TY - THES A1 - Stübs, Dorothee T1 - Identifizierung und Regulation von kälteinduzierbaren Faktoren aus B. bronchiseptica T1 - Identification and regulation of cold induced factors in B. bronchiseptica N2 - Kälteschockproteine werden in Bakterien, gleichermaßen wie die gut charakterisierten Hitzeschockproteine, bei hohen Temperaturschwankungen stark induziert und ermöglichen der Zelle durch unterschiedliche Funktionen ein Wachstum in der Kälte. In dieser Promotionsarbeit wurde begonnen, die Kälteschock-Antwort von Bakterien des Genus Bordetella zu charakterisieren. Sowohl B. bronchiseptica als auch B. pertussis codieren für fünf Kälteschockproteine, die als CspA, CspB, CspC, CspD und CspE bezeichnet werden. Die fünf Proteine weisen eine signifikante Homologie zum Haupt-Kälteschockprotein CspA aus E. coli auf. Während in den Modellorganismen E. coli und B. subtilis mindestens vier (E. coli) bzw. alle drei (B. subtilis) csp-Gene deletiert sein müssen, um einen Wachstumsdefizit zu erkennen, genügt im Falle von B. bronchiseptica eine einzige Insertionsmutation im Gen cspB, um einen temperaturunabhängigen Wachstumsdefekt zu beobachten. Nach einem Kälteschock werden in B. bronchiseptica drei der fünf csp-Gene, cspA, cspB und cspC, deutlich induziert. Betrachtet man das Expressionsmuster der fünf csp-Gene unter verschiedenen Stressbedingungen, wie Zugabe von translationshemmenden Antibiotika, Hitzeschock oder osmotischer Stress, so lässt sich ein komplexes Expressionsmuster aufzeichnen. Außerdem besitzen die drei kälteinduzierbaren Gene cspA, cspB und cspC mehrere Transkriptionsstartpunkte, deren Transkriptmengen unter den verschiedenen Schockbedingungen stark variieren. Es stellte sich heraus, dass eine Überexpression von CspB aus B. bronchiseptica für die E. coli – Zelle toxisch ist, daher wurde das CspB-Protein als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Glutathion-Sepharose aufgereinigt. Um eine potentielle Funktion von CspB in der Zelle zu untersuchen, wurden Filterbindeassays mit CspB::GST durchgeführt. Es wurde eine hochaffine, aber unspezifische Bindung an ssDNA festgestellt, was auf eine mögliche Funktion von CspB als Chaperon hindeutet. Nach Synthese eines CspB-spezifischen Antikörpers wurde die Kälteinduktion von CspB auch auf Proteinebene nachgewiesen. Durch 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrische Charakterisierung konnten 17 weitere kälteinduzierbare Proteine aus B. bronchiseptica identifiziert werden. Darunter waren u. a. ein Chaperon mit Ähnlichkeit zu GroES, ein Translationsinhibitor BB2940 und das CspB. Diese kälteinduzierbaren Proteine ähneln den CIPs aus E. coli. Weiterhin konnten noch das UspA und mehrere am Metabolismus beteiligte Proteine als CIPs aus B. bronchiseptica identifiziert werden, was signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kälteadaptation zwischen den beiden Organismen aufzeigt. Betrachtet man die Promotorbereiche aller identifizierten csp-Gene, so fällt eine für diese Gene typische sehr lange 5’UTR auf. Innerhalb dieser upstream Region findet man in vier der fünf csp-Gene einen 9 bp langen Consensus mit der Sequenz TCCTTGATT, der in nahezu gleichem Abstand vom postulierten Startcodon vorkommt. Diese identifizierte 9bp-box ist für eine effiziente Transkription in der Kälte jedoch nicht von Bedeutung. Auf posttranskriptioneller Ebene wird die lange 5’UTR für die Stabilisierung der cold-shock mRNA in der Kälte verantwortlich gemacht. Außerdem ist das Vorhandensein der kompletten 5’UTR essentiell für eine effiziente Translation bei niedriger Temperatur, wobei eine Mutation der 9bp-box einen geringen, aber signifikanten negativen Effekt auf die Translation ausübt. Sechs Gene, der neu identifizierten CIPs, beinhalten ebenfalls eine 9bp-box in ihrer upstream Region. Interessanterweise werden zwei der fünf csp-Gene, cspC und cspD, vom BvgAS Zweikomponentensystem, dem Haupttranskriptionsregulator der Virulenzgene im Genus Bordetella, reguliert. Die beiden