TY - THES A1 - Mayer, Christine Rita T1 - Zyklisches AMP kompensiert morphologische und funktionelle Defekte in isolierten Smn-defizienten Motoneuronen T1 - Cyclic AMP compensates morphological and functional defects in isolated Smn-deficient motoneurons N2 - Die proximale spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine autosomal rezessive Erb-krankheit, welche durch fortschreitende Muskelatrophie mit Betonung der pro-ximalen Extremitäten, sowie zunehmende motorische Lähmungen charakterisiert wird. Bedingt wird diese neurodegenerative Erkrankung durch Mutation bzw. Deletion des SMN1-Gens auf Chromosom 5q13. Dies führt zu reduzierten Mengen des ubiquitär exprimierten SMN-Proteins, da der Verlust des SMN1-Gens nicht durch das noch verbleibende SMN2-Gen kompensiert werden kann. Die SMN-Promotor-Region enthält ein CRE II bindendes Element, welches Effekte von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelt und so die SMN-Transkription in untersuchten Zellen stimuliert. Ausgehend von diesem Befund stellte sich die Frage, ob cAMP dem Mangel an volllängen SMN bei der SMA entgegen wirkt. Daher wurden für diese Dissertation neurosphärenbildende kortikale Vorläuferzellen und primär kultivierte Motoneuronen von Smn+/+; SMN2- und Smn–/–;SMN2-Mausembryonen untersucht, um zu klären, ob die cAMP-Behandlung der Zellen zu einer Hochregulierung des SMN2-Transkripts führt, und durch die resultierende Erhöhung des SMN-Proteingehalts morphologische und funktionelle Defekte kompensiert werden. Die Untersuchung zeigte eine signifikante Zunahme des SMN2-Transkriptgehalts in Anwesenheit von cAMP. Dadurch kam es zu einem Anstieg der SMN-Proteinmenge im Soma, Axon und Wachstumskegel von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen. Die Verteilungs-störung des SMN-Interaktionspartners hnRNP R mit fehlender kontrolltypischer Anreicherung im distalen Axon und Wachstumskegel von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen wurde ebenfalls durch cAMP kompensiert. Smn-defiziente Mo-toneurone zeigten im Vergleich zu Kontrollzellen kleinere Wachstumskegel sowie ein Defizit an β-Aktin im distalen Axon. Zudem fehlte in Smn–/–;SMN2-Motoneuronen die bei Kontrollen ausgeprägte Zusammenlagerung von N-Typ spezifischen Ca2+-Kanälen in der Präsynapse, die nach Kontakt mit der β2-Kette des endplattenspezifischen Laminin-221 spontan öffnen und so einen in-trazellulären Kalziumanstieg bewirken, wodurch es zu Erregbarkeitsstörungen und Axonelongationsdefekten bei Smn-defizienten Motoneuronen kommt. Die Behandlung der Smn-defizienten Motoneuronen mit cAMP führte zur Vergrößerung der Wachstumskegelfläche und zu einer im Verlauf des Axons zunehmenden Anfärbung mit β-Aktin. Außerdem kam es zu einer Erhöhung der Menge an Cav2.2-Kanalprotein in den Wachstumskegeln Smn-defizienter Motoneurone, was mit einer erhöhten Erregbarkeit korrelierte und zu einer Normalisierung der Axonlänge von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen auf Laminin-221 führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen die Vermutung zu, dass Smn-defiziente Motoneurone in vivo Defekte im präsynaptischen Bereich der Motorendplatte aufweisen. In Zukunft können mit dem beschriebenen in vitro Assay weitere Substanzen, welche die SMN2-Traskription stimulieren, auf ihr kompensatorisches Potential getestet werden. N2 - Proximal autosomal recessive spinal muscular atrophy (SMA) is caused by mutation or deletion of the SMN1-gene on chromosome 5q13. The SMN promotor region contains a CRE II binding element, which mediates effects of cyclic adenosine monophosphate and stimulates the SMN transcription in examined cells. In animal models of SMA, spinal motoneurons exhibit reduced axon elongation and growth cone size. These defects correlate with reduced ß-actin protein levels in distal axons. In this study I examined primary cultured motoneurons from Smn+/+;SMN2- and Smn-/-;SMN2-mice embryos. The examination could show a significant increase of the SMN2 transcript by treating the cells with cAMP. The Smn protein level increases in the soma, axonal department and growth cones of Smn-deficient motoneurons which were treated with cAMP in cell culture. I could also show that Smn–deficient motoneurons exhibit severe defects in clustering Cav2.2 channels in axonal growth cones and that treating with cAMP compensate these defects. Growth cone size, axonal length, hnRNP R protein levels and ß-actin protein levels in distal axons being normalized by cAMP treating of the Smn-/-;SMN2-motoneurons. Other substances, which stimulate the SMN2 transcription, can be tested in the future with the in this study established in vitro assay. KW - cAMP KW - Spinale Muskelatrophie KW - Motoneuron KW - Actin KW - N-Typ Kalziumkanäle KW - SMN KW - cAMP KW - spinal muscular atrophy KW - N-type calcium channel KW - SMN KW - beta-actin Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46457 