TY  - THES
A1  - Seubert, Carolin
T1  - Onkolytische Virotherapie : Virus-vermittelte Expression von MCP-1 oder ß-Galaktosidase in Vaccinia-Virus-kolonisierten Tumoren führt zu einer erhöhten Tumorregression
T1  - Oncolytic virotherapy : The virus encoded coexpression MCPI and beta galactosidase in vaccinia virus colonized tumor xenografts resulted in enhanced tumor rejection
N2  - Ungeachtet der enormen Entwicklung in Krebsdiagnostik und -Therapie in den letzten Jahren, sind vollständige Heilungsaussichten weiterhin gering und die aktuellen Behandlungsmethoden oftmals mit schwerwiegenden Nebeneffekten verbunden. Aufgrund dessen sind alternative Behandlungsmethoden unbedingt erforderlich und führten zu einer zunehmenden Bedeutung des Vaccinia-Virus als onkolytisches Virus in der Krebstherapie. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei mögliche Therapieansätze zur Verstärkung der onkolytischen Effekte in humanen Tumormodellen untersucht. Die Kombination einer gene-directed enzyme prodrug Therapie (GDEPT) mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus GLV 1h68 sollte zur Selektivitätssteigerung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren, cytotoxisch-aktiven Drugs führen. Darüber hinaus diente das für MCP-1 codierende Vaccinia-Virus GLV-1h80, zielend auf eine Cytokin-vermittelten Immuntherapie, als Vektor zur spezifischen Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks. Im Zuge der GDEPT wurde in dieser Arbeit ein, durch enzymatische Deglykosylierug aktivierbares Prodrug, basierend auf dem cytotoxischem Antibiotikum Duocarmycin SA verwendet. Durch eine Infektion mit GLV-1h68 und einer resultierenden Expression des aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase, sollte eine Umwandlung des Prodrugs in ein cytotoxisches Drug erfolgen. In vitro Infektionsstudien zeigten ein nahezu identisches Replikationsverhalten des Vaccinia-Virus GLV-1h68 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h43 in humanen GI-101A-Brustkrebszellen. Die Expression der beiden Reporter-Gene Ruc-GFP sowie ß-Galaktosidase konnten auf Protein-Ebene und mittels RT-PCR nach Infektion mit GLV-1h68 nachgewiesen werden. GLV-1h43-Infektion von GI-101A-Zellen führte zu GFP-Expression, jedoch nicht zur Expression des Enzyms ß Galaktosidase. Untersuchung der Enzym-Aktivität in Zelllysaten und Zellkultur-Überständen zeigten nach Infektion mit GLV 1h68 steigende Menge zellulär assoziierter und freier ß-Galaktosidase. Des Weiteren wurde durch Koinkubation von GI-101A-Zellen mit Virus-freien, ß Galaktosidase-haltigen Zelllysaten bzw. –überständen und Prodrug eine Aktivierung des Prodrugs durch das Virus codierte Enzym nachgewiesen. Diese Koinkubation führte zur Abtötung der Zellen. Nach Inkubation mit Proben mock- oder GLV 1h43-infizierter Zellen konnte keiner Veränderung der Proliferationsrate von GI-101A-Zellen gefunden werden. Kombinierte Behandlung von GI 101A-Zellen mit Viren des Stammes GLV 1h68 und Prodrug führte zu starken Synergieeffekten bei der Abtötung der Zellen und wies einen Bystander Effekt der Kombinationstherapie nach. Dieser konnte in 4 weiteren humanen und 2 Hunde-Brustkrebszellen bestätigt werden. Der erzielte Bystander-Effekt zeigt, dass es nach Virus-induzierter ß-Galaktosidase-Expression in GLV 1h68-infizierten Zellen zu einer enzymatischen Spaltung des Prodrugs in das cytotoxische seco-Analogon des Antibiotikums Duocarmycin SA kommt. Durch die Membrangängigkeit des Drugs konnte auch in angrenzenden uninfizierten Zellen eine Wirkung erzielt werden. Anhand von Expressionsanalysen an Apoptose-assoziierten Proteinen, wie PARP und Caspasen, wurde eine Wirkung des Prodrugs über den intrinsischen Apoptose-Signalweg nachgewiesen. In athymischen Nude-Mäusen durchgeführte Replikationsanalysen und X-Gal-Färbungen GLV 1h68 infizierter Tumore nach Prodrug-Behandlung zeigten, dass GLV-1h68 ungeachtet der simultanen Behandlung mit Prodrug im Tumorgewebe repliziert und es nicht zur Anreicherung lacZ-negativer Virusmutanten kommt. Es konnten, durch Prodrug-Behandlung und einer simultanen Expression aktiver ß Galaktosidase, starke