T unterschieden. Letzteres konnte nur bei Hinzufügen des NO-Donors DEA-NO detektiert werden. Zur Erfassung von intrazellulären Reaktionsprodukten von DAF wurden die chromatogra-phischen Trennmethoden auch auf Extrakte von mit DAF-2 DA aufgeladenen und danach elicitierten Zellen angewandt. Bei dieser Auftrennung tauchten noch mehr DAF-Reaktionsprodukte auf. Die Hauptfluoreszenz, die auch bei nicht inkubierten Zellen auf-trat, konnte auf eine Reihe sehr früh eluierender Substanzen zurückgeführt werden. Die zwei DAF-Derivate aus dem Überstand inkubierter Zellen bzw. der In-vitro-Reaktion (MR-PO+H2O2+DAF-2) tauchten jedoch überhaupt nicht auf. Vorläufige massenspektrometrische Analysen legen nahe, dass es sich bei den in Abwe-senheit von NO gebildeten zwei Verbindungen um isomere Dimere von DAF-2 handelt. N2 - Nitric oxide is a diatomic, gaseous, relatively stable radical that is mainly synthesized via a reduction of nitrate/nitrite or via an oxidation of amino groups. The latter pathway has been attributed a major role in NO production from the amino acid L-arginine catalysed by three different isoforms of NO-synthases (NOS). In animals, NO fulfils a variety of well-known functions e. g. as neurotransmitter, blood-flow and -pressure regulating agent. In the plant kingdom, it plays a role in the regulation of stomatal movement, in the defense against pathogens and in xylogenesis. Major aims of this work were: - to search for alternative oxidative pathways for nitric oxide from reduced nitrogen compounds and - to unravel previous inconsistencies described in our group on NO production in plants as detected by gas phase chemiluminescence or by fluorescing NO specific dyes. a) NO production by oxidation of hydroxylamine (HA) Hydroxylamine was discussed as an intermediate in nitrate reduction in plants and appears conjugated to carbonyl compounds as oximes. Here it is shown that tobacco suspension cells are able to oxidize exogenous hydroxylamine to nitric oxide when applied in concen-trations as low as 4 µM. This was also observed after addition of another hydroxylamine, salicylhydroxamic acid (SHAM), which is a frequently applied inhibitor of mitochondrial Alternative Oxidase (AOX). Preliminary observations suggest that reactive oxygen species (ROS) play a role as oxidants. Addition of superoxide dismutase (SOD), an enzyme de-grading ROS, led to an even higher output of NO from hydroxylamine, which may indicate an involvement of H2O2. b) DAF-fluorescence without NO Fluorescent dyes (DAF-2, DAF-FM, DAR-4M) have been used widely to visualize NO production in tissues and single cells, mostly in connection with the LSM technique. By reaction with NO, these dyes form stable and highly fluorescing triazol-derivatives (e. g. DAF-2T). Much of the present knowledge on NO in plants is based on the use of these dyes. One important example out of many is the induction of NO production by treating plants with compounds (elicitors) provoking a hypersensitive response in specific target plants. Here, the system tobacco and the elicitor cryptogein, a peptide secreted from the oomycete Phytophthora cryptogea was used. This elicitor is specific for tobacco, and in-duces programmed cell death in tobacco suspension cells. When DAF-2 was added to a filtrate of cells preincubated with cryptogein, a strong fluo-rescence increase was observed. Addition of potassium cyanide (KCN) or catalase lowered this increase. Simultaneous treatment of cells with cryptogein and DPI, an NADPH-oxidase inhibitor, abolished fluorescence almost completely. Assays using the H2O2-sensitive dye amplex red indicated an accumulation of H2O2 in the filtrate of elicited cells. Besides ROS, plants secrete peroxidase enzymes into the apoplast which catalyze the crosslinking of cell wall polymers using H2O2. Peroxidase activity was observed both in the filtrate of control cells and cryptogein-treated cells. Addition of H2O2 and DAF-2 to the filtrate of untreated cells gave a fluorescence increase similar to that observed after addi-tion of DAF-2 to the filtrate of cryptogein-elicited cells, which was a first hint that fluores-cence could be induced without NO. An in-vitro-system consisting of horseradish-peroxidase (MR-PO), H2O2 and DAF-2 re-sulted in strong fluorescence increase, confirming that fluorescence took place even in the complete absence of NO. To further characterize suspected novel DAF-derivatives not related to NO, they were analysed by reverse-phase high-pressure liquid chromatography with fluorescence detection (RP-HPLC-FL) and mass spectrometry (UPLC-MS). Indeed, two new DAF-reaction products were discovered which could be clearly separated from DAF-2T. The reaction product of DAF-2 and NO was detected only when the NO-donor DEA-NO was added to the reaction mixture of the in-vitro-system (HR-PO + H2O2 + DAF-2), revealing three peaks, the two novel DAF-derivatives and DAF-2T. In order to elucidate intracellular reaction products formed inside DAF-2 