ER - TY - THES A1 - Lechner, Barbara Dorothea T1 - Modulation des axonalen Wachstums primärer Motoneurone durch cAMP in einem Mausmodell für die Spinale Muskelatrophie T1 - Modulation of axonal growth of primary spinal motor neurons by cAMP in a mouse model for Spinal Muscular Atrophy N2 - Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine häufige autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung des motorischen Nervensystems bei Kindern. Ursache der Degeneration von spinalen Motoneuronen ist der homozygote Verlust des SMN- (survival of motoneuron) Gens und ein dadurch bedingter Mangel an SMN-Protein. Untersuchungen an Motoneuronen von Smn-defizienten Mäusen ergaben Störungen des axonalen Längenwachstums aufgrund einer Fehlverteilung des Zytoskelettproteins beta-Aktin und seiner mRNA in den Axonterminalen. Das Axonwachstum wird durch Aktin-Polymerisierung im Wachstumskegel gesteuert. beta-Aktin-mRNA findet sich auch in Axonen, und die lokale Proteinsynthese kann durch neuronale Aktivierung gesteigert werden. Das SMN-Protein ist am axonalen Transport von beta-Aktin beteiligt. In der vorliegenden Arbeit ergaben Western Blot-Analysen in neuralen Stammzellen (NSC) sowie spinalen Motoneuronen in vitro eine Steigerung der SMN-Proteinexpression durch 8-CPT-cAMP. Zur Untersuchung der Auswirkungen der erhöhten SMN-Proteinmenge auf die Pathologie der Motoneurone wurde ein in-vitro-Assay entwickelt, mit dessen Hilfe gezeigt werden konnte, dass eine Behandlung mit 100 µM 8-CPT-cAMP die axonalen Veränderungen isolierter embryonaler Smn-defizienter Motoneurone kompensieren kann. Motoneurone von 14 Tage alten Smn-defizienten und Kontroll-Mausembryonen wurden über sieben Tage hinweg auf einer Matrix aus Poly-Ornithin und Laminin-111 bzw. Laminin-121/221 kultiviert und mit 100µM cAMP und neurotrophen Faktoren behandelt. Nach Fixierung wurden die Zellen mit Antikörpern gegen Islet-1/2, tau und beta-Aktin gefärbt, mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops fotografiert und digital vermessen. 8-CPT-cAMP erhöht den beta-Aktin-Gehalt in den axonalen Wachstumskegeln von Smn-defizienten Motoneuronen. Die Größe der Wachstumskegel nimmt durch die Behandlung um das 2-3fache zu und erreicht normale Werte. Auf Laminin-111 bleibt das Längenwachstum der Axone durch 100µM 8-CPT-cAMP unbeeinflusst, auf Laminin-121/221 wird das Längenwachstum normalisiert. Die beta-Aktin-Verteilung innerhalb der Axone und Wachstumskegel von Smn-defizienten Motoneuronen erscheint durch die cAMP-Behandlung nahezu normalisiert. Die Wiederherstellung der beta-Aktin-Verteilung in Wachstumskegeln durch cAMP kann große Auswirkungen auf die Funktionalität der Motoneurone haben. Die Ergebnisse sind möglicherweise ein erster Schritt auf dem Weg zu einer Therapie für die Spinale Muskelatrophie. N2 - Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive disorder characterized by loss of alpha-motoneurons in the spinal chord due to low levels of the survival motor neuron (SMN) protein. The genetic cause is the homozygous loss or mutation of the telomeric SMN1 gene and retention of the centromeric SMN2 gene, whose transcripts consist of about 90% truncated and unstable and only 10% functional protein. Motoneurons of Smn-deficient SMN2 transgenic mouse embryos cultured on laminin-1 show abnormalities compared to wildtype controls such as shorter axons, smaller growth cones and a ß-actin protein and mRNA deficit in the distal part of the axon. ß-actin plays a major role in growth cone motility and transmitter release at the presynapse. In addition, SMN works in a complex to transport ß-actin mRNA, which is known to be localized and locally translated in axons and growth cones, along the axon. Local ß-actin protein synthesis can be stimulated by increased neuronal activation. We determined the effects of cAMP on ß-actin localisation in axons as well as on axonal growth parameters in Smn-deficient primary motoneurons. Motoneurons of 14 days old Smn-/-, SMN2 transgenic and wildtype mouse embryos were cultured on laminin for 7 days with 100µM 8-CPT-cAMP and neurotrophic factors BDNF and CNTF. Fluorescence staining and digital measurements revealed a major effect of cAMP treatment on ß-actin distribution and growth cone size, which were restored to normal. Neurite lengths on laminin-111 remained unaffected but were normalized on substrate containing a synapse-specific ß2-laminin isoform. Western blots with neural stem cells (NSC) and heterozygous Smn+/-; SMN2 transgenic motoneurons treated with 100µM cAMP showed a marked upregulation of Smn protein expression. These data point to an important role for cAMP as a possible target of SMA drug therapy. KW - Spinale Muskelatrophie KW - Motoneuron KW - Neurobiologie KW - Laminin KW - Actin KW - SMN KW - cAMP KW - SMN KW - cAMP KW - Spinal Muscular Atrophy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39585 ER -