synergistische Effekte und eine signifikante Steigerung der Tumorregression erzielt werden. Da die Kombinationstherapie zu keinerlei Unterschieden in Gewicht und Gesundheitszustand behandelter Versuchstiere führte, konnte eine systemische Toxizität außerhalb des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Verschiedene Zelllinien weisen Unterschiede in ihrer Sensitivität gegenüber der onkolytischen Aktivität von Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf. Während einige Zelllinien trotz Virus-Behandlung unverändertes Proliferationsverhalten zeigen (non- oder poor-responder), führt diese Behandlung in anderen Zelllinien zu einer vollständigen Tumorregression (responder). In Anbetracht dieser Unterschiede wurden in dieser Arbeit die Effekte einer induzierten Expression des murinen Chemokins MCP-1 in GI-101A-Tumoren (responder) und HT29-CBG-Tumoren (poor-responder) untersucht. MCP-1 zeichnet sich durch seine chemotaktischen Eigenschaften gegenüber mononukleärer Zellen aus und führt zu pleiotropen Tumor-Effekten. Replikationsstudien am Virus GLV-1h80 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h68 zeigten, dass aus der Expression des Fremd-Gens mcp-1 sowohl in vitro als auch in vivo keinerlei negativen Effekte auf das Replikationsverhalten in humanen GI-101A- und HT29-CBG-Zellen resultieren. Durch Real-time Monitoring der GFP-Expression im Tumorgewebe lebender Tiere konnte zunächst eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende Signalstärke beobachtet werden, welche dann 42 dpi an Intensität verlor. Toxizität und schädliche Nebeneffekte durch Infektion mit den beiden rVACV konnten anhand der viralen Titer in den Organen der Maus ausgeschlossen werden. Die Titer wiesen auf eine ausschließlich auf das Tumorgewebe begrenzte Replikation der Viren nach Injektion in Tumor-tragende Tiere hin. Die Expression des Chemokins MCP-1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in GLV-1h80-inifzierten Zellen und im Tumorgewebe GLV 1h80-injizierter Mäuse nachgewiesen. Nach Infektion mit GLV-1h80 konnte eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression gezeigt werden. Dabei wurde zudem deutlich, dass nicht nur eine GLV-1h80-Infektion in vivo zu einer Zunahme der intratumoralen MCP-1-Expression führte, sondern eine Vaccinia-Virus-Infektion allein einen Anstieg des Chemokins zu bewirken vermag. Eine Quantifizierung durch ELISA machte Konzentrationsunterschiede von MCP-1 zwischen den Tumormodellen GI-101A und HT29-CBG deutlich. Sowohl in vitro als auch in vivo führte ein GLV-1h80-Infektion zu deutlich niedrigeren Konzentrationen im HT29-CBG-Kolon-Adenokarzinommodell. Ein Nachweis murinen MCP-1 in Blutseren Tumor-tragender Tiere zeigte eine für therapeutische Effekte erwünschte systemische Freisetzung des intratumoral durch die Infektion mit GLV-1h80 gebildeten Chemokins MCP-1. Durch immunhistologische Untersuchungen GLV-1h80-infizierter Zellen und Tumoren konnte diese, mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression bestätigt werden. Die funktionelle Aktivität des rekombinanten Proteins wurde anhand TNF-α-spezifischer ELISA-Analysen überprüft. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression dieses proinflammatorischen Cytokins in GI-101A-Tumoren nach Infektion mit GLV-1h80. Dagegen konnte keine Steigerung der Expression im HT29-CBG-Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Nachweis des durch proinflammatorische Immunzellen exprimierten Oberlflächenproteins CD14 zeigte ebenfalls einen Anstieg nach Infektion mit GLV-1h80. Auch diese veränderte Expression blieb im poor-Responder-Modell HT29-CBG aus. Die steigende intratumorale Expression der beiden Proteine in GI-101A-Tumoren nach GLV 1h80-Infektion lässt auf eine Zunahme pro-inflammatorischer Immunzellen, basierend auf einer Virus-induzierten MCP-1-Expression schließen. Ein Monitoring der Tumorprogression nach Implantation von GI 101A-Zellen und Injektion der rVACV GLV-1h80 und GLV-1h68 bzw. einer PBS-Injektion führte nach einer anfänglichen Zunahme des Tumorwachstums schließlich bei beiden Viren zu einer Tumorregression. Jedoch konnte durch