DA preloaded cells during elicitation, extracts of suspension cells were also submitted to RP-HPLC-FL. In this case, a larger number of DAF-derivatives were found. Even in non-incubated cells, bulk fluorescence originated from a group of early eluting novel compounds. However, none of them could be matched with the two derivatives found in the cell filtrate or in vitro. Preliminary mass spectrometrical analyses suggest the two novel, highly fluorescing compounds formed in the absence of NO in vitro or the filtrate of elicited cells to represent isomeric dimers of DAF-2 which are linked via the amino-groups after reduction. KW - Stickstoffmonoxid KW - Synthese KW - Pflanzen KW - Nachweis KW - oxidative NO-Bildung KW - DAF KW - Fluoreszenz KW - Hydroxylamin KW - Salicylhydroxamsäure KW - nittric KW - oxide DAF KW - fluorescence KW - hydroxylamine KW - oxidative NO-formation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77115 ER - TY - THES A1 - Rösch, Petra T1 - Raman-spektroskopische Untersuchungen an Pflanzen und Mikroorganismen T1 - Raman spectroscopic investigations on plants and microorganisms N2 - In dieser Arbeit werden Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzenzellen und Mikro-organismen spektroskopisch untersucht und ihre Inhaltsstoffe unter minimaler Probenpräparation im biologischen Gewebe direkt lokalisiert und identifiziert. Unter den verfügbaren Schwingungs-spektroskopischen Methoden ist die Mikro-Raman-Spektroskopie für diese Fragestellungen besonders gut geeignet, da Wasser Raman-Spektren nur wenig beeinflusst. Daher kann mit Raman-spektroskopischen Methoden auch in stark wasserhaltigem Gewebe gemessen werden. Weiterhin erhält man mit der Mikro-Raman-Spektroskopie eine gute räumliche Auflösung im sub-µm-Bereich, wodurch es möglich ist, heterogene Proben zu untersuchen. Darüber hinaus kann die Mikro-Raman-Spektroskopie mit anderen Methoden, wie z. B. der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS), kombiniert werden. In pflanzlichen Zellen liegt eine Vielzahl von Substanzen in geringen Konzentrationen vor. Aufgrund der niedrigen Quantenausbeute des Raman-Effekts treten vor allem Substanzen, die eine Resonanz-Verstärkung erfahren, in den Spektren hervor. Diese Substanzen, wie z. B. b-Carotin, können deshalb in geringen Konzentrationen detektiert werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt in der Untersuchung von Sekundär-Metaboliten wie Alkaloiden, Lipiden oder Terpenen, die in der Pflanze agglomerieren. Neben der Identifikation von Inhaltsstoffen, können die Raman-Spektren von Pflanzen für die chemotaxonomische Klassifizierung mit Hilfe der hierarchischen Clusteranalyse verwendet werden. Die Identifizierung von Mikroorganismen auch in sehr geringen Mengen (Monolage, einzelne Zellen) ist mit der Mikro-Raman-Spektroskopie nur unter bestimmten Voraussetzungen durchführbar. Für weitergehende Untersuchungen wird hier die SERS-Sonde oder ein TERS-Aufbau verwendet werden. N2 - This thesis concentrates on the spectroscopic investigation of plants, plant tissue, plant cells as well as microorganisms. The characteristic components of the biological cells have been localized and identified directly in the biological tissue with minimal sample preparation only. Among the different vibrational spectroscopic methods micro Raman spectroscopy appears to be the most suitable technique for such scientific investigations. For example, water which shows sharp absorptions in the infrared is only a weak Raman scatterer. Thus biological tissues containing a high amount of water can be easily studied with Raman spectroscopy. Due to the use of laser light for the excitation of Raman scattering sub-µm spatial resolution can be realized by micro Raman spectroscopy. This allows the investigation of very heterogeneous samples. Furthermore, micro Raman spectroscopy can be combined with other methods such as surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). Plant cells consist of a great variety of substances at low concentrations. As the Raman effect has a poor quantum yield mostly resonance enhanced substances can be identified in the resulting spectra. These substances like e. g. b-carotene can be detected down to very low concentrations. The main focus lies on the investigation of secondary metabolites such as alkaloids, lipids or terpenes, which agglomerate in the plant. Besides the identification of plant components, Raman spectra allow the chemotaxonomic classification of plants when combined with a hierarchical cluster analysis. The identification of microorganisms in low amounts (monolayers, single cells) could only be achieved with Raman spectroscopy when certain conditions are met. Further investigations should focus on the SERS probe or the TERS setup. KW - Pflanzen KW - Raman-Spektroskopie KW - Mikroorganismus KW - Oberflächenverstärkter Raman-Effekt KW - Sekundärmetabolit KW - Mikro-Raman-Spektroskopie KW - SERS KW - Lipide KW - ätherische Öle KW - Clusteranalyse KW - Microorganismen KW - micro Raman spectroscopy KW - SERS KW - lipids KW - essential oils KW - cluster analysis KW - microorganisms Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3539 ER - TY - JOUR A1 - Kirchmeier, Peter A1 - Meierott, Lenz A1 - Jung, Klaus T1 - Taraxacum sect. Borealia Hand.