TY  - THES
A1  - Wulf, Andrea
T1  - Regulierung eines kalziumempfindlichen Kaliumkanals durch Proteinkinase C
T1  - Regulation of a Ca2+-sensitive K+ channel by protein kinase C
N2  - Ca2+-empfindliche K+-Kanäle mittlerer Leitfähigkeit (IK1-Kanäle) übernehmen wichtige Funktionen bei vielen physiologischen Prozessen wie z.B. bei der Zell-Proliferation, der epithelialen Salz- und Wasser-Sekretion und der Zellmigration. Die Kanäle werden durch die intrazeluläre Ca2+-Konzentration reguliert, wobei ihre Ca2+-Sensitivität durch Phosphorylierungsreaktionen moduliert werden kann. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des aus transformierten Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) klonierten Ca2+-sensitiven K+-Kanals mittlerer Leitfähigkeit (cIK1) und die Untersuchung seiner Regulierung durch die Proteinkinase C (PKC). Dazu wurde der Kanal heterolog in CHO- und HEK293-Zellen exprimiert. Seine biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften sowie der Einfluß der Proteinkinase C auf die Kanalaktivität wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die cIK1-Ströme sind schwach einwärtsrektifizierend, zeigen keine Aktivierungs- oder Inaktivierungskinetik und weisen im physiologischen Bereich keine Spannungsabhängigkeit auf. Der cIK1 ist K+-selektiv und wird durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert. Der Kanal wird durch Barium, Charybdotoxin und Clotrimazol blockiert und durch 1-Ethyl-2-Benzimidazolon aktiviert. Die funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften des klonierten cIK1 entsprechen damit denen des nativen Kanals aus MDCK-F-Zellen und stimmen mit denen anderer Mitglieder der IK1-Kanalfamilie überein. Neben der Regulierung durch die intrazelluläre Ca2+-Konzentration wird der cIK1 auch durch eine PKC-abhängige Phosphorylierung reguliert. Sowohl ATP als auch ATP?S stimulieren die Kanalaktivität. Die ATP-abhängige Aktivierung wird durch Inhibitoren der Proteinkinase C (Bisindolylmaleimid, Calphostin C) gehemmt, während die mit ATP?S induzierte Kanalaktivität weitgehend resistent gegen diese PKC-Inhibitoren ist. Eine Stimulierung der Proteinkinase C mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) führt zu einer sofortigen Aktivierung des cIK1. Im Gegensatz dazu sind die cIK1-Kanäle nach fast vollständigem Abbau der Proteinkinase C durch eine langfristige Inkubierung der Zellen mit PMA nicht mehr aktiv. Um zu untersuchen, ob diese Regulierung eine direkte Interaktion der Proteinkinase C mit dem Kanalprotein erfordert, wurden die drei putativen PKC-Konsensussequenzen des cIK1 mittels zielgerichteter Mutagenese so verändert, daß eine Phosphorylierung an diesen Stellen nicht mehr möglich ist. Weder die einzelne Mutation der PKC-Konsensussequenzen (T101, S178, T329) noch die gleichzeitige Mutation aller drei Phosporylierungsstellen zu Alanin beeinflußt die akute Regulierung des cIK1 durch die Proteinkinase C. Die cIK1-Mutante T329A und die Dreifachmutante reagieren jedoch nach einem Abbau der Proteinkinase C mit einem extremen Anstieg der Kanalaktivität und demaskieren damit einen zweiten Weg der Kanalregulierung. Die Ergebnisse zeigen, daß der cIK1 durch zwei voneinander unabhängige Mechanismen reguliert wird. Eine PKC-abhängige Phosphorylierung erhöht die Aktivität der Kanäle, findet jedoch nicht an den bekannten PKC-Konsensusesquenzen des Kanalproteins statt. Dagegen werden die cIK1-Kanäle über einen zweiten ATP-abhängigen Mechanismus, der wahrschenlich eine direkte Interaktion mit dem Kanalprotein erfordert, gehemmt.