die GLV-1h80-vermittelte MCP-1-Expression eine Verstärkung der onkolytischen Effekte erzielt werden, welche sich durch eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens zeigte. Im HT29-CBG-Modell führten die therapeutischen Effekte durch rVACV GLV-1h80 zwar zu keiner Regression des Tumors, jedoch zeigte sich auch in diesem humanen Tumormodell eine Verstärkung der onkolytischen Effekte nach GLV-1h80-Infektion im Vergleich zu einer GLV 1h68-Behandlung. Durch die GLV-1h80-induzierte Expression des Chemokins MCP-1 konnte somit eine Hemmung des Tumorwachstums auch im poor-Responder-Modell HT29-CBG erzielt werden. Sowohl die Verwendung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren Prodrugs im Zuge einer GDEPT, als auch die Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks durch Expression des Chemokins MCP-1 führten in dieser Arbeit zu positiven Synergismus-Effekten in der onkolytischen Virustherapie. Durch künftige Konstruktion eines rVACV, welches sowohl die Expression des Chemokins MCP-1, als auch des prodrug-aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase im Tumorgewebe induziert, könnte in Kombination mit einer Prodrug-Behandlung eine zusätzliche Verstärkung der Effekte erzielt und möglicherweise eine erfolgreiche Virustherapie in bisher schwach ansprechenden poor- bzw. non-Responder-Modellen ermöglicht werden.
N2  - Irrespective of enormous developments in cancer diagnostics and therapy in the last few years, complete recovery from cancer still occurs rarely. Moreover, conventional therapy is attendant on unspecific side effects. Consequently, novel, well-tolerated and more efficient therapies are required in order to reduce the number of cancer-related deaths. Among several strategies to improve currently applied treatments, the use of oncolytic viruses may turn out to be a highly promising therapeutic approach. In this thesis two different therapeutic approaches were investigated to enhance oncolytic effects of vaccinia virus in human xenografts. First, the lacZ-carrying oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 was used in combination with a ß-galactosidase activatable prodrug to increase selectivity of a cytotoxic drug. Second, based on a cytokine-mediated immunotherapy, MCP-1-encoding vaccinia virus GLV-1h80 was used as a vector with a specific impact on the intratumoral chemokine network. In the first approach, an enzymatic activatable prodrug, based on a cytotoxic seco-analogue of the antibiotic duocarmycin SA was used for gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT). An activation of the cytotoxic prodrug was to be achieved by infection with GLV 1h68 and the resulting expression of the prodrug activating enzyme ß-galactosidase. Cell culture experiments revealed a comparable replication rate of GLV-1h68 and of the control virus strain GLV-1h43 lacking the lacZ gene insert. Expression of the reporter genes Ruc-GFP and ß-galactosidase after infection of GI-101A cells with GLV-1h68 was proven on the protein level and by RT-PCR. Infection of cells with GLV-1h43 resulted in GFP-expression only, confirming the absence of lacZ in GLV-1h43. Analysis of ß-galactosidase concentrations in cell lysates and supernatants revealed an increase of the enzyme during infection of GLV 1h68. Activation of the prodrug by the virus-encoded enzyme was achieved by co incubation of GI-101A-cells with virus-depleted, ß-galactosidase-containing cell lysates or supernatants and prodrug. This co-incubation resulted in killing of GI-101A cells. Conversely, incubation with samples obtained from mock- or GLV-1h43-infected cells and prodrug did not change overall survival of GI-101A-cells. In order to find out whether an additional effect could be achieved in neighboring uninfected cells, called bystander effect, GLV-1h68-infected cells were treated with prodrug. This experiment demonstrated strong synergistic effects in terms of cell killing. Similar results were obtained with 4 other human and with 2 canine breast cancer cell lines. The achieved bystander effect reveiled that upon GLV-1h68 infection the virus-mediated