-Mazz. in den Alpen T1 - Taraxacum sect. Borealia Hand.-Mazz. of the Alps JF - Forum Geobotanicum N2 - The presence of Taraxacum microspecies of the section Borealia in the European Alps has been known from France, Suisse, Austria, Italy and Slowenia. The five known species are Taraxacum gallicum, T. handelii, T. kraettlii, T. mazzettii and T. melzerianum. From 2004 up to 2014 these localities have been visited. Detailed examinations of many collections make it possible to add characteristics and precise the descriptions and correct mistakes, eliminate ambiguities and fill gaps in the original descriptions. Numerous photos, drawings and a new determination key will make the access to the section Borealia easier. A new species of section Borealia, T. cimae-gallinae, from the mountain Hühnerspiel near Sterzing (Italy, South Tyrol) is described. The habitats of the Borealia in the alpine level are mostly gravel floors on wind-swept ridges or on summit levelings. The environment of Borealia-species is threatened by ski tourism or by the changes from global warming. N2 - Nach bisheriger Kenntnis sind aus den Alpen Vorkommen von fünf Taraxacum-Kleinarten der Sektion Borealia in Frankreich, der Schweiz, Österreich, Italien und Slowenien bekannt: Taraxacum gallicum, Taraxacum handelii, T. kraettlii, T. mazzettii und T. melzerianum. Zwischen 2004 und 2014 wurden diese Vorkommen und weitere potentielle Wuchsorte aufgesucht. Durch detaillierte Untersuchung der Vorkommen vor Ort sowie zahlreicher Belege aus mehreren europäischen Herbarien können nun Merkmale ergänzt, präzisiert und einige Fehler, Unklarheiten in den Originalbeschreibungen korrigiert und Lücken ergänzt werden. Zahlreiche Fotos und Zeichnungen sowie ein neugefasster Schlüssel sollen den Zugang zur Sektion Borealia erleichtern. Mit Taraxacum cimae-gallinae vom Hühnerspiel bei Sterzing (Italien, Südtirol) wird eine neue Art der Sektion Borealia beschrieben. Die Wuchsorte der Borealia-Arten in der alpinen Stufe sind überwiegend Schotterböden auf windgefegten Graten und Gipfelverebnungen. Diese sind derzeit sowohl durch den Ski-Tourismus als auch durch die Klimaerwärmung gefährdet. KW - Taraxacum cimae-gallinae spec. nov. KW - Taraxacum sect. Borealia KW - distribution KW - determination key KW - Agamospermy KW - Pflanzen KW - Systematik KW - alpine Taraxaca Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-347512 UR - http://forum-geobotanicum.net/articles/vol_11-2023/PK-LM-KJ_Taraxacum_pp35-56/FG---PK-LM-KJ_Taraxacum_sect_Borealia.pdf SN - 1867-9315 VL - 11 ER - TY - THES A1 - Kartäusch, Ralf T1 - Spektroskopische Flussmessung an Pflanzen mittels mobilem Magnetresonanztomographen T1 - Spectroscopic flow measurements in plants using a mobile magnetic resonance system N2 - The main objective of this dissertation was the development of a flow sensor which is specialized on flow measurements of plants. Hence, an accessible mobile magnet and the receiver/transfer hardware have been developed. Additionally, software to control the MR-console has been written. The AC-method was advanced to acquire slow flow profiles. This enables acquiring flow in plants. Additionally, in cooperation with the working group “Lipid Motobolism” of the IPK-Gatersleben studies have been carried out to measure the influence of the ear of wheat on the water transport mechanism. Furthermore, a new technique based on the Bloch-Siegert-effect has been developed which reduces the influence of eddy currents. This simplifies flow measurements that suffer heavily from eddy currents. Hardware development An accessible mobile magnet with a field strength of 0.42 T has been build. The field homogeneity is 0.5 ppm in 1 cm³. In comparison to the existing closed magnet system at the chair EP5 this is an improvement of a factor 40. Those enhancements have been achieved by an adjusted design of the magnet which has been optimized by computer simulations. The implementation of ferrite pole shoes reduced the eddy currents by a factor 7 in comparison to the usually used iron pole shoes. Therefore, phase sensitive flow measurements using fast switching magnet field gradients could be carried out. A foldable coil has been refined to achieve an accessible receiver system. This coil has been used as a transmit/receiver unit. Furthermore, the SNR of measurements in thin plant stalks was enhanced by a constructed system that could be directly wrapped around the stalk. Additionally, two systems to reduce noise in plant measurements have been developed. Those systems can reduce the noise by a factor 92. This was necessary because the longish plant stems guides electric noise from outside of the case into