TY - THES A1 - Vielreicher, Martin Christian T1 - Fluoreszenz-mikroskopische Untersuchung der Inaktivierung der Tyrosinkinase SRC im Integrin alphaIIb-beta3 -Signalweg T1 - Studies on the inactivation process of the tyrosine kinase Src in the integrin alphaIIb-beta3 signaling pathway by fluorescence microscopy N2 - Essentiell für die Blutstillung (Haemostase) ist die Thrombozyten- oder Blutplaettchen-Adhaesion und die Thrombus-Bildung. Beide Vorgaenge werden hauptsaechlich durch den Thrombozyten-Rezeptor Integrin alphaIIb-beta3 vermittelt. Nach Bindung des Liganden Fibrinogen aendert sich die Rezeptor-Konformation, Integrine assoziieren und ein intrazellulaeres Signalnetzwerk wird aktiviert, welches die Organisation des Aktin-Zytoskeletts steuert. Diese Zytoskelett-Reorganisationen sind Grundlage für zellulaere Adhaesions- und Aggregations-Prozesse. Die Signalvermittlung vom Integrin zum Zytoskelett wird durch die Protein-Tyrosinkinase Src eingeleitet, deren Aktivitaetszustand den Signalweg reguliert. Bei der Src-Aktivierung wird Tyrosin 418 durch Autokatalyse phosphoryliert. Die Kinase muss jedoch wieder inaktiviert werden. Dies übernimmt in Plaettchen ausschliesslich die Tyrosinkinase Csk (C-terminale Src Kinase) durch Phosphorylierung von Tyrosin 529 im C-terminalen Ende des Proteins. Die Csk-vermittelte Inaktivierung von Src stellt den entscheidenden Kontrollschritt des alphaIIb-beta3-vermittelten Signalwegs dar. Obwohl bekannt ist, dass die Src-Aktivierung bei der Zelladhaesion an den Zellraendern der Lamellipodien geschieht und man den Mechanismus und die Kinetik der Src-Csk Interaktion genauer versteht, ist bislang immer noch unbekannt, wo und wie Src inaktiviert wird bzw. welche Rolle der Src-Inaktivierung genau zukommt. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein physikalischer Effekt, mit dem Interaktionen beliebiger fluoreszenzmarkierter Proteine mikroskopisch detektiert werden koennen. Diese Technik wurde genutzt, um die Src-Csk-Interaktion waehrend der alphaIIb-beta3-vermittelten Fibrinogen-Adhaesion in einer etablierten Thrombozyten-Modellzelllinie (A5-CHO) direkt visualisierbar zu machen. Es zeigten sich starke Src-Csk Interaktionen (FRET-Signale) an den Zellraendern aktiver Lamellipodien und zusaetzlich in Fokalkontakten, wo beide Proteine mit Vinculin, einem Fokalkontakte-Marker, co-lokalisierten. Die Proteininteraktionen folgten einem hochdynamischen Ablauf. Nach der Akkumulation der Src-Csk Komplexe an den Zellraendern wanderten sie in Abstaenden von 2-3 Minuten nach innen, fragmentierten und bildeten schliesslich stabile Fokal-Adhaesionen. FRET-Signale an den Zellraendern fanden sich vor allem in ruhenden Lamellipodien bzw., waehrend des Lamellipodien-Rückzugs, in wachsenden Lamellipodien traten die FRET-Signale dort dagegen nicht auf. In unabhaengigen biochemischen Tests im Zeitfenster der FRET-Beobachtungen wurde ein spezifischer Anstieg der Src-Tyr529-Phosphorylierung (Inaktivierung) und eine parallele Abnahme der Src-Tyr418-Phosphorylierung (Aktivierung) gemessen. Weiterführende Ergebnisse lieferten Versuche mit Src- und Csk-Mutanten. Die Co-Expression von Wildtyp-Src mit Kinase-inaktivem CskK222R hatte weder einen Effekt auf die Adhaesion und Ausbreitung der Zellen noch auf die Praesenz von FRET, es aenderte sich jedoch drastisch die zellulaere Verteilung der FRET-Signale sowie das Wachstum und die Form der Lamellipodien. Die Co-Expression von Wildtyp-Csk mit konstitutiv aktivem SrcY529F verursachte dagegen eine stark verringerte Adhaesionsfaehigkeit und Hemmung der Lamellipodien-Bildung. Die Fokal-Adhaesionspunkte in diesen Zellen waren sehr schwach und ueberdimensioniert und lagen ungeordnet verteilt in der Adhaesionsebene. Zusaetzlich verursachte SrcY529F eine starke Ueberaktivierung des Zytoskeletts und das fast vollstaendige Verschwinden der FRET-Signale. Die ermittelten Daten zeigen, dass die enge Kontrolle der Src-Aktivitaet durch Csk eine bedeutende Rolle für die funktionelle Zell-Adhaesion and -Ausbreitung spielt. Co-Immunpraezipitations-Resultate und Messungen der Menge an markiertem Protein in Zellen, in welchen FRET detektierbar war, untermauern zusaetzlich unsere These, zum ersten Mal die Src-Regulation durch Csk in lebenden Zellen direkt beobachtbar gemacht zu haben. Dieser neue FRET-Ansatz kann auch als Reporter-System für Prozesse der Src-Inaktivierung in anderen Signalwegen und Zellen angewendet werden. Das Messprinzip kann weiterhin auf das Studium der Inaktivierung weiterer Mitglieder der Familie der Src-Kinasen (in verschiedensten Signalwegen) erweitert werden. N2 - Platelet adhesion and thrombus formation required for functional hemostasis depends on integrin receptor mediated “outside-in” signaling to the cytoskeleton. Integrin alphaIIb-beta3 is the major integrin on the platelet surface and acts as a specific receptor for the plasma protein fibrinogen. Fibrinogen binding causes clustering of integrins within the plasma membrane activating the protein tyrosine kinase Src (signal initiation) by phosphorylation of tyrosine 418. Src, however, is negatively regulated by another tyrosine kinase, Csk (C-terminal Src kinase), which phosphorylates tyrosine 529. Although, in adhering cells, it is believed that Src is getting activated at lamellipodia leading edges, neither the cellular location nor the dynamics and exact role of Src inactivation is known to date. Here, we studied Src inactivation during alphaIIb-beta3-dependent adhesion to fibrinogen in the established platelet model cell line A5-CHO. Using a live cell FRET (fluorescence resonance energy transfer) microscopy technique with CFP and YFP label molecules (cyan and yellow fluorescent protein), we were able to image highly dynamic Src-Csk interactions at the leading edges of active lamellipodia. Every 2-3 minutes, signals detecting Src-Csk interactions (complexes) appeared at the cell periphery before they begin to move inward in the cell and reorganize while lamellipodia start to protrude (grow). FRET signals were also found in small accumulations at the fringe and also further to the centre of the adhesion plane (focal complexes and adhesions). Src and Csk co-localize with vinculin (a focal adhesion marker) within these regions. During the runtime of FRET observation a specific increase in Src-Tyr529 phosphorylation with a parallel decrease in Src-Tyr418 phosphorylation was observed supporting the idea that Src inactivation occurs within the cells. The role of Src-Csk interaction was studied in further detail using Src and Csk mutants. The data revealed that co-expression of inactive CskK222R did not alter the presence of FRET signals, but fundamentally changed its distribution within the cell. Furthermore it caused lamellipodia shape changes and a tendency of constant lamellipodia protrusion. Co-expression of constitutively active SrcY529F in turn caused a severe adhesion and spreading dysfunction. Adherent cells showed very weak, disorganized and oversized focal adhesions, a hyper-activated cytoskeleton (visible in fast-changing membrane blebs) and absence of FRET signals. Results from immunoprecipitation analyses and protein level determination within cells, in which FRET was detectable, further supported that we were able, for the first time, to directly visualize Src (and integrin) regulation by Csk control in live cells. The results show that Src control by Csk is ultimately required for lamellipodia and focal adhesion function and thus for cell anchorage and spreading. The novel FRET-approach reported here can be readily applied to other integrin and signaling pathways including the study of closely related Src family kinases (SFKs). Results may also contribute to a better understanding of the processes of tumor formation. KW - Antigen CD41 KW - Src-Proteine KW - C-terminal-Src-Kinase KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Thrombozyt KW - CHO-Zelle KW - Lamellipodium KW - Zellskelett KW - Zelladhäsion KW - Integrin alphaIIb-beta3 KW - integrin alphaIIb-beta3 