ß-galactosidase-expression resulted in enzymatic cleavage of the prodrug and release of the cytotoxic drug. Furthermore it proved the ability of the activated drug to penetrate cell membranes. Expression analysis on apoptosis-associated proteins, e.g. PARP and caspases, revealed induction of apoptosis via the intrinsic pathway after prodrug activation in GLV-1h68-infected cells. In vivo replication analysis and X-Gal staining of GLV 1h68-infected tumors revealed that GLV-1h68 can replicate within tumor tissue and no enrichment of mutants in lacZ occured, regardless of simultaneous prodrug treatment. Thus, prodrug treatment and expression of ß galactosidase resulted in synergistic effects leading to significantly enhanced tumor regression. Since no sign of malaise or weight loss was observed in prodrug-treated mice when compared to the respective control mice, we concluded that no toxic side effects occurred and active ß-galactosidase released from the tumor was negligible. Different human cell lines reveal varied sensitivity to the oncolytic activity of vaccinia virus GLV-1h68, some cell lines continue growth (non- or poor-responder), while others show complete regression (responder). Considering these differences, the second aspect of this thesis was the analysis of the chemokine MCP-1 in GI-101A-xenografts (responder) and in the poor-responding HT29-CBG tumors. MCP-1 is characterized by chemotactic properties against mononuclear cells and has pleiotropic effects on cancer. Replication studies on GLV 1h80 and the control virus strain GLV-1h68 revealed that expression of the inserted mcp-1-gene had no negative effects on viral replication in vitro as well as in vivo in human GI-101A- or HT-29 CBG-cells. Real-time monitoring of GFP-expression in tumors of infected mice showed increasing amounts of GFP in tumors during the infection process until 21 dpi, followed by a decrease in intensity to 42 dpi. By determining the viral titers in organs of infected mice, toxicity and harmful side effects resulting from infection with both virus strains were excluded. The viral titers demonstrate, that viral replication occurs exclusively in tumor tissue. Expression of MCP-1 in GLV-1h80-infected cells and tumors was detected on transcriptional as well as on translational level. The concentration of the chemokine increased during infection of GLV-1h80. Additionally, the increase of intratumoral MCP-1-concentrations was not only limited on GLV-1h80-infected tumors. On the contrary, vaccinia virus infection itself resulted in increasing amounts of this chemokine. Quantifying MCP-1-expression by ELISA assay revealed differences in concentrations between tumors derived from GI-101A and HT-29-CBG cells. In case of the HT-29-CBG coloncarcinoma, infection with GLV-1h80 resulted in lower concentrations of MCP 1 in vitro as well as in vivo. Confirmation of murine MCP-1 in blood samples of tumor-bearing mice revealed a systemic release of intratumoral MCP-1 predicated on the infection with GLV-1h80. This systemic release is required for therapeutic effects. The increased expression of MCP-1 in GLV-1h80-infected cells and tumors during infection was verified by immunohistochemical analysis. Functional activity of the recombinant protein was checked by a TNF-α-specific ELISA assay, demonstrating increased expression of this proinflammatory cytokine in GI-101A tumors after infection with GLV-1h80. In contrast, no increase was observed in HT-29 CBG tumors. Likewise, the quantification of proinflammatory expressed surface protein CD14 showed higher concentrations in GI-101A-tumors after GLV-1h80-infection. Again, this increase was missing in xenografts of poor-responder HT-29-CBG. The increased expression of these two proteins in GI-101A xenografts after GLV-1h80-infection suggested an accumulation of proinflammatory immune cells, resulting from virus-mediated MCP 1-expression. Moreover, monitoring of tumor progression after implantation of GI-101A cells revealed an initially swelling of the tumors, followed by enhanced tumor regression after infection with GLV-1h80, as well as after GLV 