the receiver coil. Both noise reduction systems, the electromagnetic shielding and the common mode rejection, removed the noise to the same level. Flow measurement In the present work a refinement of the AC-method [36] enabled for the first time acquiring quantitative flow profiles. Hence, it was possible to measure slow velocity in the range of 200 µm/s. The precondition was the replacement of the sinusoidal gradient profile by a trapezoid gradient shape. Those allowed increasing the slew rate of the gradients and therefore shorten the total duration of the ramp which finally allows higher encoding strengths. Additionally, due to intervals without applied gradients, more efficient RF-pulses can be used and more data points can be acquired in an echo. The measured flow profiles correlated to the simulation results. The accurate flow profiles have been achieved by a new evaluation technique and a phase correction mechanism. The newly developed extension to imaging enabled spatially encoded spectral flow measurements. Therefore, the location of xylem and phloem can be spatially separated. In the measurement of the black alder this becomes apparent. Here the shape of dicotyledonous plants, which is described in chapter 5.1, is visible. Additionally, due to the spatial separation of the flow directions (up/down) qualitative flow measurements are possible. In pixels where opposite flow directions can spatially be resolved the difference between the left and the right side of the flow spectra yields the total flow without static water. Due to the phase corrections technique in combination with the automatically frequency calibration, long term flow measurements were possible. Therefore, the response of plants on influences like changes in the illumination have been observed in measurements over a duration of nine days. Here flow changes below 200 µm/s can be detected. Bloch-Siegert phase encoding In this work a new spatial phase encoding technique (BS-SET) using a B1-gradient in combination with far off-resonant radio frequency pulses has been demonstrated. Based on the Bloch-Siegert Shift an eddy current free B1-gradient was used to encode images and apply flow encoding. The BS-gradient induces a phase shift which depends on B1² using a constant gradient. Therefore, adapted reconstructions have been developed that provide undistorted images using this nonlinear encoding. Alternatively, a B1-gradient has been developed where the profile of the B1-field follows a square root shape. This supplies a linear phase encoding removing the need for an adapted reconstruction and enables using this technique for flow encoding. N2 - Das Ziel der Promotion war die Entwicklung eines Flusssensors mit dem Fokus auf Flussmessungen an Pflanzen. Dazu musste zunächst die Hardware in Form eines räumlich zugänglichen Magneten und einer Sende- und Empfangseinheit entworfen werden. Um die MR-Konsole ansteuern zu können, musste eine Software entwickelt werden. Die AC-Methode wurde für Flussmessungen mit niedrigen Geschwindigkeiten angepasst und die entsprechende Theorie dazu erweitert. Mit dieser weiterentwickelten AC-Methode wurde die Flussmessung an Pflanzen demonstriert. Dafür wurden im Rahmen einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe „Lipid Motobolism“ der IPK-Gatersleben Flussstudien an Weizenpflanzen durchgeführt. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit eine neue Technik zur Wirbelstromvermeidung bei Permanentmagneten entwickelt, um Problemen mit diesen bei Flussmessungen entgegenzuwirken. Sensorbau Es wurde ein zugänglicher, mobiler Magnet mit einer Feldstärke von 0,42 T gebaut. Die Feldhomogenität beträgt 0,5 ppm in 1 cm³. Im Vergleich zu dem am Lehrstuhl der EP5 bestehenden, geschlossenen, mobilen Magnetsystem erreicht das in dieser Arbeit gebaute System ein 40fach homogeneres Magnetfeld. Erzielt wurden diese Verbesserungen durch ein spezielles Design, welches durch Computersimulationen sukzessiv optimiert wurde. Durch angepasste Polschuhe konnte darüber hinaus die Induktion von Wirbelströmen im Mittel um einen Faktor 7 reduziert werden, wodurch phasensensitive Flussmessungen ermöglicht wurden. Um die Zugänglichkeit zu dem Innenraum der HF-Spulen zu gewährleisten, wurde eine Klappspule weiterentwickelt und als Sende- und Empfangseinheit für den Tomographen gebaut. Ferner wurde ein System gebaut, dass direkt um die Pflanze gewickelt werden kann und sich somit für besonders dünne Pflanzenstängel eignet. Weiterhin wurden zwei Systeme zur Rauschunterdrückung für die Messungen an Pflanzen entwickelt. Dadurch konnte das Rauschen um einen Faktor 92 gesenkt werden. Dies war notwendig, weil die länglichen Pflanzen durch ihre Ausdehnung über das Gehäuse hinweg ein Rauschen in die Empfangsspule induziert haben. Die beiden Rauschunterdrückungssysteme, die elektrische Schirmung und die Gleichtaktunterdrückung, entfernten das Rauschen dabei gleichermaßen. Flussmessung Die im Rahmen der Arbeit erfolgte