Gene gehören zu den Bvg-negativ regulierten Genen, die in der Bvg-minus-Phase exprimiert werden. Weiterhin beeinflusst eine leichte Überexpression von CspB aus B. pertussis die Expression der Adenylatzyklase sowohl in B. pertussis, als auch in B. bronchiseptica negativ. Dieser für das CspB spezifische Effekt erinnert an das strukturell verwandte Tex-Protein (Fuchs et al, 1996; König et al, 2002). Beide Proteine beeinflussen die Expression der Virulenzfaktoren negativ, wobei für CspB gezeigt werden konnte, dass es einen direkten Einfluss auf die verminderte cyaA-Expression auf Transkriptionsebene besitzt. Dies zeigt eine Verbindung der Kälteschockantwort mit dem Virulenz-Regulon der Bordetellen, deren Rolle im Infektionszyklus bislang ungeklärt ist. N2 - Bacterial cold shock proteins (CSPs), like the well characterized heat shock proteins (HSPs) are highly induced in response to strong variation in temperature and cell growth at lower temperatures could be attributed to the different functions of CIPs. In this work we have studied the cold shock response of bacteria of the genus Bordetella. Both B. bronchiseptica and B. pertussis code for five CSPs (termed CspA to CspE) with significant amino acid homology to the major CspA of Escherichia coli. Mutations of a single csp gene (cspB) strongly affected the growth of B. bronchiseptica independent of temperature while a similar effect was observed in E. coli when four out of nine csp genes and in B. subtilis when all three csp genes were deleted. Transcription of cspA, cspB and cspC increased strongly after cold shock. The exposure to other stress conditions including translational inhibitors, heat shock and osmotic stress resulted in a complex pattern of changes in the transcription of the five cold shock genes. In the case of three csp genes (cspA, cspB, cspC), more than one specific transcript could be detected. To investigate the function of one of the cold shock proteins, CspB was purified as GSTfusion over a glutathion-sepharose column, because overexpression of pure CspB was shown to be toxic for the E. coli cell. Due to its high affinity but rather unspecific binding to ssDNA as tested by filter binding assays, it is possible that CspB functions as a chaperone. Induction of CspB was confirmed using a specific antibody and subsequently 17 other cold inducible proteins (CIPs) were identified by 2D-gelelectrophoresis and mass spectrometric characterization. Among these CIPs are some proteins which resemble the cold shock response of E. coli, like CspB, a chaperone with similarities to GroES and a translation inhibitor protein. Furthermore, interesting examples are the universal stress protein UspA and some proteins that are involved in the amino acid metabolism indicating signficant differences in the cold shock response of the two organism. The coding regions of all cold shock genes are preceeded by a long non-translated upstream region. Within this 5’UTR of four of the csp genes an identical sequence of 9 nucleotides with the consensus TCCTTGATT (9bp box) was identified which is located at similar positions with respect to their start codons. This identified 9bp-box was found to be irrelevant for transcription in the cold. Furthermore by in silico analysis a putative 54- binding site in the upstream region of cspB could be identified which has a regulatory function on cspB transcription. The long 5’ UTR itself seems to be important for transcript stabilization and efficient translation under cold shock conditions. Furthermore mutation or deletion of the 9bp box has a negative effect on translation. Six of the new identified CIPs are encoded by genes that contain the 9bp box in their 5’-UTR. Using bioinformatic tools (HMMR search) we identified 131 genes in the B. bronchiseptica RB50 genome that contain such a 9mer, but only 17 of the genes contain these consensus at appropriate position. Using this approach, infB, encoding for IF-2, could be identified as cold inducible. A