1h68-infection. However, GLV-1h80-mediated MCP-1 expression resulted in an enhancement of oncolytic effects, followed by significant reduced tumor volumes compared to GLV-1h68-colonized tumors. In case of HT-29-CBG tumors MCP-1 induced indeed no regression of tumors. However, even in this poor-responding tumors oncolytic effects could be amplified by GLV 1h80 infection. Hence, inhibition of tumor growth in poor-responder model HT-29-CBG could be achieved by GLV-1h80-induced expression of the chemokine MCP-1. Taken together, both, the use of a ß galactosidase activatable prodrug in GDEPT and the modulation of the intratumoral chemokine network by expression of MCP-1 resulted in positive synergistic effects during oncolytic virus therapy. Future construction of a recombinant VACV, co expressing the prodrug-activating enzyme ß galactosidase as well as MCP-1 in tumor tissue has the potential to induce even stronger synergistic effects and might also lead to a more efficient treatment of up to now poor- or non-responding tumors.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Chemokine
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Therapie
KW  - Galactosidase <beta->
KW  - MCP-1
KW  - Krebstherapie
KW  - ß-Galaktosidase
KW  - Enzym
KW  - MCP-1
KW  - cancer therapy
KW  - ß-galactosidase
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48083
ER  - 
TY  - THES
A1  - Vollmuth, Christina
T1  - Untersuchungen zum Überleben bei zwei zeitlich definierten Kohorten von Patienten mit multiplem Myelom
T1  - Comparison of overall survival rates in two cohorts of patients with multiple myeloma: 1990-1996 and 1997-2002
N2  - Das multiple Myelom, eine maligne Plasmazell-Dyskrasie, ist bis heute unheilbar. Eine Verbesserung des medianen Überlebens von weniger als 2 auf über 3 Jahre wurde erstmals 1996 durch eine prospektiv randomisierte Studie von Attal et al. gezeigt. Die retrospektive Analyse zweier zeitlich definierter Kohorten, Kohorte 1 (1990-1996) und Kohorte 2 (1997-2002), zur Überprüfung des Therapieerfolges am Universitätsklinikum Würzburg zeigt unter Berücksichtigung aller Patienten keinen Überlebensvorteil für Patienten der 2.Kohorte. Signifikant profitiert haben allerdings Patienten bis max. 65 Jahre der Kohorte 2, die durch die HD-Therapie ein 5-JÜL von 50% (Kohorte 2) vs.32% (Kohorte 1) erreichten, wohingegen sich für ältere Patienten keine signifikant messbaren Überlebensvorteile ergaben.
N2  - The median overall survival of patients with multiple myeloma did not exceed more than 2 years for a long time. 1996 Attal et al. published a randomized prospective trial that showed a median survival of more than 3 years in patients who went through a high-dosed chemotherapy and autologous stem cell transplantation. This retrospective analysis in two cohorts compares the overall survival rates of newly diagnosed myeloma patients between 1990-1996 (cohort 1) and 1997-2002 (cohort 2). A significant benefit in 5 year survival rates could be shown for patients younger or max. 65 years(50% C.2 vs. 32% C.1). The overall survival of patients older than 65 years, who did not receive a high-dose therapy, did not improve. The high-dose therapy with autologous stem cell retransfusion seems to be the most important factor to improve the overall survival of patients.
KW  - Plasmozytom
KW  - Überleben
KW  - autologe Stammzelltransplantation
KW  - retrospektiv
KW  - Therapie
KW  - multiple myeloma
KW  - overall survival
KW  - stem cell transplantation
KW  - retrospective
KW  - treatment
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53769
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eujen, Heike Carola
T1  - Blockade der Antigenerkennung als therapeutische Strategie in einem CD8+ T-Zell vermittelten Mausmodell der Multiplen Sklerose
T1  - Interference with Recognition of a Neo-Autoantigen as Therapeutic Strategy in a CD8+ T Cell Mediated Mouse Model of Multiple Sclerosis