KW - src kinase KW - csk KW - FRET KW - platelet KW - cell adhesion KW - CHO cell KW - lamellipodium KW - actin cytoskeleton Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26743 ER - TY - THES A1 - Menzel, Nicolas T1 - Molekulare Analyse der zellulären Funktionen der p21-aktivierten Kinase Mushroom bodies tiny von Drosophila melanogaster T1 - Molecular analysis and cellular functions of the p21 activated kinase Mushroom bodies tiny from Drosophila melanogaster N2 - In Drosophila melanogaster wurde der p21-aktivierten Proteinkinase Mushroom bodies tiny (Mbt) eine wichtige Rolle als Regulator während der Differenzierung von Photorezeptorzellen zugeschrieben. Da morphologische Umgestaltungsprozesse der Photorezeptorzellen von dynamischen Zellbewegungen begleitet und die molekularen Details größtenteils noch ungeklärt sind, wurden in dieser Arbeit die Funktionen von Mbt in Bezug auf veränderte Zelladhäsionseigenschaften, Reorganisation des Aktincytoskeletts und die Beteiligung an weiteren Signalwegen analysiert. Im ersten Projekt wurde ein genetischer Interaktionsscreen mit Hilfe eines hypomorphen mbt- Allels (mbtP3) durchgeführt, um zu untersuchen, in welche zellulären Signalwege Mbt einzuordnen ist. Die Identifizierung des Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin (Drosophila: Twinstar) und der Phosphatase Slingshot bestätigte, daß Mbt in Prozesse involviert ist, die die Aktindynamik kontrollieren. In Vertebraten phosphoryliert und inaktiviert die Proteinkinase Pak4 (Drosophila Homolog zu Mbt) die Lim-Kinase (Limk), die wiederum Cofilin durch Phosphorylierung hemmt. Dieser Effekt kann nach Dephosphorylierung des Cofilin durch die Phosphatase Slingshot wieder aufgehoben werden. In Drosophila konnte gezeigt werden, daß aktiviertes Mbt mit Twinstar und Drosophila Limk (D-Limk) assoziiert ist und die Phosphorylierungen beider Moleküle induzieren kann. Zusammen mit genetischen Experimenten stellen die Ergebnisse entgegen der Situation in Vertebraten die Funktion von D-Limk als Vermittler zwischen Mbt und Twinstar in Frage und lassen vielmehr auf einen Verlauf des Signals von Mbt direkt an Twinstar, über Slingshot oder unbekannte Kinasen schließen. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit dem Einfluß von Mbt auf die DE-Cadherin-beta- Catenin/Armadillo vermittelte Zelladhäsion. Dazu wurde ein Zellkultursystem in Drosophila Schneiderzellen etabliert, welches es erlaubte, den DE-Cadherin-beta-Catenin/Armadillo-alpha- Catenin Komplex vollständig zu rekonstituieren. Die Resultate zeigten, daß Mbt mit dem Komplex interagiert und beta-Catenin/Armadillo an den Aminosäuren S561 und S688 phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt eine Destabilisierung der Bindung zwischen DE-Cadherin und beta- Catenin/Armadillo und vermindert die Adhäsion der Zellkontakte zwischen Zellen. Im dritten Projekt ging es um die Suche nach unbekannten Phosphorylierungspartnern und der Integration von Mbt in weitere Signalwege. Dazu wurde eine stringente, radioaktive in vitro Phosphorylierungsreaktion entwickelt, die die Detektion von Mbt-spezifischen Phosphorylierungssubstraten aus einem Extrakt von Drosophila Schneiderzellen ermöglichte. In einer Vorstufe wurde dieses Extrakt mit dem ATP-Analogon 5’-Fluorosulfonylbenzoyladenosin (5’FSBA) vorbehandelt, um sämtliche endogenen Kinasen irreversibel zu inhibieren und die nachfolgende Phosphorylierungsreaktion mit aufgereinigtem Mbt spezifisch für Mbt zu machen. Nach Auftrennung und Identifizierung der potentiellen Phosphoproteine durch Massenspektrometrie wurde das Drosophila Dynamitin als neuer Interaktions- und Phosphorylierungspartner von Mbt gefunden. N2 - In Drosophila melanogaster, the p21 activated kinase Mushroom bodies tiny (Mbt) fulfils a critical role in the differentiation of photoreceptor cells during development. Differentiation of photoreceptor cells is accompanied by morphogenetic rearrangement, however, the underlying molecular mechanisms are not completely understood. Therefore