connection between the occurence of the 9bp box and the cold induction could not be shown yet. Interestingly, two cold shock genes (cspC and cspD) were found to be under the negative control of the BvgAS system, the main transcriptional regulator of Bordetella virulence genes. Morover, a negative effect of a slight overexpression of CspB, but not of the other CSPs, on the transcription of the adenylate cyclase toxin CyaA in both B. pertussis and B. bronchiseptica was observed. Like the overexpression of previously described Tex protein (Fuchs et al, 1996; König et al, 2002), both proteins have a negative effect on the expression of the virulence factors. In this work, a direct influence of CspB on the cyaA transcription could be confirmed, suggesting a cross talk between the CSP mediated stress response stimulon and the Bordetella virulence regulon. KW - Bordetella bronchiseptica KW - Kälteschock-Proteine KW - Mikrobiologie KW - Bordetella KW - Regulation KW - Kälteschock KW - Bordetella KW - regulation KW - cold-shock Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12704 ER - TY - THES A1 - Iffland, Konrad T1 - Expression und Regulation des antimikrobiellen Cathelicidin-Peptids LL-37 in humanen Kolonepithelzellen, Monozyten und PBMC T1 - EXPRESSION AND REGULATION OF THE ANTIMICROBIAL CATHELICIDIN PEPTID LL-37 IN HUMAN COLON EPITHELIAL CELLS, MONOCYTES AND PBMC N2 - Butyrat ist die wichtigste kurzkettige Fettsäure im Kolon und dient der normalen Schleimhaut als trophischer Faktor. Butyrat hat paradoxe Effekte auf Epithelzellen des Kolons: Hauptenergieträger und Wachstumsstimulator normaler Mukosa einerseits, Proliferationshemmer und Apoptoseinduktor kolorektaler Karzinomzellen in vitro andererseits. Butyrat kann zudem die Immunfunktionen der Schleimhaut modulieren. Die einzellige Schicht des Dickdarmepithels ist eine aktive Barriere gegen die intestinalen Bakterien im Kolonlumen. Zusätzlich zur Bildung einer physischen Barriere ist das Epithel mit verschiedenen Effektormolekülen ausgestattet, zu welchen auch antimikrobielle Peptide zählen. Antimikrobielle Peptide spielen eine wichtige Rolle als endogene Antibiotika in der angeborenen Immunabwehr. Es sind kleine kationische Peptide von weniger als 100 Aminosäuren Länge. Sie kommen konserviert bei Insekten, Tieren, Pflanzen und dem Menschen vor. Diese Peptide werden in Zellen des Immunsystems, aber auch in Epithelzellen exprimiert und sezerniert. Sie wirken gegen gram-positive und –negative Bakterien, Viren und Pilze. Zusätzlich zu Ihrem antimikrobiellen Effekt üben diese Peptide einen chemotaktischen Reiz auf unterschiedlichste Immunzellen aus, darunter neutrophile Granulozyten, dendritische Zellen und T-Zellen, stimulieren die Chemokinfreisetzung durch Monozyten, induzieren die Mastzelldegranulation und können das Komplementsystem aktivieren. Beim Menschen sind bisher zehn Defensine und das humane Cathelicidinpeptid LL-37 beschrieben worden. Letzteres war auch Gegenstand unserer Forschungen. LL-37 wird in den Granula von neutrophilen Granulozyten gespeichert und in Knochenmark und Hoden, sowie in Hautkeratinozyten, Lungenepithel, und Plattenepithel der Zunge, des Ösophagus, der Zervix und Vagina exprimiert. In dieser Arbeit wurde die Expression und Modulation des einzigen humanen antimikrobiellen Cathelicidins LL-37 durch Entzündungsmediatoren oder Ernährungsfaktoren untersucht. Die untersuchten Zytokine, darunter TNFa und verschiedene proinflammatorische Interleukine zeigen keinen Einfluss auf die LL-37 Expression in Kolonepithelzellen. Die Expression des antimikrobiellen Peptids scheint dagegen stark mit Zelldifferenzierung verbunden zu sein. Nur differenzierte Epithelzellen im menschlichen Kolon und Ileum exprimieren LL-37 in vivo. Faktoren im Kolonlumen können dagegen einen Einfluss auf die Expression von LL-37 Expression in Kolonepithelzellen ausüben. Insbesondere kurzkettige Fettsäuren, die bei der bakteriellen Fermentation unverdauter Kohlenhydrate im Kolonlumen