N2  - Die Multiple Sklerose (MS) ist eine schwere, momentan noch unheilbare Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems, die weltweit ca. 1 Mio. Menschen betrifft. Da die zur Zeit verfügbaren, anti-inflammatorischen und immunsuppressiven Therapieformen lediglich krankheitsverzögernd wirken, ist es Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen, Möglichkeiten zur spezifischen Interferenz mit bei der MS ablaufenden Pathomechanismen zu ergründen und im Tiermodell zu testen. Das von uns für diese Arbeit verwendete Mausmodell einer CD8+ T-Zell vermittelten Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) trägt dabei neuen Erkenntnissen Rechnung, die zeigen, dass zytotoxische T-Lymphozyten bei der Pathogenese der humanen MS von entscheidender Bedeutung sind. Es handelt sich um doppelt transgene Nachkommen von Mäusen, die das Modell-Antigen Ovalbumin (OVA) unter der Kontrolle eines Oligodendrozyten (ODC-)-spezifischen MBP-Promotors im ZNS exprimieren, und Mäusen, die Ovalbumin-spezifische CD8+ T-Zellen besitzen (OT-I Zellen). Es kommt in diesem Modell zur Autoantigenerkennung durch die CD8+ T-Zellen mit konsekutiver Ausbildung einer fulminanten, letal verlaufenden EAE. Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, die therapeutische Potenz des monoklonalen Antikörpers 25-D1.16 zu evaluieren, der gegen das Autoantigen Ovalbumin in Kombination mit einem MHC-I-Molekül gerichtet ist. Mit Hilfe von FACS-Analysen und Fluoreszenz-Mikroskopie konnten wir zunächst bestätigen, dass 25-D1.16 spezifisch den Komplex aus dem Peptid SIINFEKL (antigenes Epitop von Ovalbumin) gebunden an ein MHC-I-Molekül (H-2Kb) erkennt. In nachfolgenden in vitro Versuchen wurde der Einfluss des Antikörpers auf Aktivierung und Proliferation von durch SIINFEKL:MHC-I-Komplex stimulierten OT-I Zellen untersucht. Es wurden hierfür Zellproliferation (Proliferations-Assays), Expression des Oberflächenmoleküls CD69 (FACS-Analysen) sowie IFN-γ-Sekretion (ELISA) gemessen. In Gegenwart von 25-D1.16 zeigte sich durchweg eine hochsignifikante Reduktion der jeweiligen Proliferations-/Aktivierungsmarker. Wir konnten somit in vitro zeigen, dass der gegen das Autoantigen Ovalbumin/H-2Kb gerichtete, monoklonale Antikörper 25-D1.16 kompetitiv die Aktivierung und Proliferation entsprechender T-Lymphozyten inhibieren kann. Um diese Daten in vivo zu validieren und die pathogenetische Relevanz zu überprüfen, haben wir ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Mäusen verschiedene Dosen von 25-D1.16 vor Auftreten erster EAE-Symptome einmalig intraperitoneal verabreicht. Anschließend wurde der Krankheitsverlauf klinisch beurteilt. Im EAE-Stadium 4 ohne Besserungstendenz oder bei Versuchsende wurden außerdem histologische Schnitte des Zentralnervensystems angefertigt, gefärbt (H.E., CD3, Mac-3, Luxol Fast Blue/PAS) und mit unbehandelten Tieren verglichen. Ein Teil der ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Tiere blieb nach Applikation des Antikörpers völlig gesund, während bei einem anderen Teil der Ausbruch der EAE zwar nicht vollständig verhindert, ihr Schweregrad aber deutlich gemildert wurde. Der Effekt der Antikörpertherapie war jedoch nicht nur klinisch, sondern auch histopathologisch überzeugend. So zeigte das Zentralnervensystem erfolgreich therapierter Mäuse eine weitgehend bis vollständig intakte Gewebsarchitektur (H.E.-Färbung) mit im Vergleich zu unbehandelten Mäusen drastisch reduzierter OT-I Zell- und Makrophagen/Mikroglia-Infiltration (Immunhistochemie CD3 und Mac-3). In der Luxol Fast Blue/PAS-Färbung fanden sich keinerlei Entmarkungsherde sondern durchgängig myelinisierte Axone. Es gelang uns somit durch hohe Antikörperdosen (500 μg pro ODC-OVA/OT-I doppelt transgener Maus) bei 83 % der behandelten Versuchstiere den Ausbruch der EAE ganz zu verhindern bzw. deren Verlauf deutlich abzumildern. Zusammenfassend beschreiben wir hier erstmals die antigen-spezifische Therapie einer CD8+ T-Zell mediierten EAE mittels eines gegen Peptid:MHC-I-Komplex gerichteten, monoklonalen Antikörpers. Durch Interferenz mit der Erkennung des Autoantigens durch die CD8+ T-Zellen waren wir in vivo in der Lage, den Pathomechanismus der EAE zu inhibieren. Hieraus ergibt sich ein vielversprechendes Behandlungskonzept für die Therapie der Multiplen Sklerose am Menschen.