Weiterentwicklung der AC-Methode [102] erlaubte es erstmals mit der Methode quantitative Flussprofile aufzunehmen. In Folge dessen war es außerdem möglich Geschwindigkeiten unter 200 µm/s zu messen. Die Vorrausetzung dafür war die Implementierung von trapezförmigen Gradienten, welche kürzere Rampzeiten und eine stärkere Kodierung zulassen. Dadurch sind außerdem Intervalle ohne Gradienten realisierbar, die effizientere Refokussierungspulse und die Aufnahme mehrerer Datenpunkte ermöglichen. Die zu erwartenden und simulierten Flussprofile entsprachen den gemessenen Profilen durch die Verwendung einer neuen Auswertungstechnik. Die neu entwickelte Erweiterung zur Bildgebung ermöglicht die ortsaufgelöste, spektroskopische Flussmessung und so können die Bereiche von Xylem und Phloem voneinander getrennt werden. Dies wurde durch Messungen einer Schwarzerle gezeigt, bei der die im Abschnitt 5.1 beschriebene Struktur dikotyler Pflanzen aufgelöst werden konnte. Zusätzlich können qualitativ genauere Aussagen über die Flussgeschwindigkeit getroffen werden. Bei Messungen an Pflanzen konnte mit der optimierten AC-Methode die Flussänderungen aufgrund äußerer Einflüsse, wie der Beleuchtung, beobachtet werden. Langzeitmessungen über 9 Tage zeigten einen der Beleuchtung folgenden Flussverlauf - auch bei sehr geringen mittleren Flussänderungen von unter 200 µm/s. Bloch-Siegert Phasenkodierung Um eine Phasenkodierung ohne die Induktion von Wirbelströmen zu erhalten, wurde im Rahmen der Arbeit die ortsabhängige Phasenkodierung mittels B1-Gradienten entwickelt. Diese Technik basiert auf HF-Wechselfeldern und benutzt den sogenannten BS-Shift um einen B1-feldabhängigen Frequenzshift zu induzieren. Zwei Rekonstruktionstechniken wurden entwickelt, um die Rekonstruktion von entzerrten Bildern zu ermöglichen. Dies war notwendig, da die Kodierung mittels BS-Shift von B1² abhängt. Infolgedessen wird bei der Verwendung von konstanten HF-Gradienten eine vom Quadrat des Ortes abhängige Phasenkodierung induziert. Als Alternative zu diesem Verfahren wurde ein Gradient entwickelt, der einen wurzelförmigen Feldverlauf hat und somit die lineare Kodierung ohne angepasste Rekonstruktionstechniken ermöglicht. KW - Kernspintomografie KW - Wassertransport KW - Spektroskopische Flussmessung KW - AC Gradients KW - Pflanzen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125820 ER - TY - THES A1 - Karg, Kathrin T1 - Analyse biologisch aktiver, oxidierter Lipide in Pflanzen und Menschen T1 - Analysis of biologically acitve, oxidized lipids in plants and humans N2 - Durch freie, radikalkatalysierte Oxidation von Linolensäure können in vitro und in vivo meh-rere Klassen von Phytoprostanen gebildet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wur-den Phytoprostane in Pflanzenmaterial (Blättern, Blütenpollen), Speiseölen sowie in mensch-lichen Körperflüssigkeiten (Blut und Urinproben) untersucht. Zusätzlich wurden neue Metho-den entwickelt, um Phytohormone sowie verschiedene Metabolite des pflanzlichen Primär- und Sekundärstoffwechsels zusammen mit einer gemeinsamen Aufarbeitung erfassen und bestimmen zu können. Blütenpollen enthalten mehrere mmol/g an Phytoprostanen, darunter PPA1/PPB1, PPE1 und PPF1. Physiologisch relevant sind jedoch nur die Mengen, die sich nach Extraktion in einem wässrigen Puffer wiederfinden lassen. Deshalb wurden hier erstmals wässrige Extrakte von Birkenpollen untersucht. In diesen befanden sich durchschnittlich 60 nmol PPE1 und 10 nmol PPF1 pro g extrahiertem Pollen. Pflanzenöle enthalten a-Linolensäure bis zu einem Gewichtsanteil von 56 % (m/m). In Spei-seölen aus ausgesuchten Pflanzenarten (Leinöl, Sojaöl, Olivenöl), Walnussöl, Traubenkernöl) und parenteraler Nahrung (Intralipid) wurden die Phytoprostanklassen A1, B1, D1, E1, F1 und deoxy-J1 nachgewiesen und quantifiziert. In frischen Ölen wurden große Mengen an Phy-toprostanen (0,4 – 101 mg/g Öl) gefunden, welche teilweise frei und teilweise verestert vorla-gen. Der absolute Phytoprostangehalt der Öle nahm in folgender Reihe ab: Leinöl » Sojaöl > Olivenöl > Walnussöl > Rapsöl >> Traubenkernöl. (a-Tocopherol). In allen untersuchten Ö-len dominierten entweder PPE1 oder PPF1 als häufigste Phytoprostanklasse. PPA1 und PPB1 waren lediglich als untergeordnete Bestandteile enthalten. PPD1 und dPPJ1 konnten nur in sehr geringen Mengen gefunden werden. Wenn ein Öl bei längerer Lagerung autoxidiert, können die Gehalte an oxidierten Fettsäuren um ein Vielfaches ansteigen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der Autoxidation von Spei-seölen weitere Phytoprostane entstehen und die Konzentrationen von PPE1 und PPF1 im Öl bis auf das 10-fache ansteigen können. Weiterhin wurde dabei die Bildung von detektierbaren Mengen dPPJ1 nachgewiesen. Die Kinetik der Phytoprostanbildung folgte dem für andere Autoxidationsprodukte typischem zeitlichen Verlauf und erst nach Überschreiten einer Induk-tionsperiode traten vermehrt Phytoprostane auf. Im menschlichen Verdauungstrakt sind