N2  - Ca2+ sensitive K+ channels of intermediate conductance (IK1 channels) are required for many physiological functions such as cell proliferation, epithelial transport or cell migration. The intracellular Ca2+ concentration is the most important regulator of IK1 channels. Their Ca2+ sensitivity can be modified by phosphorylation-dependent reactions. The aim of this study was the functional characterisation of the canine isoform cIK1 cloned from transformed renal epithelial cells (MDCK-F cells) and the investigation of mechanisms by which it is regulated by protein kinase C (PKC). cIK1 channels were heterologously expressed in CHO and HEK293 cells and investigated by means of patch clamp technique. cIK1 channels elicit a K+ selective, inwardly rectifying, and Ca2+-dependent current. It is inhibited by barium, charybdotoxin, clotrimazole, and activated by 1-ethyl-2-benzimidazolone. The electrophysiological and pharmacological characteristics thereby correspond to those of native cIK1 channels from MDCK-F cells and those of other IK1 channel isoforms. CIK1 channel are regulated by the intracellular Ca2+ concentration and in addition by protein kinase C. They are activated by the intracellular application of ATP or ATP?S. ATP-dependent activation is reversed by protein kinase C inhibitors (bisindolylmaleimide, calphostin C), while stimulation with ATP?S resists protein kinase C inhibition. Stimulation of protein kinase C with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) leads to the acute activation of cIK1 currents. In contrast, PKC depletion by overnight incubation with PMA prevents ATP-dependent cIK1 activation. To investigate whether this regulation requires a direct interaction with the channel protein, the three putative protein kinase C phosphorylation sites were mutated, so that the channel protein would no longer be phosphorylated at those residues. Neither single mutations nor the simultaneous mutation of all protein kinase C phosphorylation sites (T101, S178, T329) to alanine alter the acute regulation of cIK1 channels by protein kinase C. However, current amplitudes of the cIK1 mutant T329A and the triple mutant are dramatically increased upon logterm treatment with PMA. These mutations thereby disclose an inhibitory effect on cIK1 current of protein kinase C phosphorylation site at T329. Our results indicate that cIK1 activity is regulated in two ways. Protein kinase C dependent activation of cIK1 channels occurs indirectly, while the inhibitory effect probably requires a direct interaction with the channel protein.
KW  - Kaliumkanal
KW  - Calcium
KW  - Calciumion
KW  - Proteinkinase C
KW  - Kaliumkanäle
KW  - Proteinkinase C
KW  - patch-clamp
KW  - Mutagenese
KW  - Phosphorylierung
KW  - potassium channels
KW  - proteinkinase C
KW  - patch-clamp
KW  - mutagenesis
KW  - phosphorylation
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179144
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TY  - THES
A1  - Brockmann, Jörg
T1  - Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptorkinasen
T1  - Regularion of G-protein coupled receptorkinases
N2  - GRK2 wird an Serin29 durch PKC phosphoryliert. Die Phosphorylierung verhindert die Inhibition der GRK2 durch Calmodulin. Die Inhibition der GRK2 durch Calmodulin wird durch den N-Terminus der GRK2 vermittelt und ist auf eine gestörte Aktivierbarkeit der GRK2 durch G-Protein beta/gamma-Untereinheiten zurückzuführen.
N2  - GRK2 is phosphorylated by PKC at serin29. The phosphorylation prevents GRK2 inhibition by calmodulin. Inhibition of GRK2 by calmodulin is mediated by the N-terminus of the kinase and is due to a disturbed activation of GRK2 by G-protein beta/gamma subunits.