entstehen und die eine Zelldifferenzierung herbeiführen, induzieren in vitro die Expression des antimikrobiellen LL-37 in verschiedenen Kolonepithelzellen. Gleichzeitig steigert Butyrat die Differenzierung in den untersuchten Zellen. In Primärkulturen kolorektaler Karzinome und normaler Kolonschleimhautepithelzellen induzierte Butyrat die LL-37 Expression nur in undifferenzierten Tumorzellen. Als nächstes wurden Signalwege gesucht, die an der Regulation von LL-37 und der Differenzierung eine Rolle spielen. In Kolonepithelzellen verhindert eine MEK-ERK Blockade eine LL-37 Induktion – ohne die Differenzierung zu beeinträchtigen. Bei einer Blockade des p38/MAP-Kinase Weges stellte es sich genau andersherum dar: Die Differenzierung wurde gehemmt, aber die LL-37 Expression wurde nicht beeinflusst. Somit wird die LL-37 mRNA Transkription in Kolonepithelzellen über den MEK/ERK Signalweg und die Differenzierung in denselben Zellen über den p38/MAP-Kinase Signalweg reguliert. In undifferenzierten Monozyten kann wie schon in Kolonepithelzellen eine Induktion der LL-37 Expression nach Inkubation mit SCFAs beobachtet werden. Bei reifen PBMC jedoch inhibiert Butyrat eine LL-37 Transkription. In nicht differenzierten Monozyten blockt ein MEK/ERK-Hemmer die LL-37 Expression wie in Kolonepithelzellen, dagegen hat diese Blockade in reifen PBMC keine Auswirkung auf die LL-37 Konzentration. Deshalb können noch weitere unbekannte Mechanismen an der LL-37 Regulation in Darmepithelzellen und den LL-37 exprimierenden Immunzellen beteiligt sein. Diese Arbeit bietet neue Einblicke in die Regulation des antimikrobiellen Cathelicidins LL-37 in der menschlichen Darmschleimhaut und kann vielleicht die Basis für eine therapeutische Manipulation der LL-37 Expression liefern. Es muss jedoch noch geklärt werden, ob Butyrat oder andere Ernährungsfaktoren die Schleimhautbarriere dadurch stärken können, indem das Peptid LL-37 und oder andere Effektormoleküle der angeborenen Immunabwehr in vivo hochreguliert werden. N2 - The single cell layer of the colonic epithelium is an active barrier against the external environment and the enormous load of intestinal bacteria. In addition to forming a physical barrier, the epithelium is armed with an array of effector molecules including antimicrobial peptides. These peptides can be considered as endogenous antibiotics and are widespread in nature as immediate defense effectors. They have been found in invertebrates, vertebrates, plants as well as bacteria and several human antimicrobial peptides have been characterized. They are mainly stored in vacuoles of granulocytes ready for activation upon stimuli or secreted directly onto mucosal surfaces by epithelial cells. The cathelicidins constitute a family of precursor proteins with a well conserved cathelin pro-region, followed by a highly variable C-terminal antimicrobial domain. The only human cathelicidin gives rise to LL-37, a 37-residue mature antimicrobial peptide, after cleavage from the cathelin propart. LL-37 is present in neutrophils and lymphocytes. In addition, LL-37 is synthesized by bone marrow, keratinocytes of inflamed skin, lung epithelium, and squamous epithelia of human mouth, tongue, esophagus, cervix and vagina. Both purified and chemically synthesized LL-37 peptides exhibit potent and comparable antimicrobial activities in vitro. Alterations of the colonic epithelial barrier may occur in response to dietary changes, medical treatment or disease. A lack of dietary fibre can facilitate bacterial translocation from the gut. Short-chain fatty acids (SCFA), namely acetate, propionate and butyrate, are derived from bacterial fermentation of undigested dietary fibres in the colon. Butyrate and other SCFA exert profound effects on colonic physiology as they affect fluid absorption, colonocyte metabolism, proliferation and differentiation, gut motility and mucosal inflammation. In this study we analyzed the expression and modulation of the single human