Phytoprostane chemisch stabil. Allerdings können im sauren Milieu des Magens (pH 0-2) Dehydratisierungen auftreten: Nach Inkubation von PPE1 in 0,1 M HCl waren nach 3 h noch 97 % intakt, wohingegen 3 % nichtenzymatisch zu PPA1 konvertiert waren. Unter den gleichen Bedingungen wurden 19 % der inkubierten PGD1 zu dPGJ1 dehydratisiert. In den Pflanzenölen veresterte PPF1 wurden mit Schweinepankreas-Lipase innerhalb 1 h zu 44 bis 100 % hydrolysiert. Raffinierte Speiseöle, welche fast ausschließlich aus Triacylglyce-riden zusammengesetzt sind, wurden die veresterten PPF1 sogar zu fast 100 % hydrolysiert. Weiterhin konnte erstmals gezeigt werden, dass Phytoprostane nach oraler Aufnahme resor-biert werden können und anschließend mit dem Urin ausgeschieden werden. Nach Verzehr von Pflanzenölen (Sojaöl, Olivenöl, Traubenkernöl) wurden die Spiegel von PPF1 in Blut und Urin bestimmt. Dabei zeigte sich eine deutliche Korrelation zwischen dem Phytoprostangehalt der Öle und dem Gehalt in den Blut- und Urinproben: Nach Konsum von Oliven- oder Sojaöl konnten innerhalb von 24 h PPF1 in Blut und Urin wiedergefunden werden, wohingegen der Konsum von Traubenkernöl in den untersuchten Zeiträumen weder im Blut noch im Urin zu detektierbaren PPF1-Mengen führte. Im Blut lag PPF1 verestert vor: Im Serum von Olivenöl-Konsumenten konnten durchschnittlich 1,22 nmol/l PPF1 gefunden werden. Das Serum eines Sojaöl-Konsumenten enthielt 0,97 nmol PPF1/l. Die Ausscheidung von unmetabolisierten PPF1 mit dem Urin erfolgte fast vollständig innerhalb der ersten 8 h nach dem Konsum der Öle, 8 bis 24 h danach konnten im Urin nur noch sehr geringe Mengen PPF1 detektiert wer-den. In den Urinproben der Konsumenten von Olivenöl oder Sojaöl konnten nach 0-4 h durch-schnittlich 2,02 bzw. 0,43 pmol PPF1/mg Kreatinin und nach 4-8 h 1,39 bzw. 0,68 pmol PPF1/mg Kreatinin gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, welche die simultane Bestimmung von Phytohormonen, Oxylipinen und Fettsäuren ermöglicht. Weiterhin wurden Methoden zur Metabolit-Analytik entwickelt, mit welchen Konzentrationsunterschiede zwischen zwei Pro-ben direkt verglichen werden können. Zur Markierung von der Carboxylgruppe von Oxylipinen, Phytohormonen und Aminosäuren mit 18O-Sauerstoff wurden allgemein anwendbare Methoden entwickelt. Die [18O]2-markierten Verbindungen erwiesen sich als stabil und eigneten sich als interner Standard in der GC-MS und HPLC-MS Analytik. N2 - Free radical catalyzed oxidation of linolenic acid leads to the formation of several classes of phytoprostanes, which can occur in vitro and in vivo. In the present thesis, phytoprostanes have been determined in plant material (leaves, pollen), fatty oils and human body fluids (blood and urine samples). Within this work, existing methods were optimized in order to detect all phytoprostane classes in various materials. In addition, new methods for simultane-ous detection and quantification of phytohormones and other plant primary and secondary metabolites together in one sampling procedure were developed. Pollen grains contain phytoprostanes in amounts of some mmol/g, among them PPA1/PPB1, PPE1 und PPF1. However, only the concentrations that can be achieved after extraction with water are physiologically relevant. Therefore, the quantity of phytoprostanes that can be ex-tracted with aqueous buffer was examined. In aqueous birch pollen extract, considerable amounts of PPE1 and PPF1 have been found, ranging around 60 nmol PPE1 and 10 nmol PPF1 per gram extracted pollen. Vegetable oils contain a-linolenic acid in concentrations up to 50% (m/m). In edible oils from selected plant species (linseed oil, soybean oil, olive oil, walnut oil, grapeseed oil) and par-enteral nutrition (intralipid) the phytoprostane classes A1, B1, D1, E1, F1 and deoxy-J1 were identified and quantified. High levels of phytoprostanes (0,4 – 101 mg / g oil) in both free and esterified form were found even in apparently fresh oils. Linseed oil and soybean oil con-tained the highest levels of phytoprostanes (26 µg / g and 29 µg /g, respectively). The abso-lute phytoprostane content of the oil declined in the following order: Linseed oil » soybean oil > olive oil > walnut oil > rapeseed oil >> grape seed oil. Surprisingly, the total amount of phytoprostanes did not correlate well with the linolenic acid content and the content of vita-min E (a-tocopherole). In all oils, either PPE1 or PPF1 was the dominant phytoprostane class. PPA1 and PPB1 were only minor components. PPD1 was found in very small amounts whereas dPPJ1 could exclusively be detected in natural soybean oil. Moreover, levels of oxidized lipids dramatically increase when oils become autoxidized upon prolonged storage. It was shown that during autoxidation of edible oils the levels of PPE1 and PPF1 may raise 10-fold. Furthermore, the formation of detectable amounts of dPPJ1 was demonstrated. The formation of phytoprostanes showed the kinetics typical for all autoxidation products and