KW  - Rezeptor-Kinasen
KW  - G-Proteine
KW  - Calmodulin
KW  - Proteinkinase C
KW  - Phosphorylierung
KW  - GRK2
KW  - Calmodulin
KW  - PKC
KW  - Regulation
KW  - Phosphorylierung
KW  - GRK2
KW  - calmodulin
KW  - PKC
KW  - regulation
KW  - phosphorylation
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15320
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TY  - THES
A1  - Pfau, Anja
T1  - Modulation der Aldosteron-induzierten Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors - Rolle von Calcium, Proteinkinase C, PI-3-Kinase sowie H2O2
T1  - Modulation of the aldosterone-induced transactivation activity of the mineralocorticoid receptor – role of calcium, protein kinase C, phosphoinositide-3-kinase and H2O2
N2  - Aldosteron ist ein Steroidhormon, das eine zentrale Rolle in der Regulation der Salz- und Wasserhomöostase des menschlichen Körpers spielt. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass Aldosteron außderdem fibrotische Vorgänge im Herz-Kreislaufsystem begünstigt, indem es beteiligt ist an endothelialer Dsyfunktion oder das sog „cardia redmodelling“ negativ beeinflusst. Aldosteron enthüllte aber noch ein anderes Geheimnis: Bisher wusste man, dass Aldosteron an den Mineralokortikoidrezeptor bindet, der als Liganden-abhängiger Transkriptionsfaktor fungiert; auf diese Art und Weise beeinflusste Aldosteron die Proteinsynthese; nun konnte aber gezeigt werden, dass Aldosteron unabhängig von seinem Rezeptor und unabhängig von der Proteinsynthese zu schnellen Reaktionen führen kann, z.B. zu einer Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration oder zu einer Veränderung des intrazellulären pH-Wertes. Die Interaktionen zwischen Aldosteron, dem Mineralokortikoidrezeptor und anderen Signalwegen scheinen komplexer zu sein als bisher angenommen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezielt der Einfluss von Calcium, Proteinkinase C, der PI-3-Kinase sowie von H2O2 auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors untersucht. Im Rahmen der Zellkultur wurden HEK-Zellen (human embryonic kidney cells) benutzt; als Techniken kamen hauptsächlich Reportergen-Assay, ELISA, Fluoreszenzmessungen und Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz. Folgende Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden: 1. Calcium ist an der Aldosteron-induzierten Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors beteiligt: die Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration führt zu einer Abnahme der Aktivität des Mineralokortikoidrezeptors. Da Aldosteron selbst zu einer Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration führt, könnte Calcium im Sinne eines negativen Feedback-Mechanismus im Rahmen der Aldosteron-induzierten Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors fungieren. 2. Die Proteinkinase C übte in den hier durchgeführten Experimenten keinen Einfluss aus auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors. Weder Inhibierung noch Aktivierung der Proteinkinase C zeigten Wirkung. 3. Einen klaren oder direkten Einfluss auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivität des Mineralokortikoidrezeptors zeigte sich auch bei der PI-3-Kinase nicht. 4. H2O2 führt – ab einer Konzentration > 500 µmol/l – zu einer deutlichen Herunterregulierung der Aktivität des Mineralokortikoidrezeptors. Diese Herunterregulierung ist unabhängig von Aldosteron, und findet z.B. auch in Gegenwart von anderen Steroidhormonen statt bzw. auch in völliger Abwesenheit eines Mineralokortikoidrezeptor-aktivierenden Hormons. Daher ist anzunehmen, dass H2O2 nicht direkt die Interaktion des Mineralokortikoidrezeptors mit seinem Hormon Aldosteron stört, sondern dass die Einflussnahme von H2O2 auf die Aktivität des Mineralokortikoidrezeptors an einem anderen Punkt der Regulierung der Aktivität des Mineralokortikoidrezeptors stattfinden muss.