antimicrobial cathelicidin peptid LL-37 modulated by inflammatoric mediators or dietary fibres. Zytocines or different proinflammatoric interleukins indeed have no effect on expression of LL-37 in colon epithelial cells. Cell differentiation probably is the key determinant of LL-37 expression in colon epithelial cells. Only differentiated epithelial cells express LL-37 in vivo in human colon and ileum. We discovered that distinct pathways are for the induction of genes involved in differentiation on one hand and the expression of the gene encoding LL-37 on the other hand. The expression pattern of LL-37 in the colon crypt implies that these pathways are activated simultaneously in vivo. In summary, this study provides new insights into the regulation of the antimicrobial cathelicidin LL-37 in human colon mucosa and might provide the basis for a therapeutic manipulation of LL-37 expression. However, it remains to be elucidated if butyrate and other dietary substrates can strengthen the epithelial defense barrier by upregulating LL-37 and other effectors of innate immunity in vivo. KW - Antimikrobiell KW - LL-37 KW - Regulation KW - Antimicrobial KW - LL-37 KW - regulation Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11683 ER - TY - THES A1 - Beschorner, Patrick Frank Ernst T1 - Risikoklassifikation und Wettbewerb auf Versicherungsmärkten T1 - Risk Classification and Competition on Insurance Markets N2 - Mit der Schaffung des europäischen Versicherungsbinnenmarktes wurde 1994 auch der deutsche Versicherungsmarkt liberalisiert. Damit stehen seither den Unternehmen auf diesen Märkten mit der Produktgestaltung, der Prämienkalkulation und der Risikoklassifikation neue Wettbewerbsinstrumente zur Verfügung. Zusätzlich ist der Markteintritt nationaler Unternehmen in andere europäische Märkte erleichtert worden. Die Nutzung der neuen Instrumente im Rahmen von Unternehmensstrategien vor dem Hintergrund eingeschränkter Information und geringer Erfahrung der Marktteilnehmer sowie die Möglichkeiten wohlfahrtssteigernder Markteingriffe sind Inhalt der vorliegenden Untersuchung. Es zeigt sich, daß Informationsbeschränkungen und Marktmacht immanent sind. Die sich daraus ergebenden Marktunvollkommenheiten lassen sich durch einen eingeschränkt informierten Regulierer oder Staat nicht vollständig beheben. Dafür sind Eingriffe möglich, welche die negativen Effekte abzumildern vermögen und dabei einem sehr geringem Informationserfordernis unterliegen. Relevante Informationen beziehen sich in erster Linie auf die Schadenscharakteristika von Versicherungsnehmern. Ein einzelnes Unternehmen profitiert von einem Informationsvorsprung gegenüber seinen Konkurrenten, wenn es diesen für verstärkte Risikoklassifikation einsetzen kann. Aus sozialer Sicht ist es aber sinnvoller, wenn existierende Informationen allen Unternehmen zur Verfügung stehen, so daß eine einheitliche Risikoklassifikation möglich wird. Die hierfür erforderlichen Informationen können nur Beobachtung der Kunden gewonnen werden. Dann hat ein Unternehmen einen Informationsvorsprung gegenüber seinen Konkurrenten in Bezug auf die Charakteristika seiner Kunden. Dieses Effekte begründen, warum Informationsbeschränkungen und Marktmacht auf einem Versicherungsmarkt immanent sind. Versicherungsnehmer, die sich gegen ein Schadensrisiko absichern, stehen Versicherungsschutz und Prävention als substitutive Instrumente zur Verfügung. Die geeignete Wahl der Versicherungsprämie kann effiziente Prävention seitens der Versicherungsnehmer bewirken. Wenn wegen der Informationsbeschränkung verschiedene Risikoklassen nicht identifiziert werden können, kann nur eine einheitliche Prämie für alle Klassen erhoben werden. Dann kann effiziente Prävention nicht bei allen Risikoklassen vorliegen. Ein Eingriff, der diese negativen Wohlfahrtseffekte abmildern kann, besteht in der Vorgabe einer fixen Versicherungsdeckung, so daß die Anreize der verschiedenen Risikoklassen in die richtige Richtung gelenkt