the amount of oxylipin increased after an induction period. In the human gastrointestinal tract, phytoprostanes are chemically stable. Indeed, exposed to the acidic conditions in the stomach (pH 0-2), dehydration reactions may take place. After incubation of PPE1 in 0,1 M HCl for 3 h, 97% remained intact while 3% were non-enzymatically converted to PPA1. Under the same conditions, 19% of the incubated PGD1 were converted into dPGJ1.Pancreatic lipase released 44 to 100 % of PPF1 esterified in the plant oils within 1 h. Refined oils that consist almost completely of triacylglyceroles were hydrolyzed nearly by 100 %. Furthermore, absorption of phytoprostanes from the human intestinal tract and excretion into urine could be demonstrated for the first time. After oral consumption of 100 ml of a vegeta-ble oil (olive oil, soybean oil or grape seed oil) PPF1 levels were determined in blood and urine. A strong correlation could be found between the amount of phytoprostanes in the oil and the PPF1-content of the blood and urine samples. Within 24 hours after consuming olive or soybean oil, PPF1 were found in the examined body fluids, whereas after the intake of grape seed oil, PPF1 could be detected neither in blood nor in urine. In blood, PPF1 occurred esterified and the collected blood samples of olive oil consumers contained 1,22 nmol/l PPF1 on average while in the blood of one consumer of soybean oil 0,97 nmol PPF1/l could be de-tected. Excretion of the unmetabolized PPF1 in urine occurred nearly completely during the first 8 hours and 8 to 24 hours after the oil intake only very small amount of PPF1 were still measured. 0-4 h after the oil consumption the urine of olive or soybean oil consumers con-tained on average 2,02 and 0,43 pmol PPF1/mg creatinine and after 4-8 h 1,39 and 0,68 pmol PPF1/mg creatinine, respectively. A method that allows the simultaneous determination of phytohormones, oxylipins and fatty acids was developed. Additionally, methods were developed that enable a direct comparison of two different samples in a sum of metabolites. These methods were shown to be suitable for the determination of fatty acids and amino acids. For the labeling of oxylipins, acidic phytohormones and amino acids with 18O in the carboxyl group general methods were established. The [18O2]-labelled compounds are stable and suit-able as internal standards for GC/MS and HPLC/MS analysis. KW - Prostaglandine KW - Pflanzen KW - Mensch KW - Phytoprostane KW - Isoprostane KW - Prostaglandine KW - Jasmonate KW - Oxylipine KW - phytoprostanes KW - isoprostanes KW - prostaglandins KW - jasmonates KW - oxylipins Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20424 ER - TY - THES A1 - Imbusch, Ruth T1 - Phytoprostane F1 T1 - Phytoprostanes F1 N2 - Isoprostane F2 sind Autoxidationsprodukte der Arachidonsäure, die über radikal-katalysierte Oxidation entstehen. Bei einigen Erkrankungen im Tier konnte gezeigt werden, daß die Konzentration von Isoprostanen F2 mit dem verstärkten Vorkommen von freien Radikalen korreliert, weshalb Isoprostane heute als Marker des oxidativen Streß genutzt werden. Darüber hinaus weisen einige Isoprostane eine biologische Aktivität auf, weshalb sie heute als Signalstoffe des oxidativen Streß im Tier diskutiert werden. Pflanzen hingegen können keine Isoprostane F2 synthetisieren, da ihnen der Precursor Arachidonsäure fehlt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß analog zu den Isoprostanen F2 Phytoprostane F1 in Pflanzen aus Linolensäure gebildet werden. Hierfür wurden HPLC- und Gaschromatographie-Massenspektroskopie-Methoden entwickelt, die eine Quantifizierung von Phytoprostanen F1 in Pflanzen ermöglichten. In frischen Pflanzenorganen wurden Phytoprostane F1 sowohl in freier als auch in veresterter Form detektiert. Darüber hinaus stieg die Konzentration sowohl freier als auch veresterter Phytoprostane F1 in Pfefferminzblättern nach Verwundung und in pflanzlichen Zellkulturen nach Zusatz von Agentien, von denen bekannt ist, daß sie pflanzliche Zellen oxidativ schädigen, an. In getrockneten Pflanzenmaterialien wurden extrem hohe Konzentrationen an Phytoprostanen F1 quantifiziert. Daher steht die Vermutung nahe, daß Phytoprostane F1 ähnlich wie die Isoprostane F2 im Tier als sensitiver Marker der oxidativen Zellverletzung in der Pflanze eingesetzt werden können. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß der Zusatz von Phytoprostanen F1 zu Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-Zellsuspensionskulturen zu einer Phytoalexinakkumulation führte. N2 - Isoprostanes F2 are arachidonate autoxidation products in mammals that have been shown to be induced during several human disorders associated with enhanced free-radical generation. Isoprostanes F2 represent not only extremely reliable markers of oxidative stress in vivo but also exert potent biological effects. Therefore, it has been postulated that isoprostanoids are mediators of oxidant injury in vivo. Plants, however, do not generate isoprostanes since they since they are generally unable to synthesize arachidonic acid. Here we show that a series of isoprostane F2 analogs termed phytoprostanes F1 are formed by an analogous pathway from a-linolenate in plants. HPLC and gas chromatography-mass spectrometry methods have been developed to quantify phytoprostanes F1. In fresh plant organs, phytoprostanes F1 were found in free and esterified form in lipids. In addition, wounding of peppermint leaves and oxidative stress, which was triggered by the addition oxidative agents to plant cell cultures significantly increased levels of free and esterified phytoprostanes F1. Extremely high levels of phytoprostanes F1 were found in autoxidised plant material. Thus, phytoprostanes F1 represent a sensitive measure of oxidative damage in plants similar to isoprostanes in animals and men. The addition of phytoprostanes F1 to Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-cell suspension cultures triggered a phytoalexine accumulation . KW - Pflanzen KW - Oxidativer Stress KW - Prostaglandine KW - Analoga KW - Phytoprostane KW - Prostaglandin-ähnliche Verbindungen in Pflanzen KW - Isoprostane KW - Phytoprostanes KW - prostaglandin-like compounds in plants KW - Isoprostanes Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182238 ER - TY - THES A1 - Englert, Markus T1 - Mechanismus des pre-tRNA-Spleißens : Struktur und Funktion pflanzlicher und animaler RNA-Ligasen T1 - Mechanism of tRNA splicing: structure and function of plant and animal RNA ligases N2 - Transfer Ribonukleinsäuren werden von der RNA Polymerase III als Vorläufer tRNA transkribiert und durchlaufen eine Vielzahl von Reifungsschritten hin zur maturen tRNA. Neben der Hydrolyse der 5´- und 3´-Flanke durch die RNase P und die tRNase Z, sowie einer Vielzahl von Basenmodifizierungen, wird bei einigen pre-tRNAs das Intron herausgespleißt. Die ersten intronhaltigen tRNA Gene wurden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nachgewiesen und folglich wurde der Spleißmechanismus in diesem Organismus als erstes untersucht. Eine tetramere tRNA Spleißendonuklease spaltet das Intron an den Exongrenzen heraus und eine tRNA Ligase ligiert die entstandenen tRNA Hälften zur gespleißten tRNA. Einzig in der Hefe und anderen Pilzen konnten bisher die Gene für die tRNA Ligase identifiziert werden. Weder molekularbiologische Ansätze – wie z.B. DNA Hybridisierung, Expressions-“Screening“ und funktionelle Komplementationsstudien mit einem tRNA Ligase-defizienten Hefestamm – noch Datenbanksuchen mit der bekannten Hefe tRNA Ligasesequenz haben in den vergangenen Jahren zur Identifizierung eines pflanzlichen oder animalen tRNA Ligase Gens geführt. In dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, das tRNA Ligase Protein aus Weizenkeimen bis zur Homogenität zu isolieren und mit Hilfe erhaltener Peptidsequenzen die entsprechenden Kern-codierten Gene in höheren und niederer Pflanzen zu identifizieren. Die Ligaseaktivität wurde für das klonierte, rekombinant überexprimierte tRNA Ligaseprotein bestätigt. Weiterhin wurde zum ersten Mal das Ligaseprotein aus Schweineleber aufgereinigt und das zugehörige Gen im humanen Genom identifiziert. N2 - Transfer ribonucleic acids (tRNAs) are produced by RNA polymerase III and undergo multiple maturation steps until to the mature tRNA. Besides the endonucleolytic removal of 5´- and 3´-flanks by RNase P and tRNase Z and a multitude of base modifications, the introns of some pre-tRNA is spliced out. The first intron-containing tRNA genes have been identified in Saccharomyces cerevisae and consequently the splicing mechanism has been studied in this organism first. A tetrameric splicing endonuclease cleaves the intron at the exon borders and a tRNA ligase ligates the resulting tRNA halves to the spliced tRNA. The gene for this tRNA ligase has up to now only been identified in yeast and in other fungi. Neither molecular biological approaches – as, e.g., DNA hybridisation, expression screening and functional complementation studies with a tRNA ligase-deficient yeast strain – nor data bank searches with the known yeast tRNA ligase sequence have led to the identification of a plant or animal tRNA ligase gene. In this work a purification to homogeneity has been achieved for the wheat germ tRNA ligase protein for the first time, followed by the identification of the corresponding nuclear-encoded genes in higher and lower plants with the help of resulting peptide sequences. The ligase activity was confirmed for the cloned, recombinant overexpressed tRNA ligase protein. Moreover, the ligase protein from pig liver was purified and the corresponding gene identified in the human genome. KW - Pflanzen KW - Transfer-RNS KW - RNS-Ligase KW - RNS-Spleißen KW - Arabidopsis KW - pre-tRNA Spleißen KW - tRNA Ligase KW - tRNA Reparatur KW - Arabidopsis KW - pre-tRNA splicing KW - tRNA ligase KW - tRNA repair Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14420 ER -