N2  - Aldosterone is known as a hormone involved in the regulation of the water and salt homeostasis of the human body. In the last years, it could be shown that aldosterone promotes cardiovascular and renal fibrosis due to tissue remodeling and endothelial dysfunction. Furthermore, aldosterone revealed another secret: it is known that aldosterone binds to the mineralocorticoid receptor that acts as a ligand-dependent transcription factor; in this way, aldosterone and its receptor can influence protein synthesis; then it was revealed that aldosterone can also lead to quick reactions – independently of its receptor – e.g. to a rise of intracellular calcium concentration or to changes of intracellular pH. Interactions between aldosterone, the mineralocorticoid receptor and other signalling pathways seem to be more complex than it has been assumed so far. In this study, we tried to find out in which way calcium, protein kinase C, phosphoinositide-3-kinase and H2O2 can influence the aldosterone induced transactivation activity of the mineralocorticoid receptor. We used HEK cells (human embryonic kidney cells) and techniques like reporter gene assay, ELISA and fluorescence microscopy. Finally, we found the following results: 1. Calcium modulates aldosterone-induced transactivation of the mineralocorticoid receptor: rise of intracellular calcium concentration leads to a decrease of the mineralocorticoid receptor. As aldosterone itself is able to lead to an increase of the intracellular calcium level, calcium could function as a negative feedback co-signal during aldosterone-induced activation of the human mineralocorticoid receptor. 2. Aldosteron-induced activation of the mineralocorticoid receptor was not affected by protein kinase C. 3. No direct and clear correlation between phosphoinositide-3-kinase and aldosterone-induced activation of mineralocorticoid receptor could be revealed. 4. H2O2 leads - in concentration > 500 µmol/l – to a downregulation of the activity of mineralocorticoid receptor. This downregulation takes place independently of aldosterone. Consequently H2O2 does not seem to influence the interaction of aldosterone and its receptor, but seems to exert its effects on the mineralocorticoid receptor at another level of activity of the mineralocorticoid receptor.
KW  - Aldosteron
KW  - Calcium
KW  - Wasserstoffperoxid
KW  - Mineralokortikoidrezeptor
KW  - Proteinkinase C
KW  - PI-3-Kinase
KW  - Signalwege
KW  - Transaktivierung
KW  - mineralocorticoid receptor
KW  - protein kinase C
KW  - signalling pathways
KW  - transactivation
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47491
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TY  - THES
A1  - Wohlfarth, Verena
T1  - Albuminurie stört die Kollagenhomöostase der proximalen Tubuluszellen des Opossums
T1  - Albuminuria disturbs collagen homeostasis in proximal tubular opossum kidney cells
N2  - Hintergrund: Die interstitielle Fibrose spielt bei der Verschlechterung der Nierenfunktion mit dem Endstadium der Urämie eine große Rolle. In diesem Geschehen kommt der Interaktion der im Krankheitsfall vermehrt filtrierten Proteine mit der proximalen Tubuluszelle, dem Ort der Proteinrückresorption, eine entscheidende Bedeutung zu. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand eines Zellkulturmodells den Einfluss eines vermehrten Albuminangebots auf die Kollagenhomöostase kultivierter proximaler Tubuluszellen zu untersuchen, dabei involvierte Signaltransduktionswege aufzuzeigen und die zentrale Rolle der Albuminendozytose im Rahmen des Geschehens zu beurteilen. Methoden: Für unsere Untersuchungen verwendeten wir überwiegend die kultivierten proximalen Tubuluszellen des Opossums, welche – wie auch die LLC-PK1 Zellen - die für die Proteinendozytose notwendigen Komponenten - nämlich die Rezeptoren Megalin und Cubilin sowie den Natrium-Protonen-Austauscher 3 – besitzen und somit eine hohe Endozytoserate aufweisen. Diese wurden mit Albuminkonzentrationen - wie man sie bei erhöhter Proteinfiltration unter pathophysiologischen Bedingungen findet - inkubiert. Für Vergleichsstudien zogen wir Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) heran. Die Kollagenhomöostase wurde mittels Kollagenase-sensitiven Prolininkorporationsassay, Kollagen-ELISA und Kollagen-Western Blot, die Aktivität der Matrixmetalloproteinasen mittels Zymographie und Gelatinaseassay erfasst. Die Aktivierung von Signaltransduktionswegen wurde mittels eines SEAP-Reporter Gen Assays untersucht. Ergebnisse: Albuminexposition führte bei den Zelllinien mit hoher endozytotischer Aktivität (OK- und LLC-PK1- Zellen) zu einer vermehrten Sekretion von Kollagen Typ I, III und