in this work the function of Mbt was analysed with respect to the modulation of cell-cell adhesion, reorganization of the actin cytoskeleton and the integration of Mbt in different signalling pathways. In the first project a genetic screen with a hypomorphic mbt allele (mbtP3) was performed to identify components of Mbt signalling pathways. The identification of the actin depolymerization factor Cofilin (Drosophila: Twinstar) and the phosphatase Slingshot confirmed that Mbt is involved in actin regulating processes. In vertebrates, the p21 activated kinase Pak4 (Drosophila homolog of Mbt) acts as an upstream activator of the Lim-Kinase (Limk) which in turn inactivates the actin depolymerization factor Cofilin by phosphorylation. This effect can be reversed by the phosphatase Slingshot. In Drosophila activated Mbt is not only associated with Twinstar and Drosophila Limk (D-Limk) but also induces phosphorylation of both molecules. Together with genetic experiments these results are in contrast to the situation of Pak4 in vertebrates and question the role of D-Limk as a major mediator in signalling between Mbt and Twinstar. Instead we propose that Mbt can either directly act on Twinstar or regulates Twinstar phosphorylation through Slingshot or other unknown kinases. In the second project, the influence of Mbt on DE-cadherin mediated cell adhesion was investigated. Therefore a Drosophila Schneider cell line was established which allowed the reconstitution of a functional DE-cadherin-beta-catenin/Armadillo-alpha-catenin complex. The results revealed an interaction between Mbt and this complex and further showed that Mbt specifically phosphorylates beta-catenin/Armadillo on amino acids S561 and S688. As a consequence the binding between beta-catenin/Armadillo and DE-cadherin is destabilized leading to a reduced adhesion between cells. The third project was to devise a strategy that allows with high selectivity the identification of phosphorylation substrates of Mbt from total lysates of Drosophila Schneider cells. The general idea was to irreversibly block endogenous kinase activities by the ATP-analog 5’-fluorosulfonylbenzoyladenosine and then to perform a radioactive in vitro kinase assay in the presence of exogenously provided Mbt. The potential phosphoproteins were purified and identified by mass spectrometry. The Drosophila Dynamitin was found as a novel interaction and phosphorylation partner of Mbt. KW - Drosophila KW - Kinase KW - Zellkontakte KW - Photorezeptorzellen KW - Aktincytoskelett KW - Drosophila KW - kinase KW - cell contacts KW - photoreceptor cells KW - actin cytoskeleton Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23727 ER - TY - THES A1 - Galler, Annette Bettina T1 - Funktionelle Charakterisierung des Vasodilatator stimulierten Phosphoproteins (VASP) für die Stabilität des Aktin-Zytoskeletts und die Integrin-abhängige Zelladhäsion T1 - Functionel characterization of the vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP) for the stability of the actin-cytoskeleton and integrin-dependent cell adhesion N2 - Das Vasodilatator stimulierte Phosphoprotein (VASP) ist ein Zytoskelett-assoziiertes Protein der Ena (Enabled)/VASP-Proteinfamilie. Seine Funktionen bezüglich Aktin- Polymerisation, Thrombozyten-Aggregation, Wachstumskegel-Führungsprozessen und Motilität sowohl von Zellen als auch von Listerien sind bisher nur unvollständig charakterisiert. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, wie die VASP-F-Aktin Interaktion in vitro durch die Phosphorylierung zweier Aminosäuren von VASP reguliert wird. Transfektions-Experimente mit VASP und RhoA deuten eine mögliche Beteiligung von VASP im Signalweg von RhoA an. Zudem führen Überexpression und Deletion von VASP in Zellen zu demselben Stressfaser-Phänotyp, der unabhängig vom stimulierenden Einfluss von Serum ist. In VASPdefizienten Fibroblasten ist außerdem die Membranrigidität und die Phosphorylierung der leichten Kette des Myosins erhöht, was auf ein stabileres und stärker kontrahiertes Aktin- Zytoskelett in diesen Zellen schließen lässt. Die Regulation und Organisation des Aktin- Zytoskeletts beeinflusst auch die zelluläre Adhäsion, die in VASP-defizienten Zellen verändert ist. VASP-defiziente Zellen adhärieren signifikant stärker an Fibronektinbeschichtete Perlen als Wildtyp-Zellen. Der Widerstand dieser Perlen gegenüber mechanischen Kräften ist in VASP (-/-) Zellen signifikant erhöht. Dieser Unterschied beruht in erster Linie auf dem verstärkten Aktin-Zytoskelett in diesen Zellen und ist unabhängig von Mikrotubuli. Messungen mit rekonstituierten Zelllinien zeigen zudem eine VASPAbhängigkeit dieses Effekts. Der GTPase Rap1 kommt eine wichtige Bedeutung bei der Integrin-abhängigen Adhäsion von Zellen zu. Aktivierung von Epac, einem Guanin-Nukleotid- Austauschfaktor von Rap1, führt in Wildtyp-Zellen zur Verstärkung des Widerstandes gegenüber mechanischen Kräften, die auf Fibronektin-beschichtete Perlen wirken, ohne dabei die Membranrigidität zu verändern. Diese Kraft-Verstärkung wird weder vom Aktin- noch vom Mikrotubuli-Zytoskelett beeinflusst. Es exisitiert daher ein Mechanismus, bei dem die Länge von elastischen Membranfortsätzen unabhängig von der Membranfestigkeit und dem Aktin-Zytoskelett reguliert wird. Diese Experimente zeigen, dass VASP eine wichtige Rolle bei der Stabilität und Kontraktilität des Aktin-Zytoskeletts, der Membranrigidität sowie bei der zellulären Adhäsion spielt. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass hierbei weniger die direkte Interaktion von VASP mit dem Aktin-Zytoskelett von Bedeutung ist, sondern viel mehr seine mögliche Funktion als Gerüstprotein (Scaffold), das eine geregelte Signaltransduktion organisiert. N2 - The actin-cytoskeleton associated protein VASP (vasodilator stimulated phosphoprotein) is a founding member of the Ena (enabled)/VASP protein family. Its function in actinpolymerisation, platelet aggregation, axon-guidance, cell motility and Listeria monocytogenes is yet not completely understood. In this work I could show that the phosphorylation of two amino acid residues of VASP diminishes its interaction with F-actin. Transfection experiments with VASP and RhoA suggest a possible role for VASP in the RhoA signalling pathway. Both, overexpression and deletion of VASP results in a similar stressfiber phenotype, which is independent of the stimulatory effect of serum. Furthermore membrane rigidity and myosin light chain phosphorylation in VASP deficient cells is increased, indicating a more contracted and rigid cytoskeleton in these cells. Cell adhesion is influenced by the regulation and organisation of the actin-cytoskeleton. VASP deficient cells not only adhere significantly stronger to fibronectin-coated beads but also resistance to displacement by mechanical forces is enhanced. This effect results from greater stability of the actin-cytoskeleton while there is no evidence for microtubuli involvement. Experiments with reconstituted VASP (-/-) cell lines proof this effect being VASP-dependent. The GTPase Rap1 is an important regulator of integrin-dependent cell adhesion. Activation of Epac, a guanine nucleotid exchange factor for Rap1, in wildtyp cells leads to enhanced resisting forces to mechanical displacement of fibronectin-coated beads while membrane rigidity remains unchanged. This phenomenon is neither dependent on F-actin nor microtubuli indicating a modulation of membrane tethers independently of membrane rigidity. These results show that VASP is an important regulator of actin-cytoskeletal stability and contractility, as well as membrane rigidity and cell adhesion. Furthermore these data suggest a possible role for VASP as a scaffold protein organising intracellular signal transduction. KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Actin KW - Zellskelett KW - VASP KW - Aktin-Zytoskelett KW - Zelladhäsion KW - VASP KW - actin cytoskeleton KW - cell adhesion Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6518 ER -