werden. Die Marktmacht eines Unternehmens ermöglicht ihm, risikoklassenspezifische Prämien über der fairen Prämie zu wählen. Ein Unternehmen hat stets den Anreiz zu Prämiendifferenzierung, da es ihm einen höheren Gewinn zu erzielen erlaubt. Dagegen ergibt eine Wohlfahrtsuntersuchung, daß eine einheitliche Prämie sozial wünschenswert ist. Ein Verbot der Prämiendifferenzierung ist ein einfaches Mittel, für welches bei einem staatlichen Eingriff nur sehr geringen Informationsanforderungen bestehen. Es zeigt sich, daß die negativen Auswirkungen der Marktmacht dadurch abzumildern sind, indem die Marktmacht eingeschränkt wird, und zwar indem dem Unternehmen nicht die Nutzung aller Wettbewerbsinstrumente gestattet wird. N2 - Along with the creation of the European single insurance market in 1994 the German insurance market was liberalized. Since then, the firms are free in their product design, their premium calculation, and their risk classification. Furthermore, market entry within European markets is facilitated. Firm strategies in applying the new instruments and also market interventions aiming at welfare improvements are subject matters of the present investigation. Both are analyzed for an environment with information constraints and sparse experience of the market participants. One result is that information constraints and market power are immanent. The resulting market imperfections cannot be eliminated completely by a regulatory or state authority which also suffers some information constraints. However, there exist some interventions which require a very low amount of information and which can mitigate the negative effects of the market imperfections. In general, relevant information refers to the loss characteristics of consumers. A single firm benefits from an informational advantage compared to its competitor when it intensifies its risk classification activities. From the social perspective, it would be more efficient when existing information is available to all firms on the market to arrange a uniform risk classification. The necessary information can be generated from observing the loss statistics of the customers. Then a firm gains an informational advantage compared to its competitors on the loss characteristics of its customers. These effects explain why informational constraints and market power are immanent on insurance markets. Insurance coverage and loss prevention are two substitute instruments which can be utilized by consumers facing a potential loss. The appropriate insurance premium will induce an efficient use of prevention by the customers. Information constraints may inhibit the identification of distinct risk classes. Then only a uniform premium for different risk classes will be possible and loss prevention cannot be efficient for all risk classes anymore. An intervention which will reduce the resulting welfare loss may consist in a fixed insurance coverage which has to be purchased by all risk classes. Then all risk classes have an incentive to correct the prevention activities towards the efficient level. Market power allows a firm to apply price discrimination. In the context of insurance markets this means that a firm prefers to ask a specific premium from each risk class. Conversely, a welfare analysis shows that a uniform premium may be socially preferable. Imposing a uniform premium is a simple measure with very low informational requirements. Such an intervention may reduce the welfare loss from price discrimination. This shows that the negative effects resulting from market power may be alleviated by restricting the instruments which can be applied by the firm which has market power. KW - Deutschland KW - Kraftfahrtversicherung KW - Versicherungsmarkt KW - Deregulierung KW - Versicherungsmarkt KW - Regulierung KW - Wettbewerb KW - Versicherungsaufsicht KW - Insurance KW - Regulation KW - Competition KW - Insurance Regulation Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10122 ER -