IV. Bei den Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) kam es nach Albuminexposition zu einem Rückgang der Kollagensekretion. Im Kollagen-Western Blot zeigte sich nach Inkubation mit Albumin eine Zunahme des zellulären Kollagens. Mittels Zymographie und Gelatinaseassay konnte eine Albumin-induzierte Abnahme der MMP-Aktivität nachgewiesen werden. Inkubation der OK-Zellen mit Albumin führte im SEAP-Reporter-Gen-Assay zu einer Aktivierung des NF-kappaB-, AP-1- und CRE-Singalweges. Hemmung der NF-kappaB-, PKC- und PKA- Aktivierung hatte eine teilweise Reduktion der Albumin-inudzierten Kollagensekretion zur Folge. Eine Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels des NHE3-Inhibitors EIPA verminderte sowohl die Kollagensekretion als auch die Aktivierung der untersuchten Signaltransduktionswege. Diskussion: Unsere Daten zeigen, dass ein Mehrangebot an Albumin die Kollagenhomöostase der proximalen Tubuluszellen aufgrund einer vermehrten Kollagensynthese und eines verminderten Kollagenabbaus stört. Dabei scheinen vor allem Kollagen Typ I und III zur tubulointerstitiellen Fibrose beizutragen. Albuminexposition aktiviert PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 und CRE. Für PKC, PKA und NF-kappaB konnte eine direkte Beteiligung an der Albumin-induzierten Kollagensekretion nachgewiesen werden. Albumin muss mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in die proximale Tubuluszelle aufgenommen werden, um die beobachteten Effekte zu vermitteln. Die alleinige Anwesenheit von Protein im proximalen Tubulus reicht dafür nicht aus. Es ist anzunehmen, dass die gestörte Matrixhomöostase zu einer Progression der interstitiellen Fibrose und somit zum Fortschreiten der Niereninsuffizienz führt. Albuminurie ist also nicht nur ein Marker, sondern ein Motor der Nierenfibrose.
N2  - Background: Interstitial fibrosis is of major importance for the deterioration of renal function, leading to uremia. Interaction of filtered proteins with proximal tubular cells is crucial for the onset and development of tubulointerstitial damage. In the present study we investigated the effects of albuminuria on collagen homeostasis and signaling pathways of the proximal tubular cells. Methods: Therefore we exposed cultured cells derived from the proximal tubule (OK-, LLC-PK1-cells) with high endocytic activity by expressing the endocytic machinery typical for the proximal tubule (megalin, cubilin, NHE3) to albumin concentrations in a range expected during enhanced protein filtration. For comparative studies we used renal epithelial cells (MDCK-, IHKE1-, NHE3-deficient-OK-cells) with low endocytic activity. Collagen homeostasis was assessed by collagenase-sensitive proline incorporation assay, collagen ELISA and collagen Western blot; matrix metalloproteinase activity was assessed by zymography and gelatinase assay. Signaling pathways were monitored by SEAP reporter gene asssay. Results: Albumin exposure led to an increase of secreted collagen type I, III and IV in cells with high endocytic activity. In cells with low endocytic activity albumin exposure inhibited collagen secretion. Collagen Western blot analysis showed an albumin-induced increase of cellular collagen. MMP activity was significantly decreased by albumin exposure shown by zymography and gelatinase assay. Furthermore, albumin exposure led to activation of the NF-kappaB-, AP1- and CRE-pathways detected by SEAP reporter gene assay. Inhibition of NF-kappaB, PKC and PKA partially reversed the effects of albumin-induced collagen secretion. Inhibition of receptor-mediated albumin endocytosis by NHE3-inhibitor EIPA reduced collagen secretion and activation of the above investigated pathways. Discussion: The data show that protein exposure, in a concentration range expected during enhanced protein filtration, disturbs collagen homeostasis of proximal tubular cells due to increased collagen synthesis and decreased collagen degradation. Especially collagen type I and III may contribute to tubulointerstitial fibrosis. The signaling pathways activated by albumin exposure include PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 and CRE; stimulation of PKC, PKA and NF-kappaB directly contribute to collagen secretion. There has to be efficient receptor-mediated protein endocytosis in order to stimulate collagen secretion and signaling pathways; the mere presence of protein in the proximale tubule is not sufficient. The disturbed matrix homeostasis probably supports the progression of interstitial fibrosis, which is of importance for the development of renal insufficiency. Therefore albuminuria is not only a marker, but also a motor or renal fibrosis.