N2  - Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS) of presumed autoimmune origin, which affects around 1 million people worldwide. To date, anti-inflammatory and immunomodulatory therapies in clinical use can slow disease progression but are not curative and have considerable adverse effects. For this reason, researchers have begun to focus on developing antigen-specific treatment options, thereby avoiding generalized immunosuppression. Recently, the importance of CD8+ T cells in the pathogenesis of multiple sclerosis has begun to emerge. Here we employ a mouse model of CD8+ T cell mediated experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), in which the neo-self antigen ovalbumin (OVA) expressed by oligodendrocytes (ODC) is targeted by CD8+ T cells with transgenic T cell receptors (OT-I cells). In this animal model of ODC-OVA/OT-I double transgenic mice, recognition of the autoantigen by CD8+ T cells leads to fulminant, lethal EAE. A possible strategy to block organ-specific CD8+ T cell mediated inflammation is the interference with antigen recognition by a monoclonal antibody (mAb) specific for the complex composed of the immunodominant peptide and an MHC class I molecule. We therefore tested the therapeutic potency of the mAb 25-D1.16 which binds to the the OVA-8/MHC I complex, in our ODC-OVA/OT-I mouse model. Using flow cytometry and fluorescence microscopy, we confirmed that 25-D1.16 specifically recognizes the peptide SIINFEKL (antigenic epitope of ovalbumin) presented by H-2Kb, the murine homologue of the human MHC class I molecule. With in vitro experiments we addressed the ability of 25-D1.16 to inhibit activation and proliferation of OT-I cells stimulated by SIINFEKL:MHC I complexes. Cell proliferation (radioactive proliferation assays), expression of the early activation marker CD69 on the cell surface (flow cytometry) and IFN-γ secretion (ELISA) were measured. In the presence of 25-D1.16 we saw a highly significant reduction of the respective markers of activation/proliferation. We were thus able to show that the mAb 25-D1.16 recognizing OVA-8/H-2Kb is able to competitively inhibit the response of CD8+ T cells specific for the same peptide/MHC class I complex. To validate these findings in vivo and to study their pathogenic relevance, ODC-OVA/OT-I double transgenic mice were treated with different doses of 25-D1.16. For each mouse, a single dose was injected into the peritoneum prior to EAE onset. On a daily basis, mice were then scored for clinical symptoms of disease (scale 0 – 5). At the end of the experiment, histological and immunohistochemical analysis was performed on sections of brain and spinal cord and was compared to untreated animals. We observed a dose-dependent reduction of EAE severity after injection of 25-D1.16. At low doses (100 μg per mouse), the disease course was indistinguishable from that of untreated ODC-OVA/OT-1 double transgenic mice, whereas at 500 μg 10/12 animals survived. About half of them either showed no or only mild symptoms, while the others experienced full recovery after transient exacerbation. An intermediate phenotype was observed at 200 μg per mouse. Corresponding to the clinical results, the antibody’s effect on the extent of CNS damage was also convincing. Histopathological comparison of mice that recovered under 25-D1.16 therapy showed a virtually intact tissue architecture with only mild residual vacuolization (HE staining), less influx of T cells, as well as reduced microglia/macrophage activation (CD3 and Mac-3 immune histology). Luxol Fast Blue/PAS stained CNS sections showed remyelinated axons while extensive inflammation and myelin destruction is seen in double transgenic mice without 25-D1.16 therapy. In summary, treatment with high doses of 25-D1.16 (500 μg per mouse) saved 83% of the tested animals from lethal EAE, either preventing the development of or attenuating disease symptoms. For the first time, we here describe an antigen specific therapy of CD8+ T cell mediated EAE using a monoclonal antibody binding to peptide/MHC I complexes. By interference with recognition of the autoantigen by CD8+ T cells we were able to inhibit the onset of disease in vivo. Although there are anticipated problems in translating the present results into treatment of MS patients, they might offer a promising concept for future selective immunotherapy in human multiple sclerosis.
KW  - Multiple Sklerose
KW  - Antigen
KW  - Blockade
KW  - Tiermodell
KW  - Therapie
KW  - Autoimmunität
KW  - EAE
KW  - CD8 T-Zellen
KW  - spezifisch
KW  - zytotoxisch
KW  - Antigenerkennung
KW  - multiple sclerosis
KW  - EAE
KW  - CD8 T cell
KW  - antigen-specific
KW  - autoimmunity
KW  - therapy
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52052
ER  - 
TY  - THES
A1  - Drechsel, F. Philipp
T1  - Vergleichende Beobachtung zweier NRTI-haltiger Kollektive mit einem NRTI-freien Kollektiv in der HIV-Primärtherapie unter kontinuierlichem Therapeutischen Drug Monitoring über 96 Wochen