KW  - Proteinurie
KW  - Proximaler Tubulus
KW  - Kollagen
KW  - Transforming Growth Factor beta 1
KW  - Proteinkinase C
KW  - Proteinkinase A
KW  - Gelatinasen
KW  - CRE
KW  - Rezeptor-vermittelte Protein Endozytose
KW  - Kollagenhomöostase
KW  - interstitielle Fibrose
KW  - Opossum Kidney Zellen
KW  - NF-kappaB
KW  - AP1
KW  - albuminuria
KW  - receptor-mediated-endocytosis
KW  - collagen homeostasis
KW  - gelatinases
KW  - Opossum kidney cells
KW  - interstitial fibrosis
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55456
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TY  - THES
A1  - Deiß, Katharina
T1  - Die Regulation des Kinasemodulators Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP): Einfluss von Phosphorylierung und Dimerisierung auf die Interaktion mit Raf1 und G Protein-gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2)
T1  - Regulation of the kinase modulator Raf kinase inhibitor protein (RKIP): Influence of phosphorylation and dimerization on its interaction with Raf1 and G protein coupled receptor kinase 2 (GRK2)
N2  - RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern ermöglicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gewählt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung für die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpräzipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass für diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molekülen notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfläche wurden die Aminosäuren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP für seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP für die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine höhere Affinität zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivität von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivität von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufklärung dieses Mechanismus erweitert unser Verständnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen.
N2  - RKIP is a regulator of several distinct kinases and modulates diverse signal transduction cascades such as the signaling of G protein coupled receptors, of the Raf/MEK/ERK-cascade, of the transcription factor NFκB, and of GSK3β. Until now, it was not well understood how the specific interaction of RKIP with its diverse targets is achieved and regulated. Raf1 and GRK2 are the only known direct interaction partners of RKIP and were thus chosen to untangle the molecular mechanisms regulating the specific interaction of RKIP with these kinases. In this dissertation it is shown that RKIP dimerizes upon PKC-mediated phosphorylation of serine153 and that this dimerization is essential for RKIP/Raf1-dissociation and RKIP/GRK2-association. Co-immunoprecipitation experiments with a phosphorylation-deficient mutant revealed that the dimerization of RKIP requires the phosphorylation of two RKIP molecules. The amino acids 127-146 of RKIP were identified as dimer-interface, since RKIP-dimerization was efficiently and specifically inhibited by the peptide RKIP127-146. To elucidate the implication of this phosphorylation-induced dimerization on the target specificity of RKIP, a phosphomimetic RKIP mutant (RKIPSK153/7EE) and a dimeric RKIP mutant (RKIP∆143-6) were generated. The following results indicated that dimerization of RKIP controls its specific interaction with Raf1 or GRK2, respectively: (i) dimerization of phosphorylated RKIP occurred concomitantly with the release of RKIP from Raf1 and its association with GRK2; (ii) the RKIP mutants RKIPSK153/7EE and RKIP∆143-6, which had a higher propensity for RKIP-dimerization already under basal conditions, had a higher affinity to GRK2 than to Raf1; (iii) inhibition of RKIP-dimerization prevented only RKIP/GRK2-binding but did not interfere with RKIP/Raf1-binding; (iv) an RKIP- and GRK2-immunoreactive complex was detected in vitro as well as in mouse hearts; (v) analyses of RKIP-mediated inhibition of GRK2 and Raf showed that a higher propensity for RKIP-dimerization translates into efficient GRK2-inhibition but not into Raf-inhibition. The results of this thesis show that phosphorylation-induced dimerization of RKIP regulates its specific interaction with Raf1 and GRK2. The elucidation of this mechanism improves our understanding how specificity in the interaction of kinases and their regulatory proteins can be achieved.
KW  - Signaltransduktion
KW  - Dimerisierung
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Proteinkinase C
KW  - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP)
KW  - G protein-gekoppelte Rezeptor Kinase 2 (GRK2)
KW  - Raf1
KW  - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP)
KW  - G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2)
KW  - Raf1
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73884
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