T1  - Comparison of long-term treatment with one of two NRTI-containing regimens versus an NRTI-sparing regimen for first-line HIV therapy as measured by continuous therapeutic drug monitoring over a 96 week period
N2  - Eine klassische HIV-Primärtherapie setzt sich aus einer Kombination von zwei Nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) mit Protease-Inhibitoren (PI) oder Nicht-Nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) zusammen. Vor allem aufgrund NRTI-assoziierter Nebenwirkungen durch mitochondriale Toxizität wird die Option eines Verzichts auf NRTI (NRTI-Sparing) untersucht. In der vorliegenden Langzeituntersuchung wurden drei therapienaive Patientenkollektive - (1) NRTI+PI [n=23], (2) NRTI+NNRTI [n=18] und (3) NNRTI+PI [n=19] - über 96 Wochen teilweise retrospektiv, teilweise prospektiv beobachtet. Die drei Kollektive wurden bezüglich Effektivität, Veränderungen von metabolischen und hämatologischen Laborparametern und kontinuierlichem Therapeutischen Drug Monitoring (TDM) anhand statistischer Auswertung verglichen. Dabei zeigten sich unter den NNRTI Efavirenz (EFV) und Nevirapin (NVP) geringere Plasmaspiegelschwankungen als unter PI. Im Vergleich der Therapiegruppen wurden für absolute und relative Plasmaspiegel keine signifikanten Unterschiede zwischen EFV, NVP und LPV (Lopinavir) beobachtet. Unabhängig des Krankheitsstadiums (CDC-Klassifikation) konnte in allen Gruppen eine maximale Suppression der Viruslast unter die Nachweisgrenze von <50 HIV-RNA-Kopien/ml und ein Anstieg der CD4-Zellzahlen beobachtet werden. Bezüglich virologischem und immunologischem Therapieerfolg gab es im Verlauf über 96 Wochen keinen signifikanten Unterschied zwischen den Therapiekollektiven. Im Vergleich der Laborparameter von Fett- und Leberstoffwechsel kam es zwischen den Gruppen zu signifikanten Unterschieden, wobei deutliche Anstiege und höchste Werte im NRTI-freien Kollektiv gemessen wurden. Für Hämoglobin wurde dies nicht beobachtet. NRTI-Sparing kann bei HIV-therapienaiven Patienten eine Option für eine effektive Langzeittherapie mit maximaler Virussuppression und ansteigender CD4-Zellzahl darstellen, scheint aber mit einem erhöhten Risiko für ansteigende Fettstoff- und Leberparameter assoziiert zu sein.
N2  - A standard first line HIV therapy often consists of a combination of two nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) with either a protease inhibitor (PI) or a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI). Because NRTIs are associated with an occasionally intolerable side effect profile caused by mitochondrial toxicity, NRTI-sparing regimes are important to research further. In this long-term study, therapy-naive adult patients were started on one of three antiretroviral drug regimens: (1) NRTI+PI [n=23], (2) NRTI+NNRTI [n=18] and (3) NNRTI+PI [n=19], and were observed over a duration of 96 weeks. Part of the data was collected retrospectively while the remainder of the data was collected prospectively. Using statistical analysis, the three groups were compared in terms of treatment efficacy, changes in metabolic and hematologic lab parameters and plasma drug levels as measured by continuous therapeutic drug monitoring (TDM). The NNRTIs Efavirenz (EFV) and Nevirapine (NVP demonstrated less variation in plasma concentrations than did the PIs. When comparing absolute and relative plasma concentrations in the three groups, no significant differences were shown between EFV, NVP and LPV (Lopinavir). Despite inclusion of patients with differing CDC classifications within the three groups, all members obtained maximum virologic suppression with HIV-RNA levels <50 copies/ml and an increase in CD4+ cell count by the trial end. No significant differences were shown among the three groups when the virologic and immunologic responses at each time point were examined. The NRTI-sparing group was found to have the steepest rise in and highest overall levels of lipids. Similar trends were seen with transaminases, with the highest levels and most rapid rise seen within the NRTI-sparing group. These results were statistically significant. These trends were not observed for hemoglobin. NRTI-sparing regimes can be used in therapy-naive HIV patients as an option for an effective long-term therapy with maximal viral load suppression and CD4+ cell count recovery but is most likely associated with an increased risk of dyslipidemia and transaminitis.
KW  - HIV
KW  - HIV-Infektion
KW  - Therapie
KW  - Therapieabbruch
KW  - Therapieerfolg
KW  - Arzneimittelnebenwirkung
KW  - Nebenwirkung
KW  - Blutspiegel
KW  - Primärtherapie
KW  - NRTI-Sparing
KW  - Therapeutisches Drug Monitoring
KW  - Mitochondriale Toxizität
KW  - Plasmaspiegel
KW  - HIV therapy
KW  - NRTI-Sparing
KW  - therapeutic drug monitoring
KW  - mitochondrial toxicity
KW  - side effects
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51388
ER  -